Summary
Bu makalede, toplam vücut suyu, yağsız vücut kütlesi, vücut yağ kütlesi ve su tüketimini belirlemek için iki memeli, bir böcekçil ve etobur döteryum oksit seyreltme tekniği açıklanmaktadır.
Abstract
Vücut durumu puanlama sistemleri ve vücut durumu endeksleri bir türün sağlık durumunu veya uygunluğunu değerlendirmek için kullanılan yaygın tekniklerdir. Vücut durumu puanlama sistemleri değerlendirici bağımlı ve son derece öznel olma potansiyeline sahip. Vücut durumu endeksleri yem leme ile şaşırttı olabilir, vücut ağırlığının etkileri, yanı sıra istatistiksel ve inferential sorunlar. Vücut durumu puanlama sistemleri ve vücut durumu endeksleri için bir alternatif vücut kompozisyonunu belirlemek için döteryum oksit gibi istikrarlı bir izotop kullanıyor. Döteryum oksit seyreltme yöntemi, insanlarda, yaban hayatı ve evcil türlerde vücut kompozisyonu tahmin etmek için kullanılan tekrarlanabilir, nicel bir tekniktir. Ayrıca, döteryum oksit seyreltme tekniği bireysel bir hayvanın su tüketimini belirlemek için kullanılabilir. Burada, büyük kahverengi yarasalarda(Eptesicus fuscus)vücut kompozisyonunun döteryum oksit seyreltme tekniğinin uyarlanması ve kedilerdeki su tüketiminin(Felis catis)değerlendirilmesinde açıklanmıştır.
Introduction
Vücut durumu puanlama sistemleri ve vücut durumu endeksleri bir türün sağlık durumunu veya uygunluğunu değerlendirmek için kullanılan yaygın tekniklerdir1,2. Birçok yerli ve zoolojik türler bir hayvanın kas ve yüzeysel yağ dokusu değerlendirmek için kullanılan benzersiz vücut durumu puanlama (BCS) sistemleri var3. Ancak, BCS değerlendirmesi, bcs'nin eğitimli bir değerlendirici tarafından değerlendirildiğinde nesnel veya yarı nicel bir ölçüm olduğu anlamına gelen değerlendiriciye dayanır. Yaban hayatı türlerinde, vücut durumu endeksleri yaygın olarak BCS yerine kullanılır ve vücut kütlesinin vücut büyüklüğüne veya vücut kütlesine oranının 2'yiönkolagöre temel alınabıdır. Vücut durumu indicis genellikle yem etkileri ile şaşkın ve vücut büyüklüğü yanı sıra istatistiksel ve inferential sorunlar4tarafından şaşkın olabilir.
Vücut durumu puanlama sistemleri ve vücut durumu endeksleri için bir alternatif vücut kompozisyonu belirlemek için istikrarlı bir izotop kullanıyor. Yaygın olarak kullanılan kararlı izotoplardan biri, hidrojen atomlarının döteryum izotopları olduğu radyoaktif olmayan bir su formu olan döteryum oksittir (D2O). Bu çalışmada açıklanan döteryum oksit seyreltme yöntemi insanlarda vücut kompozisyonu tahmin etmek için kullanılan öznel olmayan, nicel ve tekrarlanabilir bir teknik olabilir5 ve türlerin geniş bir yelpazede4,6,7. Bu teknik yaban hayatı vücut kompozisyonu çalışma için avantajlı olabilir. Örneğin, bir yönetim eyleminden önce ve sonra olduğu gibi gövde kompozisyonundaki uzunlamasına değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Ancak, bazı yaban hayatı türlerinde döteryum oksit gerçek su içeriği8abartabilir. Bu nedenle, bir tür için tekniği adapte ederken, nesli tükenmekte olmayan türler için karkas analizi döteryum oksit yöntemi karşılaştırarak yöntemi doğrulamak önemlidir. Tehdit altındaki ve nesli tükenmekte olan türler için, çift x-ışını emilimi (DXA) gibi tahribatsız bir yöntem, tam karkas analizinin altın standart yıkıcı yöntemine alternatif bir karşılaştırma yöntemi olarak düşünülmelidir.
Vücut kompozisyonuna ek olarak, D2O seyreltme tekniği tek bir hayvanın su tüketimini belirlemek için kullanılabilir9. D2O'nun bu benzersiz uygulaması sadece araştırma sorularını yanıtlamak için değil, aynı zamanda büyük sosyal ortamlarda barındırılan hayvan(lar)ın su tüketimini değerlendirmek için de kullanılabilir.
Burada, bir böcekçil, büyük kahverengi yarasalar(Eptesicus fuscus)vücut kompozisyonu değerlendirmek için D2O seyreltme tekniğinin adaptasyon tarif ve bir etobur su tüketimini değerlendirmek için, kediler(Felis catis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm deneyler Missouri Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve Missouri Koruma Bölümü (MDC) Yaban Hayatı Bilimsel Toplama izni (İzin #16409 ve #17649) altında yürütüldü.
1. Steril, İzotonik, tuzlu D2O stok çözeltisinin hazırlanması
- 9.0 g/L tuzlu D2O 50 mL stok çözeltisi yapın.
- 450 mg farmasötik kalite NaCl ağırlığında ve tüm NaCl'i 100 mL,sterilize edilmiş bir kabın içine aktarın. Laboratuvar defterine 4 ondalık basamak için Tam NaCl miktarını kaydedin.
