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Developmental Biology

गल, Culturing, और Cryopreserving Drosophila सेल लाइनों

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59459
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Drosophila Genomics Resource Center, Department of Biology, Indiana University Bloomington

Summary

Drosophila सेल लाइनों मौलिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान दोनों के लिए महत्वपूर्ण अभिकर्मकों हैं । यह लेख thawing के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है, subculturing, और आमतौर पर इस्तेमाल किया Drosophila सेल लाइनों के cryopreservation अपने अनुसंधान में इन अभिकर्मकों के उपयोग को शामिल करने में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए ।

Abstract

वहां वर्तमान में १६० अलग drosophila सेल Drosophila जीनोमिक्स संसाधन केंद्र (DGRC) द्वारा वितरित लाइनों से अधिक कर रहे हैं । जीनोम इंजीनियरिंग के साथ, उपंयास सेल लाइनों की संख्या में वृद्धि की उंमीद है । DGRC को पूरक और उनके अनुसंधान एजेंडा ड्राइव करने के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में Drosophila सेल लाइनों का उपयोग कर के साथ शोधकर्ताओं परिचित करना है । अलग विशेषताओं के साथ Drosophila सेल लाइनों की एक किस्म के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं, thawing के लिए प्रोटोकॉल सहित प्रदान की जाती हैं, culturing, और cryopreserving सेल लाइनों । महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रकाशन सबसे अच्छा करने के लिए drosophila सेल लाइनों के साथ काम करने के लिए आवश्यक प्रथाओं को दर्शाता है कि अपस्थानिक सूक्ष्मजीवों या अंय सेल लाइनों से क्रासॅ के जोखिम को कम । शोधकर्ताओं ने जो इन प्रक्रियाओं से परिचित हो कई अनुप्रयोगों है कि biochemistry सहित Drosophila सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग में तल्लीन करने में सक्षम हो जाएगा, कोशिका जीव विज्ञान और कार्यात्मक जीनोमिक्स ।

Introduction

Drosophila सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग vivo में पूरक आनुवंशिक विश्लेषण मक्खी और कई बुनियादी जैविक प्रश्नों1,2,3को संबोधित करने के लिए एक प्राथमिक जांच उपकरण के रूप में कार्य करता है । Drosophila सेल लाइनों अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ विभिन्न ऊतक स्रोतों से व्युत्पंन कोशिकाओं की अनूठी समरूप आबादी प्रदान करते हैं । सेल लाइनों ट्रांसजेनिक जीन अभिव्यक्ति, जीनोमिक्स, transक्रिप्टोमिक्स, proteomics, metabolomics, उच्च थ्रॉपुट आरएनए हस्तक्षेप (Rna) स्क्रीन, सेल बायोलॉजी और माइक्रोस्कोपी सहित कई अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं । महत्वपूर्ण बात, Drosophila सेल संस्कृति का उपयोग ज्ञात उत्तेजनाओं को तत्काल लौकिक प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन की सुविधा । इसके अलावा, drosophila सेल संस्कृति crispr करने के लिए उत्तरदाई है-Cas9 जीनोम संपादन, यह अपेक्षाकृत आसान बनाने के लिए विशिष्ट जीनोम संशोधनों के साथ नए सेल लाइनों बनाने के4,5,6, 7.

Drosophila जीनोमिक्स संसाधन केंद्र (DGRC) एक भंडार और drosophila सेल लाइनों के लिए वितरण केंद्र के रूप में कार्य करता है । DGRC के लक्ष्यों में से एक Drosophila सेल संस्कृति संसाधनों का उपयोग करने में अनुसंधान समुदाय के सदस्यों की सहायता करने के लिए है । यह आलेख Drosophila कक्ष रेखाओं की हैंडलिंग के लिए मूल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । यह मौजूदा संसाधनों को मदद करने के लिए शोधकर्ताओं drosophila सेल संस्कृतियों हैंडलिंग और उनके प्रयोगों में स्वतंत्रता के एक स्तर को प्राप्त करने के साथ सहज हो पूरक1,2,8,9 ,10.

सबसे अधिक इस्तेमाल किया drosophila सेल लाइनों रहे हैं: schneider लाइनों11, Kc16712, मित्सुबिशी/miyake पूर्णक डिस्क और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) लाइनों13,14, मिलनर प्रयोगशाला पूर्णक डिस्क लाइनों 15, वयस्क ओवेरियन कोशिका रेखाएं16,17, और रास रेखाएं18 (तालिका 1) । Schneider और Kc167 lines सामांय सभी प्रयोजन कोशिका लाइनों biochemistry, पुनः संयोजक ट्रांसजेनिक जीन अभिव्यक्ति, और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन में उपयोग के लिए कर रहे हैं । मित्सुबिशी/मियाके प्रयोगशाला (एमएल) लाइनों या तो लार्वा पूर्णक डिस्क या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से व्युत्पंन किया गया और वे neurosecretion, प्रतिलेखन विनियमन, और आरएनए प्रसंस्करण से संबंधित अध्ययन के लिए उपयोगी रहा है । मिल्नर (सीएमई) डिस्क लाइनें सिग्नल ट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण रही हैं । उत्परिवर्ती वयस्क अंडाशय से व्युत्पन्न एफजीएस/ओएसएस कोशिका रेखाएँ रोगाणु कोशिका अनुरक्षण और विभेद17,19में गैर-कोडिंग लघु आरएनए जीव विज्ञान के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण अभिकर्मकों के रूप में बनी रहती हैं । अंत में, रास लाइनें अद्वितीय है क्योंकि इन कोशिकाओं को भ्रूण से व्युत्पंन लाइनों ectopically रास oncogene व्यक्त कर रहे हैं । वे मांसपेशियों के अग्रदूत कोशिकाओं के transअपंग हस्ताक्षर किया है और सक्रिय पीरना मशीनरी20व्यक्त करता है । हाल ही में समीक्षा लेख और पुस्तक अध्याय अधिक विवरण2,3,9के साथ इन लोकप्रिय सेल लाइनों के अनुप्रयोगों को कवर ।

इन सभी सेल लाइनों को उपकल्पि और जम कर किया जा सकता है । वहां एक सेल लाइन बनाए रखा है और cryopreservation के लिए तैयार कैसे के लिए थोड़ा लेकिन महत्वपूर्ण अलग आवश्यकताओं हैं । उदाहरण के लिए, भिंन कक्ष रेखाओं की आवश्यकता होती है विभिंन मीडिया और पूरक (तालिका 1) । रेखाएं भी सतह पालन गुण, morphologies (चित्रा 1 और चित्रा 2), जीनोटाइप और दोहरीकरण समय (तालिका 2) में बदलती हैं । हम बुनियादी प्रोटोकॉल वर्तमान और विभिंन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया Drosophila सेल लाइनों से निपटने के लिए अद्वितीय मतभेदों को उजागर ।

