Summary
Este artículo describe la técnica de dilución de óxido de deuterio en dos mamíferos, un insectívoro y carnívoro, para determinar el agua corporal total, la masa corporal magra, la masa grasa corporal y el consumo de agua.
Abstract
Los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal son técnicas comunes utilizadas para evaluar el estado de salud o la aptitud de una especie. Los sistemas de puntuación de condición del cuerpo dependen del evaluador y tienen el potencial de ser altamente subjetivos. Los índices de condición corporal pueden confundirse por forrajeo, los efectos del peso corporal, así como problemas estadísticos e inferenciales. Una alternativa a los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal es el uso de un isótopo estable como el óxido de deuterio para determinar la composición corporal. El método de dilución de óxido de deuterio es una técnica cuantitativa repetible que se utiliza para estimar la composición corporal en humanos, vida silvestre y especies domésticas. Además, la técnica de dilución de óxido de deuterio se puede utilizar para determinar el consumo de agua de un animal individual. Aquí, describimos la adaptación de la técnica de dilución de óxido de deuterio para evaluar la composición corporal en grandes murciélagos marrones (Eptesicus fuscus) y para evaluar el consumo de agua en gatos (Felis catis).
Introduction
Los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal son técnicas comunes utilizadas para evaluar el estado de salud o la aptitud de una especie1,2. Muchas especies domésticas y zoológicas tienen sistemas únicos de puntuación de condición corporal (BCS) que se utilizan para evaluar el músculo de un animal y el tejido graso superficial3. Sin embargo, la evaluación de BCS se basa en el evaluador, lo que significa que el BCS es una medida objetiva o semicuantitativa cuando es evaluada por un evaluador capacitado. En las especies de vida silvestre, los índices de condición corporal se utilizan comúnmente en lugar de BCS y se basan en una proporción de masa corporal al tamaño del cuerpo o masa corporal al antebrazo2. Condición del cuerpo indicis son a menudo confundidos por los efectos de la forrajeo y pueden ser confundidos por el tamaño del cuerpo, así como los problemas estadísticos e inferenciales4.
Una alternativa a los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal es utilizar un isótopo estable para determinar la composición corporal. Un isótopo estable comúnmente utilizado es el óxido de deuterio (D2O), una forma no radiactiva de agua en la que los átomos de hidrógeno son isótopos de deuterio. El método de dilución de óxido de deuterio descrito en este estudio puede ser una técnica no subjetiva, cuantitativa y repetible utilizada para estimar la composición corporal en humanos5 y una amplia gama de especies4,6,7. Esta técnica puede ser ventajosa para estudiar la composición corporal en la vida silvestre. Por ejemplo, se puede utilizar para evaluar los cambios longitudinales en la composición corporal, como antes y después de una acción de gestión. Sin embargo, en algunas especies de vida silvestre el óxido de deuterio puede sobreestimar el contenido real de agua8. Por lo tanto, al adaptar la técnica para una especie, es importante validar el método comparando el método de óxido de deuterio con el análisis de canales para especies no amenazadas. En el caso de las especies amenazadas y en peligro de extinción, un método no destructivo como la absortiometría de rayos X dual (DXA) debe considerarse como un método de comparación alternativo al método destructivo estándar del oro para el análisis completo de la canal.
Además de la composición corporal, la técnica de dilución D2O se puede utilizar para determinar el consumo de agua de un animal individual9. Esta aplicación única de D2O se puede utilizar para responder no sólo preguntas de investigación, pero puede ser útil para evaluar el consumo de agua de animales individuales alojados en grandes entornos sociales.
Aquí, describimos la adaptación de la técnica de dilución D2O para evaluar la composición corporal en un insectívoro, grandes murciélagos marrones (Eptesicus fuscus), y para evaluar el consumo de agua en un carnívoro, gatos (Felis catis).
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Protocol
Todos los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri y llevados a cabo bajo el #17649 #16409 permiso de Colección Científica de Vida Silvestre del Departamento de Conservación de Missouri (MDC, por sus).
1. Preparación de solución estéril, isotónica y salinizada D2O
- Haga una solución de stock de 50 ml de 9,0 g/L salinizado D2O.
- Pesar 450 mg de NaCl de grado farmacéutico y transferir todo el NaCl a un vaso esterilizado de 100 ml. Registre la cantidad exacta de NaCl a 4 decimales en el cuaderno de laboratorio.
