Summary
Denne artikel beskriver deuteriumoxid fortynding teknik i to pattedyr, en insektædende og kødædende, at bestemme samlede kropsvand, lean body mass, kropsfedt masse, og vandforbrug.
Abstract
Body condition scoring systemer og krop tilstand indekser er fælles teknikker, der anvendes til vurdering af sundhedsstatus eller egnethed af en art. Body condition scoring systemer er evaluator afhængige og har potentiale til at være meget subjektive. Body condition indekser kan confounded ved fouragering, virkningerne af kropsvægt, samt statistiske og inferentielle problemer. Et alternativ til kroppen betingelse scoring systemer og krop tilstand indekser bruger en stabil isotop såsom deuteriumoxid til at bestemme kroppens sammensætning. Deuteriumoxid fortynding metode er en repeterbar, kvantitativ teknik, der anvendes til at vurdere kroppens sammensætning hos mennesker, vilde dyr og indenlandske arter. Derudover kan deuteriumoxidfortyndingsteknikken anvendes til at bestemme vandforbruget for et enkelt dyr. Her beskriver vi tilpasningen af deuteriumoxidfortyndingsteknikken til vurdering af kropssammensætning i store brune flagermus (Eptesicus fuscus) og til vurdering af vandforbruget hos katte (Felis catis).
Introduction
Body condition scoring systemer og krop tilstand indekser er fælles teknikker, der anvendes til vurdering af sundhedsstatus eller egnethed af en art1,2. Mange indenlandske og zoologiske arter har unikke krop betingelse scoring (BCS) systemer, der bruges til at vurdere et dyrs muskel og overfladisk fedtvæv3. BCS's vurdering afhænger imidlertid af evaluatoren , hvilket betyder, at BCS er en objektiv eller semikvantitetmåling, når det vurderes af en uddannet evaluator. I vilde arter, er kroppen stilstand indekser almindeligt anvendt snarere end BCS og er baseret på et forhold mellem kropsmasse til kropsstørrelse eller kropsmasse til underarm2. Body tilstand indicis er ofte forvirret af virkningerne af fouragering og kan være forvirret af kroppens størrelse samt statistiske og inferentielle problemer4.
Et alternativ til kroppen betingelse scoring systemer og krop tilstand indekser bruger en stabil isotop til at bestemme kroppens sammensætning. En almindeligt anvendt stabil isotop er deuteriumoxid (D2O), en ikke-radioaktiv form for vand, hvor brintatomer er deuterium isotoper. Den deuteriumoxidfortyndingsmetode, der er beskrevet i denne undersøgelse, kan være en ikke-subjektiv, kvantitativ og repeterbar teknik, der anvendes til at estimere kropssammensætning hos mennesker5 og en bred vifte af arter4,6,7. Denne teknik kan være en fordel for at studere kroppens sammensætning i dyrelivet. For eksempel kan det bruges til at vurdere langsgående ændringer i kroppens sammensætning, såsom før og efter en ledelseshandling. Men i nogle vilde arter deuteriumoxid kan overvurdere det faktiske vandindhold8. Når teknikken tilpasses for en art, er det derfor vigtigt at validere metoden ved at sammenligne deuteriumoxidmetoden med slagtekroppens analyse for ikke-truede arter. For truede og truede arter bør en ikke-destruktiv metode såsom dobbelt røntgenabsorptiometri (DXA) betragtes som en alternativ sammenligningsmetode til den ødelæggende metode til fuldstændig slagtekroppen.
Ud over kroppens sammensætning kan D2O fortyndingsteknikken anvendes til at bestemme vandforbruget for et enkelt dyr9. Denne unikke anvendelse af D2O kan bruges til at besvare ikke kun forskningsspørgsmål, men kan være nyttig til vurdering af vandforbruget for de enkelte dyr(e) til huse i store sociale miljøer.
Her beskriver vi tilpasningen af D2O fortyndingsteknikken til vurdering af kropssammensætning i insektædende, store brune flagermus(Eptesicus fuscus),og til vurdering af vandforbruget i en kødædende, katte (Felis catis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter, der er beskrevet her, blev godkendt af University of Missouri Animal Care and Use Committee og udført under Missouri Department of Conservation (MDC) Wildlife Scientific Collection tilladelse (Tilladelse #16409 og #17649).
1. Forberedelse af steril, isotonisk, salineret D2O lageropløsning
- Lav en 50 ml lageropløsning på 9,0 g/L salineret D2O.
- Afveje 450 mg farmaceutisk kvalitet NaCl og overføre alle NaCl i en 100 ml, steriliseret bægerglas. Optag den nøjagtige mængde NaCl med 4 decimaler i den bærbare laboratorienotesbog.
- Ved hjælp af en steril gradueret cylinder måles 50 g ≥ 99,8% deuteriumoxid og overføres til det sterile bægerglas, der indeholder NaCl. Den nøjagtige mængde deuteriumoxid registreres med 4 decimaler i laboratorienotesbogen eller regnearket.