- Steril bir silindir kullanarak, 50 g ≥ 99.8% döteryum oksit ölçün ve NaCl içeren steril kabına aktarın. Döteryum oksitin tam miktarını laboratuvar not defterine veya elektronik tablosuna 4 ondalık basamak olarak kaydedin.
- Filtre 10 mL izosmotik mukavemet NaCl (9.0 g/L) submikron gözenekleri (0.2 m) ile pirojenik olmayan bir steril disk filtresi ile.
- 10 mL şırınga namlusu yla donatılmış mikron altı gözeneklere (0,2 m) sahip pirojenik olmayan steril disk filtresine 20 G iğne takın. 100 mL steril boş şişenin septumuna yerleştirin.
- Bir vakum tüpünü 22 G iğneye takın ve iğneyi 100 mL steril boş şişenin septumuna takın.
- Stok çözeltisinin 10 mL'sini şırınga namlunun içine dökün. D2O stok çözeltisi steril şişeye yavaşça filtre uygulamaya başlayana kadar vakumu yavaşça açın. 50 mL'nin tamamı süzülene kadar D2O stok çözeltisini şırınga namlunun içine dökmeye devam edin.
NOT: Stok çözeltisinin gerekli doza bağlı olarak seyreltilmesi veya konsantre edilmesi gerekebilir. D2O'nun dozu türe ve analitik yöntemin hassasiyetine göre değişir. Kediler için çalışma solüsyonu 0.7 g/kg D2O dozunun verilmesinde kullanıldı. Yukarıda açıklanan stok çözeltisi, hayvana deri altına getirilen NaCl çözeltisi miktarını en aza indirirken dozun doğru ölçülmesine izin verir. Yarasalar gibi küçük memeliler için bu konsantrasyon 0,1600 g/mL gibi bir çözeltiye seyreltilmelidir. Bu konsantrasyon 0.75 g/kg D2O dozunun doğru bir şekilde ölçülmesine ve yaklaşık 100 μL veya daha az NaCl çözeltisinde uygulanmasına olanak sağlar.
2. Yarasalar için steril, İzotonik, tuzlu D2O stok çalışma çözeltisinin hazırlanması
- 10 mL boş steril şişeyi tartın ve en yakın 4 ondalık basamakiçin rekor ağırlık. Tare ölçeği.
- 0,65 mL D2O stok çözeltisinin katranlı, 10 mL boş steril şişeye aktarılması için 1,0 mL şırınga kullanın. D 2 Oile4 ondalık basamakların rekor ağırlığı. Tare ölçeği.
- 10 mL boş şişedeki D2O'nun hacmini hesaplayın. Aşağıdaki denklemi kullanın.
W'nin ağırlık ve D'nin %99,8 D2O (1,107 g/mL) yoğunluğu olduğu durumlarda. - ~0,1600 g/mL çalışma çözeltisi yapmak için gereken İzotonik tuzlu nun hacmini belirlemek için Hesaplanan hacmi ve D2O'nun bilinen ağırlığını kullanın.
- 10 mL steril şişenin septumuna, 22 G iğneye (vakum tüpüne bağlı) yerleştirin. 10 mL steril şişenin septumuna, 20 G iğneye (10 mL şırınga namlusuyla donatılmış 0,22 m şırınga filtresine takılı) yerleştirin.
- Hesaplanan kozotonik NaCl kütlesini/hacmini şırınga namlunun içine dökün ve steril 10 mL şişeye yavaş bir damla izin vermek için vakumu açın.
- Şişenin ağırlığını kaydedin ve ~0,1600 g/mL çalışma çözeltisi oluşturulduğundan emin olun.
3. D2O ile büyük kahverengi yarasaların(Eptesicus fucsus)vücut kompozisyonunun belirlenmesi
NOT: Protokolde kullanılan D2O'nun stok çözeltisi 0.1598 g/mL'dir. Kan toplamadan önce, 200 μL'ye kadar kan çıkarmanın yarasanın toplam kan hacminin ≤%10'u olduğundan ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) kan toplama için belirlediği kılavuzlar dahilinde olduğundan emin olun. Tüm hayvanlar aç karnına oruç tutmalıdır veya karın palpe edilmelidir. Yeni bir yemek, vücut yağlarını belirlemek için yapılan hesaplamalar hayvanın vücut kütlesine dayandığı için hayvanın ağırlığını değiştirebilir ve bu da şaşkın sonuçlara yol açabilir.
- Büyük kahverengi bir yarasayı büyüt.
- İndüksiyon için %5.0 isofluran kullanın. %0.5−%3.0 isofluran kullanarak kararlı bir anestezi düzlemini koruyun.
- Pedal çekilme refleksini test ederek (yarasanın ayak parmaklarını çimdikleyerek) uygun anestezi derinliğini belirleyin. Yarasa hissi yanıt vermemelidir ve solunum hızı yavaş ve istikrarlı kalmalıdır. Anestezi istikrarlı bir düzlemde korumak için gerektiği gibi isoflurane ayarlayın.
- Kayıt isoflurane düzeyi, kalp hızı, solunum hızı, ve IACUC tarafından gerekli diğer bilgiler.
- Büyük kahverengi yarasa tartın ve 4 ondalık basamak için ağırlık kaydedin.
- Bir alkol hazırlık pedi ile interfemoral ven üzerinde uropatagium (kuyruk zarı) temizleyin ve kurumasını bekleyin. Interfemoral ven üzerine petrol jöle ince bir tabaka uygulayın.