Protocol

1. गल रही और जम गई ड्रोसोफिला सेल लाइनों को पुनर्जीवित

  1. ७०% इथेनॉल के साथ काम कर सतह पोंछते द्वारा हुड जीवाणुरहित । उपयुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर (तालिका 1) को 25 सेमी2 टी-फ्लास्क (t-25) में बांटना ।
  2. तरल N2 या सूखी बर्फ से cryovial/ ७०% इथेनॉल के साथ cryovial पोंछ, ध्यान से ढीला और ऐंपुले unseal ।
  3. एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग, टी 25 फ्लास्क से कमरे के तापमान (आरटी) मीडिया के 1 मिलीलीटर वापस ले लो । धीरे से cryovial में मीडिया जोड़ने और धीरे से जमे हुए कोशिकाओं गल मिश्रण, यह सुनिश्चित करना है कि सेल निलंबन ओवरफ्लो नहीं करता है ।
  4. टी-25 फ्लास्क में एम्पुले से थैड सेल सस्पेंशन की पूरी मात्रा को ट्रांसफर कर दीजिये । यह सुनिश्चित करने के लिए दोहराएं सेल निलंबन पूरी तरह से स्थानांतरित कर दिया गया है ।
  5. एक 25 ° c इनयूबेटर में फ्लास्क रखें, कोशिकाओं को व्यवस्थित करने की अनुमति देता है और कम से 2 h के लिए पालन करता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि अधिकांश कोशिकाएँ बढ़ती सतह पर बस गई हैं, एक सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत कक्षों का परीक्षण करें. धीरे पुराने मीडिया को हटाने और ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें । इनयूबेटर में फ्लास्क को लौटाएं ।
  6. अगले दिन, धीरे पुराने मीडिया को हटाने और ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें । संस्कृति को इनयूबेटर में लौटाएं ।

2. गल और जम Drosophila सेल लाइनों फूंकने (वैकल्पिक)

  1. एक हुड में, टी टी मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ जमे हुए गोली resuspending द्वारा कोशिकाओं गल । एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी गल सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  2. 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली. supernatant छोड़ें और ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
  3. सेल निलंबन की पूरी मात्रा को एक टी-25 फ्लास्क में अंतरित करें और संस्कृति को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
  4. 1 से 2 ज बाद में, यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के अंतर्गत कक्षों की जांच करें कि अधिकांश कोशिकाएँ बढ़ती सतह पर बस गई हैं. अगले दिन, नए मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ पुराने मीडिया की जगह है और इनयूबेटर को संस्कृति वापस ।

3. Subculturing अर्द्ध आसंन कोशिकाओं १०० मिमी संस्कृति प्लेटों में उगाया

  1. ७०% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा डाकू । मीडिया की बोतलें, पिपेट, pipettes सहायता, और संस्कृति प्लेटों सहित हुड में subculturing के लिए सामग्री लाओ ।
  2. एक माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृति की आकृति विज्ञान और संगम की जांच करें । संस्कृति में microorganismal क्रासॅ के स्पष्ट संकेत के लिए देखो । निर्धारित करें कि क्या कक्ष passaged करने के लिए तैयार हैं, संस्कृति की विशेषताओं के आधार पर: सेल घनत्व और दोहरीकरण समय, पिछली बार वे subcultured थे सहित ।
  3. यदि संस्कृति अत्यधिक संगामी (चित्रा 1) प्रकट होता है, कोशिका घनत्व का निर्धारण । हुड में, थाली से मध्यम के 10 मिलीलीटर तक के लिए और यह कोशिकाओं पर वितरण के द्वारा बढ़ती सतह से कोशिकाओं को उखाड़ देना । कुछ समय दोहराएं, फोम बनाने के लिए नहीं सुनिश्चित करने, जब तक बढ़ती सतह स्पष्ट हो जाता है । एक hemocytometer या एक स्वचालित कण काउंटर का उपयोग कर कोशिका घनत्व का निर्धारण (धारा 5, चित्रा 3). कोशिकाओं उपसंस्कृति यदि कोशिका घनत्व 5 x 106 और 1 x 107 कोशिकाओं के बीच है/
    नोट: 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल से नीचे एक कोशिका घनत्व के लिए उपसंस्कृति Drosophila सेल लाइनों मत करो ।
  4. तदनुसार कोशिका निलंबन को कम से न्यूनतम 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम सीडिंग एकाग्रता के लिए एक उपयुक्त माध्यम का उपयोग कर ।
    1. दिनचर्या passaging और रखरखाव के लिए, एक नई संस्कृति थाली में मध्यम की एक पूर्व निर्धारित मात्रा के लिए वांछित बोने सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन की एक उचित मात्रा में जोड़ें ।
    2. एक संस्कृति स्केलिंग के लिए, एक बड़े फ्लास्क में सभी सेल निलंबन स्थानांतरण । सेल निलंबन वांछित कोशिका घनत्व के माध्यम से एक उचित मात्रा के साथ पतला । पतला सेल निलंबन के समान मात्रा नई प्लेटों को वितरित । यह पद्धति प्लेटों के बीच कोशिका घनत्व में भिन्नता को कम करती है ।
  5. ऑपरेटर प्रथमाक्षर, तिथि, विभाजन अनुपात, सीडिंग कोशिका घनत्व, कोशिका रेखा पहचानकर्ता, मीडिया, मार्ग संख्या और एंटीबायोटिक जैसे किसी भी मीडिया परिवर्धन के साथ प्लेट्स को कवर और लेबल करें ।
  6. प्लेटों को एक प्लास्टिक कंटेनर में रखें और इनयूबेटर को बॉक्स वापस करें ।
    नोट: सारणी 3 में संस्कृति वाहिकाओं को सामान्यतः कल्टुरिंग ड्रोसोफिला कोशिका रेखाओं और संबद्ध कार्य खंडों के लिए प्रयोग किया जाता है ।