- Filtrer 10 ml isosmotisk styrke NaCl (9,0 g/L) gennem et ikke-pyrokogen sterilt diskfilter med submikronporer (0,2 μm).
- Fastgør en 20 G-nål til det ikke-pyrogene sterile diskfilter med submikronporer (0,2 μm) udstyret med en 10 ml sprøjtetønde. Indsæt i septum af en 100 ml steril tom hætteglas.
- Fastgør et vakuumrør til en 22 G-nål, og sæt nålen ind i skillevæggen i det 100 ml sterile tomme hætteglas.
- Hæld 10 ml af bestanden opløsning i sprøjten tønde. Tænd langsomt vakuum, indtil D2O-lageropløsningen langsomt filtreres ind i det sterile hætteglas. Fortsæt med at hælde D2O lageropløsningen i sprøjtetønden, indtil alle 50 ml filtreres.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at fortynde eller koncentrere stamopløsningen afhængigt af den krævede dosis. Dosis af D2O vil variere afhængigt af arten og analysemetodens følsomhed. For katte blev arbejdsopløsningen anvendt til at administrere en dosis på 0,7 g/kg D2O. Den ovenfor beskrevne bestandsopløsning minimerer mængden af NaCl-opløsning, der introduceres subkutant til dyret, samtidig med at dosis måles nøjagtigt. For små pattedyr såsom flagermus skal denne koncentration fortyndes til en arbejdsopløsning som 0,1600 g/ml. Denne koncentration gør det muligt at måle og administrere dosis på 0,75 g/kg D2O nøjagtigt i ca. 100 μL eller mindre NaCl-opløsning.
2. Forberedelse af steril, isotonisk, salineret D2O-lagerarbejdsopløsning til flagermus
- En 10 ml tom steril hætteglas vejes, og der registreres vægt til nærmeste 4 decimaler. Tare skala.
- Brug en 1,0 ml sprøjte til at overføre 0,65 ml af D2O-lageropløsningen til det tjærede, 10 ml tomme sterile hætteglas. Optag vægt på D2O til 4 decimaler. Tare skala.
- Beregn mængden af D2O i det tømuerede hætteglas på 10 ml. Brug følgende ligning.
hvor W registreres vægt og D er tætheden på 99,8% D2O (1,107 g/ml). - Brug den beregnede volumen og den kendte vægt af D2O til at bestemme mængden af isotonisk saltvand, der kræves for at gøre ~ 0,1600 g/ml arbejdsløsning.
- Indsæt i skillevæggen i det 10 ml sterile hætteglas, 22 G-nålen (fastgjort til vakuumrøret). Indsæt i skillevæggen i det 10 ml sterile hætteglas, 20 G-nålen (fastgjort til et 0,22 μm sprøjtefilter udstyret med en 10 ml sprøjtetønde).
- Hæld den beregnede masse/volumen af isotonisk NaCl i sprøjtetønden og tænd for vakuumet for at tillade et langsomt dryp i det sterile 10 ml hætteglas.
- Optag hætteglassets vægt, og sørg for, at der oprettes en arbejdsløsning på ~0,1600 g/ml.
3. Bestemmelse af kroppens sammensætning af store brune flagermus (Eptesicus fucsus) med D2O
BEMÆRK: Den lageropløsning af D2O, der anvendes i protokollen, er 0,1598 g/ml. Før der indsamles blod, skal du sørge for, at op til 200 μL blod fjernes , være ≤ 10 % af flagermusens samlede blodvolumen og er omfattet af Det Institutionelle Dyrepleje- og Brugsudvalgs (IACUC) fastsatte retningslinjer for blodtapning. Alle dyr skal fastgøres eller maven palperet for at sikre en tom mave. En nylig måltid kunne ændre dyrets vægt resulterer i forvirrede resultater, da beregninger til bestemmelse af kropsfedt stole på kroppen masse af dyret.
- Bedøve en stor brun flagermus.
- Brug 5,0% isofluran til induktion. Opretholde et stabilt plan af anæstesi ved hjælp af 0,5%−3,0% isofluran.
- Bestem korrekt anæstesidybde ved at teste pedalens tilbagetagelsesrefleks (klemme flagermusens tæer). Flagermusen bør ikke reagere på fornemmelsen, og respirationshastigheden bør forblive langsom og stabil. Juster isofluran efter behov for at opretholde et stabilt plan af anæstesi.
- Optag isofluranniveau, puls, respirationsfrekvens og andre oplysninger som krævet af IACUC.
- Afvej den store brune flagermus og registrere vægten til 4 decimaler.
- Rengør uropatagium (halemembranen) over interfemoral venen med en alkohol prep pad og lad det tørre. Påfør et tyndt lag af vaseline over interfemoral vene.