- Usando un cilindro graduado estéril, mida 50 g de óxido de deuterio del 99,8% y transfiera al vaso de precipitados estéril que contiene el NaCl. Registre la cantidad exacta de óxido de deuterio en 4 decimales en el cuaderno de laboratorio u hoja de cálculo.
- Filtrar 10 ml de resistencia isosmótica NaCl (9,0 g/L) a través de un filtro de disco estéril no pirogénico con poros submicrométricos (0,2 m).
- Fije una aguja de 20 G al filtro de disco estéril no pirogénico con poros submicranos (0,2 m) equipados con un barril de jeringa de 10 ml. Inserte en el tabique de un vial vacío estéril de 100 ml.
- Coloque un tubo de vacío en una aguja de 22 G e inserte la aguja en el tabique del vial vacío estéril de 100 ml.
- Vierta 10 ml de la solución en el barril de la jeringa. Encienda lentamente el vacío hasta que la solución de stock D2O comience a filtrarse lentamente en el vial estéril. Continúe vertiendo la solución de stock D2O en el barril de la jeringa hasta que se filtren todos los 50 ml.
NOTA: Es posible que sea necesario diluir o concentrar la solución en stock en función de la dosis requerida. La dosis de D2O variará en función de la especie y la sensibilidad del método analítico. En el caso de los gatos, se utilizó la solución de trabajo para administrar una dosis de 0,7 g/kg D2O. La solución de stock descrita anteriormente minimiza la cantidad de solución de NaCl introducida por vía subcutánea en el animal, al tiempo que permite una medición precisa de la dosis. Para mamíferos pequeños como murciélagos, esta concentración debe diluirse en una solución de trabajo como 0,1600 g/ml. Esta concentración permite medir y administrar con precisión la dosis de 0,75 g/kg D2O en aproximadamente 100 ml o menos de solución de NaCl.
2. Preparación de solución de trabajo estéril, isotónica y salinizada D2O para murciélagos
- Pesar un vial estéril vacío de 10 ml y registrar el peso a 4 decimales más cercanos. Escala de tare.
- Utilice una jeringa de 1,0 ml para transferir 0,65 ml de la solución de stock D2O al vial estéril vacío de 10 ml al frasco estéril vacío de 10 ml. Peso récord de D2O a 4 decimales. Escala de tare.
- Calcule el volumen de D2O en el vial vacío de 10 ml. Utilice la siguiente ecuación.
donde W se registra peso y D es la densidad de 99,8% D2O (1.107 g/mL). - Utilice el volumen calculado y el peso conocido de la D2O para determinar el volumen de solución salina isotónica necesaria para crear una solución de trabajo de 0,1600 g/ml.
- Inserte en el tabique del vial estéril de 10 ml, la aguja de 22 G (adjunta al tubo de vacío). Inserte en el tabique del vial estéril de 10 ml, la aguja de 20 G (adjunta a un filtro de jeringa de 0,22 m equipado con un barril de jeringa de 10 ml).
- Vierta la masa/volumen calculado de NaCl isotónico en el barril de la jeringa y encienda el vacío para permitir un goteo lento en el vial estéril de 10 ml.
- Registre el peso del vial y asegúrese de que se crea una solución de trabajo de 0,1600 g/ml.
3. Determinación de la composición corporal de grandes murciélagos marrones (Eptesicus fucsus) con D2O
NOTA: La solución en stock de D2O utilizada en el protocolo es de 0,1598 g/ml. Antes de recolectar sangre, asegúrese de que la eliminación de hasta 200 l de sangre será del 10% del volumen total de sangre del murciélago y está dentro de las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC, por sus seno) para la extracción de sangre. Todos los animales deben ser ayunados o el abdomen palpado para asegurar un estómago vacío. Una comida reciente podría alterar el peso del animal resultando en resultados confusos ya que los cálculos para determinar la grasa corporal dependen de la masa corporal del animal.
- Anestesia un gran murciélago marrón.
- Utilice 5.0% isoflurano para la inducción. Mantener un plano estable de la anestesia usando 0.5% -3.0% isoflurano.
