Summary
Este método describe un enfoque robusto y reproducible para la comparación de los niveles de proteína en distintos tejidos y en diferentes puntos de tiempo del desarrollo usando un enfoque Blot western cuantitativo estandarizado.
Abstract
Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en investigación básica y clínica. Sin embargo, como con muchas técnicas experimentales similares, los resultados de los análisis de Western blot es fácilmente influenciado por decisiones en el diseño y ejecución del experimento. Proteínas específicas de limpieza se han utilizado tradicionalmente para normalizar los niveles de proteína para la cuantificación, sin embargo, éstos tienen una serie de limitaciones y por lo tanto han sido cada vez más criticados en los últimos años. Aquí, describimos un protocolo detallado que hemos desarrollado para que podamos llevar a cabo complejas comparaciones de la variación de expresión de proteínas en diferentes tejidos, modelos de ratón (incluyendo modelos de la enfermedad) y los puntos de tiempo del desarrollo. Mediante una tinción fluorescente proteína total e introduciendo el uso de un estándar interno de la carga, es posible superar las limitaciones existentes en el número de muestras que pueden compararse en experimentos y comparar sistemáticamente los niveles de la proteína a través de un rango de condiciones experimentales. Este enfoque amplía el uso de técnicas de inmunoblot tradicional, lo que permite a los investigadores explorar mejor expresión de la proteína a través de muestras y diferentes tejidos.
Introduction
Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína, incluyendo en homogenados de tejido o extractos. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en la investigación básica y clínica, donde puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para identificar la presencia de enfermedad1,2. Primero borrar occidental fue descrito en 1979 como un método para transferir proteínas de geles de poliacrilamida a hojas de nitrocelulosa y posteriormente visualizar las proteínas usando los anticuerpos secundarios que fueron radiactivo etiquetados o conjugados con fluoresceína o peroxidasa3. Mediante el desarrollo de kits disponibles en el mercado y el equipo, Western Blot métodos han sido cada vez más estandarizados y simplificadas sobre los años. De hecho, la técnica ahora es fácilmente realizada por científicos con diferentes orígenes y niveles de experiencia. Sin embargo, como con muchas técnicas experimentales similares, los resultados de los análisis de Western blot es fácilmente influenciado por decisiones en el diseño y ejecución del experimento. Es importante, por lo tanto, que la accesibilidad de métodos estandarizados de Blot Western no obscurecer la necesidad de una cuidadosa planificación experimental y diseño. Consideraciones experimentales incluyen, pero no limitada a, muestra la preparación y manipulación, selección y validación de anticuerpos para la detección de la proteína y la eficiencia de transferencia de gel a la membrana de particularmente grande o pequeño (< 10 o > 140 kDa) proteínas4,5,6,7,8,9. Calidad de la proteína de la muestra original juega un papel importante en la determinación de los resultados de los análisis de Western blot posterior. Como proteína puede ser extraída de una gran variedad de muestras y de fuentes, incluyendo líneas celulares, tejidos de modelos animales y tejidos humanos post mortem, consistencia en el manejo y procesamiento es necesaria para obtener resultados reproducibles. Por ejemplo, cuando se requiere almacenamiento a largo plazo de muestras para la extracción de proteínas, es importante tener en cuenta que, aunque la proteína es generalmente estable a-80 º C, diferencias en la estabilidad de la proteína extraída de las proteínas y los tejidos intactos a-80 ° C han sido reportado10. Además, para obtener estimaciones reproducibles de cantidades de proteína, consecuente homogeneización de las muestras es crucial. Optimización de métodos de homogeneización (p. ej., homogeneización manual en comparación con métodos automatizados) y almacenadores intermediarios de la lisis diferentes puede ser necesario antes de comenzar un experimento a gran escala cuantitativo.