4. १०० मिमी कल्चर प्लेट्स में उगाए गए आसंन कोशिकाओं को अस्त करना

  1. थाली से एक नया बाँझ फ्लास्क के लिए सभी माध्यम स्थानांतरण. मध्यम सहेजें ।
  2. धीरे से कोशिकाओं कुल्ला ०.०५% trypsin की 1 मिलीलीटर-EDTA थाली को जोड़कर । Swirl धीरे ट्रिप् सिन समाधान सुनिश्चित करने के लिए पूरे विकास की सतह को शामिल किया गया । ट्रिप् सिन समाधान छोड़ें ।
  3. धीरे से प्लेट में ०.०५% trypsin के 1 मिलीलीटर-EDTA जोड़ें । प्लेट को 3 − 10 मिनट के बीच 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हुए, जबकि कोशिका परत के दृश्यमान संकेतों के लिए मॉनीटर करना और बढ़ती हुई सतह को बंद करना ।
  4. ट्रिप् सिन गतिविधि को रोकने के लिए प्लेट के लिए बचाया मध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ें । कक्ष को असंबद्ध करने के लिए कक्ष निलंबन मिलाएं । एक बार सभी कोशिकाओं को उखाड़ दिया गया है, बढ़ती सतह स्पष्ट हो जाएगा ।
    नोट: इस तरह के प्रयोग के पाचन एंजाइमों के रूप में ट्रिप् सिन दृढ़ता से आसंन कोशिका लाइनों passaging में एड्स । Trypsin अक्सर सुअर का अग्ंयाशय से व्युत्पंन proteases का एक मिश्रण है और शुद्धता के विभिंन ग्रेड में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ।

5. मैनुअल सेल की गिनती का उपयोग कर न्यूबयूअर सेल की मतगणना स्लाइड

  1. ७०% शराब के साथ सतह पोंछते द्वारा hemocytometer स्लाइड और coverslip तैयार करें ।
  2. कोशिका निलंबन का मिश्रण है और hemocytometer के पहले कक्ष को भरने के लिए (चित्रा 3A) कोशिका निलंबन के 15 μl का वितरण करने के लिए । हीमोसेटोमीटर का दूसरा चैम्बर भरें । केशिका क्रिया द्वारा मतगणना कक्ष में सेल सस्पेंशन तैयार किया जाएगा ।
  3. एक 10x माइक्रोस्कोप उद्देश्य का उपयोग कर, समानांतर लाइनों से बंधे ग्रिड के बीच में 1 मिमी2 क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं गिनती (चित्रा 3 सी,डी). डुप्लिकेट काउंटिंग से बचने के लिए, उन कक्षों की गणना करें जो शीर्ष और बाईं सीमाओं को आच्छादित करते हैं, लेकिन उन कक्षों को नहीं जो २०० μm2 वर्गों की दाईं और निचली सीमाएं पार करते हैं । 100 − 200 कोशिकाओं के बीच गणना कीजिए । दूसरे चैंबर के साथ गिनती दोहराएं ।
  4. दो गणनाओं के औसत की गणना करें और निम्नलिखित सूत्र के अनुसार कोशिका घनत्व का निर्धारण करें: कोशिका घनत्व (कोशिकाओं/एमएल) = औसत कोशिका गणना (n1 + n2/2) x 104.
    नोट: सेल व्यवहार्यता कुल कोशिकाओं पर व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है । सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, एक समान मात्रा के साथ सेल निलंबन का मिश्रण trypan ब्लू (०.४%) मैनुअल या स्वचालित सेल गिनती से पहले समाधान । जीवित कोशिकाओं को डाई नहीं ले जाएगा, जबकि मृत कोशिकाओं नीले दाग हो जाएगा ।

6. Drosophila सेल लाइनों के Cryopreservation

  1. स्वस्थ morphology, विकास, और संदूषण की कमी के लिए संस्कृति की जाँच करें । फसल मध्य से देर से संस्कृतियों-लॉग वृद्धि चरण (कदम ३.३, या धारा 4) । कई Drosophila सेल लाइनों के लिए, यह लगभग है के बीच 4 x 106 कोशिकाओं/एमएल से 8 x 106 कोशिकाओं/
  2. एक 15 मिलीलीटर या ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पूरे सेल निलंबन स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करने और supernatant त्यागने ।
  3. जमने वाले मीडियम (सारणी 4) के आयतन में कोशिका गुलिका को पुनः भिजवाएं, जिसके परिणामस्वरूप कम से 4 x 107 कोशिकाओं/एमएल का अंतिम कोशिका घनत्व होगा ।
  4. ड्रॉप-वार इस सेल में cryoprotectant डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) के उपयुक्त मात्रा में जोड़ें निलंबन ऐसी है कि अंतिम DMSO एकाग्रता 10% है । धीरे से सेल सस्पेंशन मिलाएं ।
  5. ध्यान से सेल निलंबन के पूर्व के aliquots में ०.५ मिलीलीटर का वितरण-लेबल क्रायोविल्स (~ 2 x 107 कोशिकाओं/ एम्क्यूल्स को आइसोप्रोपानोल से भरे हुए हिमांक कंटेनर में रखें (चित्र 4a) । एक में ठंड कंटेनर स्थानांतरण-८० ° c फ्रीजर रातोंरात cryovials के तापमान को छोड़ने के लिए अनुमति देने के लिए (-1 डिग्री सेल्सियस/
  6. जमे हुए cryovials बाहर ले लो और तेजी से उन्हें canes (चित्रा 4B) के लिए देते हैं । क्रियोविल्स युक्त canes को एक कनस्तर (चित्रा 4C) में डालें । वैकल्पिक रूप से, एक पूर्व ठंडा हिमांक बॉक्स (चित्रा 4D) के अंदर जमे हुए cryovials प्लेस । N2 फ्रीजर (चित्रा 4e,F) के तरल चरण में जमे हुए cryovials स्टोर ।
    नोट: जब ठंड DMSO युक्त मीडिया का उपयोग कर, आरटी में 30 मिनट तक की देरी कोशिकाओं के लिए हानिकारक नहीं है ।

Representative Results

यह तेजी से जमे हुए Drosophila कोशिकाओं गल महत्वपूर्ण है और एक कोशिका घनत्व है कि विकास के चरण में वापस संस्कृति लाता है पर संस्कृति । यदि क्रायोआरक्षण और गल के लिए प्रक्रियाओं का पालन किया जाता है, तो टी-25 फ्लास्क में कोशिका का घनत्व कम से कम 4 x 106 कोशिकाओं/एमएल के बराबर होगा । गल के बाद एक से दो घंटे, सबसे Drosophila सेल लाइनों के लिए बढ़ती सतह को संलग्न करने के लिए शुरू हो जाएगा । जिस परिस्थिति में अधिकांश कोशिकाएँ गल जाने के बाद दो घंटे के भीतर बढ़ती हुई सतह पर संलग्न नहीं होती हैं, उसके अंतर्गत मीडिया को बदलने से पहले रात भर कोशिकाओं को सेने की सिफारिश की जाती है.