- İnterfemoral venin sırt kısmını delmek ve plastik sodyum heparin kapiller tüpler kullanarak 100 μL kan toplamak için 29 G iğne kullanın. Toplama ve etiket tüp sonra yavaşça her tüp haddeleme tarafından sodyum heparin ile tüm kanın yeterli karıştırma sağlamak.
- Küçük memeliler için kalibre edilmiş bir DXA makinesi kullanarak, yarasa10üç DXA taramaları elde.
- Kg'daki yarasa ağırlığını 0,75 g/kg D2O dozu ile çarparak enjekte etmek için D2O'nun kütlesini (g'de) belirleyin. Hesaplanan D2O dozunun (V) hacmini, D2O dozu ağırlığını çalışma çözeltisinin konsantrasyonuna bölerek belirleyin.
- Hesaplanan D2O hacmini çizmek için 29 G iğne takılı bir insülin şırınga kullanın. D2O,insülin şırıngası ve iğneyi tartın. 4 ondalık basamak kaydedin.
- D2O'yu anestezili yarasanın dorsal kalça bölgesine deri altına enjekte edin.
- Yarasaanestezi kurtarmak ve enjeksiyon süresini kaydetmek için izin verin.
- Enjeksiyondan hemen sonra, 29 G iğne bağlı şimdi boş insülin şırınga tartın. Ağırlığı 4 ondalık basamak olarak kaydedin.
- İnsülin şırıngasının enjeksiyon sonrası ağırlığını ön enjeksiyon D2O dolu insülin şırıngasından çıkararak enjekte edilen D2O dozunun belirlenmesi. 4 ondalık basamak kaydedin.
- 30 dk sonrası kan toplama içinde, 5 dakika boyunca her kılcal tüp spin için bir hematokrit santrifüj kullanın. Hematokrit santrifüj birden fazla hıza izin veriyorsa, 10.000 x golarak ayarlanır.
- Tüm kan ve plazma arasında plastik kılcal tüp kesmek için keskin bir makas kullanın. Plazmayı doğrudan etiketli 500 μL depolama tüpüne atmak için 200 μL'lik bir pipet kullanın.
- Equilibr döneminden sonra, interfemoral ven kan başka bir 100 μL toplamak.
NOT: Denge süresi türlere göre değişir ve yarasalar torpidoya girerse. Büyük kahverengi yarasalar için, genellikle 2 saat denge süresi için yeterlidir. - İkinci etiketli içine ayrı plazma, adım 3.13 tekrarlayarak 500 μL mikrosantrifüj vida üst tüp. Numuneleri analiz edinceye kadar -20 °C veya daha soğukta saklayın.
4. Fourier-transform kızılötesi spektrofotometri analizi
- Damıtmayı kolaylaştırmak için kum banyosunun sıcaklığını 60 °C'ye ayarlayın (suyun ve D2O'nun diğer kan bileşenlerinden ayrılmasına izin verin).
- Pipet 50 μL her plazma numunesi ve standart içine 1.5 mL konik mikrosantrifüj tüp kapağı. Kalite kontrol olarak Bilinen D2O konsantrasyonlarını içeren standartlar da dahil olmak üzere.
NOT: İdeal olarak her hayvan ın numune başına üç kopyaya sahip olması ve bildirilen üç kopyanın ortalaması olacaktır. Sınırlı numune hacmi ve yazarlar tarafından kullanılan FT-IR ekipmanı için gerekli numune hacmi nedeniyle yarasa numuneleri için çoğaltma işlemi yapılmamıştır. Herhangi bir numune 50 μL'den az plazma içeriyorsa, pipet numune miktarını konik mikrosantrifüj tüp kapağına yerleştirin ve hacmi kaydedin. - Mikrosantrifüj kapağını baş aşağı tutun ve 1,5 mL konik mikrosantrifüj tüpünü kapağın üzerine vidalayın. Ters (baş aşağı) tüpü, kapakla birlikte kum banyosunda en az 12 saat (bir gecede) yerleştirin.
- 12 saat sonra kapağı çıkarın ve yeni, temiz bir kapakla değiştirin. Bir santrifüj içinde 10 s için mikrosantrifüj tüp Darbe.
- Aşağıdaki standartları oluşturun: 0 ppm (0 mg D2O in 1 L distile su), 293 ppm (293 mg D2O in 1 L distile su), 585 ppm (585 mg D2O in 1 L distile su), 878 ppm (878 mg D2O in 1 L distile su), ve 1170 ppm D2O (1170 mg D2O in 1 L distile su).
NOT: Yukarıdaki değerler standart bir eğri için önerilir. Dakikada 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm vb. gibi alternatif değerler kullanılabilir. - Fourier-transform kızılötesi spektrofotometri (FTIR) spektrometre(Malzeme Tablosu)içine bir sıvı iletim hücresi yükleyin. Hücreyi metanolle doldurun ve enjeksiyon bağlantı noktasını bağlayın. Hava kabarcıkları riskini azaltmak için metanol şırıngasını dikkatlice çıkarırken hücreyi yavaşça arka plan suyuyla doldurun. Analiz sonrası numunelerin çıkarılmasına izin vermek için çıkış portuna boru takın.
- Sudaki D2O'nun analizi için FTIR spektrometre yazılımını(Malzeme Tablosu)hazırlayın. Bu protokolde kullanılan spektrometre yazılımının parametre ayarları Tablo 1'delistelenmiştir.
