Summary
Dieser Artikel beschreibt die Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik bei zwei Säugetieren, einem Insektenfresser und Fleischfresser, um das gesamte Körperwasser, die magere Körpermasse, die Körperfettmasse und den Wasserverbrauch zu bestimmen.
Abstract
Körperzustands-Scoring-Systeme und Körperzustandsindizes sind gängige Techniken zur Beurteilung des Gesundheitszustands oder der Fitness einer Art. Körperzustands-Scoring-Systeme sind evaluatorabhängig und haben das Potenzial, sehr subjektiv zu sein. Körperzustandsindizes können durch Futtersuche, die Auswirkungen des Körpergewichts sowie statistische und inferentiale Probleme verwirrt werden. Eine Alternative zu Körperzustands-Scoring-Systemen und Körperzustandsindizes ist die Verwendung eines stabilen Isotops wie Deuteriumoxid zur Bestimmung der Körperzusammensetzung. Die Deuteriumoxid-Verdünnungsmethode ist eine wiederholbare, quantitative Technik zur Schätzung der Körperzusammensetzung bei Menschen, Wildtieren und heimischen Arten. Zusätzlich kann die Deuteriumoxidverdünnungstechnik verwendet werden, um den Wasserverbrauch eines einzelnen Tieres zu bestimmen. Hier beschreiben wir die Anpassung der Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik zur Beurteilung der Körperzusammensetzung bei großen braunen Fledermäusen (Eptesicus fuscus) und zur Beurteilung des Wasserverbrauchs bei Katzen (Felis catis).
Introduction
Körperzustands-Scoring-Systeme und Körperzustandsindizes sind gängige Techniken zur Beurteilung des Gesundheitszustands oder der Fitness einer Art1,2. Viele häusliche und zoologische Arten haben einzigartige Körperzustand Scoring (BCS) Systeme, die verwendet werden, um den Muskel eines Tieres und oberflächliches Fettgewebe3zu bewerten. Die BCS-Bewertung stützt sich jedoch auf den Bewerter, d. h., BCS ist eine objektive oder semiquantitative Messung, wenn sie von einem geschulten Bewerter bewertet wird. Bei Wildtierarten werden Körperzustandsindizes häufig anstelle von BCS verwendet und basieren auf einem Verhältnis von Körpermasse zu Körpergröße oder Körpermasse zu Unterarm2. Körperzustand Indizis werden oft durch die Auswirkungen der Nahrungssuche verwirrt und können durch Körpergröße sowie statistische und inferentialeProbleme4 verwirrt werden.
Eine Alternative zu Körperzustands-Scoring-Systemen und Körperzustandsindizes ist die Verwendung eines stabilen Isotops zur Bestimmung der Körperzusammensetzung. Ein häufig verwendetes stabiles Isotop ist Deuteriumoxid(D2O), eine nicht-radioaktive Form von Wasser, in dem die Wasserstoffatome Deuteriumisotope sind. Die in dieser Studie beschriebene Deuteriumoxid-Verdünnungsmethode kann eine nicht subjektive, quantitative und wiederholbare Technik sein, die zur Schätzung der Körperzusammensetzung beim Menschen5 und einer vielzahl n.S. 4,6,7verwendet wird. Diese Technik kann vorteilhaft für das Studium der Körperzusammensetzung in Wildtieren sein. Zum Beispiel kann es verwendet werden, um Längsänderungen in der Körperzusammensetzung zu bewerten, wie vor und nach einer Management-Aktion. Bei einigen Wildtierarten kann Deuteriumoxid jedoch den tatsächlichen Wassergehalt8überschätzen. Daher ist es bei der Anpassung der Technik für eine Art wichtig, die Methode zu validieren, indem die Deuteriumoxid-Methode mit der Schlachtkörperanalyse für nicht gefährdete Arten verglichen wird. Bei bedrohten und gefährdeten Arten sollte eine zerstörungsfreie Methode wie die duale Röntgenabsorptiometrie (DXA) als alternative Vergleichsmethode zur zerstörungsfreien Goldstandardmethode der vollständigen Schlachtkörperanalyse betrachtet werden.
Neben der Körperzusammensetzung kann dieD2O Verdünnungstechnik verwendet werden, um den Wasserverbrauch eines einzelnen Tieres9zu bestimmen. Diese einzigartige Anwendung von D2O kann nicht nur zur Beantwortung von Forschungsfragen verwendet werden, sondern kann auch für die Beurteilung des Wasserverbrauchs einzelner Tiere in großen sozialen Umgebungen nützlich sein.
Hier beschreiben wir die Anpassung der D2O Verdünnungstechnik zur Beurteilung der Körperzusammensetzung in einem Insektenfresser, großen braunen Fledermäusen (Eptesicus fuscus), und zur Beurteilung des Wasserverbrauchs in einem Fleischfresser, Katzen (Felis catis).
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Protocol
Alle hier beschriebenen Experimente wurden vom University of Missouri Animal Care and Use Committee genehmigt und im Rahmen der Wildlife Scientific Collection permit (Permit #16409 and #17649) des Missouri Department of Conservation (MDC) durchgeführt.
1. Herstellung einer sterilen, isotonischen, gesalzenenD2O Stofflösung
- Machen Sie eine 50 ml Lagerlösung von 9,0 g/l gesalzen D2O.
