Summary
Drosophila cellelinjer er vigtigt reagenser til både grundlæggende og biomedicinsk forskning. Denne artikel giver protokoller for optøning, subculturing og kryopræservering af almindeligt anvendte Drosophila cellelinjer til at hjælpe forskere med at indarbejde brugen af disse reagenser i deres forskning.
Abstract
Der er i øjeblikket over 160 forskellige Drosophila cellelinjer distribueres af Drosophila genomforskning ressource Center (DGRC). Med genom engineering forventes antallet af roman cellelinjer at stige. DGRC har til formål at sætte forskere med at bruge Drosophila cellelinjer som en eksperimentel redskab til at supplere og drive deres forskningsdagsorden. Procedurer til at arbejde med en bred vifte af Drosophila cellelinjer med forskellige karakteristika er forudsat, herunder protokoller til optøning, dyrkning og cryopreserving cellelinjer. Vigtigst, viser denne publikation de bedste fremgangsmåder, der skal arbejde med Drosophila cellelinjer til at minimere risikoen for kontaminering fra utilsigtet mikroorganismer eller andre cellelinjer. Forskere, der bliver bekendt med disse procedurer vil være i stand til at dykke ned i de mange programmer, der bruger Drosophila kulturperler celler herunder biokemi, cellebiologi og funktionel genomforskning.
Introduction
Brugen af Drosophila kulturperler celler supplerer in vivo flyve genetisk analyse og fungerer som en primær undersøgelse værktøj for at løse mange grundlæggende biologiske spørgsmål1,2,3. Drosophila cellelinjer tilbyder enestående homogene befolkninger af celler, der stammer fra forskellige væv kilder med forskellige genetiske baggrunde. Cellelinjer egner sig til mange applikationer, herunder transgene genekspression, genomforskning, transcriptomics, proteomics, metabolomics, høje overførselshastighed RNA interferens (RNAi) skærme, cellebiologi og mikroskopi. Vigtigere, letter brugen af Drosophila cellekultur karakterisering af de umiddelbare tidsmæssige svar til kendte stimuli. Derudover er Drosophila cellekultur indstillet til CRISPR-Cas9 genom redigering, hvilket gør det relativt nemt at oprette nye cellelinjer med specifikke genom ændringer4,5,6, 7.
Drosophila genomforskning ressource Center (DGRC) fungerer som et depot og distribution center for Drosophila cellelinjer. Et af målene for DGRC er at bistå medlemmerne af Fællesskabets forskning i at bruge Drosophila celle kultur ressourcer. Denne artikel præsenterer grundlæggende protokoller for håndtering af Drosophila cellelinjer. Det supplerer eksisterende ressourcer for at hjælpe forskere med at blive fortrolig med håndtering Drosophila cellekulturer og opnå en grad af uafhængighed i deres eksperimenter1,2,8,9 ,10.
De mest almindeligt anvendte Drosophila cellelinier er: Schneider linjer11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake fantasiens disc og centrale nervesystem (CNS) linjer13,14, Milner laboratorium fantasiens disc linjer 15, voksen æggestokkene celle linjer16,17, og Ras linjer18 (tabel 1). Linjerne Schneider og Kc167 er generelle all-purpose cellelinjer til brug i biokemi, rekombinant transgene genekspression og omvendt genetiske skærme. Mitsubishi/Miyake laboratorium (ML) linjer blev afledt fra enten larve fantasiens diske eller centralnervesystemet (CNS) og de har været nyttige for undersøgelser i forbindelse med neurosecretion, transskription regulering og RNA forarbejdning. Milner (CME) disk linjerne har været vigtigt for at studere signaltransduktion. FGS/OSS cellelinjer afledt af mutant voksen æggestokke forbliver vigtigt reagenser til at studere virkningerne af ikke-kodende små RNA biologi i kimcelle vedligeholdelse og differentiering17,19. Endelig er Ras linjer unik, fordi disse cellelinjer udvundet af embryoer ectopically udtrykker Ras onkogen. De har forløber muskelceller transcriptional underskrift og udtrykker aktive piRNA maskiner20. Seneste anmeldelse artikler og bogkapitler dække anvendelser af disse populære cellelinjer med flere detaljer2,3,9.
Alle disse cellelinjer kan podes og frosset. Der er lille, men vigtigt forskellige krav til hvordan hver cellelinje er vedligeholdt og forberedt til kryopræservering. For eksempel kræver forskellige cellelinjer forskellige medier og kosttilskud (tabel 1). Linjerne også variere i overholdelse af overflade egenskaber, morfologier (figur 1 og figur 2), genotype og fordobling tid (tabel 2). Vi præsenterer grundlæggende protokoller og fremhæve de unikke forskelle til håndtering af de forskellige anvendte Drosophila cellelinjer.