- Dilüent, 0,22 μm filtrelenmiş, distile su kullanarak bir arka plan örneği toplayın. Bu standartlar için kullanılan aynı su olmalıdır.
- 0 ppm D2O'nun 40 μL'sini enjekte edin ve spektrumları kaydedin. Spektrumları virgülle ayrılmış değerler (CSV) dosyası olarak kaydedin.
- Standart bir eğri oluşturmak için tüm standartların spektrumlarını enjekte etmeye ve kaydetmeye devam edin.
- Arka planı ve standart eğriyi her 60−90 dakikada bir tekrarlayın.
- Sıvı iletim hücresine her distile numunenin 40 μL'sini enjekte edin ve spektrumları kaydedin.
NOT: Sıvı iletim hücresinin hacmine bağlı olarak standartların enjeksiyon hacmini ve damıtılmış numuneleri değiştirin. Numune hacmi 40 μL'nin altındaysa daha küçük hacimli sıvı iletim hücresi kullanın veya arka plan distile su ile seyreltik 1:1. - Jennings ve ark.11 veya spektral yazılım tarafından açıklanan bir elektronik tablo programı kullanarak FTIR spektrumundan her numunenin D2O konsantrasyonunu belirleyin. Çoğaltmalar yapıldığında, vücut kompozisyonu hesaplamak için ortalama konsantrasyonu kullanın.
5. Vücut kompozisyonunun hesaplanması
- Aşağıdakidenklemi 12kullanarak her örnek için döteryum zenginleştirme (ppm) atom yüzdesi konsantrasyonu dönüştürün:
x'in ölçülen döteryum zenginleştirme (ppm) olduğu ve 0,0001557'nin Viyana Standart Ortalama Okyanus Suyu 'nda (VSMOW)13'tebildirilen döteryumun mol fraksiyonu olduğu yerdir. - Aşağıdakidenklemi4,12,14kullanarak her örnek için toplam gövde suyu hesaplamak :
)
Nerede E ölçülen zenginleştirme (atom%) arka plan düzeltmesi sonrası örnekteki döteryumun, B'nin g enjeksiyon kütlesi, 0.998'in ise enjekte edilen D2O konsantrasyonudur.
NOT: Labile hidrojen ile döteryum değişimi toplam vücut su kütlesinin %2 fazla tahmin edilmesine neden olur. Toplam vücut suyu vücut ağırlığının% 2 oranında toplam vücut su tahmini azaltarak düzeltilmelidir. - Aşağıdaki denklemi kullanarak her yarasanın yağsız kütlesini (yağsız vücut kütlesi ve diğer tüm yağsız bileşenler) tahmin edin:
NOT: Sağlıklı, ökosulu, emzirilmeyen yarasalar için yağsız vücut kütlesinin fraksiyonel nem içeriği için geleneksel olarak kabul edilen 0,732 değerini kullanın. Yağsız kütlenin fraksiyonel nem içeriği doğum sonrası hafta15dayalı büyük kahverengi emzirme değişebilir. Diğer türler için, literatürde yayınlanan değerleri kullanın veya yağsız vücut kütlesihesaplamaları gerçekleştirmeden önce yağsız vücut kütlesinin fraksiyonel nem içeriğini belirleyin. - Aşağıdaki denklemi kullanarak vücut yağ kütlesitahmin edin:
- Aşağıdaki denklemi kullanarak g vücut yağ kütlesi yüzde vücut yağ kütlesi dönüştürün:
)
6. Bir etobursu su bileşiminin belirlenmesi (Felis catus, evcil kedi)
- Bölüm 1'de açıklandığı gibi stok çözümlerini hazırlayın.
- Her kediyi en yakın 3 ondalık basamakta tartın ve rekor ağırlığı nı kaydedin. Adım 3.6'da açıklandığı gibi her kedi için dozu 0,70 g/kg D2O dozu kullanarak hesaplayın.
- Her dozu 3.7−3.8 adımlarında açıklandığı şekilde hazırlayın. insülin şırınga yerine 22 G iğne ile 3 mL veya 5 mL şırınga kullanmak.
- 500 μL tam kanı toplayın ve daha sonra 0.7 g/kg D2O. Santrifüj tam kanı 15 dk için 2.000 x g'de subkutan olarak uygulayın ve analiz ene kadar -20°C'de 1,5 mL mikrosantrifüj vidaüst tüplerinde plazmayı depolayın.
- Enjeksiyon sonrası 500 μL tam kan 4 saat toplayın. 15 dakika boyunca 2.000 x g'de tam kanı santrifüj edin ve analiz ene kadar -20 °C'de 1,5 mL mikrosantrifüj vidaüst tüplerinde plazmayı saklayın.
- Enjeksiyondan 14 gün sonra 500 μL tam kan toplayın. 15 dakika boyunca 2.000 x g'de tam kanı santrifüj edin ve analiz ene kadar -20 °C'de 1,5 mL mikrosantrifüj vidaüst tüplerinde plazmayı saklayın.
NOT: Kan toplama arasındaki gün sayısı deneysel ihtiyaçlar ve D2O'nun arka plan seviyelerinin üzerinde tespit edilebildiği enjeksiyon sonrası döneme dayandırılabilir. On dört gün Hooper ve ark.9gelen diyet tedavi blokları uzunluğu oldu. - Bölüm 4'e göre FT-IR analizi yapın ve bu protokolün 5.
