Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לייצר בו תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מן העור של 0-4 העכברים הישנים של היום. התרבויות העיקריות הללו ניתן לשמור ומניפולציות בתוך מבחנה כדי ללמוד מגוון של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל ביולוגיה של תאי העור, פיגמנטציה, ריפוי פצעים ומלנומה.
Abstract
פגמים בטיפול בפיברולגון או בתפקוד מלנוציט קשורים למחלות עור, כולל תפקוד המכשול המסכן, ריפוי בפצע פגום, פגמים בפיגמנטציה וסרטן. חיוני להבנה ולנאום של מחלות אלו הם ניסויים בתרבויות היסוד בגידולים ובתרביות מלנוציט. עם זאת, הפרוטוקולים הנוכחיים עבור בידוד מלנוציט דורשים כי שכבות באפידרמיס העורי של העור הם טריסינטזציה ומנותק ידנית. תהליך זה הוא זמן רב, טכנית מאתגרת ותורמת התפוקה לא עקבית. יתר על כן, שיטות לייצר בו תרבויות טהור העור מאותו דגימת רקמות אינם זמינים בקלות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור בידוד המלנוציטים והפיברוהכדורים מהעור של העכברים ביום לאחר הלידה 0-4. בפרוטוקול זה, העור השלם הוא הומוגניים מכנית באמצעות מסוק רקמה ולאחר מכן מתעכל בקצרה עם הקולגן וטריפסין. אוכלוסיות תאים מבודדות אז באמצעות ציפוי סלקטיבי ואחריו טיפול G418. הליך זה מביא התשואות עקבית מלנוציט ופיברוהפיצוץ מעכבר בודד פחות מ 90 דקות. פרוטוקול זה גם מדרגי בקלות, ומאפשר לחוקרים לעבד כפות גדולות של בעלי חיים ללא עלייה משמעותית בזמן. אנו מציגים באמצעות שימוש בהערכות הסייטוטומטריות שתרבויות שהוקמו באמצעות פרוטוקול זה מועשר במידה רבה עבור מלנוציטים או פיברוהריות.
Introduction
העור הוא איבר רב שכבתי המגן על הגוף מפני פתוגנים זרים והקרנה אולטרה סגולה (UVR). העור גם משחק תפקיד קריטי הומסטטי תהליכים כגון ריפוי הפצע, בקרת טמפרטורה וויטמין D הפקה1,2,3. העור של המיונקים מורכב משלושה סוגי תאים עיקריים: מלנוציטים, פיברונוציטים ו keratinocytes. אלה סוגי תאים לאכלס שכבות שונות של העור, עם keratinocytes ממציא את האפידרמיס, הגידולים המתגוררים בתוך דרמיס ו מלנוציטים לקשר באפידרמיס העור וזקיקי השיער4. כאן, אנו מפרטים הליך פשוט המאפשר את הדור המקביל של התרבויות הראשיות מלנוציט ופיברובלסט מעור מורלין.
מלנוציטים הם תאים המייצרים פיגמנט נמצא במקומות רבים ברחבי הגוף האנושי, כולל האפידרמיס הבזליים, איריס, שבלול, המוח וזקיקי השיער5. הפונקציה העיקרית של מלנוציטים היא לייצר ולהפריש מלנין המכילים שלפוחיות בשם מלאנוזומים5,6. מלאנוזומים מכילים שני מחלקות עיקריות של מלנין: מלנין חום/שחור וצהוב/בצבע אדום-פאומאלאנין6,7. תהליכים ביוכימיים בתוך המליוציט מווסת את השפע היחסי של כל מיני מלנין ומסייעים לקבוע את צבע השיער, העור והעין8,9. מלנין משמש גם לקלוט UVR ולהגן על רקמות חשופות השמש מ מוטגנזה10.