Protocol
1. optøning og genoplive frosne Drosophila cellelinjer
- Sterilisere hætten ved at tørre den arbejdende overflade med 70% ethanol. Der afpipetteres 5 mL af den passende medium (tabel 1) i en 25 cm2 T-kolbe (T-25).
- Fjerne cryovial/ampul fra flydende N2 eller tøris. Aftør cryovial med 70% ethanol, forsigtigt løsne og fjerne forseglingen ampule.
- Ved hjælp af Pasteurs pipette, trække 1 mL af stuetemperatur (RT) medier fra T-25 kolben. Langsomt tilføje medierne ind i cryovial og forsigtigt blandes for at tø frosne celler, at sikre, at cellesuspension ikke overløb.
- Overføre hele omfanget af de optøede cellesuspension fra ampule i T-25 kolbe. Gentag for at sikre cellesuspension er blevet helt overført.
- Kolben anbringes i en 25 ° C inkubator, så cellerne til at bosætte sig og holde sig til mindst 2 h. undersøge celler under et mikroskop for at sikre, at de fleste celler har afgjort på vækstarealet. Forsigtigt fjerne gamle medier og erstatte med 5 mL frisk medier. Vende kolben i rugemaskinen.
- Den følgende dag, forsigtigt fjerne de gamle medier og erstatte med 5 mL frisk medier. Returnere kulturen til rugemaskine.
2. optøning og genoplive frosne Drosophila cellelinjer (alternativ)
- I en steril hætte, tø cellerne ved resuspending den frosne pellet med 1 mL RT medier. Overføre alle de optøede cellesuspension ind i en 15 mL konisk rør.
- Sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes celle i 5 mL frisk medier.
- Overføre hele mængden af cellesuspension i en kolbe på T-25 og inkuberes kultur ved 25 ° C.
- 1 til 2 h senere, undersøge celler under mikroskop for at sikre, at de fleste celler har afgjort på vækstarealet. Den følgende dag, erstatte de gamle medier med 5 mL frisk medier og vende tilbage kulturen til rugemaskine.
3. podning semi-vedhængende celler dyrkes i 100 mm kultur plader
- Sterilisere hætten af aftørring med 70% ethanol. Bringe de sterile materialer til subculturing i hætten, herunder medier flasker, pipetter, pipette støtte og kultur plader.
- Undersøge morfologi og sammenløbet af kultur under et mikroskop. Kigge efter klare tegn på microorganismal forureninger i kulturen. Afgøre, om cellerne er klar til at blive passaged, baseret på de særlige kendetegn ved kultur: celle tæthed og fordoble tid, herunder den sidste gang de var podes.
- Hvis kulturen vises meget sammenflydende (figur 1), bestemme celle tæthed. I den sterile hood, løsne celler fra vækstarealet af pipettering op til 10 mL af medium fra pladen og udlevering det over cellerne. Gentag et par gange, sikrer ikke for at skabe skum, indtil vækstarealet bliver klar. Bestemme den celle tæthed ved hjælp af en hemocytometer eller en automatisk partikel counter (afsnit 5, figur 3). Subkultur celler hvis den celle tæthed er mellem 5 x 106 og 1 x 107 celler/mL.
Bemærk: Gør ikke subkultur Drosophila cellelinjer til en celle tæthed under 1 x 106 celler/mL. -
Fortyndet cellesuspension i overensstemmelse hermed ved hjælp af et passende medium til en endelig seeding koncentration af mindst 1 x 106 celler/mL.
- For rutinemæssig passaging og vedligeholdelse, skal du tilføje et passende volumen af cellesuspension til en forud fastsat mængde af medium i en ny kultur plade til at opnå den ønskede seeding celle tæthed.
- For optrapning af en kultur, der overføres alle cellesuspension til en stor målekolbe. Fortyndet cellesuspension til den ønskede celle tæthed med en passende mængde af mediet. Distribuere lige store mængder af fortyndet cellesuspension til nye plader. Denne metode minimerer variationerne i celle tæthed mellem pladerne.
- Dække og etiket plader med operatøren initialer, dato, delingsforholdet, seeding celle tæthed, celle linje id, medier, passage antallet og medier tilsætningsstoffer såsom antibiotika.
- Læg pladerne i en plast beholder og returnere boksen til rugemaskine.
Bemærk: tabel 3 viser kultur fartøjer almindeligt anvendt til dyrkning af Drosophila cellelinjer og de tilknyttede arbejder bind.
4. løs vedhængende celler dyrkes i 100 mm kultur plader
- Overføre alle medium fra pladen til en ny steril kolbe. Gem mediet.
- Skyl celler ved at langsomt tilføje 1 mL 0,05% trypsin-EDTA til pladen. Swirl forsigtigt for at sikre trypsin løsningen dækker hele vækst overflade. Kassér trypsin løsning.