Estrategias de normalización para corregir la variabilidad de carga y la cuantificación de proteína son esenciales para obtener resultados robustos, cuantitativos de la expresión de la proteína. Servicio de limpieza tales como β-actina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), α-tubulina y β-tubulina han tradicionalmente utilizados para normalizar los niveles de proteína para la cuantificación. Sin embargo, normalización a las proteínas de limpieza específico para propósitos de cuantificación ha sido criticado cada vez más en el pasado pocos años11,12. Por ejemplo, puede cambiar la expresión de proteínas de limpieza a través de diferentes etapas de desarrollo13,14, a través de los tejidos del animal mismo4y bajo diversas enfermedades condiciones4,15 ,16,17. Por lo tanto, el uso de proteínas específicas de limpieza limita las posibilidades de realizar comparaciones más complejas entre la expresión de proteínas de diversos tejidos, en diferentes puntos de tiempo y bajo diferentes condiciones experimentales. Una alternativa a las proteínas de la limpieza a control para variación de la carga de la proteína es el uso de un colorante de proteínas totales (TPS) que las etiquetas y visualiza todas las proteínas presentes en una muestra. TPS permite la normalización de la señal en base a proteína total carga en lugar de niveles de una proteína específica y por lo tanto la cuantificación de la señal TPS deben ser comparables y reproducibles independientemente de la condición experimental, tipo de muestra o punto de tiempo del desarrollo . Ejemplos de manchas de proteína total incluyen Ponceau S, geles mancha-libre, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black y Cy5 (revisado en Ref. 18). Cada uno de estos métodos tiene limitaciones y ventajas específicas y selección del método depende del tiempo y las herramientas disponibles así como la disposición experimental4,18.
Además de utilizar un TPS para corregir para la carga dentro de la membrana y variabilidad de cuantificación, puede ser necesario comparar muestras entre diferentes membranas, particularmente cuando se realiza el análisis de expresión de proteínas a gran escala. Sin embargo, variabilidad en los factores tales como eficiencia y total intensidad de tinción de proteínas de unión del anticuerpo puede introducir mayor variabilidad entre las muestras de proteína que se analizan en diferentes geles y membranas. Para la cuantificación sólida en esta situación, por lo tanto es necesario introducir un nuevo paso de normalización para tener en cuenta la variabilidad entre la membrana. Esto puede lograrse mediante la inclusión de una norma interna de la carga en cada una de las membranas analizadas por separado que se mantiene constante a través de experimentos. Esta norma puede tomar la forma de cualquier proteína lisada que puede obtenerse en cantidad suficiente para usarse en todas las membranas en el experimento. Aquí, utilizamos un lisado de cerebro de ratón (Obtenido de los ratones de control 5 días de edad), como cerebro fácilmente está homogeneizado y la proteína obtenida lisada contiene una cantidad significativa de proteína en alta concentración. Carga estándar interno por triplicado permite muestras en separar las membranas a ser normalizado y comparadas directamente.
Aquí, describimos un protocolo detallado que hemos desarrollado para que podamos llevar a cabo complejas comparaciones de la variación de expresión de la proteína a través de diferentes tejidos, modelos de ratón (incluyendo modelos de la enfermedad) y los puntos de tiempo del desarrollo19. Combinando un TPS fluorescente con el uso de un estándar interno de la carga, hemos sido capaces de superar las limitaciones existentes en el número de muestras y condiciones experimentales que pueden compararse en un solo experimento. Este enfoque amplía el uso de técnicas tradicionales de Western blot, lo que permite a los investigadores explorar mejor expresión de la proteína a través de muestras y diferentes tejidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los tejidos para este procedimiento se obtuvieron de los estudios en animales que fueron aprobados por el Comité de ética interna en la Universidad de Edimburgo y fueron realizados en concordancia con institucionales y regulaciones UK Home Office bajo la autoridad de las personal y licencias del proyecto.
Nota: Este protocolo se ha optimizado con reactivos y kits estandarizados, disponibles en el mercado con el fin de aumentar la reproducibilidad (véase Tabla de materiales).
1. preparación de muestras
-
Extracción de proteínas
- Transferencia congelados complemento celular o muestras de tejido de-80 ° C en hielo seco, descongelar el hielo y lavado según se requiera con hielo frío 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (para detalles sobre los tejidos y lavados de PBS, vea tabla 1). Evitar ciclos de congelación y descongelación innecesaria como esto afectará la calidad de la proteína.