- Determinar la profundidad de la anestesia adecuada mediante la prueba del reflejo de retirada del pedal (pinchando los dedos de los murciélagos). El murciélago no debe responder a la sensación y la frecuencia respiratoria debe permanecer lenta y estable. Ajuste el isoflurano según sea necesario para mantener un plano estable de la anestesia.
- Registre el nivel de isoflurano, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y otra información según lo requiera la IACUC.
- Pesar el bate marrón grande y registrar el peso en 4 decimales.
- Limpie el uropatagium (membrana de la cola) sobre la vena interfemoral con una almohadilla de preparación de alcohol y deje secar. Aplique una fina capa de vaselina sobre la vena interfemoral.
- Utilice una aguja de 29 G para perforar la porción dorsal de la vena interfemoral y recoger 100 ml de sangre utilizando tubos capilares de heparina sódica de plástico. Asegurar una mezcla adecuada de toda la sangre con la heparina sódica enrollando suavemente cada tubo después de la recolección y etiquetando el tubo.
- Usando una máquina DXA calibrada para mamíferos pequeños, obtenga tres escaneos DXA del murciélago10.
- Determinar la masa (en g) de D2O para inyectar multiplicando el peso del murciélago en kg por la dosis de D2O de 0,75 g/kg. Determinar el volumen de la dosis de D2O (V) calculada dividiendo el peso de la dosis de D2O por la concentración de la solución de trabajo.
- Utilice una jeringa de insulina con una aguja de 29 G unida para extraer el volumen de D2O calculado. Pese el D2O, la jeringa de insulina y la aguja. Grabar en 4 decimales.
- Inyecte el D2O por vía subcutánea sobre la región dorsal de la cadera del murciélago anestesiado.
- Permita que el murciélago se recupere de la anestesia y registre el tiempo de la inyección.
- Inmediatamente después de la inyección, pese la jeringa de insulina ahora vacía con la aguja de 29 G conectada. Registre el peso en 4 decimales.
- Determinar la dosis de D2O inyectada restando el peso posterior a la inyección de la jeringa de insulina de la jeringa de insulina preinyección D2O llena. Grabar en 4 decimales.
- Dentro de los 30 minutos después de la recolección de sangre, utilice una centrífuga hematocrito para girar cada tubo capilar durante 5 min. Si la centrífuga hematocrito permite múltiples velocidades, ajuste a 10.000 x g.
- Utilice unas tijeras afiladas para cortar el tubo capilar de plástico entre toda la sangre y el plasma. Utilice una pipeta de 200 ml para expulsar el plasma directamente en un tubo de almacenamiento etiquetado de 500 ml.
- Después del período de equilibrio, recoja otros 100 l de sangre de la vena interfemoral.
NOTA: El período de equilibrio variará según la especie y si los murciélagos entran en torpor. Para los murciélagos marrones grandes, por lo general 2 h es suficiente para el período de equilibrio. - Separe el plasma en un segundo tubo superior de tornillo de microcentrífuga etiquetado de 500 l repitiendo el paso 3.13. Almacene las muestras a -20 oC o más frío hasta su análisis.
4. Análisis de espectrofotometría infrarroja de transformación de Fourier
- Ajuste la temperatura de un baño de arena a 60 oC para facilitar la destilación (permitir la separación del agua y D2O de otros componentes sanguíneos).
- Pipetear 50 l de cada muestra de plasma y estándar en el interior de una tapa de tubo de microcentrífuga cónica de 1,5 ml. Incluyendo normas que contienen concentraciones conocidas de D2O como control de calidad.
NOTA: Idealmente cada animal tendrá tres réplicas por muestra y el promedio de las tres réplicas reportadas. Debido al volumen limitado de la muestra y al volumen de muestra requerido para el equipo FT-IR utilizado por los autores, no se realizaron réplicas para las muestras de murciélagos. Si alguna muestra contiene menos de 50 ml de plasma, pipetee la cantidad de la muestra en la tapa del tubo de microcentrífuga cónica y registre el volumen. - Mantenga la tapa de microcentrífuga boca abajo y atornille el tubo de microcentrífuga cónico de 1,5 ml en la tapa. Coloque el tubo invertido (al revés) con la tapa en contacto con la arena en el baño de arena durante un mínimo de 12 h (durante la noche).
- Después de las 12 h, retire la tapa y reemplácela con una tapa nueva y limpia. Pulse el tubo de microcentrífuga durante 10 s en una centrífuga.
