Summary
ショウジョウバエの細胞株は、基礎・生物医学研究のための重要な試薬です。この資料では、融解、培養、研究のこれらの試薬の使用を組み込むことで研究者を支援するために一般的に使用されるショウジョウバエの細胞の凍結保存にプロトコルを提供します。
Abstract
ショウジョウバエ ゲノム リソース センター (DGRC) での分散 160 の異なるショウジョウバエの細胞の現在があります。ゲノム工学と新規細胞株の数が増加すると予想します。DGRC は、補完し、彼らの研究の議題をドライブ実験ツールとしてショウジョウバエ細胞株を用いた研究を理解を目指しています。解凍、養殖、セルラインをトウキョウにプロトコルを含むさまざまな異なる特性を持つショウジョウバエ細胞を操作するための手順が提供されます。重要なは、この出版物は、ショウジョウバエ細胞不定微生物や他の細胞からの汚染のリスクを最小限に抑えるために動作するように必要なベスト プラクティスを示します。なるこれらの手順に精通している者は、ショウジョウバエ培養細胞生化学、細胞生物学、ゲノム機能学を含むを使用する多くのアプリケーションに掘り下げて調査することができます。
Introduction
ショウジョウバエの培養細胞補完する生体内で遺伝子解析を飛ぶし、多く基本的な生物学的質問1,2,3に対処するための主なお問い合わせツールとしてです。ショウジョウバエの細胞は異なる遺伝的背景の異なるティッシュ ソース由来細胞のユニークな同種個体を提供しています。細胞は形質転換遺伝子発現、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、スループットの高い RNA 干渉 (RNAi) 画面、細胞生物学、顕微鏡を含む多くのアプリケーションに適しています。重要なは、ショウジョウバエ細胞培養の使用知られている刺激に対する即時の時間応答の評価が容易になります。さらに、ショウジョウバエの細胞培養は CRISPR Cas9 ゲノム編集、特定ゲノムの変更4,5,6,と新しい細胞ラインの作成が比較的容易に従う7。
ショウジョウバエ ゲノム リソース センター (DGRC) はショウジョウバエの細胞のリポジトリ、流通センターとして機能します。ショウジョウバエ細胞文化資源の研究コミュニティのメンバーを支援するために、DGRC の目標の 1 つです。この記事では、ショウジョウバエのセル行の処理のための基本プロトコルを示します。ショウジョウバエ培養細胞を処理すると快適になるし、実験1,2,8,9 の独立のレベルを達成するための研究者を支援する既存のリソースを補完します。 ,10。
最も一般的に使用されるショウジョウバエのセル行: シュナイダー線11, Kc16712, 三菱/三宅成虫ディスクそして中枢神経系 (CNS)13,14、ミルナー研究室成虫ディスク ライン15、成体卵巣細胞ライン16,17、および Ras 行18 (表 1)。シュナイダーと Kc167 行は、生化学、遺伝子組換え遺伝子組換え遺伝子発現、および逆遺伝的画面で使用するための一般的な万能細胞です。三菱/三宅研究室 (ML) ラインは幼虫成虫ディスクまたは中枢神経系 (CNS) のいずれかから派生した、彼らは惹か、転写調節、RNA プロセシングに関する研究に有用されています。ミルナー (CME) ディスク ラインは、シグナル伝達の勉強のために重要されています。FGS/OSS 細胞変異アダルト卵巣由来のまま生殖細胞維持と分化の17,のための19の小さな RNA 生物の非コーディングの影響を研究する重要な試薬。最後に、これらは Ras 癌遺伝子を表現する異所萌出への胚由来細胞株であるために、Ras ライン、一意です。彼らは筋前駆細胞の転写署名しアクティブ ピルナ機械20を表現します。最近のレビュー記事や書籍の章は、詳細詳細2,3,9これら人気のある細胞のアプリケーションをカバーしています。
すべてのこれらの細胞は継代、凍結できます。わずかであるけれども重要な各セルラインの維持方法と凍結のために準備方法についてさまざまな要件があります。たとえば、異なる細胞さまざまなメディアとサプリメント (表 1) が必要です。遺伝子型と倍加時間 (表 2)、ラインは表面密着性、形態 (図 1および図 2) で異なります。我々 は現在の基本的なプロトコルと様々 な広く使われているショウジョウバエの細胞を処理するため一意の違いを強調します。
Protocol
1. 解凍・冷凍ショウジョウバエ細胞の復活
- 70% のエタノールと作業面を拭くことによってフードを滅菌します。25 cm2 T フラスコ (T-25) に適切な媒体 (表 1) の 5 mL を調剤します。
- リキッド N2またはドライアイスからクリオバイアル/アンプルを削除します。70% エタノール クリオバイアルを拭く、慎重に緩め、アンプルを開封します。