- Forsigtigt tilsættes 1 mL 0,05% trypsin-EDTA til pladen. Inkuber plade ved 25 ° C mellem 3−10 min mens overvågning for synlige tegn på celle lag afmontering og glidende ud vækstarealet.
- Tilføje 9 mL af den gemte medium på pladen til at stoppe trypsin aktivitet. Bland cellesuspension for at adskille celle klumper. Når alle celler er blevet fortrængt, vækstarealet vil være tydelig.
Bemærk: Brug af fordøjelsesenzymer som trypsin aids i passaging stærkt klæbende cellelinjer. Trypsin er en blanding af proteaser ofte stammer fra svin bugspytkirtlen og er kommercielt tilgængelige i forskellige kvaliteter af renhed.
5. manuel celle optælling ved hjælp af cellen Neubauer tælle dias
- Forberede hemocytometer dias og coverslip ved at tørre overfladen med 70% alkohol.
- Bland cellesuspension og dispensere 15 µL af cellesuspension ind i den rillede kant i hemocytometer (figur 3A) til at udfylde den første afdeling af hemocytometer. Fyld den anden afdeling af hemocytometer. Cellesuspension trækkes ind i tælle salen af kapillaritet.
- Ved hjælp af en 10 x mikroskop mål, tælle celler inden for området 1 mm2 midt i gitteret bundet af de parallelle linjer (figur 3 c,D). For at undgå overlapning, tælle de celler, der overlay top og venstre grænser, men ikke celler, der krydser over 200 µm2 firkanter højre og bund grænser. Tæller mellem 100−200 celler. Gentag optællingen med Andetkammeret.
- Beregne gennemsnittet af de to tæller og bestemme den celle tæthed efter følgende formel: celle tæthed (celler/mL) = gennemsnitlige celletal (n1 + n2/2) x 104.
Bemærk: Cellernes levedygtighed er udtrykt som procentdelen af levedygtige celler over samlede celler. For at bestemme cellernes levedygtighed, bland cellesuspension med et lige saa stort volumen af trypan blå (0,4%) løsning før manuel eller automatisk celle optælling. Levende celler vil ikke tage farvestof, mens døde celler vil være farves blå.
6. kryopræservering af Drosophila cellelinjer
- Kontrollere kultur for sund morfologi, vækst og manglen på forurening. Høste kulturer fra de medio til sene-log vækstfase (trin 3.3 eller afsnit 4). Det er for mange Drosophila cellelinjer, ca mellem 4 x 106 celler/mL til 8 x 106 celler/mL.
- Overføre hele cellesuspension i en 15 mL eller 50 mL konisk slange. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min og supernatanten.
- Resuspenderes celle i et volumen på indefrysning medium (tabel 4), der vil resultere i en afsluttende celle tæthed på mindst 4 x 107 celler/mL.
- Tilføje dråbevis den passende mængde kryoprotektant dimethylsulfoxid (DMSO) i cellesuspension, således at den endelige DMSO koncentration er 10%. Forsigtigt blandes cellesuspension.
- Omhyggeligt dispensere 0,5 mL af cellesuspension i delprøver af den forud mærket cryovials (~ 2 x 107 celler/vial). Placere ampuller i en indefrysning container fyldt med isopropanol (figur 4A). Overføre indefrysning beholderen i en-80 ° C fryser natten over så temperaturen af cryovials at falde langsomt (-1 ° C/min.) til temperaturen, fryser.
- Tag den frosne cryovials og hurtigt vedhæfte dem til Stokke (figur 4B). Indsæt Stokke med cryovials i en beholder (figur 4 c). Alternativt kan du placere frosne cryovials inde en pre afkølede indefrysning boks (figur 4D). Butikken frosne cryovials i den flydende fase af N2 frysere (figur 4E,F).
Bemærk: Når du bruger indefrysning medier indeholdende DMSO, er en forsinkelse på op til 30 min på RT ikke skadelig for cellerne.
Representative Results
Det er vigtigt at optø frosne Drosophila celler hurtigt og kultur dem på en celle tæthed, som bringer kulturen tilbage i vækstfasen. Hvis procedurerne for kryopræservering og optøning er overholdt, vil celle tæthed i T-25 kolbe mindst lig 4 x 106 celler/mL. En til to timer efter optøning, vil de fleste Drosophila cellelinjer begynde at tillægge vækstarealet. Under de omstændigheder, som de fleste af cellerne ikke har vedhæftet på vækstarealet inden for to timer efter optøning, anbefales det at udruge cellerne natten før du ændrer mediet.