- Wiegen Sie 450 mg pharmazeutische NaCl und übertragen Sie alle NaCl in ein 100 ml sterilisiertes Becherglas. Notieren Sie die genaue Anzahl von NaCl bis 4 Dezimalstellen im Labor-Notebook.
- Mit einem sterilen abgestuften Zylinder 50 g von 99,8 % Deuteriumoxid messen und auf das sterile Becherglas übertragen, das den NaCl enthält. Notieren Sie die genaue Menge an Deuteriumoxid auf 4 Dezimalstellen im Labor-Notebook oder Inseton.
- Filter 10 ml isosmotische Stärke NaCl (9,0 g/l) durch einen nicht-pyrogenen sterilen Scheibenfilter mit submikronporen (0,2 m).
- Befestigen Sie eine 20 G Nadel am nicht-pyrogenen sterilen Scheibenfilter mit submikronporen (0,2 m) mit einem 10 ml Spritzenfass. In das Septum einer 100 ml sterilen leeren Durchstechflasche einlegen.
- Befestigen Sie ein Vakuumrohr an einer 22 G Nadel und legen Sie die Nadel in das Septum der 100 ml sterilen leeren Durchstechflasche ein.
- 10 ml der Lagerlösung in den Spritzenlauf gießen. Schalten Sie das Vakuum langsam ein, bis dieD2O-Lagerlösung langsam in die sterile Durchstechflasche zu filtern beginnt. Gießen Sie die D2O-Lagerlösung in den Spritzenlauf, bis alle 50 ml gefiltert sind.
HINWEIS: Die Stammlösung muss je nach benötigter Dosis möglicherweise verdünnt oder konzentriert werden. Die Dosis vonD2O variiert je nach Art und Empfindlichkeit der Analysemethode. Bei Katzen wurde die Arbeitslösung verwendet, um eine Dosis von 0,7 g/kgD2O zu verabreichen. Die oben beschriebene Stammlösung minimiert die Menge der NaCl-Lösung, die subkutan für das Tier eingeführt wird, während sie dennoch eine genaue Messung der Dosis ermöglicht. Bei kleinen Säugetieren wie Fledermäusen muss diese Konzentration zu einer funktionierenden Lösung wie 0,1600 g/ml verdünnt werden. Mit dieser Konzentration kann die Dosis von 0,75 g/kgD2O genau gemessen und in ca. 100 l oder weniger NaCl-Lösung verabreicht werden.
2. Herstellung von steriler, isotonischer, entsalzterD2O Lagerarbeitslösung für Fledermäuse
- Wiegen Sie eine 10 ml leere sterile Durchstechflasche und zeichnen Sie das Gewicht auf die nächsten 4 Dezimalstellen auf. Tare-Skala.
- Verwenden Sie eine 1,0 ml Spritze, um 0,65 ml derD2O-Lagerlösung auf die geteerte, 10 ml leere sterile Durchstechflasche zu übertragen. Rekordgewicht von D2O bis 4 Dezimalstellen. Tare-Skala.
- Berechnen Sie das Volumen von D2O in der 10 ml leeren Durchstechflasche. Verwenden Sie die folgende Gleichung.
wobei W ein gemessenes Gewicht und D die Dichte von 99,8%D2O (1,107 g/ml) ist. - Verwenden Sie das berechnete Volumen und das bekannte Gewicht derD2O, um das Volumen der isotonischen Salin zu bestimmen, das erforderlich ist, um eine Arbeitslösung für 0,1600 g/ml herzustellen.
- In das Septum der 10 ml sterilen Durchstechflasche, der 22 G Nadel (am Vakuumröhrchen befestigt) einlegen. In das Septum der 10 ml sterilen Durchstechflasche, der 20 G Nadel (befestigt an einem 0,22 m Spritzenfilter mit einem 10 ml Spritzenfass).
- Gießen Sie die berechnete Masse/Volumen isotonischer NaCl in den Spritzenlauf und schalten Sie das Vakuum ein, um einen langsamen Tropf in die sterile 10 ml Durchstechflasche zu ermöglichen.
- Zeichnen Sie das Gewicht der Durchstechflasche auf und stellen Sie sicher, dass eine Arbeitslösung mit einem Wert von 0,1600 g/mL erstellt wird.
3. Bestimmung der Körperzusammensetzung der großen braunen Fledermäuse (Eptesicus fucsus) mit D2O
HINWEIS: Die im Protokoll verwendete Lagerlösung VonD2O beträgt 0,1598 g/ml. Vor der Blutentnahme stellen Sie sicher, dass die Entfernung von bis zu 200 L Blut 10 % des gesamten Blutvolumens der Fledermaus beträgt und innerhalb der vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) festgelegten Richtlinien für die Blutentnahme liegt. Alle Tiere sollten gefastet oder Bauch gestreichelt werden, um einen leeren Magen zu gewährleisten. Eine kürzliche Mahlzeit könnte das Gewicht des Tieres verändern, was zu verwirrten Ergebnissen führt, da Berechnungen zur Bestimmung des Körperfetts auf der Körpermasse des Tieres beruhen.
- Anästhetisieren Sie eine große braune Fledermaus.