- Añadir el tampón de ensayo (RIPA) de radioinmunoprecipitación (25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, desoxicolato de sodio al 1%, 0.1% SDS) que contiene 1 x inhibidor de la proteasa para cada muestra, usando la cantidad óptima del peso de tejido (véase la tabla 1 para recomendaciones).
Nota: Dependiendo de la aplicación, el tipo y cantidad de buffer de homogeneización pueden necesitar más optimización. - Utilizar un homogeneizador eléctrico portátil con un mortero polipropileno para homogeneizar las muestras de tejido. Entre cada muestra, la mano del mortero en agua doble destilada de lavar y secar con un paño limpio. Cambiar la mano del mortero entre diferentes condiciones experimentales y los tejidos.
- Dejar las muestras en hielo durante 10 min después de la homogeneización. Centrifugar las muestras a > 10.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo en hielo sin perturbar el pellet. El sobrenadante es la muestra de proteína. Tienda la proteína extraída a-80 ° C o directamente proceder a medir la concentración de proteína.
-
Cuantificación y normalización de la concentración de la proteína
- Medir la concentración de proteína usando un análisis de bicinchoninic ácido (BCA). Preparar una mezcla de ensayo BCA según las instrucciones del fabricante en una placa de 96 pocillos óptica con 200 μL de mezcla BCA por pozo.
Nota: Otros métodos de cuantificación como ensayos de Lowry y Bradford también pueden utilizarse para determinar la concentración de proteína como la concentración de proteína se cuantifica constantemente a través de experimentos. - Preparar albúmina de suero bovino (BSA) normas en el aumento de las concentraciones en triplicado y añadir 1 μl de cada muestra de proteína por duplicado. Incubar la placa de 96 pocillos en un bloque de calor precalentado a 60 ° C durante 10 minutos o más si se espera que la concentración de proteína es bajo.
- Después de la incubación, medir la absorción en 560 nm utilizando un lector de placas.
- Exportar las medidas de placa lector y calcular la concentración de proteína mediante la comparación de los valores promedio de absorbancia de cada muestra a una curva estándar obtenida utilizando el estándar de proteína. El valor R cuadrado para la curva estándar debe ser mayor o igual a 0,98 para estimar con precisión la concentración de proteína de la muestra.
- Normalizar la cantidad de proteína mediante la preparación de las diluciones de las muestras de proteína en solución tampón de muestra y agua ultrapura. El volumen puede ajustarse dependiendo del tipo de gel utilizado. 30 μg de proteína por carril como una cantidad inicial de carga es recomendable. Añadir agente reductor como el Ditiotreitol (DTT; concentración final 5 mM) o beta-mercaptoetanol (concentración final 200 mM) a cada muestra según sea necesario. Pipeta sin diluir beta-mercaptoetanol en una campana de humos.
- Incubar las muestras en un bloque térmico a 70 ° C durante 10 minutos poner las muestras en hielo, vortex y desactivación brevemente para recoger. Mantenga en hielo hasta cargar el gel.
- Medir la concentración de proteína usando un análisis de bicinchoninic ácido (BCA). Preparar una mezcla de ensayo BCA según las instrucciones del fabricante en una placa de 96 pocillos óptica con 200 μL de mezcla BCA por pozo.
2. electroforesis de las muestras de proteína
-
Dispositivo y configurar gel
- Configuración de un gradiente de Bis-Tris prefabricados 4 – 12% gel (véase Tabla de materiales) en el sistema de cámara de electroforesis de gel. Enjuague los geles con agua doble destilada antes del uso.
Nota: Dependiendo del tamaño, las interacciones y abundancia de la proteína de interés, geles con un gradiente diferente, buffering agent o bien tamaño y número puede utilizarse. - Añadir 500 mL de 1 SDS x MES funcionamiento tampón diluido en agua destilada doble por un tanque. Retire cuidadosamente el peine de los geles después de agregar el buffer corriente sin molestar a los pocillos en el gel de apilamiento.
- Configuración de un gradiente de Bis-Tris prefabricados 4 – 12% gel (véase Tabla de materiales) en el sistema de cámara de electroforesis de gel. Enjuague los geles con agua doble destilada antes del uso.