- パスツール ピペットを使用して、T-25 フラスコから部屋の温度 (RT) メディアの 1 mL を撤回します。ゆっくりと、クリオバイアルにメディアを追加し、優しく細胞懸濁液がオーバーフローしないことを確認、凍結細胞の解凍がミックスします。
- T-25 フラスコにアンプルから解凍細胞懸濁液のボリューム全体を転送します。細胞懸濁液を完全に転送されていることを確認するを繰り返します。
- 25 の ° C の定温器にフラスコを置き、ほとんどの細胞が成長表面に定住していることを確認するには顕微鏡下で細胞を調べる解決し少なくとも 2 における付着細胞をことができます。優しく古いメディアを削除し、5 mL の新鮮なメディアに置き換えます。インキュベーターにフラスコを返します。
- 次の日に軽く古いメディアを削除し、5 ml の新鮮なメディア置き換えます。文化をインキュベーターに戻ります。
2. 解凍・冷凍ショウジョウバエ細胞 (代替) の復活
- 無菌フードで再 RT メディアの 1 mL の冷凍餌によって細胞を解凍します。解凍の細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します。
- 上澄み 1,000 x gで 5 分間破棄での遠心分離によって細胞をペレットし、5 mL の新鮮な培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- T-25 フラスコ細胞懸濁液の全体ボリュームを転送し、25 ° C で文化を孵化させなさい
- 1 ~ 2 時間後、ほとんどの細胞が成長表面に定住していることを確保するために、顕微鏡下で細胞を調べます。次の日に 5 mL の新鮮なメディアと古いメディアを交換し、インキュベーターにカルチャを返します。
3. 培養半付着細胞 100 mm 培養皿で栽培
- 70% のエタノールで拭くフードを滅菌します。フード、びん、ピペット、ピペットの援助、培養皿などに培養のための滅菌材料をもたらします。
- 形態と顕微鏡下で文化の合流点を調べます。Microorganismal の汚染文化の明確な兆候を探します。文化の特性に基づいて細胞を継代する準備ができているかどうかを判断: 細胞密度と倍加時間、彼らが継代された最後の時間を含みます。
- 文化が高く表示される場合 (図 1)、合流がセル密度を決定します。無菌フード プレートから培地 10 mL までをピペッティングおよびそれのセル上で成長の表面から細胞を取り除きます。成長の表面が明らかになるまで泡を作成することを確保するに数回を繰り返します。診断または自動粒子カウンター (セクション 5、図 3) を使用してセル密度を決定します。サブカルチャー細胞細胞密度は、5 × 106と 1 x 107セル/mL の場合。
注:1 x 106セル/mL 以下の細胞密度にサブカルチャーショウジョウバエ細胞を行います。 -
少なくとも 1 x 106セル/mL の最終的な播種濃度を適切な媒体を使用してそれに応じて細胞懸濁液を希釈します。
- ルーチン継やメンテナンスのため目的の播種細胞密度を達成するために新しい培養プレート中のあらかじめ決められた量に細胞懸濁液の適切な量を追加します。
- 文化をスケールの大きなフラスコに細胞懸濁液を転送します。媒体の適切なボリュームと必要な細胞密度に細胞懸濁液を希釈します。新しいプレートに希釈した細胞懸濁液の平等なボリュームを配布します。このメソッドは、プレートの間の細胞密度の変化を最小限に抑えます。
- カバー、ラベルの演算子のイニシャル、日付、分割比率、播種細胞密度、セルの行識別子、メディア、通路番号抗生物質などの任意のメディア追加とプレート。
- プラスチックの容器にプレートを置き、インキュベーターにボックスを返します。
注: 表 3 ショウジョウバエ細胞と関連する作業ボリュームを培養するために一般的に使用される培養容器が一覧表示されます。
4. 100 mm 培養皿で育った付着性細胞を外れ
- 新しい生殖不能のフラスコにプレートからすべてのメディアを転送します。媒体を保存します。
- ゆっくりとプレートに 0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL を追加することによって細胞をすすいでください。トリプシン溶液全体の成長表面を覆うように優しく旋回します。トリプシン溶液を破棄します。
- 優しくプレートに 0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL を追加します。沖成長表面の細胞層のデタッチの目に見える兆候の監視とスライディングしながら 3−10 分間 25 ° C でプレートを孵化させなさい。
- トリプシン活性を停止するプレートに保存した媒体の 9 mL を追加します。細胞塊を分離するに細胞懸濁液を混ぜます。すべてのセルを外れている、成長の表面はクリアになります。