Målet med subculturing er at opretholde celler i den sunde eksponentielle log-fase af vækstkurven. Kriterierne for subculturing afhænger af den synlige mangel microorganismal kontaminering, celle tæthed og behovet for at etablere en regelmæssig vedligeholdelsesplan. Det er vigtigt først at vurdere sundhed af cellerne og bestemme mangel af utilsigtet forurenende stoffer før frysning. De fleste bakterier og svampe forureninger er let at påvise blot ved visuel inspektion. Forurenet kulturer kan identificeres ved en stigning i medier turbiditet. Under mikroskopet, kan forurenende stoffer forekomme som bakteriel stænger, kokker, spirende gærceller eller streng-lignende svampe hyfer. Andre kilder til forurening som den ikke-cytopatisk mycoplasma kan ikke påvises visuelt og rutinemæssigt kan afprøves i PCR-baserede assays21.
Sammenløbet af en cellelinje kan bestemmes visuelt (figur 1). Hurtigt voksende cellelinjer nå sammenløbet tidligt og skal være passaged regelmæssigt. Disse linjer er podes op til to gange om ugen. Derimod er langsomt voksende celler passaged mindst en gang hver to uger eller længere. Cellerne skal dog fodres friske medier hver uge. Dette er at forhindre media udmattelse og fortyndes metaboliske affaldsstoffer fra cellerne. Cellelinjer stammer fra varierende væv kilderne er uenige i deres morfologi (figur 2), overholdelse af egenskaber, medier krav (tabel 1) og en fordobling tid (tabel 2). Tabel 5, tabel 6, tabel 7og tabel 8 liste opskrifter til de forskellige Drosophila celle kultur medier.
Celle tælle sikrer en præcis seeding tæthed og en forudsigelig rutine for subculturing. For kvantitative eksperimenter er celle optælling afgørende. Celler tælles med enten ved hjælp af en hemocytometer (figur 3A) eller en automatiseret partikel counter (figur 3B). Hvis bruger en automatiseret counter, Følg fabrikantens anvisninger. Tælle celler manuelt er ved hjælp af en hemocytometer økonomisk og let. Antallet af celler i de midterste Neubauer gitre tælles og celle massefylden beregnes; For eksempel, n = 214 celler, hvilket resulterer i en celle tæthed af 2.14 x 106 celler/mL (figur 3D).
Cellesuspension fra to 100 mm plader, hver indeholdende 10 mL cellesuspension ved 4 x 106 celler/mL opsamles og genopslemmes i 2 mL af frysning medier til at opnå en massefylde på 4 x 107 celler/mL. Hver frosne cryovial med 0,5 mL cellesuspension indeholder 2 x 107 celler. Dette vil resultere i en kultur med 4 x 106 celler/mL når optøet i henhold til protokollen afsnit 1.
Figur 1 : Repræsentative billeder af tre forskellige Drosophila cellelinjer ved forskellige sammenløbet og celle tætheder. (A) S2-DGRC kultur på 1 x 106 celler/mL. (A') S2-DGRC kultur på 4,5 x 106 celler/mL. (B) ML-BG2-c2 kultur på 2 x 106 celler/mL. (B) ML-BG2-c2 kultur på 8 x 106 celler/mL, hvor celler er hober sig og aggregere som foci. (C) OSS kultur på 1 x 106 celler/mL. (C') OSS kultur på 4 x 106 celler/mL. Celler i suspension er ikke fanget på den samme fokalplan. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant billeder af de otte særskilte Drosophila cellelinjer. (A) runde embryo-afledte S2-DGRC. (B) runde embryo-afledte Kc167. (C) runde larve CNS-afledte ML-BG2-c2. (D) runde larve spindel-formet ML-BG3-c2. (E) CME L1, en cellelinje stammer fra larve ben fantasiens diske, er mindre og har runde/fusiform morfologi. (F) OSS, en cellelinje stammer fra voksne æggestokke, viser spindel-formet morfologi. (G) spindel-formet RasV12 cellelinje at udtrykke aktiveret Ras. (H) RasV12; wtsRNAi (WRR1), en cellelinje at udtrykke aktiveret Ras og dobbelt-strenget RNA rettet mod tumor suppressor vorter (wts), viser epitelial karakteristika. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Celle tæthed kan tælles manuelt ved hjælp af en hemocytometer eller automatisk ved hjælp af en automatiseret partikel counter. (A) A hemocytometer med to kamre. (B) en automatiseret celle counter vise outputtet af en celletal. (C) den forbedrede Neubauer celle tælle gitter set under en 10 x mål. Tælle celler af 0,1 mm3 centrale gitter (rød stiplet linje square). (D) den centrale gitter på hemocytometer fyldt med celler til optælling. Skalalinjen = 1 mm (C); 0.2 mm (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Udstyr til kryopræservering. (A) A indefrysning container butikker ampuller i en oprejst position for langsom frysning. (B) en metal stok til at holde frosne ampuller. (C) en dunk holder Stokke. (D) A plastik indefrysning kasse (cryobox). (E) A dunk holder flere Stokke indsat i en flydende N2 lagertank. (F) en flydende N2 lagertank. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Celle stamme | Medier | Overholdelse af | Trypsin |