विकास वक्र के स्वस्थ घातांक लॉग-चरण में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए subculturing का लक्ष्य है । Subculturing के लिए मानदंड microorganismal संदूषण की दिखाई कमी, कोशिका घनत्व, और एक नियमित रखरखाव अनुसूची स्थापित करने की आवश्यकता पर निर्भर करते हैं । यह सबसे पहले कोशिकाओं के स्वास्थ्य का आकलन करने और ठंड से पहले अपस्थानिक contaminants के अभाव का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे बैक्टीरियल और कवक contaminants दृश्य निरीक्षण द्वारा बस का पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं । दूषित संस्कृतियों को मीडिया की अस्वस्थता में वृद्धि से पहचाना जा सकता है । माइक्रोस्कोप के तहत, contaminants बैक्टीरियल छड़, cocci, नवोदित खमीर कोशिकाओं या स्ट्रिंग की तरह कवक hyphae के रूप में प्रकट हो सकता है । संदूषण के अन्य स्रोतों जैसे कि गैर-कोशिकापेथिक माइकोप्लाज्मा का पता नहीं लगाया जा सकता और पीसीआर आधारित21assays द्वारा नियमित रूप से परीक्षण किया जा सकता है ।

एक कोशिका रेखा का संगम नेत्रहीन निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 1) । तेजी से बढ़ती सेल लाइनों संगम जल्दी पहुंच और नियमित रूप से passaged की जरूरत है । इस तरह की लाइनें सप्ताह में दो बार उपकल्पा की जाती हैं । इसके विपरीत, धीमी गति से बढ़ रही कोशिकाओं हर दो सप्ताह या उससे अधिक समय में एक बार passaged हैं । हालांकि, कोशिकाओं को हर हफ्ते ताजा मीडिया खिलाया जाना चाहिए । यह मीडिया थकावट को रोकने के लिए और कोशिकाओं से चयापचय अपशिष्ट उत्पादों को पतला करने के लिए है । विभिन्न ऊतक स्रोतों से व्युत्पन्न कोशिका रेखाएँ उनके आकारिकी (चित्र 2), पालन गुण, मीडिया आवश्यकताएं (तालिका 1) और दुगनी समय (तालिका 2) में भिन्न होती हैं । तालिका 5, तालिका 6, तालिका 7, और तालिका 8 विभिंन drosophila सेल संस्कृति मीडिया के लिए व्यंजनों की सूची ।

सेल काउंटिंग एक सटीक सीडिंग घनत्व और subculturing के लिए एक पूर्वानुमान के लिए दिनचर्या सुनिश्चित करता है । मात्रात्मक प्रयोगों के लिए, कोशिका गिनती आवश्यक है । कोशिकाओं को या तो एक hemocytometer (चित्रा 3A) या एक स्वचालित कण काउंटर (चित्रा 3a) का उपयोग करके गिना जाता है । यदि किसी स्वचालित काउंटर का उपयोग कर रहा है, तो निर्माता के निर्देशों का पालन करें । मैन्युअल रूप से एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती किफायती और आसान है. मध्य न्यूबयूअर ग्रिडों में संलग्न कक्षों की संख्या गिनी जाती है और कोशिका घनत्व की गणना की जाती है; उदाहरण के लिए, n = २१४ कोशिकाओं, २.१४ x 106 कोशिकाओं/एमएल (चित्रा 3 डी) के एक सेल घनत्व में जिसके परिणामस्वरूप ।

सेल निलंबन २ १०० मिमी प्लेट्स से, 4 x 106 कक्षों/एमएल में प्रत्येक 10 मिलीलीटर सेल सस्पेंशन का संग्रहण किया जाता है और 4 x 107 कक्षों/एमएल के घनत्व को प्राप्त करने के लिए 2 मिलीलीटर हिमांक मीडिया में पुन एकत्र किया जाता है । सेल निलंबन के ०.५ मिलीलीटर के साथ प्रत्येक जमे हुए cryovial 2 x 107 कोशिकाओं में शामिल हैं । यह 4 x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ एक संस्कृति में परिणाम होगा जब प्रोटोकॉल खंड 1 के अनुसार गल ।

Figure 1
चित्रा 1 : तीन अलग के प्रतिनिधि छवियां ड्रोसोफिला विभिंन संगम और कोशिका घनत्व पर सेल लाइनें । (क) 1 x 106 कक्षों/एमएल में S2-डीएनजीसी संस्कृति । (क ') S2-DGRC ४.५ x 106 कोशिकाओं पर संस्कृति/ (ख) एमएल-BG2-c2 संस्कृति 2 x 106 कक्षों/एमएल में । (ख ') ML-BG2-c2 संस्कृति 8 x 106 कोशिकाओं/एमएल जिसमें कोशिकाओं को जमा कर रहे हैं और समग्र रूप से फोकी के रूप में. (ग) 1 x 106 कक्षों/एमएल में ओएसएस संस्कृति । (ग ') 4 x 106 कोशिकाओं पर ओएसएस संस्कृति/ निलंबन में कोशिकाओं को एक ही फोकल विमान पर कब्जा नहीं कर रहे हैं । स्केल बार = १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 2
चित्रा 2 : आठ अलग Drosophila सेल लाइनों के प्रतिनिधि छवियों । (क) सर्वांगीण भ्रूण-S2-डीएसआरसी (ख) सर्वांगीण भ्रूण-व्युत्पन्न Kc167 । (ग) गोल लार्वा सीएनएस-व्युत्पन्न एमएल-BG2-c2 । (घ) गोल लार्वा धुरी के आकार का एमएल-BG3-c2 । (ङ) सीएमई एल एल, लारवाल लेग इमेमिनल डिस्क से ली गई एक सेल लाइन छोटी होती है और इसमें गोल/फ्यूसीफार्म आकारिकी होती है । (च) ओएसएस, वयस्क अंडाशय से प्राप्त एक कोशिका रेखा, तर्कु आकार की आकारिकी को प्रदर्शित करती है । (छ) धुरी के आकार रासV12 सेल लाइन सक्रिय रास व्यक्त । (ज) रासV12; wtsrnai (WRR1), एक सेल लाइन सक्रिय रास और डबल-फंसे आरएनए ट्यूमर दमनकारी मौसा (wts) लक्ष्यीकरण व्यक्त, उपकला विशेषताओं को प्रदर्शित करता है । स्केल बार = ५० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : कोशिका घनत्व मैन्युअल रूप से एक hemocytometer का उपयोग कर गिना जा सकता है या स्वचालित रूप से एक स्वचालित कण काउंटर का उपयोग. (क) दो कक्षों के साथ एक hemocytometer । (ख) एक स्वचालित सेल काउंटर एक सेल गिनती के उत्पादन को प्रदर्शित । (ग) एक 10x उद्देश्य के अंतर्गत देखे गए उन्नत न्यूबयूअर सेल गणना ग्रिड । ०.१ मिमी3 केंद्रीय ग्रिड (लाल डैश्ड-लाइन वर्ग) से बाउंड कक्षों की गणना । (घ) हीमोसेटोमीटर पर केन्द्रीय ग्रिड की गणना के लिए कोशिकाएँ भरी जाती हैं. स्केल पट्टी = 1 मिमी (C); ०.२ मिमी (डी). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : Cryopreservation के लिए उपकरण । (ं) एक हिमांक कंटेनर धीमी ठंड के लिए एक ईमानदार स्थिति में ampules भंडार । (ख) जमे हुए एम्पालों को रखने के लिए एक धातु का गन्ना । (ग) कलियों को धारण करने के लिए एक कनस्तर । (घ) प्लास्टिक फ्रीजिंग बॉक्स (सीआरयोबॉक्स) । (ङ) एक कनस्तर एक तरल N2 भंडारण टैंक में डाला एकाधिक कनस्तर । (च) एक लिक्विड एन2 स्टोरेज टैंक । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कोशिका विकृति मीडिया पालन ट्रिप् सिन
Schneider लाइंस M3 + BPYE + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), पीएच ६.६ अर्ध-आसंन नहीं
(S2R +, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11
Schneider मीडिया+ + 10% FCS
Kc लाइंस (Kc167, Kc7E10)21, 22 M3 + BPYE + 5% FCS, पीएच ६.६ अर्ध-आसंन नहीं
Hyclone-CCM3, पीएच ६.२
Imaginal डिस्क और सीएनएस लाइनों (एमएल लाइनों)13, 14 M3 + BPYE + 10% FCS, पीएच ६.६ अर्ध-आसंन नहीं
10 μg/मिलीलीटर इंसुलिन
मिल्नर पूर्णक डिस्क लाइनों (सीएमई-लाइंस)15 M3 + 2% FCS अर्ध-आसंन नहीं
5 μg/मिलीलीटर इंसुलिन
२.५% फ्लाई निकालें
fGS/ओएसएस16 M3 + 10% FCS, पीएच ६.८ पक्षपाती *
10 μg/मिलीलीटर इंसुलिन
1 मिलीग्राम/एमएल सी5एच8kno4  
०.५ mg/एमएल खको3 
०.६ mg/एमएल ग्लूटाथियोन
10% फ्लाई निकालें
रासV12 लाइंस18 M3 + BPYE + 10% FCS, पीएच ६.६ पक्षपाती हाँ