注:トリプシンなどの消化酵素の使用は、強く付着性のセルラインを継に役立ちます。トリプシンはしばしばブタ膵臓由来プロテアーゼの混合物であるし、純度の異なった等級で市販されています。
5. 手動細胞数スライドを数えるノイバウアー セルを使用して
- 70% アルコールで表面を拭くことによって検定スライドと coverslip を準備します。
- 細胞懸濁液を混合し、検定 (図 3 a)、検定の最初の部屋を埋めるための溝の端に細胞懸濁液の 15 μ L を分注します。第二商工会議所の検定をご記入ください。細胞懸濁液は、毛管作用によってカウントのチャンバ内に描画されます。
- 対物レンズ × 10 を使用すると、(図 3、D) 平行線によってバインド グリッドの中央に 1 mm2の領域内のセルをカウントします。重複カウントを避けるため、200 μ m2の正方形の右と下の境界を越えるセルではなく、トップと左の境界をオーバーレイする細胞を数えます。100−200 細胞間をカウントします。2 番目の箱の数を繰り返します。
- 2 つの数の平均を計算し、次の式に従ってセル密度を決定する: 細胞の密度 (セル/mL) = 10 x の平均細胞数 (n1 + n22)4。
注:細胞生存率は合計のセルに実行可能なセルの割合として表されます。細胞生存率を調べるには、トリパン ブルー色素の等量とセル中断 (0.4%) を混ぜる手動または自動のセルを数える前に、ソリューション。死んだ細胞、青色に染色される間、染料を生きた細胞には行いません。
6.ショウジョウバエ細胞の凍結保存
- 健康的な形態、成長、および汚染の欠如の文化を確認します。収穫から文化、半ば後半ログ成長段階 (ステップ 3.3、またはセクション 4)。多くのショウジョウバエの細胞の約 4 x 106セル/8 x 106セル/mL に mL の間です。
- 15 mL や 50 mL の円錐管に全体の細胞懸濁液を転送します。5 分 1,000 × gで遠心分離によって細胞を収集し、上澄みを廃棄します。
- 少なくとも 4 x 107セル/mL の最終的な細胞密度になります凍結中 (表 4) の容積の細胞ペレットを再懸濁します。
- 追加滴下凍結ジメチルスルホキシド (DMSO) の適切な量細胞懸濁液に、最終の DMSO 濃度が 10%。細胞懸濁液を軽く混ぜます。
- 慎重に事前ラベル クリオバイアル (2 〜 107セル/バイアル x) の因数に細胞懸濁液 0.5 mL を調剤します。イソプロパノール (図 4 a) でいっぱい冷凍コンテナーに、アンプルを配置します。ゆっくり落としクリオバイアルの温度まで一晩に-80 ° C のフリーザー冷凍コンテナーに転送 (-1 ° C/分) 冷凍庫温度に。
- 冷凍のクリオバイアルを取り出して、急速に杖 (図 4 b) にそれらを添付します。クリオバイアルを含んでいる小さなかん (図 4) に杖を挿入します。また、予冷凍結ボックス (図 4) 内冷凍クリオバイアルを配置します。ストア N2冷凍庫 (図 4 e,F) の液体相におけるクリオバイアルを凍結します。
注:凍結メディア含む DMSO を使用している場合、RT で最大 30 分の遅れは、細胞に悪影響ではないです。
Representative Results
急速に凍結ショウジョウバエ細胞を解凍し、成長段階に戻って文化をもたらす細胞密度でそれらを文化することが重要です。凍結と融解のため手順を遵守している場合 T-25 フラスコ細胞密度、少なくとも 4 x 106セル/mL と等しくなります。解凍後、1 ~ 2 時間ほとんどショウジョウバエ細胞成長表面に添付する開始されます。ほとんどのセルの接続されていないの成長表面融解後 2 時間以内の状況下では、メディアを変更する前に一晩細胞をインキュベートすることをお勧めします。
培養の目的は、成長曲線の健康指数ログ段階の細胞を維持するためにです。培養の条件は、microorganismal 汚染、細胞密度、および定期的なメンテナンス スケジュールを確立する必要性の表示の欠乏によって異なります。まず、細胞の健康を評価し、凍結前に不定汚染物質の有無を判断することが重要です。ほとんどの細菌や真菌の汚染物質が目視検査で単に検出.汚染された文化は、メディアの濁度の増加によって識別できます。顕微鏡で細菌棒、出芽酵母や文字列のような菌糸は球菌汚染物質が表示されます。その他非変性のマイコ プラズマなど汚染の源は視覚的に検出することはできず、PCR に基づく試金21によって定期的にテストすることができます。