- Brug en 29 G nål til at punktere rygdelen af interfemoral venen og indsamle 100 μL blod ved hjælp af natriumheparin kapillær rør. Sørg for tilstrækkelig blanding af fuldblod med natriumheparinved forsigtigt at rulle hvert rør efter opsamling og mærke røret.
- Ved hjælp af en DXA maskine kalibreret til små pattedyr, få tre DXA scanninger af flagermus10.
- Massen (i g) af D2O bestemmes ved at multiplicere batvægten i kg med D2O-dosis på 0,75 g/kg. Mængden af den beregnede D2O dosis (V) bestemmes ved at dividere vægten af D2O-dosis med arbejdsopløsningens koncentration.
- Brug en insulinsprøjte med en 29 G-nål fastgjort til at optrække mængden af D2O beregnet. Veje D2O, insulin sprøjte, og nål. Optag til 4 decimaler.
- Injicer D2O subkutant over rygbenets dorsale hofteregion i det bedøvete flagermus.
- Tillad flagermus at komme sig efter anæstesi og registrere tidspunktet for injektion.
- Umiddelbart efter injektionen vejes den nu tomme insulinsprøjte med 29 G-nålen monteret. Optag vægten til 4 decimaler.
- Dosis af D2O injiceres ved at trække insulinsprøjtens efterinjektionsvægt fra den forinjektion D2O fyldte insulinsprøjte. Optag til 4 decimaler.
- Inden for 30 min post blodtapning, bruge en hæmatokrit centrifuge at spinde hver kapillær rør i 5 min. Hvis hæmatokritcentrifugen tillader flere hastigheder, skal du indstille til 10.000 x g.
- Brug en skarp saks til at skære plast kapillær rør mellem hele blod og plasma. Brug en 200 μL pipette til at udvise plasmaet direkte ind i et mærket 500 μL opbevaringsrør.
- Efter ækvilibreringsperioden indsamles yderligere 100 μL blod fra interfemoral venen.
BEMÆRK: Ækvilibreringsperioden varierer fra art til art, og hvis flagermusene går i torpor. For store brune flagermus er typisk 2 timer tilstrækkeligt til ækvilibreringsperioden. - Adskil plasma i et andet mærket, 500 μL mikrocentrifuge skrue top rør ved at gentage trin 3.13. Prøverne opbevares ved -20 °C eller koldere indtil analysen.
4. Fourier-transformerinfrarød spektrofotometrianalyse
- Indstil temperaturen i et sandbad til 60 °C for at lette destillation (tillade adskillelse af vand og D2O fra andre blodkomponenter).
- Pipette 50 μL af hver plasmaprøve og standard på indersiden af en 1,5 ml konisk mikrocentrifugerørhætte. Herunder standarder, der indeholder kendte koncentrationer af D2O som kvalitetskontrol.
BEMÆRK: Ideelt set hvert dyr vil have tre replikater pr prøve og gennemsnittet af de tre replikater rapporteret. På grund af den begrænsede prøvemængde og den mængde prøve, der kræves til FT-IR-udstyret, der anvendes af forfatterne, blev der ikke udført replikater for flagermusprøverne. Hvis en prøve indeholder mindre end 50 μL plasma, pipette prøven mængden på den koniske mikrocentrifuge rør hætte og registrere volumen. - Hold mikrocentrifugehætten på hovedet, og skru det 1,5 ml koniske mikrocentrifugerør på hætten. Anbring det omvendte (på hovedet) rør med hætten i kontakt med sandet i sandet bad i mindst 12 timer (natten over).
- Efter 12 timer skal du fjerne hætten og udskifte med en ny, ren hætte. Pulse mikrocentrifugerøret i 10 s i en centrifuge.
- Opret følgende standarder: 0 ppm (0 mg D2O i 1 L destilleret vand), 293 ppm (293 mg D2O i 1 L destilleret vand), 585 ppm (585 mg D2O i 1 L destilleret vand), 878 ppm (878 mg D2O i 1 L destilleret vand) og 1170 ppm D2O (1170 mg D2O i 1 L destilleret vand).
BEMÆRK: Ovenstående værdier foreslås for en standardkurve. Alternative værdier som 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, og så videre kan bruges. - Installer en flydende transmissionscelle i fourier-transformeret infrarød spektrofotometri (FTIR) spektrometer(Materialetabel). Fyld cellen med methanol, og tilslut injektionsporten. Fyld langsomt cellen med baggrundsvand, mens methanolsprøjten fjernes omhyggeligt for at reducere risikoen for luftbobler. Fastgør slangen til udgangsporten for at gøre det muligt at fjerne prøverne efter analysen.
- Forbered FTIR spektrometer software (Tabel over materialer) til analyse af D2O i vand. Parameterindstillingerne for den spektrometersoftware , der bruges i denne protokol , er angivet i tabel 1.