- Verwenden Sie 5,0% Isofluran zur Induktion. Halten Sie eine stabile Anästhesieebene mit 0,5% bis 3,0% Isofluran.
- Bestimmen Sie die richtige Anästhesietiefe, indem Sie den Pedalentzugsreflex testen (die Zehen der Fledermaus kneifen). Die Fledermaus sollte nicht auf das Gefühl reagieren und die Atemfrequenz sollte langsam und stabil bleiben. Stellen Sie Isofluran nach Bedarf ein, um eine stabile Anästhesieebene aufrechtzuerhalten.
- Rekord-Isofluran-Spiegel, Herzfrequenz, Atemfrequenz, und andere Informationen, wie von IACUC gefordert.
- Wiegen Sie die große braune Fledermaus und notieren Sie das Gewicht auf 4 Dezimalstellen.
- Das Uropatagium (Schwanzmembran) über der zwischenmenschlichen Vene mit einem Alkohol-Prep-Pad reinigen und trocknen lassen. Tragen Sie eine dünne Schicht Petroleumgelee über die zwischenmenschliche Vene auf.
- Verwenden Sie eine 29 G Nadel, um den dorsalen Teil der interfemoralen Vene zu durchstechen und 100 l Blut mit Kunststoff-Natriumheparinkapillarröhren zu sammeln. Sorgen Sie für eine ausreichende Vermischung des Vollblutes mit dem Natriumheparin, indem Sie jedes Rohr nach der Entnahme sanft rollen und das Rohr beschriften.
- Mit einer DXA-Maschine für kleine Säugetiere kalibriert, erhalten sie drei DXA-Scans der Fledermaus10.
- Bestimmen Sie die Masse (in g) vonD2O zu injizieren, indem Sie das Fledermausgewicht in kg mit derD2O-Dosis von 0,75 g/kg multiplizieren. Bestimmen Sie das Volumen derberechneten D2O-Dosis (V), indem Sie das Gewicht derD2O-Dosis durch die Konzentration der Arbeitslösung dividiert.
- Verwenden Sie eine Insulinspritze mit einer 29 G Nadel, die angebracht ist, um das berechnete Volumen vonD2O zu erstellen. Wiegen Sie dieD2O, Insulinspritze und Nadel. Auf 4 Dezimalstellen aufzeichnen.
- Injizieren Sie die D2O subkutan über die dorsale Hüftregion der anästhesierten Fledermaus.
- Lassen Sie Fledermaus von Anästhesie erholen und die Zeit der Injektion aufzeichnen.
- Unmittelbar nach der Injektion die nun leere Insulinspritze mit der 29 G Nadel abwägen. Zeichnen Sie die Gewichtung auf 4 Dezimalstellen auf.
- Bestimmen Sie die Dosis vonD2O injiziert, indem Sie das Gewicht der Insulinspritze nach der Injektion von der Vorinjektions-D2 O gefüllten Insulinspritze subtrahieren. Auf 4 Dezimalstellen aufzeichnen.
- Innerhalb von 30 min nach der Blutentnahme verwenden Sie eine Hämatokritzentrifuge, um jedes Kapillarrohr für 5 min zu spinnen. Wenn die Hämatokritzentrifuge mehrere Geschwindigkeiten zulässt, stellen Sie 10.000 x gein.
- Verwenden Sie eine scharfe Schere, um das Kunststoffkapillarrohr zwischen Vollblut und Plasma zu schneiden. Verwenden Sie eine 200-L-Pipette, um das Plasma direkt in ein beschriftetes, 500-L-Speicherrohr zu vertreiben.
- Nach der Ausgleichsperiode, sammeln Sie weitere 100 L Blut aus der zwischenfmoralen Vene.
HINWEIS: Die Ausgleichsperiode variiert je nach Art und wenn die Fledermäuse in Torpor gehen. Für große braune Fledermäuse, in der Regel 2 h ist ausreichend für die Gleichgewichtszeit. - Trennen Sie Plasma in ein zweites markiertes, 500 L Mikrozentrifugen-Schrauben-Oberrohr, indem Sie Schritt 3.13 wiederholen. Proben bei -20 °C oder kälter bis zur Analyse lagern.
4. Fourier-Transform-Infrarot-Spektrophotometrie-Analyse
- Stellen Sie die Temperatur eines Sandbades auf 60 °C ein, um die Destillation zu erleichtern (die Trennung von Wasser und D2O von anderen Blutbestandteilen zu ermöglichen).
- Pipette 50 l jeder Plasmaprobe und Standard auf die Innenseite einer 1,5 ml konischen mikrozentrifugenrohren Kappe. Einschließlich Normen, die bekannte Konzentrationen vonD2O als Qualitätskontrolle enthalten.
HINWEIS: Idealerweise hat jedes Tier drei Wiederholungen pro Probe und den Durchschnitt der drei gemeldeten Replikationen. Aufgrund des begrenzten Probenvolumens und des Probenvolumens, das für die von den Autoren verwendeten FT-IR-Geräte benötigt wird, wurden keine Wiederholungen für die Fledermausproben durchgeführt. Wenn eine Probe weniger als 50 l Plasma enthält, pipette die Probenmenge auf die konische Mikrozentrifugenrohrkappe und zeichnet das Volumen auf. - Halten Sie die Mikrozentrifugenkappe auf den Kopf und schrauben Sie das 1,5 ml konische Mikrozentrifugenrohr auf die Kappe. Legen Sie das umgekehrte (umgedrehte) Rohr mit der Kappe mindestens 12 h (übernachtungsfrei) in Kontakt mit dem Sand in das Sandbad.