-
Carga de la proteína
- Carga 3.5 μl de un estándar de la proteína en el pozo. Dependiendo del diseño de la muestra, cargando una escalera de proteína en ambos lados del gel puede ayudar en la más precisa estimación de tamaño de la proteína. Utilice gel punta fina carga consejos para la carga de muestra más exacta.
- Cuando se usa un estándar interno para la normalización entre la membrana (ver paso 5 a continuación y discusión), cargar una cantidad que es igual a las otras muestras en los 3 pocillos junto a la escalera de la proteína.
- Carga 30 μg de cada muestra en los pocillos restantes. Añadir 1 x de tampón de muestra en todos los pocillos vacíos.
-
Electroforesis
- Montar el tanque del gel después de cargar las muestras. Recorren las muestras el gel de apilamiento a 80 V durante 10 min seguida de 150 V para un adicional 45-60min.
3. transferencia de proteínas
Nota: La transferencia de proteína en este protocolo se realiza utilizando un sistema comercialmente disponible de Blot semiseco (véase Tabla de materiales) para los resultados rápidos y consistentes.
- Preparar la transferencia de la proteína previamente remojar papel de filtro de agua doble destilada y velando por el cuchillo de gel, plástico Pasteur pipeta, Blot de rodillos y pinzas están listas para usar.
- Abra la pila de transferencia quitando cuidadosamente todo papel de envoltura. Quitar la parte superior de la pila de la parte inferior y póngala a un lado. Humedece rápidamente la membrana de la pila de la parte inferior con varias gotas de corriente (2-3 mL) de tampón de electroforesis. Una vez abierta la pila de la transferencia, es importante evitar que la membrana PVDF de la desecación.
- Después de parar la electroforesis, abrir el gel prefabricado usando el cuchillo de gel y cortar el gel de apilamiento. Corte el gel alrededor de sus bordes para liberarla del plástico fundido. Mantenga el cuchillo de gel húmedo para evitar daños en el gel.
- Montar la pila de la transferencia de la parte inferior hacia arriba: abajo de la pila (que contiene la membrana PVDF), proteína gel, papel de filtro. Use el rodillo blot para eliminar todas las burbujas de aire. Coloque la pila superior sobre el papel de filtro y rodillo de la pila de nuevo para eliminar burbujas de aire. No empuje demasiado fuertemente ya que puede causar el gel se deforme durante la proteína de transferencia.
- La pila entera de transferencia en el dispositivo de transferencia con el electrodo en el lado izquierdo del dispositivo y colocar la esponja de gel encima de la pila de modo que quede alineada con los correspondientes contactos eléctricos en el dispositivo. Cierre la tapa, seleccionar e iniciar el programa apropiado (20 V por 7 min es un punto de partida recomendado).
- Cuando haya terminado, deje la tapa cerrada durante 2 minutos permitir que la pila se enfríe y para evitar que la membrana de la desecación. Retire la pila de transferencia y corta la membrana con el tamaño del gel. Lavar la membrana corte rápidamente con agua destilada doble antes de continuar con la tinción de proteínas totales.
4. total proteína tinción
Nota: Usando la detección fluorescente proporciona un beneficio sustancial sobre los enfoques más tradicionales (e.g., detección de ECL), como la gama lineal y la sensibilidad pueden ser mucho mejor controlada4. Por lo tanto, en los pasos 4 y 5, un TPS fluorescente y fluorescentes anticuerpos secundarios se utilizan (véase Tabla de materiales).
- Rollo de la membrana en un tubo de 50 mL con la proteína hacia hacia el interior. Debido a la sensibilidad a la luz de fluorescente TPS los anticuerpos secundarios, todos los pasos posteriores se llevan a cabo en la oscuridad.
- Añadir 5 mL de solución de tinción de proteínas (véase Tabla de materiales) y se incuba en un rodillo durante 5 minutos a temperatura ambiente. Porque TPS y tampón de lavado contiene metanol, realizar estos pasos en una campana de humos.
- Deseche la solución de tinción y lavar dos veces con 5 mL de solución de lavado (ácido acético al 6.3% en metanol 30%). Coloque el tubo brevemente en el rodillo entre pasos de lavado. Enjuagar la membrana brevemente con agua ultrapura antes de continuar.