| Schneider linjer | M3 + BPYE + 10% føtalt kalveserum (FCS), pH 6.6 | Semi-tilhænger | Nej |
| (S2R +, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11 | |||
| Schneiders media+ + 10% FCS | |||
| KC linjer (Kc167, Kc7E10)21,22 | M3 + BPYE + 5% FCS, pH 6.6 | Semi-tilhænger | Nej |
| Hyclone-CCM3, pH 6.2 | |||
| Fantasiens disc og CNS (ML-linier)13,14 | M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6.6 | Semi-tilhænger | Nej |
| 10 µg/mL insulin | |||
| Milner fantasiens disc linjer (CME-linjer)15 | M3 + 2% FCS | Semi-tilhænger | Nej |
| 5 µg/mL insulin | |||
| 2,5% flyve ekstrakt | |||
| fGS/OSS16 | M3 + 10% FCS, pH 6,8 | Tilhænger | * |
| 10 µg/mL insulin | |||
| 1 mg/mL C5H8KNO4 | |||
| 0,5 mg/mL KHCO3 | |||
| 0,6 mg/mL glutathion | |||
| 10% flyve ekstrakt | |||
| RASV12 linjer18 | M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6.6 | Tilhænger | Ja |
Tabel 1: Kravene til egenskaber og medier af forskellige Drosophila cellelinjer. Forskellige isolater af semi-vedhængende Schneider linjer herunder S2R + S2-Drosophila RNAi Screening Center (DRSC), S2-Drosophila genomforskning ressource Center (DGRC) og Sg4 er almindeligt anvendte cellelinjer, der formere sig håndfast når kulturperler i M3 medier + Bactopetone gærekstrakt (BPYE) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS). Alternativt, Schneiders medier (pH 6.7-6.8) bruges ofte i stedet for M3 + BPYE. Kc linjer formere sig i enten M3 + BPYE (5% FCS) eller serumfrit CCM3 medier. ML fantasiens disc og centrale nervesystem (CNS) linjer kræver insulin tilskud for spredning. Milner fantasiens disc linjer kræver både insulin og flyve ekstrakt kosttilskud. Vedhængende fGS/OSS cellelinjer kræver insulin, en højere koncentration af flyve ekstrakt samt glutathion for vækst. Vedhængende RasV12 linjer vokser godt i M3 + BPYE (10% FCS). Trypsin bruges til at løsne vedhængende cellelinjer fra vækst overflade.
| Celle linje (lager #) | Genotype | Fordobling tid (h) * | Væv kilde |
| S2R + (150) | Ører | 39 | Sen embryoner |
| S2-DGRC (6) | Ører | 23 | Sen embryoner |
| S2-DRSC (181) | Ører | 46 | Sen embryoner |
| Kc167 (1) | e/se | 22 | 6−12 h embryoner |
| ML-BG2-c2 (53) | y v f mal | 48 | 3rd instar larve CNS |
| ML-BG3-c2 (68) | y v f mal | 104 | 3rd instar larve CNS |
| ML-DmD8 (92) | y v f mal | 66 | 3rd instar larve wing disc |
| CME W1 Cl.8+ (151) | Ører | 46 | 3rd instar larve wing disc |
| CME L1 (156) | Ører | 47 | 3rd instar larve ben disc |
| OSS (190) | bamD86 | 45 | Voksen bam mutant æggestokke |
| RASV12 linjer | UAS-NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS; P(UAS-Ras85D.V12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1 | 41−65 | Embryo |
Tabel 2: Genotype, fordobling tid, og væv kilder af almindeligt anvendte Drosophila cellelinjer. Væv genotype, kilde og befolkningen fordobling tid af almindeligt anvendte cellelinjer præsenteres. Fordobling tid er baseret på vækst i de anbefalede medier ved 25 ° C.
| Kultur fartøj | Volumen af medier (mL) |
| 12,5 cm2 T-kolbe | 2.5 |
| 25 cm2 T-kolbe | 5 |
| 75 cm2 T-kolbe | 15 |
| 35 mm plade | 1 |
| 60 mm plade | 4 |
| 100 mm plade | 10 |
| 384-godt plade * | 0,04/brønd |
| 96-brønd plade * | 0,1/brønd |
| 48-godt plade * | 0,3/brønd |
| 24-godt plade * | 0,5/brønd |
| 12-godt plade | 1,0/brønd |
| 6-godt plade | 2.0/brønd |
Tabel 3: kultur fartøjer og anbefalede media diskenheder. Kultur skibe af forskellige størrelser er tilgængelige til dyrkning Drosophila celler. Relevante medier diskenheder (mL) anbefales for hvert fartøj. Forsegle multi godt plader der indeholder mindre end 0,5 mL cellesuspension med paraffin film at reducere media tab på grund af fordampning.