तालिका 1: गुण और मीडिया की आवश्यकताओं के विभिंन ड्रोसोफिला कक्ष रेखाएं । S2R +, s2-drosophila rnai स्क्रीनिंग केंद्र (drsc), s2-drosophila जीनोमिक्स संसाधन केंद्र (dgrc), और Sg4 सहित अर्द्ध आसंन schneider लाइनों के विभिन्न आइसोलेट्स आमतौर पर जब एम 3 मीडिया में सुसंस्कृत है कि एक प्रकार का फल पैदा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं + बेक्टोपेटोन खमीर निकालने (BPYE) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ पूरक । वैकल्पिक रूप से, Schneider मीडिया (पीएच 6.7-6.8) अक्सर एम 3 + BPYE के स्थान पर प्रयोग किया जाता है । Kc लाइनों या तो एम 3 में पैदा करना + bpye (5% FCS) या सीरम मुक्त CCM3 मीडिया । एमएल पूर्णक डिस्क और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) लाइनों के प्रसार के लिए इंसुलिन पूरकता की आवश्यकता है । मिलनर पूर्णक डिस्क लाइनों दोनों इंसुलिन और उड़ान निकालने पूरकता की आवश्यकता होती है । आसंन fGS/OSS सेल लाइनों इंसुलिन की आवश्यकता होती है, एक उच्च मक्खी निकालने की एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकास के लिए ग्लूटाथियोन । आसंन रासV12 लाइनें एम 3 + bpye में अच्छी तरह से विकसित (10% FCS) । ट्रिप्सिन का उपयोग विकास की सतह से आसंन कोशिका रेखाओं को उखाड़ कर करने के लिए किया जाता है ।

सेल लाइन (स्टॉक #) जीनोटाइप दोहरीकरण समय (एच) * ऊतक स्रोत
S2R + (१५०) ओरर ३९ दिवंगत भ्रूण
S2-DGRC (6) ओरर 23 दिवंगत भ्रूण
S2-DRSC (१८१) ओरर ४६ दिवंगत भ्रूण
Kc167 (1) e/se 22 6 − 12 एच भ्रूण
एमएल-BG2-c2 (५३) y वी f मल ४८ 3rd instar लार्वा सीएनएस
एमएल-BG3-c2 (६८) y वी f मल १०४ 3rd instar लार्वा सीएनएस
एमएल-DmD8 (९२) y वी f मल ६६ 3rd instar लारवल विंग डिस्क
सीएमई W1 Cl .8 + (१५१) ओरर ४६ 3rd instar लारवल विंग डिस्क
सीएमई L1 (१५६) ओरर ४७ 3rd instar लार्वल लेग डिस्क
ओएसएस (१९०) बमाड८६ ४५ वयस्क bam उत्परिवर्ती अंडाशय
रासV12 लाइंस यूएएस-जीएफपी; P (यूएएस-Ras85D. V12)/पी (Act5C-GAL4) 17bFO1 41 − 65 भ्रूण

तालिका 2: जीनोटाइप, दोहरीकरण समय, और व्यापक रूप से इस्तेमाल के ऊतक स्रोतों ड्रोसोफिला कक्ष रेखाएं । ऊतक जीनोटाइप, स्रोत और सामांय रूप से इस्तेमाल किया सेल लाइनों के दोहरीकरण समय जनसंख्या प्रस्तुत कर रहे हैं । दोहरीकरण समय 25 डिग्री सेल्सियस पर अनुशंसित मीडिया में वृद्धि पर आधारित है ।

संस् कृति वाहिका मीडिया की मात्रा (एमएल)
१२.५ सेमी2 टी-फ्लास्क २.५
25 सेमी2 टी-फ्लास्क 5
७५ सेमी2 टी-फ्लास्क 15
३५ मिमी प्लेट 1
६० मिमी प्लेट 4
१०० मिमी प्लेट 10
३८४-well थाली * 0.04/अच्छी तरह से
९६-well थाली * 0.1/well
४८-well थाली * 0.3/खैर
24-खैर थाली * 0.5/वेल
12-कूप प्लेट 1.0/खैर
6-कूप प्लेट 2.0/वैसे