- Crear las siguientes normas: 0 ppm (0 mg D2O en 1 L de agua destilada), 293 ppm (293 mg D2O en 1 L de agua destilada), 585 ppm (585 mg D2O en 1 L de agua destilada), 878 ppm (878 mg D2O en 1 L de agua destilada) y 1170 ppm D2O (1170 mg D2O en 1 L.
NOTA: Los valores anteriores se sugieren para una curva estándar. Se pueden utilizar valores alternativos como 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, etc. - Instale una célula de transmisión líquida en el espectrómetro de espectrofotometría infrarroja de transformación de Fourier (FTIR)(Tabla de materiales). Llene la célula con metanol y conecte el puerto de inyección. Llene lentamente la celda con agua de fondo mientras retira cuidadosamente la jeringa de metanol para reducir el riesgo de burbujas de aire. Conecte el tubo al puerto de salida para permitir la extracción de las muestras posteriores al análisis.
- Prepare el software del espectrómetro FTIR(Tabla de materiales)para el análisis de D2O en agua. La configuración de los parámetros para el software del espectrómetro utilizado en este protocolo se enumeran en la Tabla 1.
- Recoger una muestra de fondo utilizando el diluyente, 0,22 m de agua destilada. Debe ser el mismo agua utilizada para las normas.
- Inyectar 40 oL de la 0 ppm D2O y registrar los espectros. Guarde los espectros como un archivo de valores separados por comas (CSV).
- Continúe inyectando y guarde los espectros de todos los estándares para crear una curva estándar.
- Repita el fondo y la curva estándar cada 60 a 90 min.
- Inyectar 40 l de cada muestra destilada en la célula de transmisión líquida y guardar los espectros.
NOTA: Modificar el volumen de inyección de las normas y las muestras destiladas en función del volumen de la célula de transmisión líquida. Utilice una celda de transmisión líquida de menor volumen si el volumen de la muestra es inferior a 40 ml o diluya 1:1 con agua destilada de fondo. - Determinar la concentración de D2O de cada muestra de los espectros FTIR utilizando un programa de hoja de cálculo como se describe en Jennings et al.11 o el software espectral. Cuando se realizan réplicas, utilice la concentración media para calcular la composición corporal.
5. Cálculo de la composición corporal
- Convierta el enriquecimiento de deuterio (ppm) a concentración porcentual de átomos para cada muestra utilizando la siguiente ecuación12:
donde x es el enriquecimiento de deuterio medido (ppm) de la muestra y 0.0001557 es la fracción mole de deuterio reportada en Vienna Standard Mean Ocean Water (VSMOW)13. - Calcular el agua corporal total para cada muestra utilizando la siguiente ecuación4,12,14:
)
donde E es el enriquecimiento medido (átomo%) dedeuterio en la muestra después de la corrección de fondo, B es la masa de inyección en g, y 0.998 es la concentración de D2O inyectado.
NOTA: El intercambio de deuterio con hidrógeno lábil provoca una sobreestimación del 2% de la masa total de agua corporal. El agua corporal total debe corregirse reduciendo la estimación total de la masa de agua corporal en un 2% del peso corporal. - Estimar la masa libre de grasa (masa corporal magra y todos los demás componentes no grasos) de cada murciélago utilizando la siguiente ecuación:
NOTA: Utilice el valor convencionalmente aceptado de 0.732 para el contenido de humedad fraccionada de masa corporal magra para murciélagos sanos, euhidratados y no lactantes. El contenido de humedad fraccionada de masa libre de grasa puede cambiar en lactación de grandes marrones basados en la semana15post-parto. Para otras especies, utilice los valores publicados en la literatura o determine el contenido de humedad fraccionaria de la masa corporal magra antes de realizar cálculos de la masa corporal magra. - Calcule la masa grasa corporal utilizando la siguiente ecuación:
- Convierta la masa grasa corporal en g en porcentaje de masa grasa corporal utilizando la siguiente ecuación:
)
6. Determinación de la composición del agua en un carnívoro(Felis catus,gato doméstico)
- Prepare la solución de stock como se describe en la sección 1.
- Pesar cada gato hasta los 3 decimales más cercanos y registrar el peso. Calcule la dosis para cada gato como se describe en el paso 3.6 utilizando una dosis de D2O de 0,70 g/kg.