- Der opsamles en baggrundsprøve ved hjælp af fortyndingsglasset, 0,22 μm filtreret, destilleret vand. Dette bør være det samme vand, der anvendes til standarderne.
- Tilsprøjt 40 μL af 0 ppm D2O, og spektreregistreres. Gem spektresom en CSV-fil (comma separate d.).
- Fortsæt med at injicere og gemme spektre af alle standarder for at skabe en standard kurve.
- Gentag baggrunden og standardkurven hver 60-90 min.
- Tilsprøjt 40 μL af hver destilleret prøve i væsketransmissionscellen, og spektrene gemmes.
BEMÆRK: Ændre injektionsvolumenet af standarder og destilleret prøver baseret på mængden af flydende transmissionscelle. Brug en mindre volumenvæsketransmissionscelle, hvis prøvevolumenet er under 40 μL eller fortyndes 1:1 med baggrundsdestilleret vand. - Koncentrationen af D2O for hver prøve fra FTIR-spektreveden ved hjælp af et regnearksprogram som beskrevet af Jennings et al.11 eller spektralsoftwaren. Når replikater udføres, skal du bruge den gennemsnitlige koncentration til at beregne kropssammensætningen.
5. Beregning af kroppens sammensætning
- Deuteriumberigelsen (ppm) omregnes til atomprocentkoncentrationen for hver prøve ved hjælp af følgende ligning12:
hvor x er den målte deuteriumberigelse (ppm) af prøven og 0,0001557 er mole fraktion af deuterium rapporteret i Wien Standard Mean Ocean Water (VSMOW)13. - Beregne stã ̧rrelig vand i kroppen for hver prøve ved hjà ̧sningaffoelgende ligning 4,12,14:
)
hvor E er den målte berigelse (atom%) af deuterium i prøven efter baggrundskorrektion, B er injektionsmassen i g, og 0,998 er koncentrationen af injiceret D2O.
BEMÆRK: Deuterium udveksling med labilbrintforårsager en 2% overvurdering af den samlede kropsvandmasse. Samlet vand i kroppen bør korrigeres ved at reducere det samlede skøn over kropsvandsmasse med 2 % af kropsvægten. - Anslå fedtfri masse (lean body mass og alle andre fedtfri komponenter) af hver flagermus ved hjælp af følgende ligning:
BEMÆRK: Brug den konventionelt accepterede værdi på 0,732 til det fraktionerede vandindhold i lean body mass for sunde, euhydrerede, ikke-ammende flagermus. Den fraktioneret fugt indholdet af fedtfri masse kan ændre sig i ammende store brune baseret på post-partum uge15. For andre arter, bruge de værdier, der offentliggøres i litteraturen eller bestemme fraktioneret fugt indhold af lean body mass før udfører beregninger af lean body mass. - Anslå kropsfedt masse ved hjælp af følgende ligning:
- Konverter kropsfedt masse i g til procent kropsfedt masse ved hjælp af følgende ligning:
)
6. Bestemmelse af vandsammensætning i en kødædende (Felis catus, tamkat)
- Klargør lageropløsningen som beskrevet i afsnit 1.
- Hver kat vejes til de nærmeste 3 decimaler og rekordvægt. Dosis for hver kat beregnes som beskrevet i trin 3.6 ved hjælp af en D2O-dosis på 0,70 g/kg.
- Gør hver dosis klar som beskrevet i trin 3.7−3.8. ved hjælp af en 3 ml eller 5 ml sprøjte med en 22 G-nål i stedet for en insulinsprøjte.
- 500 μL fuldblod og derefter subkutant genanskføres 0,7 g/kg D2O. Centrifugefuldblod ved 2.000 x g i 15 min og opbevar plasma i 1,5 ml mikrocentrifugeskruetoprør ved -20°C indtil analysen.
- Opsaml 500 μL fuldblod 4 timer efter injektionen. Centrifuger fuldblod ved 2.000 x g i 15 min og opbevarplasma i 1,5 ml mikrocentrifugeskruetoprør ved -20 °C indtil analyse.
- Opsaml 500 μL fuldblod 14 dage efter injektionen. Centrifuger fuldblod ved 2.000 x g i 15 min og opbevarplasma i 1,5 ml mikrocentrifugeskruetoprør ved -20 °C indtil analyse.
BEMÆRK: Antallet af dage mellem blodtapningen kan baseres på forsøgsbehovene og perioden efter injektionen, hvor D2O kan påvises over baggrundsniveauerne. Fjorten dage var længden af kosten behandling blokke fra Hooper et al.9. - Udfør FT-IR-analyse i henhold til afsnit 4, og beregn kropssammensætningen i henhold til afsnit 5 i denne protokol.