5. bloqueo, incubación de anticuerpos y detección de
- Bloqueo de la membrana: Añadir 3 mL de solución amortiguadora de bloqueo (véase Tabla de materiales) para el tubo de 50 mL que contiene la membrana. Incubar la membrana en un rodillo durante 30 min a temperatura ambiente. Dependiendo de la elección del anticuerpo, el tipo de solución amortiguadora de bloqueo utilizado puede requerir optimización.
-
Incubación del anticuerpo primario
- Desechar el tampón y reemplazar con el anticuerpo primario en el caso, optimizado la concentración (figura 1 y figura 2: ratón-anti-SMN, en 1:1, 000, diluida en solución amortiguadora de bloqueo).
Nota: Optimización adecuada de anticuerpos primarios debería incluir la confirmación de que el anticuerpo detecta un producto de proteína de tamaño correcto, mientras que ningún o mínimo a los productos de proteína no específica. Si es posible, probar y comparar múltiples anticuerpos contra la proteína de interés. - Incubar la membrana en un rodillo durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, quitar la solución de anticuerpo y lavar 6 veces durante 5 min con 1 x PBS en un rodillo a temperatura ambiente (RT).
- Desechar el tampón y reemplazar con el anticuerpo primario en el caso, optimizado la concentración (figura 1 y figura 2: ratón-anti-SMN, en 1:1, 000, diluida en solución amortiguadora de bloqueo).
-
Incubación del anticuerpo secundario
- Preparar el anticuerpo secundario específico en 1:5,000 contra el anfitrión del anticuerpo primario en 5 mL de tampón de bloqueo. Otros anticuerpos secundarios pueden requerir otras diluciones o el uso de tampones de bloqueo alternativos.
- Incubar la membrana con la solución de anticuerpo secundario en un rodillo de 1 h a TA. Después de la incubación, lavar la membrana 30 minutos tres veces con 1 PBS de x en un rodillo.
- Secar la membrana y mantener la membrana protegida de la luz con papel de aluminio hasta la detección. Membranas pueden conservarse a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.
-
Adquisición de imágenes
- Inicie sesión en el ordenador conectado al escáner. Coloque la membrana sobre el escáner con la proteína hacia y seleccione el área de análisis en el software.
- Optimizar la intensidad del láser para ambos (700 nm y 800 nm) canales, confirmando la no saturación ocurre. Adquirir las imágenes en ambos canales y exportar las imágenes para su posterior análisis (paso 6).
6. cuantificación y análisis Western blot
Nota: Estas recomendaciones se basan en el software de estudio de imagen libremente disponible. Sin embargo, también pueden hacer análisis comparables con otros paquetes de software, como el ImageJ.
- Importar el archivo: crear un espacio de trabajo local en el equipo utilizado para el análisis. Esto genera una base de datos de archivos de imagen para manchas blancas /negras occidentales adquiridas. Importar archivos en el explorador y seleccione la imagen para el análisis.
-
Análisis TPS
- Mostrar el canal nm 700 para mostrar la proteína total resultado de tinción. Un ejemplo de una imagen TPS se incluye en la figura 1 en que diversos tejidos de neonatal (P5) (figura 1A-B) y 10 - semana ratones (Figura 1C-D) se comparan directamente. Del mismo modo, la figura 2 muestra un ejemplo de una comparación directa del tejido cerebral de ratones de diferentes edades.
- Seleccione la ficha de análisis de la esquina superior derecha y seleccione Agregar rectángulo para definir el área de interés para la normalización (figura 1B, D). Copiar y pegar la primera área del rectángulo en cada muestra individual para la región definida en el mismo tamaño para todas las líneas analizadas.
- Copiar el resultado en la ficha de formas en la esquina inferior izquierda del software.