- Prepare cada dosis como se describe en los pasos 3.7 a 3.8. utilizando una jeringa de 3 ml o 5 ml con una aguja de 22 G en lugar de una jeringa de insulina.
- Recoger 500 ml de sangre entera y posteriormente administrar por vía subcutánea los tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 0,7 g/kg D2O. Centrifuge a 2.000 x g durante 15 min y almacenar el plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis.
- Recoger 500 l de sangre entera 4 h después de la inyección. Centrifugar sangre entera a 2.000 x g durante 15 min y almacenar plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis.
- Recoger 500 l de sangre entera 14 días después de la inyección. Centrifugar sangre entera a 2.000 x g durante 15 min y almacenar plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis.
NOTA: El número de días entre la recolección de sangre puede basarse en las necesidades experimentales y el período posterior a la inyección en el que se puede detectar D2O por encima de los niveles de fondo. Catorce días fue la longitud de los bloques de tratamiento dietético de Hooper et al.9. - Realice el análisis FT-IR de acuerdo con la sección 4 y calcule la composición corporal de acuerdo con la sección 5 de este protocolo.
- Calcule el consumo de agua en ml/día utilizando las siguientes ecuaciones:
donde TBW es agua corporal total, la inicial D2O y la d2O final son las concentraciones medidas en ppm en las muestras de D2O post-inyección.
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Representative Results
La técnica de dilución de óxido de deuterio se puede utilizar para evaluar la composición corporal de una variedad de especies. Para demostrar la adaptabilidad, estamos reportando el primer uso de la técnica de dilución de óxido de deuterio en una especie de murciélago insectívoro norteamericano, Eptesicus fuscus, el gran murciélago marrón para resultados representativos. Se completó una meseta de cronometraje tomando muestras de sangre de inyección de 2 O antes y después de D2O, como debe hacerse con cualquier especie en la que se desconozca el período de equilibrio. Se determinó que dos horas después de la inyección en murciélagos no torpid era adecuada para el equilibrio. Con el tiempo de equilibrio conocido, se determinó el agua corporal total, la masa corporal magra y la masa grasa corporal para 13 grandes murciélagos marrones capturados salvajemente y 8 murciélagos marrones grandes cautivos(Tabla 2). Otros 2 murciélagos marrones grandes capturados salvajes y 5 grandes murciélagos marrones cautivos fueron determinados a tener una masa de grasa corporal negativa. Una masa grasa corporal negativa se calcula debido a una o más de las siguientes razones: no recibir la dosis completa de óxido de deuterio, convertirse en torpid durante la fase de equilibrio, tener masas grasas anormalmente grandes y masa magra mínima, o murciélagos que tienen menos de 3% -5% de grasa corporal según lo determine DXA(Tabla 3).
El síndrome de nariz blanca ha hecho que muchas especies de murciélagos disminuyan, por lo que la técnica se comparó con la grasa corporal medida con DXA. La Figura 1 muestra el porcentaje de grasa corporal determinado por la técnica de dilución D2O y DXA (n x 19). Las dos técnicas estaban bien correlacionadas con una r de Pearson a 0,897(Figura 2) y no eran estadísticamente diferentes (análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), valor F a 0,366, p a 0,549). La grasa corporal mostró fuertes correlaciones entre la grasa corporal y el peso corporal (Figura 3). La técnica de dilución D2O no constantemente sobre o subestimar la masa grasa corporal.
El método de óxido de deuterio ha sido validado previamente en gatos16. La Tabla 4 muestra un ejemplo del agua corporal total, la masa corporal magra y la masa grasa corporal de un solo gato9. 9 fue el primero en informar sobre el uso de dilución de óxido de deuterio para medir el consumo de agua de los animales socialmente alojados con el consumo diario de agua de los gatos durante cada bloque dietético del experimento, como se muestra en la Figura 4.