- Vandforbruget beregnes i mL/dag ved hjælp af følgende ligninger:
hvor TBW er totalt vand i kroppen, første D2O og endelig D2O, er de koncentrationer, der måles i ppm i de Post-injection D2O-prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deuteriumoxidfortyndingsteknikken kan anvendes til at vurdere kroppens sammensætning af en række forskellige arter. For at demonstrere tilpasningsevnen, vi rapporterer den første brug af deuterium oxid fortynding teknik i en nordamerikansk insektædende flagermus arter, Eptesicus fuscus, den store brune flagermus for repræsentative resultater. Et tidsplateau blev afsluttet ved at tage blodprøver før og efter D2O, som det skal gøres med enhver art, hvor ækvilibreringsperioden er ukendt. Det blev fastslået, at to timer efter injektion i ikke-torpid flagermus var tilstrækkelig til ligevægt. Med ligevægt tid kendt, den samlede kropsvand, lean body mass, og kropsfedt masse for 13 vildtfangede store brune flagermus og 8 fangenskab store brune flagermus blev bestemt(Tabel 2). Yderligere 2 vildtfangede store brune flagermus og 5 fangenskab store brune flagermus var fast besluttet på at have en negativ kropsfedt masse. En negativ kropsfedtmasse beregnes på grund af en eller flere af følgende årsager: ikke at modtage hele dosis af deuteriumoxid, bliver torpid i ligevægtsfasen, med unormalt store fedtmasser og minimal lean masse, eller flagermus med under 3%-5% kropsfedt som bestemmes af DXA (Tabel 3).
Hvidnæsesyndrom har forårsaget mange flagermusarter til at falde, så teknikken blev sammenlignet med kropsfedt målt ved hjælp af DXA. Figur 1 viser den procentdel af kropsfedt bestemt ved D2O fortyndingsteknikken og DXA (n = 19). De to teknikker var godt korreleret med en Pearson's r = 0,897 (figur 2) og var ikke statistisk forskellige (envejsanalyse af varians (ANOVA), F-værdi = 0,366, p = 0,549). Kropsfedtviste stærke sammenhænge mellem kropsfedt og kropsvægt (Figur 3). D2O fortynding ser ikke konsekvent over eller undervurderede kropsfedtmassen.
Deuteriumoxidmetoden er tidligere blevet valideret hos katte16. Tabel 4 viser et eksempel på den samlede kropsvand, lean body mass, og kropsfedt masse af en enkelt kat9. Hooper et al.9 var den første til at indberette brugen af deuteriumoxidfortynding til at måle vandforbruget for socialt opstalde dyr med det daglige vandforbrug af kattene under hver kostblok i forsøget, som vist i figur 4.
Figur 1: Deuteriumoxid og DXA linje plot. Hvert punkt repræsenterer kropsfedt procent af en individuel flagermus som bestemt af DXA eller deuteriumoxid. Gennemsnitet er det lysegrønne punkt med fejlbjælker, der angiver standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Procentdel af kropsfedt i store brune flagermus. Afdugningsregression (solid blue line, Pearsons r = 0,897) og sammenligner procentdelen af kropsfedt bestemt af DXA (x-akse, referencemetoden) og procentdelen af kropsfedt bestemt af deuteriumoxid (y-akse, testmetoden) i store brune flagermus med 95% konfidensintervaller, der er angivet ved grå skygge. Den tegnede grøn streg-identitetslinje repræsenterer regressionslinjen, når metoderne er ens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Procentdel af kropsfedt i store brune flagermus sammenlignet med kropsvægt. Kropsvægt en flagermus plottet mod kropsfedt procent bestemt af D2O eller DXA. En stærk sammenhæng mellem kropsvægt og kropsfedt som bestemt af DXA (mørkeblå linje, Pearson's r = 0,88) og D2O (blå linje, Pearson's r = 0,86). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vandforbrug af socialt opstalde katte. Repræsentative resultater af det daglige vandforbrug af socialt opstalde katte under et eksperiment, der evaluerer kostbestanddeles virkninger på vandforbruget. Dette tal er blevet ændret fra Hooper et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parameter | Indstilling |
| Antal scanninger | 64 |
| Opløsning | 2 |
| Dataafstand | 0,946 cm-1 |
| Endeligt format | Absorbans |
| Korrektion | Ingen |
| Bruge faste Y-aksegrænser i samlingsvinduet | Min -0,01, Max 0,03 |
| Bænkrækkevidde | Max 6.38, Min -5.02, Loc 1024 |
| Totalabsorberende topfølsomhed | 50 |
| frynser eller kanaliseringsfølsomhed | 80 |
| Afledte toppe sensativitet | 51 |
| Følsomhed for oprindelig fejl | 50 |
| CO 2-niveaufølsomhed | 19 |
| H2O niveauer følsomhed | 19 |
| Apodiseringstilstand | Happ-Genzel delte et hold op |
| Fasekorrektion | Mertz |
| Filtre, der er indstillet baseret på | Hastighed |
| filter for lavt gennemløb | 11,000 |
| høj pas filter | 20 |
Tabel 1: Indstillinger for spektral software. Parameterindstillinger, der bruges til spektraloptagelsessoftware.