- Aşağıdaki denklemleri kullanarak mL/gün'deki su tüketimini hesaplayın:
TBW'nin toplam vücut suyu olduğu yerde, ilk D2O ve son D2O enjeksiyon sonrası D2O örneklerinde ppm cinsinden ölçülen konsantrasyonlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Döteryum oksit seyreltme tekniği çeşitli türlerin vücut kompozisyonu değerlendirmek için kullanılabilir. Adaptasyon göstermek için, bir Kuzey Amerika böcekçil yarasa türlerinde döteryum oksit seyreltme tekniğinin ilk kullanımını bildiriyoruz, Eptesicus fuscus, temsili sonuçlar için büyük kahverengi yarasa. Bir zamanlama platosu, denge süresinin bilinmemesi halinde herhangi bir türde yapılması gerektiği gibi D öncesi ve sonrası2O enjeksiyon kan örnekleri alınarak tamamlanmıştır. Torpid olmayan yarasalarda enjeksiyon dan iki saat sonra denge için yeterli olduğu belirlendi. Bilinen denge süresi ile, toplam vücut suyu, yağsız vücut kütlesi ve vücut yağ kütlesi için 13 vahşi yakalanmış büyük kahverengi yarasalar ve 8 esir büyük kahverengi yarasalar tespit edilmiştir(Tablo 2). Ek bir 2 vahşi yakalanmış büyük kahverengi yarasalar ve 5 esir büyük kahverengi yarasalar negatif bir vücut yağ kütlesi olduğu tespit edildi. Negatif bir vücut yağ kütlesi aşağıdaki nedenlerden biri veya birkaçı nedeniyle hesaplanır: döteryum oksit in tamamının alınmaması, denge aşamasında torpid hale gelme, anormal derecede büyük yağ kütleleri ve minimal yağsız kütleye sahip olması veya DXA tarafından belirlendikçe %3−%5 vücut yağının altında olan yarasalar(Tablo 3).
Beyaz burun sendromu birçok yarasa türünün azalmasına neden olmuştur, bu nedenle teknik DXA kullanılarak ölçülen vücut yağı ile karşılaştırıldı. Şekil 1, D2O seyreltme tekniği ve DXA (n = 19) tarafından belirlenen vücut yağ yüzdesini gösterir. Bu iki teknik Pearson'ın r = 0.897(Şekil 2)ile iyi korelasyonları ile ilişkiliydi ve istatistiksel olarak farklı değildi (varyans tek yönlü analizi (ANOVA), F değeri = 0.366, p = 0.549). Vücut yağ vücut yağ ve vücut ağırlığı arasında güçlü korelasyonlar gösterdi(Şekil 3). D2O seyreltme tekniği sürekli üzerinde veya vücut yağ kütlesi hafife vermedi.
Döteryum oksit yöntemi daha önce kedilerde doğrulanmıştır16. Tablo 4 toplam vücut suyu, yağsız vücut kütlesi ve tek bir kedi9vücut yağ kütlesi bir örnek gösterir. Hooper ve ark.9, sosyal olarak barındırılan hayvanların su tüketimini, deneyin her diyet bloğu sırasında kedilerin günlük su tüketimiyle ölçmek için döteryum oksit seyreltme kullanımını bildiren ilk kişilerdir, Şekil 4'tegösterildiği gibi .
Şekil 1: Döteryum oksit ve DXA çizgi çizimi. Her nokta dxa veya döteryum oksit tarafından belirlenen bireysel bir yarasa vücut yağ yüzdesi temsil eder. Ortalama, ortalamanın standart hatasını gösteren hata çubuklarıolan açık yeşil noktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Büyük kahverengi yarasalarda vücut yağ yüzdesi. Deming regresyon (solid blue line, Pearson's r = 0.897) DXA tarafından belirlenen vücut yağ yüzdesi karşılaştırarak (x-eksen, referans yöntemi) ve döteryum oksit tarafından belirlenen vücut yağ yüzdesi (y-ekseni, test yöntemi) gri gölgeleme tarafından belirlenen% 95 güven aralıkları ile büyük kahverengi yarasalar. Çizilen yeşil çizgi kimlik çizgisi, yöntemler eşit olduğunda gerileme çizgisini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Büyük kahverengi yarasalarda vücut ağırlığına göre vücut yağ yüzdesi. Her yarasa vücut ağırlığı D2O veya DXA tarafından belirlenen vücut yağ yüzdesi karşı çizilmiş. DXA (koyu mavi çizgi, Pearson'ın r = 0.88) ve D2O (mavi çizgi, Pearson'ın r = 0.86) tarafından belirlenen vücut ağırlığı ve vücut yağ arasında güçlü bir korelasyon vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sosyal olarak barındırılan kedilerin su tüketimi. Diyet bileşenlerinin su tüketimi üzerindeki etkilerini değerlendiren bir deney sırasında sosyal olarak barındırılan kedilerin günlük su tüketiminin temsili sonuçları. Bu rakam Hooper ve ark.9'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametre | Ayarı |
| Tarama sayısı | 64 |
| Çözünürlük | 2 |
| Veri aralığı | 0,946 cm-1 |
| Son biçim | Emicilik |
| Düzeltme | Hiçbiri |
| Toplama penceresinde sabit Y ekseni sınırlarını kullanma | Min -0.01, Maksimum 0.03 |
| Tezgah aralığı | Max 6.38, Min -5.02, Loc 1024 |
| Toplam emici tepe hassasiyeti | 50 |
| saçaklar veya kanalize duyarlılık | 80 |
| Türev zirveler duyarlılık | 51 |
| Temel hata duyarlılığı | 50 |
| CO2 düzeyleri hassasiyeti | 19 |
| H2O düzeyleri hassasiyeti | 19 |
| Apodization modu | Happ-Genzel |
| Faz düzeltme | Mertz |
| Temel olarak ayarlanan filtreler | Hız |
| düşük geçiş filtresi | 11,000 |
| yüksek geçiş filtresi | 20 |
Tablo 1: Spektral yazılım ayarları. Spektral kayıt yazılımı için kullanılan parametre ayarları.