Figura 1: Trazado de línea de óxido de deuterio y DXA. Cada punto representa el porcentaje de grasa corporal de un murciélago individual según lo determinado por DXA o óxido de deuterio. La media es el punto verde claro con barras de error que indican el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Porcentaje de grasa corporal en grandes murciélagos marrones. Regresión de deming (línea azul sólida, r de Pearson a 0,897) comparando el porcentaje de grasa corporal determinado por DXA (eje X, el método de referencia) y el porcentaje de grasa corporal determinado por el óxido de deuterio (eje y, el método de prueba) en grandes murciélagos marrones con intervalos de confianza del 95% designados por sombreado gris. La línea de identidad de guión verde dibujada representa la línea de regresión cuando los métodos son iguales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Porcentaje de grasa corporal en grandes murciélagos marrones en comparación con el peso corporal. Peso corporal de cada murciélago trazado contra el porcentaje de grasa corporal determinado por D2O o DXA. Existe una fuerte correlación entre el peso corporal y la grasa corporal según lo determinado por DXA (línea azul oscura, r de Pearson a 0,88) y D2O (línea azul, r de Pearson a 0,86). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Consumo de agua de gatos socialmente alojados. Resultados representativos del consumo diario de agua de gatos socialmente alojados durante un experimento que evalúa los efectos de los componentes dietéticos en el consumo de agua. Esta cifra ha sido modificada de Hooper et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetro | Ajuste |
| Número de escaneos | 64 |
| Resolución | 2 |
| Espaciado de datos | 0.946 cm-1 |
| Formato final | Absorbancia |
| Corrección | Ninguno |
| Usar límites fijos del eje Y en la ventana de recopilación | Mín.01, Máximo 0.03 |
| Gama de bancos | Máximo 6.38, Min -5.02, Loc 1024 |
| Sensibilidad máxima absorbente total | 50 |
| flecos o sensibilidad de canalización | 80 |
| Sensatividad de picos derivados | 51 |
| Sensibilidad de error de línea base | 50 |
| Sensibilidad de los niveles de CO2 | 19 |
| Sensibilidad de los niveles de H2O | 19 |
| Modo de apodización | Happ-Genzel |
| Corrección de fase | Mertz |
| Filtros configurados en función de | Velocidad |
| filtro de paso bajo | 11,000 |
| filtro de paso alto | 20 |
Tabla 1: Configuración del software espectral. Configuración de parámetros utilizada para el software de grabación espectral.
| Animal | Especies | Peso corporal (kg) |
D2O inyectado (g) |
Agua corporal total (g) |
Masa corporal magra (g) |
Masa grasa corporal (g) |
Masa grasa corporal (%) |
DXA lean + bmc (g) |
Grasa DXA (g) |
Grasa DXA (%) |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.01715 | 0.0740 | 11.80 | 16.15 | 1.00 | 5.80 | 14.65 | 0.75 | 4.80 |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.01950 | 0.0920 | 13.80 | 18.83 | 0.69 | 3.50 | 16.20 | 1.40 | 7.90 |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.01677 | 0.08 | 11.33 | 15.47 | 1.30 | 7.74 | 11.33 | 1.30 | 7.74 |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.02129 | 0.097 | 12.51 | 17.09 | 4.20 | 19.7 | 15.9 | 19.65 | 19.2 |
Tabla 2: Composición corporal de grandes murciélagos marrones. Los resultados representativos del agua corporal total, la masa corporal magra y la grasa corporal determinada por la dilución de óxido de deuterio en grandes murciélagos marrones se muestran en las columnas 5-8. Los resultados representativos de la masa corporal magra más el contenido mineral óseo y la grasa corporal según lo determinado por DXA en los mismos murciélagos marrones grandes se muestran en las columnas 9-11.
| Animal | Especies | Peso corporal (kg) |
D2O inyectado (g) |
Agua corporal total (g) |
Masa corporal magra (g) |
Masa grasa corporal (g) |
Masa grasa corporal (%) |
DXA lean + bmc (g) |
Grasa DXA (g) |
Grasa DXA (%) |
Comentario |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.0277 | 0.1299 | 34.18 | 46.69 | -19.02 | -68.74 | 9.90 | 26.55 | 62.80 | Tiempo de equilibrio insuficiente |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.0185 | 0.0810388 | 64.23 | 87.75 | -69.25 | -374.33 | 14.20 | 17.30 | 17.95 | Dosis completa no inyectada |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.0164 | 0.0719 | 17.38 | 23.74 | -7.33 | -44.68 | 14.15 | 14.40 | 1.70 | Menos del 3% de grasa |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.0212 | 0.0994 | 54.57 | 74.54 | -53.37 | -252.0 | 16.41 | 19.01 | 13.65 | Murciélago se convirtió en torpe (cool to touch) |
Tabla 3: Composición corporal de grandes murciélagos marrones. Resultados representativos de murciélagos que no recibieron toda la dosis de óxido de deuterio, se convirtieron en torpid durante la fase de equilibrio, murciélagos con masa grasa anormalmente grande y masa magra mínima, o murciélagos por debajo de 3%-5% grasa corporal según lo determine DXA. Los resultados representativos del agua corporal total, la masa corporal magra y la grasa corporal determinada por la dilución de óxido de deuterio se muestran en las columnas 5-8. Los resultados representativos de la masa corporal magra más el contenido mineral óseo y la grasa corporal según lo determinado por DXA se muestran en las columnas 9-11.