セルラインの合流点を視覚的に決定することができます (図 1)。高速成長している細胞は早く合流点に達するし、定期的に継代する必要があります。このような行は週に 2 回まで継代します。対照的に、遅い成長細胞は継代 2 週間ごとに少なくとも 1 回以上です。ただし、セルは、毎週新鮮なメディアを供給する必要があります。これはメディアの枯渇を防ぐために、細胞からの代謝廃棄物を希釈します。セルの行は、ソースの違い自分の形態 (図 2)、密着性、メディアの要件 (表 1) は組織の変化と倍加時間 (表 2) から派生します。表 5表 6表 7表 8様々 なショウジョウバエの細胞培養媒体のためのレシピを一覧表示します。
セルを数えるには、正確な播種密度と培養のための予測可能なルーチンが保証されます。定量的な実験は、細胞数が不可欠です。(図 3 a) 検定または (図 3 b) 自動パーティクル カウンターを使用して、セルがカウントされます。自動カウンターを使用している場合は、製造元の指示をに従ってください。手動でセルを数えると、経済的で簡単診断を使用です。中間ノイバウアー格子で囲まれているセルの数をカウントし、細胞密度が計算されます。たとえば、n = 214 細胞、106セル/mL (図 3 D) x 2.14 の細胞密度の結果します。
2 つの 100 mm プレート、各 10 mL を含む 4 × 106セル/mL の細胞懸濁液から細胞を懸濁液は収集および 4 x 107細胞/ml の密度を達成するためにメディアを凍結の 2 mL で再停止されます。細胞懸濁液 0.5 mL を各冷凍クリオバイアルには 2 x 10 の7セルが含まれます。これは 4 x 106セル/mL プロトコルのセクション 1 に従って解凍時の文化になります。
図 1:3 つの異なる代表的な画像ショウジョウバエ細胞の合流およびセル密度を異にします。(A) S2 DGRC 文化で 1 × 106セル/mL。(A')4.5 x 106セル/mL で S2 DGRC 文化。(B) ML BG2 c2 は 2 × 106セル/mL で文化します。(B')ML BG2 c2 文化 8 x 106セル/mL 細胞を積み、巣として集約します。(C) OSS 文化 1 × 106セル/mL。(C')4 x 106セル/mL で OSS 文化。懸濁液中の細胞は同じ焦点面にはキャプチャされません。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 8 つの明瞭なショウジョウバエ細胞ラインの代表的なイメージです。(A) ラウンド胚派生 S2 DGRC。(B) ラウンド由来胚 Kc167。 (C) 幼虫中枢神経系由来 ML-BG2-c2 をラウンド。(D) ラウンドの幼虫は、ML BG3 c2 を紡錘形に。(E) CME L1、幼虫脚成虫原基由来細胞株は小さいで、ラウンド/紡錘状の形態。(F) OSS、大人卵巣由来細胞株には、紡錘状の形態が表示されます。(G) RasV12の紡錘形細胞ラインを表現すると、Ras が活性化。(H) RasV12; wtsRNAi (WRR1) 活性化 Ras と二本鎖 RNA 腫瘍サプレッサー疣贅(wts) をターゲットを表現する細胞株は、上皮の特性を表示します。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 細胞密度をカウントするには、診断を使用して手動でまたは自動的に自動化されたパーティクル カウンターを使用します。(A) A 検定二室。(B) 細胞数の出力を表示する自動化された細胞カウンター。(C) 改良されたノイバウアー セルカウント グリッド 10 × 対物の下に表示。0.1 mm3中央グリッド (赤い破線広場) に拘束のセルをカウントします。(D)、検定の中央のグリッドは、カウントのための細胞でいっぱい。スケール バー = 1 mm (C);0.2 mm (D)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 凍結保存装置。(A) A 凍結容器の店直立位置でアンプル緩慢凍結のため。(B) A 凍結アンプルを保持するための金属の杖。(C) A キャニスター杖を保持するため。(D) A のプラスチック冷凍の箱 (cryobox)。(E) A 容器液 N2ストレージ タンクに挿入された複数の杖を保持しています。(F) 液体 N2タンク。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 細胞株 | メディア | 遵守 | トリプシン |
| シュナイダー線 | M3 + BPYE + 10% 牛胎児血清 (FCS)、pH 6.6 | 半付着 | 違います |
| (S2R + S2 DRSC、S2-DGRC、Sg4)11 | |||
| シュナイダーのメディア+ + 10% FCS | |||
| Kc ライン (Kc167、Kc7E10)21, 22 | M3 + BPYE + 5 %fcs、pH 6.6 | 半付着 | 違います |
| Hyclone CCM3、pH 6.2 | |||