| Volumen | |
| M3 + BPYE, pH 6.6 | 70 mL |
| Varme inaktiveret FCS | 20 mL |
| Sterile filtrerede DMSO * | 10 mL |
Tabel 4: opskriften til at forberede 100 mL af indefrysning medium (M3 + BPYE, 20% FCS, 10% DMSO). Forberede indefrysning medier efter behov og undgå at gemme indefrysning medier indeholdende DMSO i længere periode.
| M3 + BPYE medium | Beløb |
| Skjolde og Sang's M323 | 1 flaske |
| KHCO3 | 0,5 g |
| Vælg gærekstrakt | 1,0 g |
| Bactopeptone | 2,5 g |
| Sterile renset vand | 1000 mL |
Tabel 5: Opskrift for at forberede 1 L, M3 + BPYE væv næringssubstratet. Justere pH til 6,6. Sterilisere ved at passere mediet gennem et 0,22 µm filter.
| Base M3 medium for fGS/OSS cellelinie | Beløb |
| Skjolde og Sang M3 | 1 flaske |
| KHCO3 | 0,5 g |
| C5H8KNO4 | 1,0 g |
| Sterile renset vand | 1.000 mL |
Tabel 6: Opskrift på 1 L fGS/OSS M3 base medium. Justere pH til 6,8. Sterilisere ved at passere mediet gennem et 0,22 µm filter.
| Hyclone-CCM3 | Beløb |
| CCM3 pulver | 28,6 g |
| NaHCO3 | 0,35 g |
| 10 N NaOH | 2,5 mL |
| CaCl2 | 0,5 g |
| Sterile renset vand | 1.000 mL |
Tabel 7: Opskrift på 1 L, Hyclone-CCM3 væv næringssubstratet. Justere pH til 6.2. Sterilisere ved at passere mediet gennem et 0,22 µm filter.
| M3 + BPYE + 10% FCS | Miyake disc og CNS linjer medium | Milner disc linjer medium | fGS/OSS komplet medium | |
| M3 + BPYE, pH 6.6 | 90 mL | 90 mL | - | - |
| Varme inaktiveret FCS * | 10 mL | 10 mL | 2 mL | 10 mL |
| Insulin (10 mg/mL) | - | 100 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Flyve ekstrakt | - | - | 2,5 mL | 10 mL |
| Glutathion (60 mg/mL) | - | - | 1 mL | |
| M3, pH 6.6 | - | - | 97.5 mL | - |
| fGS/OSS M3, pH 6,8 | - | - | 79 mL |
Tabel 8: Opskrift til at forberede 100 mL af forskellige fælles Drosophila celle dyrkningsmedier. Inkuber FCS ved 56 ° C i 1 time og ryster hver fem minutter til at varme-inaktivere supplement proteiner.
Discussion
Drosophila cellekulturer er primære reagenser til høj overførselshastighed celle-baserede skærme. Deres anvendelse også supplerer in vivo genetiske forskning ved at give en homogen population af celler egnet for biokemi, hurtig test af transgene konstruktioner før indsprøjtning i fluer, cellebiologi, mikroskopi og mere nylig somatisk celle genetiske manipulationer af genom-redigering1,2,3,8,9,10.
Levedygtighed og inddrivelse af frosne Drosophila celler er følsomme over for drastiske udsving selv ved lave temperaturer. DGRC gemmer frosne cellelinjer i den flydende fase af N2 (-196 ° C) og transporterer dem i tøris (-78.5 ° C). Frosne ampuller, der er blevet transporteret i tøris bør ikke overføres tilbage til flydende N2 eller en-80 ° C fryser til opbevaring. I stedet, de frosne celler bør være optøet, tilsås med en høj celle tæthed hurtigst muligt ved ankomsten (protokollen afsnit 1) og kulturperler til deres formål (protokollen afsnit 3). Hvis cellelinier ikke udnyttes straks for eksperimenter, cellen linjer bør være befrugtede (protokoltjenesten 6) indtil de er klar til brug.
Nogle cellelinjer linjerne ML-BG2-c2 og Ras har brug for flere dage hen til genoprette fra virkningerne af at blive genoplivet fra tilstanden befrugtede. En betydelig mængde af celleaffald ledsager disse cellelinjer de første par dage efter optøning. Venstre uforstyrret, vil cellerne genoprette og formere. Mange Drosophila cellelinjer på DGRC er blevet tilpasset til at vokse i M3 baseret medier22. I cellelinjer, der er langsomme til at inddrive fra virkningerne af optøning, kan brugen af aircondition medier være nyttigt. Konditioneret media sandsynligvis indeholder vækstfaktorer udskilles af celler i de medier, som kan tilskynde opsving og spredning af cellerne efter optøning.