| Bloquear | Especies | Peso corporal (kg) |
D2O inyectado (g) |
Agua corporal total (kg) |
Masa corporal magra (kg) |
Masa grasa corporal (kg) |
Masa grasa corporal (%) |
Consumo diario de agua (ml/día) |
Tratamiento dietético |
| 1 | Felis Catus | 4.830 | 3.36 | 2.69 | 3.68 | 1.149 | 23.8 | 96.8 | Control |
| 2 | Felis Catus | 4.764 | 3.45 | 2.66 | 3.63 | 1.136 | 23.8 | 217.5 | Alta humedad |
| 3 | Felis Catus | 4.727 | 3.25 | 2.50 | 3.41 | 1.314 | 27.8 | 125.1 | Alto selenio |
Tabla 4: Composición corporal y consumo de agua en un solo felino. Resultados representativos de la técnica diluyante de óxido de deuterio para evaluar la masa corporal magra, la masa grasa y el consumo de agua de un gato en tres puntos de tiempo diferentes durante el estudio realizado por Hooper et al.9.
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Discussion
El uso de óxido de deuterio para determinar TBW se ha utilizado desde la década de 194017 y se utiliza en los seres humanos y una variedad de especies domésticas y de vida silvestre4,6,7. Se han desarrollado otras técnicas no destructivas, como el análisis de impedancia bioeléctrica (BIA), DXA y la resonancia magnética cuantitativa (QMR). Cada método tiene ventajas y desventajas que deben tenerse en cuenta antes de seleccionar una metodología particular para evaluar la composición corporal. Este protocolo seleccionado para utilizar DXA como método de comparación para el óxido de deuterio para evaluar la composición corporal, ya que el equipo está disponible como un recurso universitario básico con un costo mínimo, se requiere un tiempo mínimo por escaneo (30 s por murciélago), y no es sensible a variables como la temperatura corporal y el aislamiento de la piel.
Al adaptar la técnica de dilución de óxido de deuterio a una especie de interés, se debe iniciar un estudio piloto para determinar el tiempo necesario para el equilibrio18. Esto se puede hacer tomando una muestra de fondo, y una muestra de sangre cada 15 minutos después de la inyección. Para especies pequeñas como murciélagos, se pueden sangrar varios murciélagos en los diferentes intervalos de tiempo en lugar de un solo animal18. El tiempo de equilibrio puede cambiar cuando los animales, como los murciélagos, entran en torpor, lo que explica por qué algunos de nuestros animales tenían un porcentaje negativo de grasa corporal(Tabla 3). Si se obtiene un porcentaje negativo de grasa corporal, y la dosis de deuterio tuvo tiempo suficiente para equilibrar completamente con el agua corporal del animal, entonces es probable que la dosis no se inyectó completamente. Debido a que la técnica de dilución de óxido de deuterio depende en gran medida de la dosis completa que se administra y el registro preciso de la cantidad de deuterio inyectado, esta técnica sólo debe ser completada por individuos expertos en la realización de inyecciones. Además, los animales anestésicos o seantes pueden ayudar a garantizar que se pueda administrar toda la dosis.
Al administrar el óxido de deuterio, es importante determinar una concentración adecuada para administrar al animal. Utilizando una dosis de 0,7 g/kg para los gatos, la concentración de la solución en stock fue adecuada, mientras que para los grandes murciélagos marrones una dosis de 0,75 g/kg requería diluir la solución en stock de óxido de deuterio. Al diluir la solución en stock, se debe utilizar una solución isotónica como el 0,9% de NaCl. Para evitar alterar el agua corporal total de los pequeños mamíferos, diluir la dosis de óxido de deuterio lo más mínimamente posible, lo suficiente para garantizar que la dosis se puede medir con precisión.