תפקוד מלנוציט יכול לגרום לפגמים פיגמנטרים ולהגדיל את הרגישות לסרטן העור. לדוגמה, העור hyper-פיגמנט מאפיין המאפיינים של מלזמה הם תוצאה של ייצור overproduction מלנין מוקד, ואילו germline מוטציות גנטיות אשר להתפשר על גנים מעורב סינתזה מלנין להוביל לבקנות11,12 . ידע אינטימי של ביולוגיה של מלנוציט נדרש לפתח אסטרטגיות שיתקנו פגמים פיגמנטרים כאלה ובסופו של דבר לשפר את הרווחה הפסיכופסיכו של אנשים הנגועים במחלות אלה. להגרעונות בייצור מלנין ו/או הסינתזה המוועדף של פאנדואנאין משויכים גם לסרטן העור מוגבר סיכון10. סיכון זה הוא האמין תוצאה של הגנה מופחתת uvr6,13. כך, שיטות לשפר או לשחזר הייצור האומלנין במלנוציטים עשוי להפחית את השכיחות של סרטן העור באוכלוסיות אלה.
מססניקל פיברולליים לבסס את רקמת החיבור ואת התמיכה המבנית עבור כל אברי הגוף, כולל השכבה העורי של העור14. הפרשה של חלבונים כגון קולגן, אלסטין, למינציה ו fibronectin לאפשר פיברוהפיצוצים כדי ליצור את מטריקס מסחטות (ecm) כי הוא חיוני עבור שלמות רקמות1,14. פיברותקיעות גם לשחק תפקידים חיוניים בתהליכים כגון ריפוי הפצע, דלקת, אנגיוגנזה והיווצרות סרטן/התקדמות1,15,16.
בדומה למלנוציטים, פגמים בהפעלת פיברובלסט ובתפקוד יכולים לקדם את המחלה בטווריגנזה ובמחלות. לדוגמה, הפעלה בלתי הולמת פיברוהפיצוץ מוביל בדרך כלל להיווצרות פיברוזיס, וכתוצאה מכך ההצהרה המשופרת של רכיבי ECM עודף לתוך הרקמה הסובבת. כמו הפיברותקיעות לשמור על הרבה של הגוף שלמות מבנית, פיברוזיס מקדם מחלות המשפיעות על רקמות ואיברים רבים, כולל פיברוזיס הריאות אידיופטית, טרשת מערכתית, שחמת הכבד ופיברוזיס של הלב15. פיברותקיעות גם לשחק תפקיד קריטי בסרטן16. סרטן הקשורים לפיברותקיעות (CAFs) הם התאים הנפוצים ביותר שאינם ממאירים ב מיקרוסביבה של גידולים רבים. CAFs הוכחו לקדם התפשטות הגידול, התקדמות ההתנגדות הטיפולית על ידי קשיות רקמות מאופייגטיים, הייצור cy, המקומי ותפקוד החיסון16.
תרביות תאים ראשוניים לספק חוקרים עם מודלים מגנטי מגנטית לזהות ולהמתיק פגמים מלנוציט ופיברובלסט המובילים למחלות. עם זאת, שיטות נוכחיות להקמת תרבויות מלנוציט הן זמן רב ומאתגרות באופן טכני. הצורך בטריסיזציה והפרדה עדינה של האפידרמיס והדרסטיות תורמת לשונות בתפוקה הניסיונית ומקשה על ביצוע ניסויים בקנה מידה גדול. יתר על כן, הפרוטוקולים לבידוד בו הפיברוציטים מעור שלם חסרים כרגע בשדה.
פיתחנו שיטה כדי להפחית את שלבי העיבוד, השונות והזמן הנדרש כדי ליצור תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מאותה דגימת עור כולה. באמצעות שיטת הומוקות מכנית ולאחריה עיכול קצר, האסטרטגיה שלנו מקטינה באופן משמעותי את כמות הידיים על הזמן הנדרש כדי לבודד את המלנוציטים הראשוניים תוך הפיכת בידוד פיברופיצוץ במקביל. מהירות מוגברת, יעילות ועקביות של פרוטוקול זה, בשילוב עם היכולת לבודד מלנוציטים מ 0-4 ביום העכברים הישנים, מספק לחוקרים את הגמישות לבצע מגוון רחב יותר של ניסויים מאשר אפשרי בעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
קבל אישור מוועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים לפני שאתה מתחיל את זה או כל מחקר אחר המעורב בבעלי חיים. ניסויים שבוצעו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת אוהיו (IACUC, פרוטוקול2012A00000134).