- Nach 12 h die Kappe entfernen und durch eine neue, saubere Kappe ersetzen. Pulsieren Sie das Mikrozentrifugenrohr für 10 s in einer Zentrifuge.
- Erstellen Sie folgende Normen: 0 ppm (0 mg D2O in 1 L destilliertem Wasser), 293 ppm (293 mg D2O in 1 L destilliertem Wasser), 585 ppm (585 mgD2O in 1 L destilliertes Wasser), 878 ppm (878 mg D2O in 1 L destilliertem Wasser) und 1170 ppm D2O (1170 mgD2O in 1 L destilliertem Wasser).
HINWEIS: Die oben genannten Werte werden für eine Standardkurve vorgeschlagen. Alternative Werte wie 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm usw. können verwendet werden. - Installieren Sie eine flüssige Übertragungszelle in das Fourier-transformierte Infrarotspektrophotometrie (FTIR) Spektrometer (Tabelle der Materialien). Füllen Sie die Zelle mit Methanol und verbinden Sie den Injektionsanschluss. Füllen Sie die Zelle langsam mit Hintergrundwasser, während Sie die Methanolspritze vorsichtig entfernen, um das Risiko von Luftblasen zu reduzieren. Schließen Sie Schläuche an den Ausgangsanschluss an, um das Entfernen der Proben nach der Analyse zu ermöglichen.
- Bereiten Sie die FTIR-Spektrometer-Software (Materialtabelle) für die Analyse von D2O in Wasser vor. Die Parametereinstellungen für die in diesem Protokoll verwendete Spektrometersoftware sind in Tabelle 1aufgeführt.
- Sammeln Sie eine Hintergrundprobe mit dem Verdünnungsmittel, 0,22 m-gefiltertem, destilliertem Wasser. Dabei sollte es sich um das gleiche Wasser handelt, das für die Normen verwendet wird.
- Injizieren Sie 40 l der 0 ppm D2O und nehmen Sie die Spektren auf. Speichern Sie die Spektren als CSV-Datei (CSV) (Comma separated Values).
- Setzen Sie die Injektion und Speicherung der Spektren aller Standards fort, um eine Standardkurve zu erstellen.
- Wiederholen Sie den Hintergrund und die Standardkurve alle 60 bis 90 min.
- In jizieren Sie 40 l jeder destillierten Probe in die flüssigkeitsgebundene Übertragungszelle und speichern Sie die Spektren.
HINWEIS: Ändern Sie das Injektionsvolumen der Normen und destillierten Proben basierend auf dem Volumen der flüssigen Übertragungszelle. Verwenden Sie eine flüssigkeitsübertragungszelle mit kleinerem Volumen, wenn das Probenvolumen unter 40 l liegt, oder verdünnen Sie 1:1 mit Hintergrunddestilliertem Wasser. - Bestimmen Sie die Konzentration von D2O jeder Probe aus den FTIR-Spektren mit einem Tabellenkalkulationsprogramm, wie von Jennings et al.11 oder der Spektralsoftware beschrieben. Wenn Replikationen durchgeführt werden, verwenden Sie die durchschnittliche Konzentration, um die Körperzusammensetzung zu berechnen.
5. Berechnung der Körperzusammensetzung
- Konvertieren Sie die Deuteriumanreicherung (ppm) in Atomprozentkonzentration für jede Probe mit der folgenden Gleichung12:
wobei x die gemessene Deuteriumanreicherung (ppm) der Probe und 0,0001557 der im Wiener Standard Mean Ocean Water (VSMOW)13gemeldete Molanteil des Deuteriums ist. - Berechnen Sie das Gesamtkörperwasser für jede Probe mit der folgenden Gleichung4,12,14:
)
wobei E die gemessene Anreicherung ist (Atom%) deuterium in der Probe nach Hintergrundkorrektur, B ist die Injektionsmasse in g, und 0,998 ist die Konzentration der injiziertenD2O.
HINWEIS: Deuteriumaustausch mit labilem Wasserstoff verursacht eine 2% Überschätzung der gesamten Körperwassermasse. Das gesamte Körperwasser sollte korrigiert werden, indem die Gesamtgewichtschätzung der Körperwassermasse um 2 % des Körpergewichts verringert wird. - Schätzen Sie die fettfreie Masse (schlanke Körpermasse und alle anderen nicht-Fett-Komponenten) jeder Fledermaus mit der folgenden Gleichung:
HINWEIS: Verwenden Sie den konventionell akzeptierten Wert von 0,732 für den fraktionierten Feuchtigkeitsgehalt der schlanken Körpermasse für gesunde, euhydrierte, nicht laktierende Fledermäuse. Der fraktionierte Feuchtigkeitsgehalt der fettfreien Masse kann sich in laktierenden großen Brauntönen auf Basis der postpartalen Woche15ändern. Für andere Arten verwenden Sie die in der Literatur veröffentlichten Werte oder bestimmen Sie den fraktionierten Feuchtigkeitsgehalt der mageren Körpermasse, bevor Sie Berechnungen der schlanken Körpermasse durchführen. - Schätzen Sie die Körperfettmasse mit der folgenden Gleichung:
- Konvertieren Sie die Körperfettmasse in g in Prozent Körperfettmasse mit der folgenden Gleichung:
)
6. Bestimmung der Wasserzusammensetzung in einem Fleischfresser (Felis catus, Hauskatze)
- Bereiten Sie die Lagerlösung wie in Abschnitt 1 beschrieben vor.