Cellelinjer følger generelt en stereotype vækstkurve bestående af en mellemliggende fase, eksponentiel fase, plateau fase og en forringelse af fase. Mange Drosophila cellelinjer formere sig i log-fase af vækst når de er kulturperler med en tæthed mellem 1 x 106 og 1 x 107 celler/mL ved 25 ° C. Det er vigtigt at cellelinjer er passaged sådan, at de er altid i den eksponentielle vækstfase.
Sammenløbet af en kultur, udtrykt i procent, beskriver vækst areal, der er dækket af celler. Celle sammenløbet for en cellelinje afhænger af dets celle form og størrelse. Særskilte cellelinjer har forskellige morfologier og overholdelse af egenskaber. Som et resultat, kan forskellige cellelinjer på ca lignende confluence har langt adskilte celle tæthed (figur 1). Kultur sammenløbet kan ikke være en ideel indikator for passaging Drosophila cellekulturer, fordi Drosophila cellelinjer fortsætte til at formere sig enten ved Fundering oven på hinanden som foci eller suspension, selv efter vækst overflade har været overdækket (figur 1). Brugere erfarne med specifikke cellelinjer kan dog ofte anvende sammenløbet som en hurtig visuel vejledning for når til subkultur.
Mens det er muligt at dyrke Drosophila linjer på omgivende RT mellem 19−25 ° C, anbefales det ikke, fordi omgivende temperaturudsving kan påvirke spredning sats. En dedikeret 25 ° C inkubator anbefales. Inkubator for Drosophila cellekulturer behøver ikke at lette CO2 gasudveksling fordi Drosophila celle Kulturmedier ikke brug CO2 til bufferlagring. Fugtighed i rugemaskinen for dyrkning cellelinjer er en vigtig faktor ikke at blive overset, når dyrkning af celler i plader. Afhængigt af hvilken rugemaskine og arbejdsmiljø, kan det være nødvendigt at placere et bægerglas af sterilt vand inde i rugemaskinen. For at minimere media fordampning, bruge lukkede T-kolbe eller gemme kultur plader i en tætsluttende plastikbeholder mens inde i rugemaskinen.
Det er vigtigt at udvikle en tidsplan for podning Drosophila cellelinjer. Du skal vurdere vækst sats og overvåge konsistens, er det praktisk at subkultur på en selv geometriske forhold (split forholdet 1:2, 1:4, 1:8). For eksempel, kan en 10 mL sammenflydende plade af Kc167 celler på 8 x 106 celler/mL opdeles på 1:8 forhold til at opnå en seeding tæthed af 1 x 106 celler/mL (1,25 mL cellesuspension fortyndet til 8,75 mL frisk media). I 72 h forventes Kc167 kulturer at formere sig til en tæthed på 8 x 106 celler/mL, givet sin fordobling tid på 24 timer. Delingsforholdet er derfor besluttet på at lette en bekvemt subkultur rutine i op til to gange om ugen, at sikre at cellerne er altid kulturperler i deres eksponentiel log fase af vækst. Dette giver mulighed for en regelmæssig tidsplan for subculturing celler, så den tid til sammenløbet er hverken for kort eller for lang. Hvis tid til sammenløbet er for kort, podes i celler på en lavere celle tæthed (højere delingsforholdet). Tilsvarende, hvis tid at nå frem til sammenløbet er for lang, cellerne er podes på et højere celle tæthed (lavere delingsforholdet). Det er vigtigt at bemærke, at de fleste Drosophila cellelinjer er meget følsomme over for lav celle tætheder (< 1 x 105 celler/mL), i hvilke celler næppe formere sig og kan i sidste ende dø.
Drosophila cellelinjer varierer i vækst egenskaber og morfologi. Som følge heraf kan cellelinjer med forskellige egenskaber skal håndteres forskelligt. De fleste Drosophila cellelinjer er semi-tilhænger. På nederste celle tæthed, de overholder stærkere vækst overflade og som kulturen bliver sammenflydende, cellerne bliver mindre vedhængende og nemt løsne. Denne gradvise ændring i celle tilslutning letter let subculturing af mest anvendte Drosophila cellelinjer (Schneider, Kc linjer, fantasiens disc og CNS linjer), som det lader operatøren simpelthen dispensere medier over celle éncellelag at løsne dem fra vækst overfladen når kulturen er tætte. For linjer, der er overfladen tilhænger som kvindelige kønsceller stængel/æggestokkene somatiske kappe (fGS/OSS) og Ras linjer, det er vigtigt at udruge celler i trypsin for en kort varighed til støtte i afmontering celler fra vækst overflade.