| Dyr | Arter | Kropsvægt (kg) |
D2O injiceret g) |
Samlet vand i kroppen g) |
Lean kropsmasse g) |
Kropsfedt masse g) |
Kropsfedt masse (%) |
DXA lean + bmc g) |
DXA fedt g) |
DXA fedt (%) |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.01715 | 0.0740 | 11.80 | 16.15 | 1.00 | 5.80 | 14.65 | 0.75 | 4.80 |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.01950 | 0.0920 | 13.80 | 18.83 | 0.69 | 3.50 | 16.20 | 1.40 | 7.90 |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.01677 | 0.08 | 11.33 | 15.47 | 1.30 | 7.74 | 11.33 | 1.30 | 7.74 |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.02129 | 0.097 | 12.51 | 17.09 | 4.20 | 19.7 | 15.9 | 19.65 | 19.2 |
Tabel 2: Kropssammensætning af store brune flagermus. De repræsentative resultater af total kropsvand, lean body mass, og kropsfedt som bestemt af deuteriumoxid fortynding i store brune flagermus er vist i kolonne 5−8. Repræsentative resultater af den magre kropsmasse plus knoglemineralindhold og kropsfedt som bestemt af DXA i de samme store brune flagermus er vist i kolonner 9−11.
| Dyr | Arter | Kropsvægt (kg) |
D2O injiceret g) |
Samlet vand i kroppen g) |
Lean kropsmasse g) |
Kropsfedt masse g) |
Kropsfedt masse (%) |
DXA lean + bmc g) |
DXA fedt g) |
DXA fedt (%) |
Kommentar |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.0277 | 0.1299 | 34.18 | 46.69 | -19.02 | -68.74 | 9.90 | 26.55 | 62.80 | Ækviminer-bration tid utilstrækkelig |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.0185 | 0.0810388 | 64.23 | 87.75 | -69.25 | -374.33 | 14.20 | 17.30 | 17.95 | Fuld dosis ikke injiceres |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.0164 | 0.0719 | 17.38 | 23.74 | -7.33 | -44.68 | 14.15 | 14.40 | 1.70 | Mindre end 3% fedt |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.0212 | 0.0994 | 54.57 | 74.54 | -53.37 | -252.0 | 16.41 | 19.01 | 13.65 | Bat blev torpid (cool at røre) |
Tabel 3: Kropssammensætning af store brune flagermus. Repræsentative resultater fra flagermus, der ikke fik hele dosis af deuteriumoxid, blev torpid under ligevægtsfasen, flagermus med unormalt stor fedtmasse og minimal lean masse, eller flagermus under 3%−5% kropsfedt som bestemmes af DXA. De repræsentative resultater af total kropsvand, lean body mass, og kropsfedt som bestemt af deuteriumoxid fortynding er vist i kolonne 5−8. Repræsentative resultater af den magre kropsmasse plus knoglemineralindhold og kropsfedt som bestemt af DXA er vist i kolonne 9−11.
| Blok | Arter | Kropsvægt (kg) |
D2O injiceret g) |
Samlet vand i kroppen (kg) |
Lean kropsmasse (kg) |
Kropsfedt masse (kg) |
Kropsfedt masse (%) |
Dagligt vandforbrug (mL/dag) |
Behandling i kosten |
| 1 | Felis Catus | 4.830 | 3.36 | 2.69 | 3.68 | 1.149 | 23.8 | 96.8 | Kontrol |
| 2 | Felis Catus | 4.764 | 3.45 | 2.66 | 3.63 | 1.136 | 23.8 | 217.5 | Høj fugt |
| 3 | Felis Catus | 4.727 | 3.25 | 2.50 | 3.41 | 1.314 | 27.8 | 125.1 | Høj selen |
Tabel 4: Kropssammensætning og vandforbrug i en enkelt kat. Repræsentative resultater af deuteriumoxid dilutional teknik til vurdering af lean body mass, fedtmasse, og vandforbrug af en kat på tre forskellige tidspunkter i løbet af undersøgelsen foretaget af Hooper et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af deuteriumoxid til bestemmelse af TBW har været anvendt siden 1940'erne17 og anvendes til mennesker og en række tam- og dyrearter4,6,7. Andre ikke-destruktive teknikker er blevet udviklet, herunder bioelektrisk impedansanalyse (BIA), DXA og kvantitativ magnetisk resonans (QMR). Hver metode har fordele og ulemper, der bør overvejes, før der vælges en bestemt metode til vurdering af kroppens sammensætning. Denne protokol valgt at bruge DXA som en sammenligning metode til deuteriumoxid til at vurdere kroppens sammensætning, fordi udstyret er tilgængelig som en kerne universitet ressource med minimale omkostninger, minimal tid er påkrævet pr scanning (30 s pr bat), og det er ikke følsomme over for variabler såsom kropstemperatur og hudisolering.