- Wiegen Sie jede Katze auf die nächsten 3 Dezimalstellen und zeichnen Sie das Gewicht auf. Berechnen Sie die Dosis für jede Katze wie in Schritt 3.6 beschrieben mit einerD2O-Dosis von 0,70 g/kg.
- Bereiten Sie jede Dosis wie in den Schritten 3.7-3.8 beschrieben vor. mit einer 3 ml oder 5 ml Spritze mit einer 22 G Nadel anstelle einer Insulinspritze.
- Sammeln Sie 500 l Vollblut und verabreichen Sie anschließend subkutan die 0,7 g/kgD2O. Zentrifuge Vollblut bei 2.000 x g für 15 min und speichern Sie Plasma in 1,5 ml Mikrozentrifuge Schraube Top-Röhren bei -20°C bis zur Analyse.
- Sammeln Sie 500 l Vollblut 4 h nach der Injektion. Zentrifugieren Sie Vollblut bei 2.000 x g für 15 min und lagern Sie Plasma in 1,5 ml Mikrozentrifugen-Schraub-Top-Röhren bei -20 °C bis zur Analyse.
- Sammeln Sie 14 Tage nach der Injektion 500 L Vollblut. Zentrifugieren Sie Vollblut bei 2.000 x g für 15 min und lagern Sie Plasma in 1,5 ml Mikrozentrifugen-Schraub-Top-Röhren bei -20 °C bis zur Analyse.
HINWEIS: Die Anzahl der Tage zwischen der Blutentnahme kann auf den experimentellen Bedürfnissen und der Zeit nach der Injektion basieren, in der D2O über den Hintergrundniveaus nachgewiesen werden kann. Vierzehn Tage war die Länge der diätetischen Behandlungsblöcke von Hooper et al.9. - Führen Sie die FT-IR-Analyse gemäß Abschnitt 4 durch und berechnen Sie die Körperzusammensetzung gemäß Abschnitt 5 dieses Protokolls.
- Berechnen Sie den Wasserverbrauch in ml/Tag anhand der folgenden Gleichungen:
wobei TBW Gesamtkörperwasser ist, sind die Anfangswerte D2O und EndD2O die in ppm in den Proben nach der InjektionD2O gemessenen Konzentrationen.
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Representative Results
Die Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik kann verwendet werden, um die Körperzusammensetzung einer Vielzahl von Arten zu bewerten. Um die Anpassungsfähigkeit zu demonstrieren, berichten wir über den ersten Einsatz der Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik bei einer nordamerikanischen insektenfressenden Fledermausart, Eptesicus fuscus, der großen braunen Fledermaus für repräsentative Ergebnisse. Ein Timing-Plateau wurde durch die Einnahme von Blutproben vor und nach D2O abgeschlossen, wie es bei jeder Art der Art geschehen sollte, bei der die Ausgleichsperiode unbekannt ist. Es wurde festgestellt, dass zwei Stunden nach der Injektion bei nicht-torpid Fledermäuse nfürsisch ausreichend für die Gleichgewichtium. Mit der Gleichgewichtszeit bekannt, die gesamte Körperwasser, magere Körpermasse, und Körperfettmasse für 13 wild gefangene große braune Fledermäuse und 8 gefangene große braune Fledermäuse wurden bestimmt (Tabelle 2). Weitere 2 wild gefangene große braune Fledermäuse und 5 gefangene große braune Fledermäuse wurden bestimmt, um eine negative Körperfettmasse zu haben. Eine negative Körperfettmasse wird aufgrund eines oder mehrerer der folgenden Gründe berechnet: nicht die gesamte Dosis von Deuteriumoxid erhalten, während der Gleichgewichtsphase torpid werden, ungewöhnlich große Fettmassen und minimale magere Masse haben, oder Fledermäuse mit unter 3% 5% Körperfett, wie durch DXA bestimmt (Tabelle 3).
White-Nose-Syndrom hat viele Fledermausarten zu sinken verursacht, so dass die Technik mit dem Körperfett mit DXA gemessen verglichen wurde. Abbildung 1 zeigt den durch dieD2O-Verdünnungstechnik und DXA (n = 19) ermittelten Körperfettanteil. Die beiden Techniken waren gut korreliert mit einem Pearson r = 0,897 (Abbildung 2) und waren statistisch nicht unterschiedlich (einwegige Varianzanalyse (ANOVA), F-Wert = 0,366, p = 0,549). Das Körperfett zeigte starke Korrelationen zwischen Körperfett und Körpergewicht (Abbildung 3). Die D2O Verdünnungstechnik überließ oder unterschätzte die Körperfettmasse nicht konsequent.