1. הכנה לפרוטוקול
הערה: הוראות הכנה הכימית הבאות מתאימות לדור של 9 ס מ2 תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מעכבר אחד. עיין במדריך להכנה מגיב בטבלה 1 לצורך הדלצות בקנה מידה גדול יותר.
- להכין 1.5 mL של הפתרון קולגן המכיל 50 μg/mL קולגן בשנת 0.1 חומצה אצטית קרחוני.
- בארון זרימה למינארי, מעיל אחד טוב של צלחת התרבות 6-היטב עם 8 μg/cm2 (1.44 ML) קולגן פתרון. ודא כי הבאר מכוסה לחלוטין על ידי פתרון קולגן. מודחת את המנה ב-37 ° c למשך 3 שעות או ב -4 ° c בלילה. לפני השימוש, לשטוף את הקולגן מצופה היטב פעמיים עם 1.35 mL של מלוחים סטרילית פוספט באגירה (PBS) (150 μL של PBS לכל 1 ס מ2).
- להרכיב את המסוק רקמות בארון זרימה למינארי על ידי הצבת בזהירות דיסק חיתוך על פלטפורמת המסוק הרקמה ואבטחת להב סטרילי לזרוע ההזזה.
- להכין 3 mL של 1 x אנטיביוטי/Antimycotic פתרון על ידי דילול 100x אנטיביוטי/Antimycotic מניות פתרון ב-PBS סטרילי.
- הכינו 3 מ ל של מאגר עיכול טרי העור המכיל 10% סרום של שור עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין פתרון, 1% L-גלוטמין, 10 מ"ג/ml קולגן מסוג i, 0.25% חזירי טריפסין ו 0.02 mg/ml deoxyribonuclease i ב RPMI 1640.
- הכינו 6 מ ל של מדיה מלנוציט טרי המכיל 10% סרום של שור עוברי, 7% סרום הסוס, 1% פניצילין/סטרפטומיצין פתרון, 1% L-גלוטמין, 0.5 mM די בוטיל מחזורי המגבר (dbcAMP), 20 ננומטר כולרה 13-אצטט (הסברתי) ו 200 pM כולירה טוקסין (CT) ב מזון מיקס F-12. התקשורת של האם
הערה: מרוכז dbcAMP, הסברתי ו-CT פתרונות מניות ניתן לעשות, מצוטט ומאוחסן עבור > 1 שנה ב-80 ° c. מדיית בסיס החסרה רכיבים אלה, יכולה להיות מאוחסנת עד חודש אחד ב-4 ° c. - הכינו 4 מ ל של מדיה פיברובלסט המכיל 10% סרום של שור עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% L-גלוטמין ב בינוני הנשר של דולבקה שונה. ניתן לאחסן מדיה זו ב-4 ° צ' עד לחודש אחד.
- הכינו 40 mL של 4% הפתרון פאראפורמלדהיד על ידי דילול 16% פאראמפורמלדהיד ב PBS. אחסן כל עודף ב -4 ° c במשך חודש או עד 20 ° c עד שנה אחת.
- הכינו 1% סאפונין פתרון מניות על ידי ערבוב 0.5 g של סאפונין ב 50 mL של PBS ב 37 ° צ' עד סאפונין יש התפרקה לחלוטין. לחטא את הפתרון לאחסון לטווח ארוך באמצעות מזרק 50 mL מצויד במסנן 0.2 יקרומטר-PES. את הפתרון המתקבל סאפונין מניות ניתן לשמור ב 4 ° צ' עבור 1 חודש.
- להכין 200 μl של 0.1% סאפונין פתרון לכל העכבר על ידי דילול 1% סאפונין פתרון מניות ב-PBS המכיל 3% בסרום שור אלבומין (bsa).
- הכינו 1 מ ל של פתרון הכדאיות על ידי דילול 1 μL של לתקן את היכולת לתקן הכדאיות 1 מ ל של PBS.