| Hayvan | Tür | Vücut ağırlığı (kg) |
D2O enjekte (g) |
Toplam vücut suyu (g) |
Yağsız vücut kütlesi (g) |
Vücut yağ kütlesi (g) |
Vücut yağ kütlesi (%) |
DXA yalın + bmc (g) |
DXA yağ (g) |
DXA yağ (%) |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.01715 | 0.0740 | 11.80 | 16.15 | 1.00 | 5.80 | 14.65 | 0.75 | 4.80 |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.01950 | 0.0920 | 13.80 | 18.83 | 0.69 | 3.50 | 16.20 | 1.40 | 7.90 |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.01677 | 0.08 | 11.33 | 15.47 | 1.30 | 7.74 | 11.33 | 1.30 | 7.74 |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.02129 | 0.097 | 12.51 | 17.09 | 4.20 | 19.7 | 15.9 | 19.65 | 19.2 |
Tablo 2: Büyük kahverengi yarasaların vücut kompozisyonu. Büyük kahverengi yarasalarda döteryum oksit seyreltme ile belirlenen toplam vücut suyu, yağsız vücut kütlesi ve vücut yağlarının temsili sonuçları 5−8 sütunlarında gösterilmiştir. Aynı büyük kahverengi yarasalarda DXA tarafından belirlenen yağsız vücut kütlesi nin yanı sıra kemik mineral içeriği ve vücut yağlarının temsili sonuçları 9−11 sütunlarında gösterilmiştir.
| Hayvan | Tür | Vücut ağırlığı (kg) |
D2O enjekte (g) |
Toplam vücut suyu (g) |
Yağsız vücut kütlesi (g) |
Vücut yağ kütlesi (g) |
Vücut yağ kütlesi (%) |
DXA yalın + bmc (g) |
DXA yağ (g) |
DXA yağ (%) |
Yorum |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.0277 | 0.1299 | 34.18 | 46.69 | -19.02 | -68.74 | 9.90 | 26.55 | 62.80 | Denklik süresi yetersiz |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.0185 | 0.0810388 | 64.23 | 87.75 | -69.25 | -374.33 | 14.20 | 17.30 | 17.95 | Tam doz enjekte edilmedi |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.0164 | 0.0719 | 17.38 | 23.74 | -7.33 | -44.68 | 14.15 | 14.40 | 1.70 | %3'ten az yağ |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.0212 | 0.0994 | 54.57 | 74.54 | -53.37 | -252.0 | 16.41 | 19.01 | 13.65 | Yarasa torpid oldu (dokunmak için serin) |
Tablo 3: Büyük kahverengi yarasaların vücut kompozisyonu. Döteryum oksit tüm doz alamadım yarasalar temsilcisi sonuçları, denge aşamasında torpid oldu, anormal büyük yağ kütlesi ve minimal yağsız kitle ile yarasalar, ya da dxa tarafından belirlenen% 3−5 vücut yağ altında yarasalar. Döteryum oksit seyreltme ile belirlenen toplam vücut suyu, yağsız vücut kütlesi ve vücut yağlarının temsili sonuçları 5−8 sütunlarında gösterilmiştir. DXA tarafından belirlenen yağsız vücut kütlesi nin yanı sıra kemik mineral içeriği ve vücut yağlarının temsili sonuçları 9−11 sütunlarında gösterilmiştir.
| Blok | Tür | Vücut ağırlığı (kg) |
D2O enjekte (g) |
Toplam vücut suyu (kg) |
Yağsız vücut kütlesi (kg) |
Vücut yağ kütlesi (kg) |
Vücut yağ kütlesi (%) |
Günlük su tüketimi (mL/gün) |
Diyet Tedavisi |
| 1 | Felis Catus | 4.830 | 3.36 | 2.69 | 3.68 | 1.149 | 23.8 | 96.8 | Denetim |
| 2 | Felis Catus | 4.764 | 3.45 | 2.66 | 3.63 | 1.136 | 23.8 | 217.5 | Yüksek Nem |
| 3 | Felis Catus | 4.727 | 3.25 | 2.50 | 3.41 | 1.314 | 27.8 | 125.1 | Yüksek Selenyum |
Tablo 4: Tek bir kedide vücut kompozisyonu ve su tüketimi. Hooper ve ark.9tarafından yapılan çalışma sırasında bir kedinin üç farklı zaman noktasında yağsız vücut kütlesi, yağ kütlesi ve su tüketimini değerlendirmek için döteryum oksit seyreltme tekniğinin temsili sonuçları .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TBW belirlemek için döteryum oksit kullanımı 1940'lardan beri17 ve insanlar ve çeşitli yerli ve yaban hayatı türleri4,6,7kullanılır. Biyoelektrik empedans analizi (BIA), DXA ve kantitatif manyetik rezonans (QMR) gibi diğer tahribatsız teknikler geliştirilmiştir. Her yöntemin, vücut kompozisyonu değerlendirmek için belirli bir metodoloji seçmeden önce göz önünde bulundurulması gereken avantajları ve dezavantajları vardır. Döteryum oksit için vücut kompozisyonu değerlendirmek için bir karşılaştırma yöntemi olarak DXA kullanmak için seçilen bu protokol, ekipman en az maliyetle bir çekirdek üniversite kaynağı olarak kullanılabilir çünkü, en az zaman (yarasa başına 30 s) ve vücut ısısı ve cilt yalıtımı gibi değişkenlere duyarlı değildir.