Die Deuteriumoxid-Methode wurde zuvor bei Katzen16validiert. Tabelle 4 zeigt ein Beispiel für das gesamte Körperwasser, die schlanke Körpermasse und die Körperfettmasse einer einzelnen Katze9. Hooper et al.9 war der erste, der über die Verwendung von Deuteriumoxidverdünnung berichtete, um den Wasserverbrauch von sozial untergebrachten Tieren mit dem täglichen Wasserverbrauch der Katzen während jedes Ernährungsblocks des Experiments zu messen, wie in Abbildung 4dargestellt.
Abbildung 1: Deuteriumoxid- und DXA-Liniendiagramm. Jeder Punkt stellt den Körperfettanteil einer einzelnen Fledermaus dar, der durch DXA oder Deuteriumoxid bestimmt wird. Der Mittelwert ist der hellgrüne Punkt mit Fehlerbalken, die den Standardfehler des Mittelwerts anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Anteil des Körperfetts bei großen braunen Fledermäusen. Deming Regression (solide blaue Linie, Pearson s r = 0.897) Vergleich des Prozentsatzes des Körperfetts durch DXA (x-Achse, die Referenzmethode) und den Prozentsatz des Körperfetts durch Deuteriumoxid (y-Achse, die Testmethode) in großen braunen Fledermäusen mit 95% Konfidenzintervallen durch graue Schattierung bestimmt. Die gezeichnete grüne Strichidentitätslinie stellt die Regressionslinie dar, wenn die Methoden gleich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Prozentsatz des Körperfetts in großen braunen Fledermäusen im Vergleich zum Körpergewicht. Körpergewicht jeder Fledermaus gegen den Körperfettanteil durch D2O oder DXA bestimmt. Es besteht eine starke Korrelation zwischen Körpergewicht und Körperfett, wie durch DXA (dunkelblaue Linie, Pearsons r = 0,88) und D2O (blaue Linie, Pearsons r = 0,86) bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Wasserverbrauch von sozial untergebrachten Katzen. Repräsentative Ergebnisse des täglichen Wasserverbrauchs von sozial untergebrachten Katzen während eines Experiments zur Bewertung der Auswirkungen von Nahrungsbestandteilen auf den Wasserverbrauch. Diese Zahl wurde von Hooper et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Parameter | Einstellung |
| Anzahl der Scans | 64 |
| Auflösung | 2 |
| Datenabstand | 0.946 cm-1 |
| Endgültiges Format | Absorption |
| Korrektur | nichts |
| Verwenden fester Y-Achsengrenzen im Sammlungsfenster | Min -0,01, Max 0,03 |
| Bench-Sortiment | Max 6.38, Min -5.02, Loc 1024 |
| Absorbierende Spitzenempfindlichkeit insgesamt | 50 |
| Fransen oder Channeling-Empfindlichkeit | 80 |
| Derivative Spitzen Empfindlichkeit | 51 |
| Baseline-Fehlerempfindlichkeit | 50 |
| CO2-Pegelempfindlichkeit | 19 |
| H2O-Pegel Empfindlichkeit | 19 |
| Apodisierungsmodus | Happ-Genzel |
| Phasenkorrektur | Mertz |
| Filter, die auf | Geschwindigkeit |
| Tiefpassfilter | 11,000 |
| Hochpassfilter | 20 |
Tabelle 1: Einstellungen der Spektralsoftware. Parametereinstellungen für Spektralaufzeichnungssoftware.
| Tier | Spezies | Körpergewicht (kg) |
D2O injiziert g) |
Gesamtkörperwasser g) |
Schlanke Körpermasse g) |
Körperfettmasse g) |
Körperfettmasse (%) |
DXA mager + bmc g) |
DXA-Fett g) |
DXA-Fett (%) |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.01715 | 0.0740 | 11.80 | 16.15 | 1.00 | 5.80 | 14.65 | 0.75 | 4.80 |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.01950 | 0.0920 | 13.80 | 18.83 | 0.69 | 3.50 | 16.20 | 1.40 | 7.90 |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.01677 | 0.08 | 11.33 | 15.47 | 1.30 | 7.74 | 11.33 | 1.30 | 7.74 |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.02129 | 0.097 | 12.51 | 17.09 | 4.20 | 19.7 | 15.9 | 19.65 | 19.2 |
Tabelle 2: Körperzusammensetzung von großen braunen Fledermäusen. Die repräsentativen Ergebnisse von Gesamtkörperwasser, magerer Körpermasse und Körperfett, wie durch Deuteriumoxid-Verdünnung in großen braunen Fledermäusen bestimmt sind, sind in den Spalten 5-8 gezeigt. Repräsentative Ergebnisse der schlanken Körpermasse plus Knochenmineralgehalt und Körperfett, wie durch DXA in den gleichen großen braunen Fledermäusen bestimmt sind, sind in den Spalten 9-11 gezeigt.