2. בידוד מלנוציט ופיברובלסט
- המתת חסד 0 ל -4 ביום זכר ו/או נקבה C57Bl/6J כלבלבים על ידי עריפת ראש ולהסיר את הגפיים מן העכברים מורדמים באמצעות מספריים כירורגי.
- בארון זרימה למינארי, התגלגל בקצרה את תא המטען של כל עכבר בצלחת פטרי סטרילית המכילה 70% אתנול. הסירו את הגזע מהאתנול והניחו אותו לצלחת פטרי ריקה וסטרילית.
- באמצעות מספריים כירורגית, מעוקר ב 70% אתנול, לעשות חתך בעור בצד הגחוני של הגזע החל מהצוואר אל הזנב. לקלף את העור מתוך תא המטען של העכבר באמצעות מלקחיים סטרילי.
- מניחים את העור דרמיס למטה במנה 6-היטב המכיל 3 מ ל של 1x אנטיביוטי/Antimycotic פתרון ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2-3 דקות.
- הפעל את מסוק הרקמה עם ההגדרות הבאות במקום: עובי פרוסה: 1 μm; כוח להב: ~ 60% מהמקסימום; מהירות: ~ 50% של המקסימום.
- להעביר את העור, דרמיס בצד למטה, אל הדיסק המסוק סטרילי הנייר ולהעביר את העור לחלוטין דרך המסוק רקמות שהופעלו 3 פעמים.
- להעביר את העור הומוגניים כדי סטרילי, 15 מ"ל שפופרת חרוט המכיל 3 מ ל של מאגר עיכול העור. מערבבים את ההשעיה שנוצר על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10-15 פעמים עם מיקרופיפטה P1000.
- Cap שפופרת חרוט ו מודטה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עבור 15 דקות, היפוך הצינור כל 3-5 דקות.
- גלולה את התאים בעור המגון אכלו על ידי תפרידו את צינור חרוט ברוטור דלי מנופף ב 750 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- באמצעות P1000 מיקרופיפטה, לאט לחלוטין להסיר את מאגר העיכול העור להיזהר לא להפריע את הגלולה.
הערה: חלק של עור שלם ניתן לשמור בשלב זה ומשמש כפקד עבור שלב 3: אישור של טוהר הסלולר. מסננים תאים אלה באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר ולאחר מכן להתחיל בשלב 3.5 לעיבוד נוסף. - השעיית מחדש ביסודיות את הגלולה הסלולרית ב-1 מ ל של מלנוציט מדיה על-ידי ליטוף למעלה ולמטה 15-20 פעמים עם מיקרופיפטה P1000. הוסף את פתרון התאים המתקבל dropwise לבאר בלתי מצופה של מאכל 6-טוב המכיל 1 מ ל של מלנוציט מדיה.
- מניחים את העור מצופה הומוזה בחממה תרבית רקמה להגדיר ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאפשר לתרבויות לדגירה עבור 40 דקות.
הערה: במהלך הזמן הזה, כמה התקיעות בעור המגון לאכול יהיה לדבוק במנה הבלתי מצופה בעוד המלנוציטים ו keratinocytes נשארים בהשעיה. - העבר את התרבות supernatant מן המנה הבלתי מצופה לבאר אחת של מראש שטף, קולגן מצופה מאכל 6-היטב. הוסף G418 למדיה כגון הריכוז הסופי הוא 100 ng/mL.
- הוסף 2 מ ל של מדיה פיברובלסט לבאר אחת של המנה הבלתי מצופה, כיום המכיל פיברופפיצוצים.
- דגירה שתי התרבויות לילה בחממה תרבות רקמה להגדיר ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- בנפרד מולף את התקשורת ואת כל הפסולת מכל תרבות, 16-24 h לאחר ציפוי. לשטוף כל מנה פעמיים עם 1 מ ל של ה-PBS סטרילי, ולאחר מכן להוסיף 2 מ ל של מדיה טריים מלנוציט בתוספת 100 ng/mL G418 לתרבות מלנוציט 2 מ ל של מדיה פיברובלסט טרי לתרבות פיברובלסט.