Döteryum oksit seyreltme tekniğini bir türe uyarlarken, denge için gereken süreyi belirlemek için bir pilot çalışma başlatılmalıdır18. Bu bir arka plan örneği alarak yapılabilir, ve bir kan örneği her 15 dakikada bir enjeksiyon sonrası. Yarasalar gibi küçük türler için, birkaç yarasa tek bir hayvan18yerine farklı zaman aralıklarında kanamış olabilir. Denge süresi, yarasalar gibi hayvanların torpora girmesiyle değişebilir, bu da bazı hayvanlarımızın neden negatif yüzde vücut yağlarına sahip olduğunu açıklar(Tablo 3). Negatif bir yüzde vücut yağ elde edilir, ve döteryum dozu tamamen hayvanın vücut suyu ile denge lemek için yeterli zaman vardı, o zaman doz tamamen enjekte değildi muhtemeldir. Döteryum oksit seyreltme tekniği, uygulanan tam doza ve enjekte edilen döteryum miktarının doğru kaydedilmesine son derece bağımlı olduğundan, bu teknik sadece enjeksiyon yapma konusunda yetenekli kişiler tarafından tamamlanmalıdır. Ayrıca, anestezi veya yatıştırıcı hayvanlar tüm doz uygulanabilir sağlanması ile yardımcı olabilir.
Döteryum oksit verirken, hayvana uygulanacak uygun bir konsantrasyonbelirlemek önemlidir. Kediler için 0,7 g/kg doz kullanılarak stok çözeltisi konsantrasyonu uygunolurken, büyük kahverengi yarasalar için 0,75 g/kg doz döteryum oksit stok çözeltisinin seyreltilmesini gerektiriyordu. Stok çözeltisi seyreltilirken %0,9 NaCl gibi bir isotonik çözelti kullanılmalıdır. Küçük memelilerin toplam vücut suyunu değiştirmemek için, döteryum oksit dozuna mümkün olduğunca az seyreltin, sadece dozu doğru bir şekilde ölçülebilir sağlamak için yeterli.
Burada sunulan dozlar FTIR spektrometresi kullanılarak saptanabilir. FTIR spektrometresi daha az pahalı ve bakımı daha kolay, ancak izotop oranı kütle spektrometresi (IRMS)19,20kadar hassas değil. FTIR spektrometresi plazma ve tükürük döteryum zenginleştirme ölçmek için kullanılabilir, ancak idrarda döteryum zenginleştirme analiz etmek için bir FTIR iletim hücresi kullanılması tavsiye edilmez19. İdrar istenilen örneklem tipi ise, TBW19'unhesaplanmasında döteryum zenginleştirmesini değerlendirmek için FTIR veya IRMS ile zayıflatılmış toplam yansıma (ATR) eki kullanılmalıdır.
Ayrıca, kediler için kullanılan dozlar döteryum oksit tespiti ne izin vermek için yeterli ydi 14 gün post-enjeksiyon. Döteryum oksit konsantrasyonu enjeksiyon dan 14 gün sonra saptanabildiği için kedilerin su tüketimi hesaplanabilir(Şekil 4). Döteryum oksit bu yenilikçi kullanımı yüksek recapture oranları ile türler için vücut suyu ciroölçmek için saha çalışmalarında veya eski yerinde veya laboratuvar çalışmaları gruplar halinde barındırılan hayvanlar için istihdam edilebilir. Ancak, saha çalışmalarında istihdam önce, araştırmacılar hayvan yakalanan ve denge süresi boyunca tutulabilir olup olmadığını değerlendirmek gerekir. Bu uzun kullanım süresi döteryum oksit tekniğinin dezavantajlarından biridir ve nesli tükenmekte olan birçok hayvanın belirli bir hayvanın tutulabileceği süreyi sınırlayamalarından sorunlu olabilir. Ayrıca, yıkama tekniği vücut kütlesinin ölçümü ne dayanır gibi hayvanlar son zamanlarda yemiş olamaz; bu nedenle, yeni bir yemek sonuçları şaşırtmak olabilir. Bir hayvanın deri altı enjeksiyon ve kan toplamaları için anestezi veya uyuşturulması mı gerektiği ya da hayvanın sedasyon/anestezi olmadan dizginlenip dizginlenemeyeceği dir. Bu vücut su ciro oranı insan sağlığı için önemli bir gösterge olabilir ileri sürülmüştür21. Kedi 5'teki su tüketiminin artması(Şekil 4)geleneksel biyokimyasal böbrek yetmezliği izlerinden önce belgelenmiş ve kreatinin ve kan üre azotu (BUN) konsantrasyonları yükselmiş, bu da vücut su larının artışının hayvanlarda sağlığın bir göstergesi olabileceğini düşündürmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma MDC Kooperatif Anlaşması (#416), ABD Orman Hizmetleri Kooperatifi Anlaşması (16-JV-11242311-118), Amerikan Veteriner Beslenme Akademisi ve Waltham/Royal Canin, USA Grant (hibe numarası: 00049049), NIH eğitim bursu (hibe numarası: T32OS011126) ve Missouri Üniversitesi Veterineraraştırma Bursu ile desteklenmiştir. Yazarlar shannon Ehlers'a bu el yazını önceden inceleleri için teşekkür ediyor. Dr. Robert Backus'a D2O standartlarını sağladığı ve laboratuvarının kullanımına izin verdiği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 micron non-pyrogenic disk filter | Argos Technologies | FN32S | nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile |
| 1.5 mL conical microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-9701 | 1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap |
| 10 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | MS-SEV10 | clear, sterile glass injection unit |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | sterile 10 mL syringe individually wrapped |
| 100 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | AL-SV10020 | clear, sterile glass injection unit |