| Tier | Spezies | Körpergewicht (kg) |
D2O injiziert g) |
Gesamtkörperwasser g) |
Schlanke Körpermasse g) |
Körperfettmasse g) |
Körperfettmasse (%) |
DXA mager + bmc g) |
DXA-Fett g) |
DXA-Fett (%) |
Kommentar |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.0277 | 0.1299 | 34.18 | 46.69 | -19.02 | -68.74 | 9.90 | 26.55 | 62.80 | Equili-Brationszeit unzureichend |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.0185 | 0.0810388 | 64.23 | 87.75 | -69.25 | -374.33 | 14.20 | 17.30 | 17.95 | Volle Dosis nicht injiziert |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.0164 | 0.0719 | 17.38 | 23.74 | -7.33 | -44.68 | 14.15 | 14.40 | 1.70 | Weniger als 3% Fett |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.0212 | 0.0994 | 54.57 | 74.54 | -53.37 | -252.0 | 16.41 | 19.01 | 13.65 | Fledermaus wurde torpid (cool zu berühren) |
Tabelle 3: Körperzusammensetzung von großen braunen Fledermäusen. Repräsentative Ergebnisse von Fledermäusen, die nicht die gesamte Dosis von Deuteriumoxid erhalten, wurde torpid während der Gleichgewichtsphase, Fledermäuse mit ungewöhnlich großen Fettmasse und minimale magere Masse, oder Fledermäuse unter 3%-5% Körperfett, wie durch DXA bestimmen. Die repräsentativen Ergebnisse von Gesamtkörperwasser, magerer Körpermasse und Körperfett, wie durch Deuteriumoxidverdünnung bestimmt, sind in den Spalten 5-8 dargestellt. Repräsentative Ergebnisse der schlanken Körpermasse plus Knochenmineralgehalt und Körperfett, wie durch DXA bestimmt, sind in den Spalten 9-11 dargestellt.
| Block | Spezies | Körpergewicht (kg) |
D2O injiziert g) |
Gesamtkörperwasser (kg) |
Schlanke Körpermasse (kg) |
Körperfettmasse (kg) |
Körperfettmasse (%) |
Täglicher Wasserverbrauch (mL/Tag) |
Diätetische Behandlung |
| 1 | Felis Catus | 4.830 | 3.36 | 2.69 | 3.68 | 1.149 | 23.8 | 96.8 | Steuerung |
| 2 | Felis Catus | 4.764 | 3.45 | 2.66 | 3.63 | 1.136 | 23.8 | 217.5 | Hohe Feuchtigkeit |
| 3 | Felis Catus | 4.727 | 3.25 | 2.50 | 3.41 | 1.314 | 27.8 | 125.1 | Hohes Selen |
Tabelle 4: Körperzusammensetzung und Wasserverbrauch in einer einzigen Katze. Repräsentative Ergebnisse der Deuteriumoxid-Dilutionaltechnik zur Beurteilung der mageren Körpermasse, Fettmasse und des Wasserverbrauchs einer Katze an drei verschiedenen Zeitpunkten während der von Hooper et al.9durchgeführten Studie.
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Discussion
Die Verwendung von Deuteriumoxid zur Bestimmung von TBW wird seit den 1940erJahren 17 verwendet und wird beim Menschen und einer Vielzahl von Haus- und Wildtierarten4,6,7verwendet. Weitere zerstörungsfreie Techniken wurden entwickelt, darunter bioelektrische Impedanzanalyse (BIA), DXA und quantitative Magnetresonanz (QMR). Jede Methode hat Vor- und Nachteile, die vor der Auswahl einer bestimmten Methode zur Beurteilung der Körperzusammensetzung berücksichtigt werden sollten. Dieses Protokoll wählte die Verwendung von DXA als Vergleichsmethode für Deuteriumoxid zur Beurteilung der Körperzusammensetzung, da das Gerät als Kernressource der Universität mit minimalen Kosten zur Verfügung steht, minimale Zeit pro Scan (30 s pro Fledermaus) benötigt wird und es nicht empfindlich auf Variablen wie Körpertemperatur und Hautisolierung reagiert.
Bei der Anpassung der Deuteriumoxidverdünnungstechnik an eine Art von Interesse sollte eine Pilotstudie eingeleitet werden, um die Zeit zu bestimmen, die für den Ausgleich erforderlich ist18. Dies kann durch die Entnahme einer Hintergrundprobe und einer Blutprobe alle 15 Minuten nach der Injektion erfolgen. Für kleine Arten wie Fledermäuse, mehrere Fledermäuse können in den verschiedenen Zeitintervallen anstelle eines einzelnenTieres 18geblutet werden. Die Ausgleichszeit kann sich ändern, wenn Tiere, wie Fledermäuse, in Torpor gehen, was erklärt, warum einige unserer Tiere ein negatives Prozent Körperfett hatten (Tabelle 3). Wenn ein negatives Prozent Körperfett erhalten wird und die Deuteriumdosis genügend Zeit hatte, um vollständig mit dem Körperwasser des Tieres auszugleichen, dann ist es wahrscheinlich, dass die Dosis nicht vollständig injiziert wurde. Da die Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik in hohem Maße von der vollen Verabreichung der Dosis und der genauen Aufzeichnung der Menge des injizierten Deuteriums abhängt, sollte diese Technik nur von Personen durchgeführt werden, die in der Durchführung von Injektionen geschult sind. Darüber hinaus können anästhesierende oder sedierende Tiere dabei helfen, sicherzustellen, dass die gesamte Dosis verabreicht werden kann.