| 成虫ディスクと中枢神経系 (ML ライン)13, 14 | M3 + BPYE + 10 %fcs、pH 6.6 | 半付着 | 違います |
| 10 μ G/ml インスリン | |||
| ミルナー成虫ディスク ライン (CME 行)15 | M3 + 2% の FCS | 半付着 | 違います |
| 5 μ g/mL インスリン | |||
| 2.5% フライ エキス | |||
| fGS oss では,16 | M3 + 10 %fcs、pH 6.8 | 付着性 | * |
| 10 μ G/ml インスリン | |||
| 1 mg/mL C5H8自演4 | |||
| 0.5 mg/mL KHCO3 | |||
| 0.6 mg/mL グルタチオン | |||
| 10% フライ エキス | |||
| RasV12行18 | M3 + BPYE + 10 %fcs、pH 6.6 | 付着性 | うん |
表 1:各種のプロパティとメディアの要件ショウジョウバエ細胞株。S2R +、S2-ショウジョウバエ RNAi スクリーニング センター (DRSC)、S2-ショウジョウバエ ゲノム リソース センター (DGRC)、および sg4 という名前を含む半付着のシュナイダー ラインの異なる菌株が M3 媒体で培養した場合確実に増殖細胞の一般的に使用される +Bactopetone 酵母エキス (BPYE) 10% 牛胎児血清 (FCS) を添加しました。また、シュナイダーのメディア (pH 6.7 6.8)、M3 + BPYE の代わりに使用されます。M3 + BPYE Kc 行増殖 (5% の FCS) または無血清 CCM3 メディア。ML 成虫ディスクと中枢神経系 (CNS) 行増殖のインスリン補充が必要。ミルナー成虫ディスク ラインは、インスリンとフライ エキスが摂取を必要とします。付着 fGS oss では, 細胞の成長のためインスリン、フライのエキスとしてグルタチオンの高濃度が必要です。付着性 RasV12ラインは M3 + BPYE でよく育つ (10 %fcs)。トリプシンは、成長面から付着性のセルラインを取り除くために使用されます。
| 細胞 (# ストック) | 遺伝子型 | 倍加時間 (h) * | 組織のソース |
| S2R + (150) | 動体 | 39 | 遅い胚 |
| S2 DGRC (6) | 動体 | 23 | 遅い胚 |
| S2 DRSC (181) | 動体 | 46 | 遅い胚 |
| Kc167 (1) | e/se | 22 | 6−12 h 胚 |
| ML BG2 c2 (53) | y v f マル | 48 | 3rd齢幼虫中枢神経系 |
| ML BG3 c2 (68) | y v f マル | 104 | 3rd齢幼虫中枢神経系 |
| ML DmD8 (92) | y v f マル | 66 | 3rd齢幼虫翼ディスク |
| CME W1 Cl.8+ (151) | 動体 | 46 | 3rd齢幼虫翼ディスク |
| CME L1 (156) | 動体 | 47 | 3rd齢幼虫脚ディスク |
| OSS (190) | 体86 | 45 | アダルトbam変異卵巣 |
| RasV12行 | UA-GFP。P(UAS-Ras85D.V12)/P (Act5C GAL4) 17bFO1 | 41−65 | 胚 |
表 2:遺伝子型、倍加時間とのティッシュ ソースを広く使用ショウジョウバエ細胞株。組織の遺伝子型、ソース、倍加時間は一般的に使用される細胞の人口が掲載されています。倍加時間は 25 ° C で推奨メディアの成長に基づいて
| 培養器 | メディア (mL) のボリューム |
| 12.5 cm2 T フラスコ | 2.5 |
| 25 cm2 T フラスコ | 5 |
| 75 cm2 T フラスコ | 15 |
| 35 mm プレート | 1 |
| 60 mm の板 | 4 |
| 100 mm の板 | 10 |
| 384 ウェル プレート * | 0.04/ウェル |
| 96 ウェル プレート * | 0.1/ウェル |
| 48 ウェル プレート * | 0.3/ウェル |
| 24 ウェル プレート * | 0.5/ウェル |
| 12 ウェル プレート | 1.0/ウェル |
| 6 ウェル プレート | 2.0/ウェル |
テーブル 3: 培養容器および推奨メディア ボリューム。様々 なサイズの培養容器はショウジョウバエ細胞を培養です。適切なメディア ボリューム (mL) は、各容器に適しています。メディア蒸発による損失を低減するパラフィン フィルム細胞懸濁液 0.5 mL 未満を含むウェル プレートをシールします。
| ボリューム | |
| M3 + BPYE、pH 6.6 | 70 mL |
| 熱は、FCS を不活化 | 20 mL |
| 滅菌フィルター DMSO * | 10 mL |