| 20 gauge needle | Exel | 26417 | needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel |
| 22 gauge needle | Exel | 26411 | needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel |
| deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-25G | 99.9 atom % D |
| isofluorane | Vetone | 3060 | fluriso isoflurane, USP |
| OMNIC Spectra Software | ThermoFisher Scientific | 833-036200 | FT-IR standard software |
| petroleum jelly | Vaseline | 305212311006 | Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant |
| plastic capillary tubes | Innovative Med Tech | 100050 | sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length |
| Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell | International Crystal Laboratory | 0005D-875 | 0.05 mm Pathlength |
| sodium chloride | EMD Millipore | 1.37017 | suitable for biopharmaceutical production |
| Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer | ThermoFisher Scientific | 269-169400 | discontinued model, newer models available |
References
- Schiffmann, C., Clauss, M., Hoby, S., Hatt, J. M. Visual body condition scoring in zoo animals – composite, algorithm and overview approaches. Journal of Zoo Aquarium Research. 5 (1), (2017).
- Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
- Bissell, H. Body Condition Scoring Resource Center. , https://nagonline.net/3877/body-condition-scoring/ (2017).
- McWilliams, S. R., Whitman, M. Non-destructive techniques to assess body composition of birds: a review and validation study. Journal of Ornithology. 154 (3), 597-618 (2013).
- Lukaski, H. C., Johnson, P. E. A simple, inexpensive method of determining total body water using a tracer dose of D2O and infrared absorption of biological fluids. American Journal of Clinical Nutrition. 41 (2), 363-370 (1985).
- Chusyd, D. E., et al. Adiposity and Reproductive Cycling Status in Zoo African Elephants. Obesity (Silver Spring). 26 (1), 103-110 (2018).
- Kanchuk, M. L., Backus, R. C., Calvert, C. C., Morris, J. G., Rogers, Q. R. Neutering Induces Changes in Food Intake Body Weight, Plasma Insulin and Leptin Concentrations in Normal and Lipoprotein Lipase–Deficient Male Cats. The Journal of Nutrition. 132 (6), 1730S-1732S (2002).
- Eichhorn, G., Visser, G. H. Technical Comment: Evaluation of the Deuterium Dilution Method to Estimate Body Composition in the Barnacle Goose: Accuracy and Minimum Equilibration Time. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (4), 508-518 (2008).
- Hooper, S. E., Backus, R., Amelon, S. Effects of dietary selenium and moisture on the physical activity and thyroid axis of cats. Journal of Animal Physiolgy and Animal Nutrition (Berl). 102 (2), 495-504 (2018).
- Stevenson, K. T., van Tets, I. G. Dual-Energy X-Ray Absorptiometry (DXA) Can Accurately and Nondestructively Measure the Body Composition of Small, Free-Living Rodents. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (3), 373-382 (2008).
- Jennings, G., Bluck, L., Wright, A., Elia, M. The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces. Clinical Chemistry. 45 (7), 1077-1081 (1999).
- Beuth, J. M. Body Composition, movemement phenology and habitat use of common eider along the southern new england coast. Master of Science in Biological and Environmental Sciences (MSBES) thesis. , University of Rhode Island. (2013).
- Coplen, T. B., Hopple, J., Peiser, H., Rieder, S. Compilation of minimum and maximum isotope ratios of selected elements in naturally occurring terrestrial materials and reagents. U.S. Geological Survey Water-Resources Investigations Report 01-4222. , (2002).
- Karasov, W. H., Pinshow, B. Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site. Physiological Zoology. 71 (4), 435-448 (1998).
- Hood, W. R., Oftedal, O. T., Kunz, T. H. Variation in body composition of female big brown bats (Eptesicus fuscus.) during lactation. Journal of Comparative Physiology B. 176 (8), 807-819 (2006).
- Backus, R. C., Havel, P. J., Gingerich, R. L., Rogers, Q. R. Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase Fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats. American Journal of Veterinary Research. 61 (7), 796-801 (2000).
- Moore, F. D. Determination of Total Body Water and Solids with Isotopes. Science. 104 (2694), 157-160 (1946).
- Voigt, C., Cruz-Neto, A. Ecological and Behavioral Methods in the Study of Bats. Parsons, S., Kunz, T. H. , John Hopkins University Press. Ch. 30 621-645 (2009).
- International Atomic Energy Agency. Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques. , (2009).
- International Atomic Energy Agency. Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (2011).
- Shimamoto, H., Komiya, S. The Turnover of Body Water as an Indicator of Health. Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).