तालिका 3: Culture जहाजों और अनुशंसित मीडिया वॉल्यूम । विभिन्न आकारों के कल्चरल वेसल्स, क्लॉटुरिंग ड्रोसोफिला कोशिकाओं के लिए उपलब्ध हैं । उपयुक्त मीडिया खंड (एमएल) प्रत्येक पोत के लिए सिफारिश कर रहे हैं । सील मल्टी-वेल प्लेटों से कम ०.५ मिलीलीटर पैराफिन फिल्म के साथ सेल निलंबन के कारण मीडिया हानि को कम करने के लिए वाष्पीकरण ।

आयतन
M3 + BPYE, पीएच ६.६ ७० मिलीलीटर
हीट निष्क्रिय FCS 20 एमएल
बाँझ छान DMSO * 10 एमएल

तालिका 4: फ्रीजिंग मीडियम (M3 + BPYE, 20% FCS, 10% DMSO) की १०० mL तैयार करने की विधि । जरूरत के अनुसार ठंड मीडिया तैयार करने और लंबे समय के लिए DMSO युक्त ठंड मीडिया भंडारण से बचें ।

M3 + BPYE मध्यम राशि
ढाल और गाया है एम 323 1 बोतल
खको३ ०.५ जी
चुनें खमीर निकालें १.० जी
बैक्टोपेप्टोन २.५ जी
बाँझ शुद्ध जल १००० मिलीलीटर

तालिका 5: एम 3 + BPYE ऊतक संवर्धन मध्यम के 1 एल की तैयारी के लिए नुस्खा । ६.६ को पीएच समायोजित करें । एक ०.२२ μm फिल्टर के माध्यम से माध्यम से पारित करके ।

FGS/OSS सेल लाइन के लिए आधार एम 3 मध्यम राशि
ढाल और गाया एम 3 1 बोतल
खको३ ०.५ जी
C5ज8kno4   १.० जी
बाँझ शुद्ध जल १,००० मिलीलीटर

तालिका 6: FGS/OSS एम 3 आधार मध्यम के 1 एल के लिए नुस्खा । ६.८ को पीएच समायोजित करें । एक ०.२२ μm फिल्टर के माध्यम से माध्यम से पारित करके ।

Hyclone-CCM3 राशि
CCM3 powder) २८.६ जी
नहको३ ०.३५ जी
10 N नयोः २.५ मिलीलीटर
CaCl2 ०.५ जी
बाँझ शुद्ध जल १,००० मिलीलीटर

तालिका 7: Hyclone के 1 एल के लिए नुस्खा-CCM3 ऊतक संस्कृति मध्यम । ६.२ को पीएच समायोजित करें । एक ०.२२ μm फिल्टर के माध्यम से माध्यम से पारित करके ।

M3 + BPYE + 10% FCS Miyake डिस्क और सीएनएस लाइनों मध्यम मिल्नर डिस्क लाइंस मीडियम fGS/ओएसएस पूर्ण माध्यम
M3 + BPYE, पीएच ६.६ ९० मिलीलीटर ९० मिलीलीटर - -
हीट निष्क्रिय FCS * 10 एमएल 10 एमएल 2 मिलीलीटर 10 एमएल
इंसुलिन (10 मिलीग्राम/ - १०० μL ५० μL १०० μL
फ्लाई निकालें - - २.५ मिलीलीटर 10 एमएल
ग्लूटाथियोन (६० mg/ - - 1 मिलीलीटर
M3, पीएच ६.६ - - ९७.५ मिलीलीटर -
fGS/OSS M3, pH ६.८ - - ७९ मिलीलीटर

तालिका 8: विभिन्न आम की १०० मिलीलीटर की तैयारी के लिए नुस्खा ड्रोसोफिला सेल संस्कृति मीडिया । 1 एच के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर सेते FCS और गर्मी के लिए हर पांच मिनट हिला-inactivate प्रोटीन पूरक ।

Discussion

Drosophila सेल संस्कृतियों उच्च थ्रॉपुट सेल-आधारित स्क्रीन के लिए प्राथमिक अभिकर्मकों हैं । उनके उपयोग भी जैव रसायन के लिए उपयुक्त कोशिकाओं की एक समरूप जनसंख्या प्रदान करके vivo आनुवंशिक अनुसंधान में पूरक, मक्खियों में इंजेक्शन से पहले ट्रांसजेनिक constructs की तेजी से परीक्षण, कोशिका जीव विज्ञान, माइक्रोस्कोपी और अधिक हाल ही में दैहिक कोशिका आनुवंशिक जीनोम संपादन1,2,3,8,9,10द्वारा जोड़तोड़ ।

स्थिर Drosophila कोशिकाओं की व्यवहार्यता और वसूली भी कम तापमान पर कठोर उतार चढ़ाव के प्रति संवेदनशील है । Dgrc (-१९६ डिग्री सेल्सियस) N2 के तरल चरण में जमे हुए सेल लाइनों भंडार और उंहें सूखी बर्फ में परिवहन (-७८.५ डिग्री सेल्सियस) । जमे हुए ampules कि सूखी बर्फ में ले जाया गया है वापस तरल N में स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए2 या एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर भंडारण के लिए । इसके बजाय, जमे हुए कोशिकाओं thawed होना चाहिए, जल्दी के रूप में आगमन पर संभव के रूप में एक उच्च कोशिका घनत्व पर reseeded (प्रोटोकॉल खंड 1) और उनके उद्देश्य प्रयोजनों (प्रोटोकॉल खंड 3) के लिए सभ्य । यदि उपयोग के लिए कक्ष रेखाएं तुरंत उपयोग नहीं की जाती हैं, तो कक्ष रेखाएं cryopreserved (प्रोटोकॉल अनुभाग 6) होनी चाहिए जब तक कि वे प्रयोग के लिए तैयार न हों ।

कुछ कक्ष रेखाओं, जैसे कि ML-BG2-c2 और Ras रेखाओं को cryopreserved स्थिति से पुनर्जीवित किए जाने के प्रभावों से पुनर्प्राप्त करने के लिए कई दिनों की आवश्यकता होती है. सेलुलर मलबे की एक महत्वपूर्ण राशि इन सेल लाइनों के पहले कुछ दिनों thawing के बाद स्वजनों । अबाधित छोड़ दिया, कोशिकाओं को ठीक हो जाएगा और proliferate । DGRC में कई Drosophila सेल लाइनों एम 3 आधारित मीडिया22में विकसित करने के लिए अनुकूलित किया गया है । Thawing के प्रभाव से उबरने के लिए धीमा कर रहे हैं कि सेल लाइनों के लिए, वातानुकूलित मीडिया का उपयोग उपयोगी हो सकता है. वातानुकूलित मीडिया की संभावना में उन कोशिकाओं द्वारा मीडिया में स्रावित वृद्धि कारक होते हैं जो गल जाने के बाद कोशिकाओं की वसूली और प्रसार को प्रोत्साहित कर सकते हैं ।