Ved tilpasning af deuteriumoxidfortyndingsteknikken til en art af interesse bør der indledes en pilotundersøgelse for at bestemme den tid, der kræves for ligevægt18. Dette kan gøres ved at tage en baggrundsprøve, og en blodprøve hvert 15 minutter efter injektion. For små arter som flagermus, kan flere flagermus blive blødt på de forskellige tidsintervaller i stedet for et enkelt dyr18. Den ligevægt tid kan ændre sig, når dyr, såsom flagermus, gå ind i torpor, hvilket forklarer, hvorfor nogle af vores dyr havde en negativ procent kropsfedt(Tabel 3). Hvis der opnås et negativt percentkropsfedt, og deuteriumdosis havde tilstrækkelig tid til fuldt ud at ligeudkalibrere med dyrets kropsvand, er det sandsynligt, at dosis ikke blev injiceret helt. Da deuteriumoxidfortyndingsteknikken er meget afhængig af, at den fulde dosis administreres, og nøjagtig registrering af mængden af deuterium injiceres, bør denne teknik kun udfyldes af personer, der er dygtige til at udføre injektioner. Derudover kan bedøvelse eller bedøvende dyr hjælpe med at sikre, at hele dosis kan administreres.
Ved administration af deuteriumoxid er det vigtigt at bestemme en passende koncentration til at administrere dyret. Ved hjælp af en dosis på 0,7 g/kg til kattene var koncentrationen af bestandenopløsning passende, mens en dosis på 0,75 g/kg for de store brune flagermus krævede, at bestanden opløsning af deuteriumoxid fortyndes. Ved fortynding af lageropløsningen bør der anvendes en isotonisk opløsning som 0,9 % NaCl. For at undgå at ændre det samlede kropsvand for små pattedyr fortyndes dosis af deuteriumoxid så minimalt som muligt, lige nok til at sikre, at dosis kan måles nøjagtigt.
De doser, der præsenteres her, kan påvises ved hjælp af FTIR-spektrometri. FTIR spektrometri er billigere og lettere at vedligeholde, men ikke så følsom som isotop forholdet masse spektrometri (IRMS)19,20. FTIR-spektrometri kan anvendes til måling af deuteriumberigelse i plasma og spyt, men det anbefales ikke at bruge en FTIR-transmissionscelle til at analysere deuteriumberigelse i urin19. Hvis urin er den ønskede prøvetype, bør der anvendes en svækket totalrefleksion (ATR) med FTIR eller IRMS til vurdering af deuteriumberigelse til beregning af TBW19.
Desuden var de doser, der blev anvendt til kattene, tilstrækkelige til at gøre det muligt at påvise deuteriumoxid 14 dage efter injektionen. Da koncentrationen af deuteriumoxid 14 dage efter injektionen kunne påvises, kunne kattenes vandforbrug beregnes (figur 4). Denne innovative anvendelse af deuteriumoxid kan anvendes i feltundersøgelser til måling af omsætning af kropsvand for arter med høje genindfangningsrater eller til dyr, der er anbragt i grupper i ex situ- eller laboratorieundersøgelser. Men før de ansættes i feltundersøgelser, skal forskerne vurdere, om dyret kan fanges og opbevares i hele ækvilibreringsperioden. Denne forlængede håndteringsperiode er en af ulemperne ved deuteriumoxidteknikken og kan være problematisk, da mange truede arter tillader at begrænse varigheden af et bestemt dyr. Derudover kan dyr ikke for nylig have spist, da udvaskningsteknikken afhænger af måling en kropsmasse. Derfor kan et nyligt måltid forvirre resultaterne. Et yderligere hensyn er, om et dyr skal bedøves eller bedøves til subkutan injektion og blodtapninger, eller om dyret kan holdes tilbage uden sedation/anæstesi. Det er blevet foreslået , at hastigheden af omsætningen af vand i kroppen kan være en væsentlig indikator for menneskers sundhed21. Det øgede vandforbrug i kat 5 (figur 4) blev dokumenteret, før traditionelle biokemiske mærker af nyresvigt, og koncentrationerne af kreatinin og blodurinstofnitrogen (BUN) blev forhøjet, hvilket tyder på, at kropsvandsomsætningen også kunne være en sundhedsindikator hos dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af MDC Cooperative Agreement (#416), US Forest Service Cooperative Agreement (16-JV-11242311-118), American Academy of Veterinary Nutrition og Waltham/Royal Canin, USA Grant (tilskudsnummer: 00049049), NIH-uddannelsestilskud (tilskudsnummer: T32OS011126) og University of Missouri Veterinary Research Scholars Program. Forfatterne takker Shannon Ehlers for at gennemgå dette manuskript på forhånd. Vi takker Dr. Robert Backus for at give D2O standarder og tillade brug af hans laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 micron non-pyrogenic disk filter | Argos Technologies | FN32S | nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile |
| 1.5 mL conical microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-9701 | 1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap |
| 10 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | MS-SEV10 | clear, sterile glass injection unit |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | sterile 10 mL syringe individually wrapped |
| 100 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | AL-SV10020 | clear, sterile glass injection unit |
| 20 gauge needle | Exel | 26417 | needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel |
| 22 gauge needle | Exel | 26411 | needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel |
| deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-25G | 99.9 atom % D |
| isofluorane | Vetone | 3060 | fluriso isoflurane, USP |
| OMNIC Spectra Software | ThermoFisher Scientific | 833-036200 | FT-IR standard software |
| petroleum jelly | Vaseline | 305212311006 | Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant |
| plastic capillary tubes | Innovative Med Tech | 100050 | sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length |
| Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell | International Crystal Laboratory | 0005D-875 | 0.05 mm Pathlength |
| sodium chloride | EMD Millipore | 1.37017 | suitable for biopharmaceutical production |
| Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer | ThermoFisher Scientific | 269-169400 | discontinued model, newer models available |
References
- Schiffmann, C., Clauss, M., Hoby, S., Hatt, J. M. Visual body condition scoring in zoo animals – composite, algorithm and overview approaches. Journal of Zoo Aquarium Research. 5 (1), (2017).
- Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
- Bissell, H. Body Condition Scoring Resource Center. , https://nagonline.net/3877/body-condition-scoring/ (2017).
- McWilliams, S. R., Whitman, M. Non-destructive techniques to assess body composition of birds: a review and validation study. Journal of Ornithology. 154 (3), 597-618 (2013).
- Lukaski, H. C., Johnson, P. E. A simple, inexpensive method of determining total body water using a tracer dose of D2O and infrared absorption of biological fluids. American Journal of Clinical Nutrition. 41 (2), 363-370 (1985).
- Chusyd, D. E., et al. Adiposity and Reproductive Cycling Status in Zoo African Elephants. Obesity (Silver Spring). 26 (1), 103-110 (2018).
- Kanchuk, M. L., Backus, R. C., Calvert, C. C., Morris, J. G., Rogers, Q. R. Neutering Induces Changes in Food Intake Body Weight, Plasma Insulin and Leptin Concentrations in Normal and Lipoprotein Lipase–Deficient Male Cats. The Journal of Nutrition. 132 (6), 1730S-1732S (2002).
- Eichhorn, G., Visser, G. H. Technical Comment: Evaluation of the Deuterium Dilution Method to Estimate Body Composition in the Barnacle Goose: Accuracy and Minimum Equilibration Time. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (4), 508-518 (2008).
- Hooper, S. E., Backus, R., Amelon, S. Effects of dietary selenium and moisture on the physical activity and thyroid axis of cats. Journal of Animal Physiolgy and Animal Nutrition (Berl). 102 (2), 495-504 (2018).
- Stevenson, K. T., van Tets, I. G. Dual-Energy X-Ray Absorptiometry (DXA) Can Accurately and Nondestructively Measure the Body Composition of Small, Free-Living Rodents. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (3), 373-382 (2008).
- Jennings, G., Bluck, L., Wright, A., Elia, M. The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces. Clinical Chemistry. 45 (7), 1077-1081 (1999).
- Beuth, J. M. Body Composition, movemement phenology and habitat use of common eider along the southern new england coast. Master of Science in Biological and Environmental Sciences (MSBES) thesis. , University of Rhode Island. (2013).
- Coplen, T. B., Hopple, J., Peiser, H., Rieder, S. Compilation of minimum and maximum isotope ratios of selected elements in naturally occurring terrestrial materials and reagents. U.S. Geological Survey Water-Resources Investigations Report 01-4222. , (2002).
- Karasov, W. H., Pinshow, B. Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site. Physiological Zoology. 71 (4), 435-448 (1998).
- Hood, W. R., Oftedal, O. T., Kunz, T. H. Variation in body composition of female big brown bats (Eptesicus fuscus.) during lactation. Journal of Comparative Physiology B. 176 (8), 807-819 (2006).
- Backus, R. C., Havel, P. J., Gingerich, R. L., Rogers, Q. R. Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase Fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats. American Journal of Veterinary Research. 61 (7), 796-801 (2000).
- Moore, F. D. Determination of Total Body Water and Solids with Isotopes. Science. 104 (2694), 157-160 (1946).
- Voigt, C., Cruz-Neto, A. Ecological and Behavioral Methods in the Study of Bats. Parsons, S., Kunz, T. H. , John Hopkins University Press. Ch. 30 621-645 (2009).
- International Atomic Energy Agency. Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques. , (2009).
- International Atomic Energy Agency. Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (2011).
- Shimamoto, H., Komiya, S. The Turnover of Body Water as an Indicator of Health. Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).