表 4: 凍結中 (M3 + BPYE、20% の FCS 10 %dmso) 100 mL を準備するためのレシピです。必要に応じて凍結メディアを準備し、長時間の DMSO を含む凍結のメディアを格納するを回避します。
| M3 + BPYE 媒体 | 量 |
| 盾し、歌ったの M323 | 1 ボトル |
| KHCO3 | 0.5 g |
| 選択酵母エキス | 1.0 g |
| Bactopeptone | 2.5 g |
| 滅菌精製水 | 1000 mL |
表 5:M3 + BPYE の 1 L の準備のためのレシピ組織培養培地。6.6 pH を調整します。0.22 μ m のフィルターを介してメディアを渡すことによって殺菌します。
| FGS/OSS セルラインの基本の M3 媒体 | 量 |
| 盾し、M3 を歌った | 1 ボトル |
| KHCO3 | 0.5 g |
| C5H8自演4 | 1.0 g |
| 滅菌精製水 | 1,000 mL |
表 6:FGS/OSS M3 基本培地 1 L のレシピ。6.8 pH を調整します。0.22 μ m のフィルターを介してメディアを渡すことによって殺菌します。
| Hyclone CCM3 | 量 |
| CCM3 パウダー | 28.6 g |
| NaHCO3 | 0.35 g |
| 10 N NaOH | 2.5 mL |
| CaCl2 | 0.5 g |
| 滅菌精製水 | 1,000 mL |
表 7:Hyclone CCM3 組織培養培地の 1 L のレシピ。6.2 に pH を調整します。0.22 μ m のフィルターを介してメディアを渡すことによって殺菌します。
| M3 + BPYE + 10% FCS | 三宅ディスクと CNS 行中 | ミルナー ディスク行中 | fGS/OSS 完全培地 | |
| M3 + BPYE、pH 6.6 | 90 mL | 90 mL | - | - |
| 熱不活化 FCS * | 10 mL | 10 mL | 2 mL | 10 mL |
| インスリン (10 mg/mL) | - | 100 Μ L | 50 Μ L | 100 Μ L |
| エキスを飛ぶ | - | - | 2.5 mL | 10 mL |
| グルタチオン (60 mg/mL) | - | - | 1 mL | |
| M3、pH 6.6 | - | - | 97.5 mL | - |
| fGS/OSS M3、pH 6.8 | - | - | 79 mL |
テーブル 8:様々 な共通の 100 mL の準備のためのレシピショウジョウバエ細胞の培養基。FCS を 56 ° C 1 時間インキュベートし、補体タンパク質を熱不活化する 5 分ごとを振る。
Discussion
ショウジョウバエ培養細胞は、高スループット セル ベースの画面の主な試薬です。使用も細胞生化学、急速なハエ、細胞生物学、顕微鏡、最近では遺伝子の体細胞に注入する前に遺伝子構造のテストに適した均質な人口を提供することで生体内での遺伝子研究を補完します。1,2,3,8,9,10を編集のゲノムによって操作します。
生存率と凍結のショウジョウバエの細胞の回復は、低温でも急激な変動に敏感です。DGRC は N2 (-196 ° C) の液体相における凍結細胞ラインを格納し、ドライアイス (-78.50 ° C) で転送します。ドライアイスで運ばれている凍結アンプルをリキッド N2またはストレージの-80 ° C のフリーザーに転送してはいけません。凍結細胞の解凍、できるだけ早く到着 (プロトコル セクション 1) 高細胞密度で再シード、意図された目的 (プロトコル セクション 3) 培養がする必要があります代わりに。実験のための細胞株がすぐに利用されていないセルの行をする必要があります使用する準備ができるまで (プロトコル セクション 6), 凍結保存。
ML BG2 c2 Ras ラインなどのいくつかの細胞株では、数日凍結状態から復活する効果から回復する必要があります。細胞の残骸のかなりの量はこれらの細胞株に融解後最初の数日間を伴います。妨げられていない残って、細胞は回復し、増殖します。ショウジョウバエのセル行数、DGRC は M3 ベース メディア22での成長に適応されています。細胞融解の影響から回復に時間がかかる、調節されたメディアの使用が役に立つ可能性があります。調節されたメディア可能性にはには、回復と融解後の細胞の増殖を促す可能性がありメディアに細胞によって分泌される成長因子が含まれています。
細胞一般に遅れ位相、指数段階、プラトー相と劣化相から成るステレオタイプ的な成長曲線に従います。1 x 10 の6と 1 x 107セル/mL 25 ° C での密度で培養している多くのショウジョウバエの細胞成長のログ段階で増殖します。急激な成長段階で常にように、細胞は継代が不可欠です。