सेल लाइंस आम तौर पर एक बाहुबली विकास वक्र का पालन करते हैं जिसमें एक अंतराल चरण, घातांक चरण, पठार चरण और एक गिरावट चरण शामिल हैं । कई Drosophila सेल लाइनों में वृद्धि के लॉग-चरण में जब वे एक घनत्व में 1 x 106 और 1 x 107 कोशिकाओं के बीच में है/ यह आवश्यक है कि कोशिका रेखाएँ इस प्रकार की होती हैं कि वे हमेशा घातांक वृद्धि प्रावस्था में होती हैं ।

एक संस्कृति का संगम, एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त, विकास सतह क्षेत्र है कि कोशिकाओं द्वारा कवर किया जाता है वर्णन करता है । कोशिका रेखा के लिए कोशिका संगम उसके कोशिका आकार और आकार पर निर्भर करता है. अलग सेल लाइनों विभिंन morphologies और पालन गुण है । नतीजतन, लगभग इसी तरह के संगम पर अलग सेल लाइनों काफी अलग कोशिका घनत्व (चित्रा 1) हो सकता है । संस्कृति संगम है क्योंकि drosophila सेल लाइनों या तो फोकी के रूप में एक दूसरे के ऊपर जमा करके या निलंबन में वृद्धि की सतह के बाद भी बढ़ रहा है जारी रखने के लिए एक आदर्श संकेतक नहीं हो सकता है । ढका हुआ (चित्रा 1). हालांकि, उपयोगकर्ताओं को विशिष्ट कक्ष लाइनों के साथ अनुभव अक्सर उपसंस्कृति के लिए जब के लिए एक तेजी से दृश्य गाइड के रूप में संगम का उपयोग कर सकते हैं ।

हालांकि यह 19 − 25 ° c के बीच परिवेश RT पर Drosophila लाइनों को विकसित करने के लिए संभव है, यह अनुशंसित नहीं है क्योंकि परिवेश तापमान fluctuations प्रसार दर को प्रभावित कर सकते हैं । एक समर्पित 25 ° c इनयूबेटर के उपयोग की सिफारिश की है । Drosophila सेल संस्कृतियों के लिए इनक्यूबेटर को सीओ2 गैस एक्सचेंज की सुविधा की जरूरत नहीं है क्योंकि drosophila सेल संस्कृति मीडिया बफरिंग के लिए सह2 का उपयोग नहीं करते । संवर्धन कोशिका लाइनों के लिए इनक्यूबेटर के अंदर नमी एक महत्वपूर्ण कारक की अनदेखी नहीं की जा जब प्लेटें में कोशिकाओं संवर्धन है । इनसेबेटर और काम कर रहे पर्यावरण पर प्रकार के आधार पर, यह इनयूबेटर के अंदर बाँझ पानी की एक बीकर जगह के लिए आवश्यक हो सकता है. मीडिया वाष्पीकरण को कम करने के लिए, बंद टी flask या स्टोर संस्कृति प्लेटों एक कसकर सील प्लास्टिक कंटेनर में जबकि इनयूबेटर के अंदर का उपयोग करें ।

इसके लिए सबकल्चरल ड्रॉसोफिला सेल लाइनों के लिए शेड्यूल डेवलप करना जरूरी है । वृद्धि दर का अनुमान लगाने और निरंतरता की निगरानी करने के लिए, यह एक भी ज्यामितीय अनुपात (विभाजन अनुपात 1:2, 1:4, 1:8) पर उपसंस्कृति के लिए सुविधाजनक है । उदाहरण के लिए, 8 x 106 कोशिकाओं/एमएल में Kc167 कोशिकाओं की 10 मिलीलीटर संगामी प्लेट को 1:8 के अनुपात में विभाजित किया जा सकता है, जिससे 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल (१.२५ मिलीलीटर सेल सस्पेंशन) के सीडिंग घनत्व को नए मीडिया के ८.७५ एमएल में पतला कर दिया जाएगा । ७२ ज में, Kc167 संस्कृतियों को 8 x 106 कोशिकाओं के घनत्व को बढ़ने की संभावना है/एमएल, 24 एच के दोहरीकरण समय दिया । विभाजन अनुपात इसलिए एक सप्ताह में दो बार करने के लिए एक सुविधाजनक उपसंस्कृति दिनचर्या की सुविधा के लिए निर्धारित किया जाता है, यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को हमेशा विकास के अपने घातीय लॉग चरण में सभ्य हैं । यह कोशिकाओं को कम करने के लिए एक नियमित कार्यक्रम के लिए अनुमति देता है ताकि संगम के लिए समय न तो बहुत छोटा है और न ही बहुत लंबा है । यदि संगम के लिए समय बहुत कम है, कोशिकाओं को कम कोशिका घनत्व (उच्च विभाजन अनुपात) में subcultured हैं । इसी प्रकार, यदि संगम तक पहुंचने का समय बहुत लंबा है, तो कोशिकाएँ उच्च कोशिका घनत्व (निम्न विभाजन अनुपात) में उपकल्पि होती हैं । यह ध्यान दें कि सबसे drosophila सेल लाइनों बहुत कम सेल घनत्व के प्रति संवेदनशील है के लिए महत्वपूर्ण है (< 1 x 105 कोशिकाओं/, जिसमें कोशिकाओं को शायद ही पैदा करना और अंततः मर सकते हैं ।

ड्रोसोफिला कोशिका रेखाएँ वृद्धि विशेषताओं और आकारिकी में बदलती रहती हैं । नतीजतन, अलग गुण के साथ सेल लाइनों को अलग ढंग से संभाला जा सकता है । अधिकांश ड्रोसोफिला कोशिका रेखाएँ अर्ध-आसंन होती हैं । कम कोशिका घनत्व पर, वे विकास की सतह के लिए मजबूत पालन और के रूप में संस्कृति संगामी हो जाता है, कोशिकाओं को कम और आसंन आसानी से अलग हो जाते हैं । सेल पालन में यह क्रमिक परिवर्तन सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया drosophila सेल लाइनों (schneider, Kc लाइंस, पूर्णक डिस्क और सीएनएस लाइनों) के रूप में यह ऑपरेटर बस सेल monolayer पर मीडिया बांटना उंहें बेदखल करने के लिए अनुमति देता है की आसान subculturing सुविधा विकास की सतह से जब संस्कृति सघन है. ऐसी रेखाओं के लिए जो मादा कीटाणु-रेखा के तने/डिम्बग्रंथि दैहिक म्यान (एफजीएस/ओएसएस) और रास रेखाओं जैसी सतह का पालन करती हैं, के लिए यह आवश्यक है कि ट्रिप्सिन में कोशिकाओं को वृद्धि सतह से कोशिकाओं को अलग करने में सहायता के लिए अल्प अवधि के लिए सेने ।