-
Cuantificación
Nota: El enfoque óptimo para la cuantificación de las muestras depende del diseño experimental. Aquí ofrecemos un ejemplo ilustrativo de la detección de la proteína de la neurona motora de la supervivencia (Smn, una proteína clave involucrada en la enfermedad neuromuscular la atrofia muscular espinal20,21), que se sabe que disminuye con el tiempo 19 y como normalización de la intensidad de la señal de Smn a TPS proporciona estimaciones fiables de desarrollo de expresión de la proteína.- La figura 2 muestra una disminución de la expresión de Smn con aumento de la edad del animal con el TPS como proteína control de carga. Repita el paso 6.2.1-6.2.3 para cuantificar proteínas carga (figura 2B). Repita el paso 6.2.1-6.2.3 en el canal 800 de nm (figura 2A) para analizar la proteína del interés.
- Copiar los resultados de TPS y la proteína de interés en un programa de hoja de cálculo. En la hoja de cálculo, primero normalizar la proteína carga mediante la determinación de la más alta señal TPS y dividiendo cada TPS valor por este valor para obtener la proteína normalizada de carga del valor de la señal.
- Dividir el valor de la señal de nm 800 de cada muestra individual por su valor de proteína normalizada correspondiente para calcular la relación de expresión relativa de proteínas en diferentes muestras.
- Después de la primera normalización, comparar diversos puntos de tiempo o el valor promedio del estándar interno para permitir comparaciones directas entre experimentos y membranas de diferentes tejidos.
7. estadísticas
- Para determinar diferencias estadísticamente significativas en la expresión de la proteína a través de complejos y grandes grupos de muestras, metodología estadística apropiada es necesaria. Aunque una discusión detallada de fondo estadístico va más allá del alcance de este artículo, queremos destacar varias consideraciones y detallar un método exitoso que hemos utilizado anteriormente19.
- Para muchos experimentos, las mediciones de cuantificación de proteína no representan datos totalmente independientes. Aquí, por ejemplo, tejidos múltiples generalmente se obtienen de animales solo para determinar los niveles de proteínas a través de múltiples órganos en un solo momento experimental. Por lo tanto, se utilizan un modelos de efectos mixtos para analizar las diferencias en la expresión de la proteína con el tiempo y entre los tejidos. En general, los modelos de efectos mixtos proporcionan un medio eficaz de ocuparse de no independencia y así evitar seudo replicación22,23. En el presente caso, los modelos de efectos mixtos aumentan potencia estadística contabilidad para mediciones repetidas entre los tejidos, dentro de los individuos. Utilizamos el paquete de software estadístico R para realizar estos análisis, ya que es libremente disponible y versátil. Sin embargo, otros paquetes disponibles comercialmente pueden ser capaces de realizar análisis similares.
- El diseño experimental corriente involucra un diseño "split parcela" porque cada ratón perteneció a un único grupo de edad. Por lo tanto, modelamos los ratones (mouse ID) como un efecto aleatorio con un identificador único; también nos representaron tejido, edad y su interacción como efectos fijos. Modelamos los datos utilizando la función lmer en la biblioteca R, lme4. Como medida de control de calidad, visualizar residuales para evaluar las hipótesis de igual varianza y una distribución normal y transforma los datos cuando sea necesario para cumplir con estos supuestos. Para comprobar una interacción significativa entre edad y tejido, encajamos un modelo idéntico que carecía de esta interacción y en comparación con los modelos usando Bootstrap paramétrico (función de R PBmodcomp en la biblioteca, pbkrtest). Donde se presentaron interacciones significativas, utilizamos la función emmeans (en la biblioteca de emmeans R) para determinar la causa de la interacción. Por ejemplo, comparamos la expresión media entre clases de edad dentro de cada tejido; puede surgir una interacción significativa entre la edad y tejido si, decir, dos clases de edad determinada difieren significativamente para un tejido, pero no en otro. En Resumen, estos métodos proporcionan una manera de extender la robustez de las conclusiones de los experimentos de la mancha blanca /negra occidental por el apoyo estadístico a estos resultados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Incluyen ejemplos del uso de la TPS y el estándar interno para facilitar las comparaciones de niveles de proteína en los tejidos y puntos del tiempo. La figura 1 muestra los resultados de Western Blot en proteína extraída de tejidos obtenidos de neonatal (día postnatal 5) en comparación con ratones adultos (10 - semana de edad). TPS y Smn immunoblot se muestran en la figura 1A, C. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de los TPS se logró mediante la medición de la intensidad de fluorescencia dentro de la caja rectangular en cada carril y sus resultados se muestran en las tablas figura 1B y 1D. Tenga en cuenta que las muestras de diferentes tejidos se caracterizan por patrones de banda de proteína TPS diferentes y por lo tanto es necesario utilizar el carril entero para propósitos de normalización. De hecho, cuando se analizaron todo carriles, la intensidad de fluorescencia sigue siendo relativamente similar a través de muestras, indicando que TPS para la normalización es conveniente para este propósito. Un patrón interno que consiste en una mezcla de lisado de cerebro de P5 se incluyó también para ilustrar cómo puede ser utilizado para otras comparaciones entre las diferentes membranas. Además, en la figura 2, mostramos cómo un TPS fluorescente se puede utilizar para comparar los niveles de proteína en diferentes momentos del desarrollo. Aquí, mostramos los niveles de Smn en lisados cerebro de neonatal (P5), destete edad (P20) y adulto (10W) ratones (figura 2A). Aunque los niveles de Smn disminuyen claramente con la edad, cuantificación de TPS sigue siendo constante como se muestra en la figura 2B.