- לאחר התרבויות מלנוציט טופלו עם G418 h, 48 לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ ל של PBS סטרילי ולהוסיף 2 מ ל של מדיה מלנוציט טרי מבלי G418 לתרבות.
הערה: כאשר הגידול בתרבות המללנוציט ממשיך למות ביטול הטיפול post-G418, לשטוף את התבשיל עם ה-PBS הסטרילי כדי להסיר תאים מתים ולהוסיף מדיה מלנוציט טרייה. בתרבויות מלנוציט ו פיברובסט יש להיות בגיל כאשר הם מגיעים 70-80% השטף.
3. אישור לטוהר הסלולר
- מנושף את התקשורת מכל תרבות ושוטף בזהירות כל מנה עם 1 מ ל של הערוץ הסטרילי.
- הוסיפו 0.7 mL של 0.25% טריפסין לכל תרבות ומודחלת את התרבויות בטריפסין ב-37 ° צ' ו -5% CO2 עבור 1 דקות.
- באמצעות ליטוף הטריפסין בתחתית המנה באמצעות מיקרופיפטה P1000.
- הוסיפו 0.7 מ ל של המדיה המתאימה לכל התרבויות הטריסידיות, והעבירו את פתרון התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 750 x g עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר ולמחוק את supernatant באמצעות P1000 מיקרופיפטה.
הערה: שלבים 3.1-3.5 ניתן להשתמש לעבר תרבויות מלנוציט ופיברובלסט. את הגלולה כתוצאה יש להשעות מחדש את המדיה המתאימה ומושם חדש, לא מצופה (פיברותקיעות) או מראש, מצופה קולגן (מלנוציטים) הצלחת. - השהה מחדש את הגלולה ב0.5 מ ל. של הערוץ הקרח הקר
- לספור ולהעביר 500,000 תאים לצינור טרום מקורר 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
- חזור על שלב 3.5 ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ב-100 μL של פתרון הכדאיות. מכבית את המתלה לתא במשך 30 דקות ב -4 ° c בחשיכה.
- חזור על שלבים 3.5-3.6 פעמיים.
- חזור על השלב 3.5, ואז לתקן את התאים על ידי השעיית הגלולה ב 100 μL של קרח קר 4% הפתרון פאראפורמלדהיד. מודקון את ההשעיה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- חזור על שלב 3.5 פעמיים, בכל פעם השעיית מחדש את הגלולה ב 0.5 mL של 3% BSA ב-1x PBS.
- חזור על שלב 3.5, לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה התא ב 100 μL של 0.1% Saponin פתרון. מודקון את ההשעיה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- חזור על שלב 3.5, לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה תא ב 100 μL של 0.1% Saponin פתרון המכיל 0.5 μg של הארנב anti-gp100 נוגדן, 0.5 μg של ארנב אנטי פיברוסט ספציפי חלבון 1 (FSP1) נוגדן ו 0.025 μg של העכבר נגד ציטוקרטין 14 (K14) נוגדן. . בטמפרטורת החדר בחשיכה
הערה: בעוד את הנוגדן K14 נרכש מראש מעלה מעלה לאלקסה Fluor 647, gp100 ו FSP1 נוגדנים היו מצוקדים ל-CF 555 ו CF 488, בהתאמה. כתמים של אוכלוסיות השליטה צריך גם להתחיל בשלב זה. יש לבודד אוכלוסיות תאים מהתרבות ולעבד אותן כמתואר בשלבים 3.5-3.12. - חזור על שלב 3.11 פעמיים, כדי להסיר נוגדן לא מאוגד.
- חזור על שלב 3.5, לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה התא ב 200-400 μL של 3% BSA ב-1x PBS.