Las dosis presentadas aquí son detectables utilizando espectrometría FTIR. La espectrometría FTIR es menos costosa y más fácil de mantener, pero no tan sensible como la espectrometría de masas de relación isótopo (IRMS)19,20. La espectrometría FTIR se puede utilizar para medir el enriquecimiento de deuterio en plasma y saliva, pero no se recomienda utilizar una célula de transmisión FTIR para analizar el enriquecimiento de deuterio en orina19. Si la orina es el tipo de muestra deseado, se debe utilizar un accesorio de reflexión total atenuada (ATR) con el FTIR o IRMS para evaluar el enriquecimiento de deuterio para el cálculo de TBW19.
Además, las dosis utilizadas para los gatos fueron adecuadas para permitir la detección de óxido de deuterio 14 días después de la inyección. Debido a que la concentración del óxido de deuterio 14 días después de la inyección era detectable, se pudo calcular el consumo de agua de los gatos(Figura 4). Este uso innovador de óxido de deuterio se puede emplear en estudios de campo para medir la rotación de agua corporal para especies con altas tasas de recaptura o para animales alojados en grupos en estudios ex situ o de laboratorio. Sin embargo, antes de emplear en estudios de campo, los investigadores deben evaluar si el animal puede ser capturado y retenido durante el período de equilibrio. Este período de manipulación prolongado es una de las desventajas de la técnica de óxido de deuterio y podría ser problemático ya que muchos permisos de especies en peligro de extinción limitan la duración que un animal en particular puede tener. Además, los animales no pueden haber comido recientemente ya que la técnica de lavado se basa en la medición de la masa corporal; por lo tanto, una comida reciente puede confundir los resultados. Una consideración adicional es si un animal debe ser anestesiado o sedado para la inyección subcutánea y las colecciones de sangre o si el animal puede ser restringido sin sedación/ anestesia. Se ha sugerido que la tasa de rotación del agua corporal podría ser un indicador significativo para la salud humana21. El aumento del consumo de agua en el gato 5(Figura 4)se documentó antes de las marcas bioquímicas tradicionales de la insuficiencia renal, y las concentraciones de creatinina y nitrógeno de urea en sangre (BUN) fueron elevadas, lo que sugiere que la rotación del agua corporal también podría ser un indicador de salud en los animales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Acuerdo Cooperativo MDC (#416), el Acuerdo Cooperativo de Servicio Forestal de los Estados Unidos (16-JV-11242311-118), la Academia Americana de Nutrición Veterinaria y Waltham/Royal Canin, LA Subvención de los Estados Unidos (número de subvención: 00049049), la beca de capacitación NIH (número de subvención: T32OS011126) y el Programa de Estudios Otoros de Investigación Veterinaria de la Universidad de Missouri. Los autores agradecen a Shannon Ehlers por pre-revisar este manuscrito. Agradecemos al Dr. Robert Backus por proporcionar las normas D2O y permitir el uso de su laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 micron non-pyrogenic disk filter | Argos Technologies | FN32S | nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile |
| 1.5 mL conical microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-9701 | 1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap |
| 10 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | MS-SEV10 | clear, sterile glass injection unit |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | sterile 10 mL syringe individually wrapped |
| 100 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | AL-SV10020 | clear, sterile glass injection unit |
| 20 gauge needle | Exel | 26417 | needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel |
| 22 gauge needle | Exel | 26411 | needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel |
| deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-25G | 99.9 atom % D |
| isofluorane | Vetone | 3060 | fluriso isoflurane, USP |
| OMNIC Spectra Software | ThermoFisher Scientific | 833-036200 | FT-IR standard software |
| petroleum jelly | Vaseline | 305212311006 | Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant |
| plastic capillary tubes | Innovative Med Tech | 100050 | sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length |
| Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell | International Crystal Laboratory | 0005D-875 | 0.05 mm Pathlength |
| sodium chloride | EMD Millipore | 1.37017 | suitable for biopharmaceutical production |
| Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer | ThermoFisher Scientific | 269-169400 | discontinued model, newer models available |
References
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