Media Tilføjelser til de fleste Drosophila cellelinjer omfatter føtalt kalveserum (FCS). Insulin og voksne flyve ekstrakt (FEX) er nødvendige for nogle specifikke linjer. FEX indeholder udefinerede elementer til vækst af bestemte larver fantasiens disc linjer og de voksne æggestokkene cellelinjer. DGRC forbereder, og gør tilgængelige voksen FEX stammer fra 1 uge gamle Oregon-R-modENCODE fluer (RRID: BDSC_25211) i 2,5 mL og 10 mL alikvoter. DGRC giver også vejledning i lille skala FEX forberedelse på sit websted < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. FEX forberedelse, men er tidskrævende og kræver en stor mængde af voksne fluer.
Kryopræservering af Drosophila cellelinjer sparer tid og reagenser til vedligeholdelse af cellelinjer ikke i umiddelbar hjælp. Kryopræservering opnås ved langsomt frysning celler (-1 ° C/min.) til-80 ° C i et medium, der indeholder DMSO, en cryoprotective agent. Den langsomme afkøling skridt er afgørende for vellykket kryopræservering. I et-80 ° C fryser afkøles ampule af celler med en hastighed på 1 ° C/min. når de placeres i en indefrysning container fyldt med isopropanol. Starter ved 25 ° C omgivende temperatur, vil det tage op til 2 timer for temperaturen i ampuller at nå-80 ° C. Det anbefales at lade ampuller til fryse natten over.
Frosne ampuller skal derefter overføres hurtigt ind i den flydende fase af kvælstof for længere tids opbevaring. Ved omgivelsestemperatur, cryovial vil genopvarme hurtigt på ca 10 ° C/min. og rentabilitet vil blive kompromitteret på over-50 ° C23. For at holde overførsel hurtige, håndtere ampuller i små partier at minimere eksponering for omgivelsestemperatur. Alternativt, placere den frosne cryovials på tøris mens forberedelserne til deres overførsel til flydende N2. Hvis flydende nitrogen ikke er tilgængelig, kan cellerne være gemt i en-80 ° C fryser, selv med risiko for betydelig forværring med tiden.
Celle massefylde er afgørende for vellykket kryopræservering og efterfølgende genoplivning af cellelinjer. I almindelighed, nye celle linjer bør fastfryses for at oprette indledende fryse (1−3 ampuller) så snart et overskud af celler bliver tilgængelig. Når linjen celle har været yderligere kulturperler stabilt, skal der oprettes en frossen bestand af 10−20 ampuller. Denne bestand er derefter optøet at kontrollere sin post fryse celle opsving og levedygtighed, hvorefter det er opformeret til eksperimenter eller til at erstatte bestanden, når antallet af frosne stock ampuller falder til under fem. Endelig er det vigtigt at validere, at de optøede celler bevarer kendetegn af dets avlsmateriale som cellelinjer er kendt for at udvikle sig3,24.
Til sidst, præsenterer denne artikel en primer til at arbejde med Drosophila cellekulturer ved at levere de grundlæggende oplysninger om forskellige linjer, bedste praksis og audiovisuelle protokoller for grundlæggende håndtering af Drosophila cellelinjer. Denne tilgængelig ressource er beregnet til glat lette Introduktion til arbejde med kulturperler Drosophila celler og som supplement til eksisterende uddannelse guider på enhver forskningslaboratorium.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker National Institutes of Health (Award NIH P40OD010949) og Fællesskabets forskning for at udnytte de forskellige D. melanogaster DNA/vektor/celle ressourcer kurateret på DGRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
| 25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
| 35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
| Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
| Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
| Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
| Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
| DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
| Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
| Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
| Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
| Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
| Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
| L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
| Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
| Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
| Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
| Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
| Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |
References
- Baum, B., Cherbas, L. Drosophila: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Dahmann, C. 420, Humana Press. Ch. 25 391-424 (2008).
- Cherbas, L., Gong, L. Cell lines. Methods. 68 (1), 74-81 (2014).
- Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).
- Franz, A., Brunner, E., Basler, K. Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP. Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).
- Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).
- Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells. G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).
- Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells. Methods. 126, 186-192 (2017).
- Echalier, G. Drosophila Cells in Culture. , Academic Press. (1997).
- Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. Drosophila cells in culture. 2nd edition. , Elsevier. (2017).
- Cherbas, L., Cherbas, P. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 10, 2nd, Oxford University Press. 319-346 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).
- Echalier, G., Ohanessian, A. Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).
- Ui, K., et al. Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics. In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).
- Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).
- Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Development. 102, 805-814 (1988).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Saito, K., et al. A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).
- Simcox, A., et al. Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes. PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).
- Sumiyoshi, T., et al. Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells. Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).
- Dequeant, M. L., et al. Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
- Shields, G., Sang, J. H. Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells. Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).
- Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , Wiley Blackwell. (2016).
- Lee, H., et al. DNA copy number evolution in Drosophila cell lines. Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).