パーセンテージ、文化の合流点では、細胞によって覆われている成長表面領域について説明します。セルラインのセルの合流点は、その細胞の形とサイズに依存します。異なる細胞が異なる形態と付着性あります。その結果、およそ似たような合流点で異なる細胞株は大幅に異なるセル密度 (図 1) があります。文化の合流はショウジョウバエ細胞が成長表面がされた後も、互いの上に盛り、巣または懸濁液中のいずれかを増殖し続けるので、ショウジョウバエ培養細胞を継の理想的な指標にできない場合があります。カバー (図 1)。ただし、特定のセルの行を持つ経験豊富なユーザーの急速な視覚的なガイドとしてサブカルチャーに合流使用が頻繁。
19−25 ° C 周囲常温ショウジョウバエラインを育てることは可能ですが、周囲温度の変動は増殖率に影響を与えるのでないお勧め。専用の 25 ° C の定温器の使用をお勧めします。ショウジョウバエ培養細胞のためのインキュベーターは、ショウジョウバエの細胞培養媒体は、バッファリングの CO2を使用しないために、CO2ガス交換を容易にする必要はありません。細胞を培養するためのインキュベーターの湿度は、プレートで細胞を培養するとき見落とされないための重要な要因です。インキュベーターと作業環境の種類によっては、インキュベーター内の滅菌水のビーカーを配置する必要があります。メディアの蒸発を最小限に抑えるために閉じた T フラスコを使用またはインキュベーターの中の堅く密封されたプラスチック容器で培養皿を格納します。
ショウジョウバエ細胞二次培養のスケジュールを開発することが重要です。成長率とモニターの一貫性を推定するには、(分割比 1:2、1:4、1:8) も幾何学的な比率でサブカルチャーに便利です。たとえば、8 x 106セル/mL Kc167 細胞の 10 mL 合流プレートは、1 x 106セル/mL (1.25 mL の新鮮なメディアの 8.75 mL に希釈した細胞懸濁液) の播種密度を達成するために 1:8 の比率で分割できます。72 h、24 h の倍加時間を与え 8 × 10、6セル/ml の密度に増殖する Kc167 文化が期待されます。したがって、分割比は成長の彼らの指数ログの段階で細胞を培養している常にことを確認、週に 2 回までの便利なサブカルチャー ルーチンを容易にするために決定されます。合流する時間が短すぎるも長くなるように、セルを subculturing のための規則的なスケジュールが可能になります。合流に時間が短すぎる場合、セルはセル密度が低い (より高い分割比) で継代します。同様に、合流点に到達する時間が長すぎる場合、細胞は細胞密度が高い (低い分割比) で継代します。ほとんどショウジョウバエ細胞が低細胞密度に非常に敏感に注意することが重要だ (< 1 x 10 の5セル/mL)、セルはほとんど増殖し、最終的には死ぬかもしれない。
ショウジョウバエの細胞の成長特性と形態によって異なります。その結果、異なるプロパティを持つ細胞は、異なる方法で処理する必要があります。ほとんどショウジョウバエ細胞は半付着性です。細胞密度が低い、彼らは成長の表面に強く付着と文化は、コンフルエントになると、セル少ない付着性になるし、簡単にデタッチします。この細胞接着性の漸進的な変更それにより、単にそれらを除去する細胞膜上のメディアを分配する演算子として最も広く使われているショウジョウバエ細胞株 (シュナイダー、Kc 線、成虫ディスクおよび中枢神経系の線) の簡単な継代培養が容易になります成長表面のカルチャが密な場合。表面付着をラインの女性生殖系列幹/卵巣体シース (fGS/OSS) と Ras ライン、それは成長面からセルを取り外すときに支援するために短い期間のトリプシンで細胞をインキュベートする不可欠です。
ほとんどショウジョウバエ細胞に対するメディアの追加には、牛胎児血清 (FCS) が含まれます。インスリンと大人フライ エキス (FEX) いくつかの特定の行に必要です。FEX には、特定の幼虫成虫ディスク ラインと大人の卵巣細胞の成長に必要不可欠な未定義の部品が含まれています。DGRC の準備となります利用可能なアダルト FEX に由来する 1 週齢のオレゴン州 R modENCODE ハエ (RRID: BDSC_25211) 2.5 mL と 10 mL の因数で。DGRC も説明します小規模 FEX 準備のウェブサイトに < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>。ただし、FEX 準備は時間がかかり、成虫の大規模な量を必要とします。