सबसे Drosophila सेल लाइनों के लिए मीडिया परिवर्धन भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) शामिल हैं । कुछ विशिष्ट लाइनों के लिए इंसुलिन और वयस्क मक्खी निकालने (FEX) की आवश्यकता होती है । Fex विशिष्ट लार्वा पूर्णक डिस्क लाइनों और वयस्क ओवेरियन सेल लाइनों के विकास के लिए आवश्यक अपरिभाषित घटक शामिल हैं । DGRC तैयार करता है, और उपलब्ध बनाता है वयस्क FEX 1 सप्ताह पुरानी ओरेगन से व्युत्पंन-आर-modENCODE मक्खियों (RRID: BDSC_25211) में २.५ मिलीलीटर और 10 मिलीलीटर aliquots । DGRC भी अपनी वेबसाइट < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf > पर छोटे पैमाने पर FEX तैयारी के लिए निर्देश प्रदान करता है । FEX तैयारी, तथापि, समय लेने वाली है और वयस्क मक्खियों की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है ।

Drosophila सेल लाइनों के cryopreservation तत्काल उपयोग में नहीं सेल लाइनों के रखरखाव के लिए समय और अभिकर्मकों बचाता है । Cryopreservation एक DMSO, एक cryoprotective एजेंट से युक्त मध्यम में धीरे-2 कोशिकाओं (-1 डिग्री सेल्सियस/ धीमी गति से ठंडा कदम सफल cryopreservation के लिए महत्वपूर्ण है । A-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में, कोशिकाओं के एम्पुले-1 ° c/मिनट की दर से ठंडा है जब एक ठंड isopropanol से भरा कंटेनर में रखा । 25 ° c परिवेश तापमान पर शुरू, यह ampules में तापमान के लिए 2 एच तक पहुंचने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस तक ले जाएगा । इसे रातोंरात फ्रीज करने के लिए एम्पलों को छोड़ने की सिफारिश की जाती है ।

जमे हुए एम्पाल्स तो तेजी से लंबे समय तक भंडारण के लिए नाइट्रोजन के तरल चरण में स्थानांतरित किया जाना चाहिए. परिवेशी तापमान पर, cryovial लगभग 10 ° c/मिनट पर तेजी से गरम हो जाएगा और व्यवहार्यता ऊपर-५० डिग्री सेल्सियस23पर समझौता किया जाएगा । स्थानांतरण तेजी से रखने के लिए, परिवेश के तापमान के लिए जोखिम को कम करने के लिए छोटे बैचों में ampules संभाल । वैकल्पिक रूप से, सूखी बर्फ पर जमे हुए cryovials जगह है जबकि तरल N 2 में उनके हस्तांतरण के लिए तैयारी। यदि तरल नाइट्रोजन उपलब्ध नहीं है, कोशिकाओं को एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है, हालांकि समय के साथ महत्वपूर्ण गिरावट के जोखिम के साथ ।

सेल घनत्व सफल cryopreservation और सेल लाइनों के बाद पुनरुद्धार के लिए महत्वपूर्ण है । सामांय में, नई सेल लाइनों के लिए प्रारंभिक फ्रीज (1 − 3 ampules) बनाने के रूप में जल्द ही कोशिकाओं की एक अतिरिक्त उपलब्ध हो जाता है जम जाना चाहिए । एक बार सेल लाइन को और अधिक सुसंस्कृत कर दिया गया है, तो 10 − 20 एम्कुलों का जम स्टॉक बनाया जाना चाहिए । यह स्टॉक तो अपने बाद फ्रीज सेल वसूली और व्यवहार्यता, जिसके बाद यह प्रयोग के लिए प्रचारित किया है या शेयर की जगह जब जमे हुए शेयर ampules की संख्या पांच से नीचे गिर जाता है के लिए जांच गल है । अंत में, यह मांय है कि गल कोशिकाओं को अपने पैतृक स्टॉक की विशेषताओं को बनाए रखने के रूप में सेल लाइनों के लिए3,24विकसित करने के लिए जाना जाता है महत्वपूर्ण है ।

निष्कर्ष में, यह लेख drosophila सेल संस्कृतियों के साथ काम करने के लिए विभिंन लाइनों पर मौलिक जानकारी प्रदान करके एक किताब प्रस्तुत करता है, सर्वोत्तम प्रथाओं, और ड्रॉसोफिला सेल लाइनों के बुनियादी हैंडलिंग के लिए audiovisual प्रोटोकॉल । इस सुलभ संसाधन को सुचारू रूप से सुसंस्कृत Drosophila कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए परिचय कम करने के लिए और किसी भी अनुसंधान प्रयोगशाला में मौजूदा प्रशिक्षण गाइड के पूरक का मतलब है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (पुरस्कार nih P40OD010949) और अनुसंधान समुदाय के विभिंन D. melanogaster डीएनए का उपयोग करने के लिए धंयवाद/वेक्टर/सेल संसाधनों dgrc पर क्यूरेट ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm tissue culture plates Corning  430167 Subculturing
25 cm2 T-flask Corning  430168 Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank Taylor-Wharton 35HCB-11M Cryopreservation
Automated Cell counter BIO-RAD TC20 Counting
Bactopeptone BD BioSciences 211677 Medium additions
Counting Slides BIO-RAD 145-0011 Counting
Cryovial 1 mL Greiner  123263 Cryopreservation
DMSO Sigma Aldrich D5879 Cryopreservation
Freezing Box Nalgene 5029-0909 Cryopreservation
Freezing Container Fisher Scientific 15-350-50 Cryopreservation
Hematocytometer Fisher Scientific #0267110 Counting
Human Insulin Millipore Sigma I9278 Medium additions
Hyclone CCM3 media GE Healthcare Life Sciences SH30061.03 Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30070.03 Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1149 Medium additions
L-Glutathione reduced Millipore Sigma G6013 Medium additions
Potassium Bicarbonate Millipore Sigma 237205 Medium additions
Select Yeast Extract  Millipore Sigma Y1000 Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium Millipore Sigma S8398 Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red  ThermoFisher Scientific 25300054 Subculturing
Trypan Blue (0.4%) BIO-RAD 145-0013 Counting

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Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts, J., Zelhof, A. C. Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines. J. Vis. Exp. (146), e59459, doi:10.3791/59459 (2019).

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