Bei der Verabreichung des Deuteriumoxids ist es wichtig, eine geeignete Konzentration zu bestimmen, die dem Tier verabreicht werden soll. Bei Verwendung einer Dosis von 0,7 g/kg für die Katzen war die Konzentration der Stammlösung angemessen, während bei den großen braunen Fledermäusen eine Dosis von 0,75 g/kg die Verdünnung der Lagerlösung von Deuteriumoxid erforderte. Bei der Verdünnung der Stammlösung sollte eine isotonische Lösung wie 0,9% NaCl verwendet werden. Um zu vermeiden, dass das gesamte Körperwasser kleiner Säugetiere verändert wird, verdünnen Sie die Dosis von Deuteriumoxid so minimal wie möglich, gerade genug, um sicherzustellen, dass die Dosis genau gemessen werden kann.
Die hier vorgestellten Dosen sind mit DerFTIR-Spektrometrie nachweisbar. FTIR Spektrometrie ist kostengünstiger und einfacher zu warten, aber nicht so empfindlich wie Isotopenverhältnis Massenspektrometrie (IRMS)19,20. FTIR-Spektrometrie kann verwendet werden, um die Deuteriumanreicherung in Plasma und Speichel zu messen, aber es wird nicht empfohlen, eine FTIR-Übertragungszelle zu verwenden, um die Deuteriumanreicherung im Urin zu analysieren19. Wenn Urin der gewünschte Probentyp ist, sollte eine abgeschwächte Gesamtreflexionsanlage (ATR) mit dem FTIR verwendet werden oder IRMS sollte verwendet werden, um die Deuteriumanreicherung für die Berechnung von TBW19zu bewerten.
Darüber hinaus waren die Dosen, die für die Katzen verwendet wurden, ausreichend, um den Nachweis von Deuteriumoxid 14 Tage nach der Injektion zu ermöglichen. Da die Konzentration des Deuteriumoxids 14 Tage nach der Injektion nachweisbar war, konnte der Wasserverbrauch der Katzen berechnet werden (Abbildung 4). Diese innovative Verwendung von Deuteriumoxid kann in Feldstudien eingesetzt werden, um den Körperwasserumsatz für Arten mit hohen Rückfangraten oder für Tiere zu messen, die in Gruppen ex situ oder Laborstudien untergebracht sind. Vor dem Einsatz in Feldstudien müssen die Forscher jedoch beurteilen, ob das Tier für die Dauer des Ausgleichszeitraums gefangen und gehalten werden kann. Diese längere Handhabungszeit ist einer der Nachteile der Deuteriumoxid-Technik und könnte problematisch sein, da viele gefährdete Arten die Dauer des Haltens eines bestimmten Tieres begrenzen. Darüber hinaus können Tiere in letzter Zeit nicht gegessen haben, da die Auswaschtechnik auf der Messung der Körpermasse beruht; Daher kann eine kürzliche Mahlzeit die Ergebnisse verwirren. Eine weitere Überlegung ist, ob ein Tier für subkutane Injektionen und Blutentnahmen beästigt oder sediert werden muss oder ob das Tier ohne Sedierung/Anästhesie zurückgehalten werden kann. Es wurde vorgeschlagen, dass die Rate des Umsatzes mit Körperwasser ein wichtiger Indikator für die menschliche Gesundheit sein könnte21. Der erhöhte Wasserverbrauch in Kat 5 (Abbildung 4) wurde vor traditionellen biochemischen Zeichen des Nierenversagens dokumentiert, und die Konzentrationen von Kreatinin und Harnstoffstickstoff im Blut (BUN) wurden erhöht, was darauf hindeutet, dass der Körperwasserumsatz auch ein Indikator für die Gesundheit von Tieren sein könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch MDC Cooperative Agreement (#416), US Forest Service Cooperative Agreement (16-JV-11242311-118), American Academy of Veterinary Nutrition und Waltham/Royal Canin, USA Grant (Grant-Nummer: 00049049), NIH-Ausbildungsstipendium (Grant-Nummer: T32OS011126) und das University of Missouri Veterinary Research Scholars Program. Die Autoren danken Shannon Ehlers für die Vorprüfung dieses Manuskripts. Wir danken Dr. Robert Backus für die Bereitstellung der D2O-Standards und die Nutzung seines Labors.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 micron non-pyrogenic disk filter | Argos Technologies | FN32S | nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile |
| 1.5 mL conical microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-9701 | 1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap |
| 10 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | MS-SEV10 | clear, sterile glass injection unit |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | sterile 10 mL syringe individually wrapped |
| 100 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | AL-SV10020 | clear, sterile glass injection unit |
| 20 gauge needle | Exel | 26417 | needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel |
| 22 gauge needle | Exel | 26411 | needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel |
| deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-25G | 99.9 atom % D |
| isofluorane | Vetone | 3060 | fluriso isoflurane, USP |
| OMNIC Spectra Software | ThermoFisher Scientific | 833-036200 | FT-IR standard software |
| petroleum jelly | Vaseline | 305212311006 | Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant |
| plastic capillary tubes | Innovative Med Tech | 100050 | sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length |
| Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell | International Crystal Laboratory | 0005D-875 | 0.05 mm Pathlength |
| sodium chloride | EMD Millipore | 1.37017 | suitable for biopharmaceutical production |
| Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer | ThermoFisher Scientific | 269-169400 | discontinued model, newer models available |
References
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