Figura 1. Manchas blancas /negras occidentales mostrando TPS y Smn niveles de proteína en tejidos de ratón en dos edades diferentes. Proteína TPS y Smn para P5 (A) y 10 semanas de edad (C) ratones. (B, D) La intensidad de fluorescencia de carril conjunto TPS se calculó y se indica (en unidades arbitrarias). M: marcador/proteína estándar; kDa: kilodalton; a.u.: unidad arbitraria; P5: día postnatal 5; 10W: 10 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de la expresión de Smn en tejidos de ratón en diferentes momentos del desarrollo. (A) cerebro lisados de tejidos obtenidos de P5, P20 y 10 semanas de edad ratones se analizaron mediante TPS (panel superior) y el SMN (panel inferior). (B) la intensidad de fluorescencia de los TPS se calculó y se indica en unidades arbitrarias. M: marcador/proteína estándar; kDa: kilodalton; a.u.: unidad arbitraria; P5: día postnatal 5; P20: día postnatal 20; 10W: 10 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tejido | Peso aprox. * | lavado de 1xPBS (4 ° C) | Repita el lavado | Buffer de homogeneización ** |
| De la médula espinal | 40 mg | 150 mL | x 3 | 100 mL |
| Músculo (GC) | 20 mg | 150 mL | x 3 | 100 mL |
| Cerebro | 240 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Corazón | 60 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| Hígado | 130 mg | 400 mL | 4 x | 400 mL |
| Riñón | 45 mg | 400 mL | 4 x | 200 mL |
| * Estos pesos son valores indicativos de tejido Obtenido de ratones P8. | ||||
| ** Estos volúmenes son indicaciones y pueden ajustarse más según el peso del tejido. | ||||
Tabla 1. Resumen de tejidos esperados pesos y recomendaciones correspondientes para lavados de PBS y el volumen de buffer de lisis para homogeneización. Los pesos son indicaciones para el tejido Obtenido de día postnatal 8 (P8) ratones. Volúmenes de tampón PBS y lisis se pueden escalar hacia arriba y hacia abajo según las necesidades experimentales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Con el diseño experimental adecuado, medidas de control y análisis estadístico, el borrar occidental puede utilizarse para hacer estimaciones cuantitativas fiables de expresión de la proteína dentro de y entre una gran variedad de muestras biológicas. El protocolo que se describe en el manuscrito actual pretende servir de guía para los investigadores que buscan para utilizar el Western blot para llevar a cabo análisis cuantitativo a través de grupos más grandes y más complejos de muestras, usando una combinación de fluorescencia métodos de detección, la carga de proteína total normalización y estándares internos. Aunque el foco aquí está en determinar y comparar la expresión de la proteína de los tejidos de ratón diferente y a diferentes edades, este enfoque puede ampliarse para comparar la expresión de proteínas en otras condiciones experimentales.