ショウジョウバエの細胞の凍結保存は、即戦力ではなく時間と細胞の維持のための試薬を保存します。凍結保存は-80 ° C における凍害防御剤、DMSO を含有する培地にゆっくりと凍結細胞 (-1 ° C/分) によって実現されます。遅い冷却ステップは、凍結保存の成功にとって重要です。-80 ° C のフリーザーで細胞のアンプルはイソプロパノールでいっぱい冷凍コンテナーに配置時の-1 ° C/分の速度で冷却されます。周囲温度 25 ° C で始まる、それは-80 ° C に到達するアンプル内の温度の 2 h までかかります一晩を凍結するアンプルのままにすることをお勧めします。
凍結アンプルは、長期貯蔵窒素の液体段階に急速に転送する必要があります。周囲温度、クリオバイアルはおよそ 10 ° C/分で急速に再加熱し、23-50 ° C の上で生存率が低下します。転送を高速に保つために、周囲温度への露出を最小限に抑えるために少量でアンプルを処理します。また、液体 N への移転のため準備中にドライアイス冷凍クリオバイアルを配置2.液体窒素が使用できないセルは時間の経過とともに劣化のリスクが、-80 ° C の冷凍庫に格納場合があります。
細胞密度は、凍結保存の成功と細胞のそれに続く復活のため重要です。一般に、細胞の過剰が利用可能になるとすぐに、新しいセルの行は初期の作成に冷凍する必要がありますは (1 − 3 アンプル) をフリーズします。細胞ラインでさらに安定して培養された、10−20 アンプルの冷凍ストックを作成する必要があります。その後凍結細胞回復と生存率、その後、それは実験の伝播を確認するまたは冷凍ストック アンプル数を下回る 5 株式を交換する、この株式は解凍し。最後に、解凍のセルが親株式の特性を維持して3,24を進化する細胞が知られていることを検証することが重要です。
結論として、この記事はショウジョウバエ細胞の基本的な処理の様々 なライン、ベスト ・ プラクティス、および視聴覚プロトコルに関する基本的な情報を提供して、ショウジョウバエ培養細胞を操作するためのプライマーを示します。このアクセス可能なリソースは、スムーズにショウジョウバエの培養細胞での作業への導入を容易にするため、任意の研究所で、既存のトレーニング ガイドを補完するものです。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は、DGRC のキュレーションショージョーバエ ・ DNA/ベクトル/セルのさまざまなリソースを利用するため健康の国民の協会 (NIH P40OD010949 賞) と研究コミュニティをありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
| 25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
| 35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
| Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
| Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
| Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
| Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
| DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
| Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
| Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
| Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
| Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
| Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
| L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
| Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
| Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
| Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
| Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
| Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |
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