Un paso central en nuestro protocolo actual es la normalización de proteínas de interés para proteína total cargada mediante la cuantificación de una tinción fluorescente de la proteína total. Normalización de TPS corrige la variación de carga de muestra y márgenes de error en los métodos de cuantificación de proteína. Sin embargo, porque el número de muestras de proteínas que pueden analizarse en una sola membrana es a menudo limitado, más normalización se requiera comparar múltiples membranas. De hecho, variabilidad entre cómo las proteínas se detectan en diferentes membranas (debido a por ejemplo anticuerpo incubación tiempo o temperatura variación) puede causar variación más allá de a través de pasos carga y cuantificación del protocolo. Aquí, utilizamos un patrón interno que consiste en una mezcla de lisado de solo proteína que es cargado por triplicado en cada gel y permite la comparación y la normalización entre membranas de geles. Teóricamente, esto podría ser cualquier muestra de proteína, como se puede hacer en cantidades suficientes para que la misma muestra puede utilizarse para todos los experimentos. En nuestros experimentos, se utiliza una mezcla de lisados de la proteína del cerebro, como homogenados de cerebro contienen grandes cantidades de proteína y por lo general se obtienen en una alta concentración. Promedio de cuantificación del estándar por triplicado debe además aumentar la exactitud de las cuantificaciones a través de membranas y contribuyen a la reproducibilidad del experimento.
Niveles de proteína pueden ser determinados por un número de diversas técnicas y el método preferido depende del tipo de muestra se analiza y el objetivo del experimento. Cuantificación reproducible de Western blot funciona mejor en situaciones donde las condiciones experimentales pueden ser controladas, tales como Cuándo usar ratón u otros modelos animales de un fondo genético definido. Por el contrario, en muchos experimentos con muestras de pacientes humanas, esto puede ser menos factible, como edad, variabilidad genética y tiempos de toma de muestras de tejido son mucho más difíciles de controlar que en sistemas modelo (animal). Técnicas basadas en la placa como ELISA podrían ser más convenientes para estos análisis, aunque la validación cuidadosa de la especificidad del anticuerpo es crucial. Por ejemplo, en frágil X investigación síndrome anticuerpos se ha demostrado para detectar diferentes isoformas y cuando se utiliza ELISA esto daría lugar a la sobrestimación de la cantidad total de proteína como ELISA determina una señal para todos de isoformas combinado24. Opciones óptimas para los métodos determinar la expresión de la proteína por lo tanto, dependiendo del contexto, de la muestra tipo y la pregunta de investigación que está siendo investigada.
Realizar análisis estadístico adecuado es un requisito previo para la fiabilidad de las conclusiones extraídas de la cuantificación de los datos biológicos. Estadísticamente analizar datos complejos como generados mediante la comparación de diferentes tejidos, puntos de tiempo u otras condiciones experimentales y sus combinaciones pueden requerir que más avanzadas de modelado estadístico de ANOVA con prueba post-hoc puede ofrecer. Para modelos estadísticos más complejos, tales como los efectos mezclado del modelo enfoque se describe en el manuscrito actual, puede ser aconsejable buscar asesoramiento adicional de bioestadísticos. Análisis estadístico adecuado de expresión de proteínas a gran escala puede mejorar considerablemente la robustez de los resultados y la confiabilidad y reproducibilidad de los resultados.
En Resumen, el enfoque experimental que Describimos aquí proporciona un método reproducible y robusto para los investigadores que quieren determinar la expresión de la proteína usando mancha blanca /negra occidental en muestras complejas que permiten para responder a preguntas de investigación nuevo y apasionante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores tienen intereses que compiten a revelar.
Acknowledgments
E.J.N.G. es apoyado por el Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Otros fondos han sido facilitados por el SMA Trust (Consorcio de Reino Unido de SMA; T.H.G. & Y-T. H.), Europa de SMA (T.H.G, D.v.D.H. y E.J.N.G.), el DTP de la Universidad de Edimburgo en medicina precisión (T.H.G., L.L. & a.m.m.) y el centro de Euan MacDonald para la investigación de la enfermedad de neurona motora (T.H.G).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | -- | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, e2-7 (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), 196-198, 200-192 (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. Applied longitudinal analysis. , Wiley-Interscience. (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