- להעביר את הפתרון הסלולרי דרך מסננת תא 40 יקרומטר לתוך 5 מ ל פוליסטירן מוקצף עגול-התחתון ולנתח את התאים המתוחים על ידי לזרום cy, לנסות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים זכר ונקבה C57Bl/6j הורדמים על ימים לאחר הלידה 0-4 ואת העור עזרתי היה נתון דיסוציאציה מכנית כמתואר לעיל. לאחר החיתוך, העור יצר מחסור צמיגי חסר כל סימן לרקמה מבנית. הצנטריפוגה של המשקע הביא להיווצרות מיכל תא גדול בתחתית הצינורית החרוטית ושכבת אדיפוז שצפה בראש הסופרנטאנט. שכבת האדיפוז הזאת הושלך עם הסופרנטאנט בעוד שהגלולה הסלולרית הנותרת הופסקה והועברה לבאר בלתי מצופה ממנה של 6 היטב. צפיפות התאים הגבוהה גרמה לאמצעי התקשורת להיראות מעוננים. עם זאת, לאחר 40 דקות של דגירה, התאים הגדולים ותאגידים רקמות נצפו באמצעי התקשורת והמיקרותקיעות ניתן לראות עם מיקרוסקופ אור הפוכה (איור 1).
התאים הלא מחסיד של התרבות הפיברובלסט הועברו אחד היטב של מאכל 6-טוב מצופה קולגן על מנת לבודד מלנוציטים. תוספת של G418 הרג כל הפיברוטים הנותרים בהגון, השארת תאים מתים רבים צף במדיה של 5 הימים הבאים (איור 2א-ג). לאחר 4-5 ימים של הצמיחה, החלה מלנוציטים מצופה לקחת על פניטיפ דנדריטים סטריאוטיפי עם גרגירים מלנוציטוטיים (איור 2ג). הפנוטיפ הזה התעקש לאחר הפסיית התרבות (איור 2ד). בעוד אשכולות של keratinocytes מזהם נצפו בתחילה בתרבויות מלנוציט (איור 2א), אוכלוסיות אלה אבדו בעקבות הכניסה הבאה.
ניתוחים של הסייטוטומטטיים שימשו כדי לאשר את הטוהר של התרבויות הראשיות הנובעות מלנוציט ו הפיברובלסט. C5N עכבר keratinocytes17, יום 10 בתרבויות מלנוציט הראשי ויום 6 תרבויות העיקריים פיברוהפיצוץ היו מוכתמים עם: anti-gp100 (הבדיל מלנוציטים), Anti-ציטוקרטין 14 (K14; keratinocytes) ו אנטי פיברולסט-חלבון ספציפי 1 ( FSP1; פיברותקיעות) (איור 3). בתאים אלה, gp100 כתמים היה ספציפי המלנוציטים הראשי, בעוד FSP1 חיוביות נצפתה רק בפיברותקיעות (איור 3א, ב). הביטוי של K14 היה מוגבל C5N keratinocytes (איור 3ג). ניתוחים נוספים בוצעו כדי לקבוע את טוהר התרבויות המלניציט שלנו 1, 2, 3, 4 ו -10 ימים לאחר בידוד (איור 4). שילוב פיברוהפיצוץ וזיהום keratinocyte מעולם לא חרג 25% של התאים הכולל בתרבות (איור 4ב, ג). עם זאת, עליות דרמטיות ב-gp100 לא נצפו עד היום הרביעי בתרבות (איור 4א). אנו מייחסים התבוננות זו לביטוי מופחת של gp100 בתוך מלנומה מלציט (כלומר, מלנומה), רבים מהם מופיעים להבדיל באופן מלא ביום 10 בתרבות (איור 4א). לסיכום, נתונים אלה מדגימים שפרוטוקול הבידוד המהיר שלנו מייצר בו תרבויות מועשר למלנוציטים ולפיברוביגים.
| צעד # | ריאגנט | כיתה 1 | 5 כלבלבים |
| 1.1 | קולגן פתרון | 1.5 מ ל | 4.5 מ ל |
| 1.2 | גודל צלחת | 6-טוב | 10 ס מ |
| 1.4 | אנטיביוטי/פתרון Antimycotic | 3 מ ל | 15 מ ל |
| 1.5 | מאגר עיכול העור | 3 מ ל | 15 מ ל |
| 1.6 | מלנוציט מדיה | 6 מ ל | 30 מ ל |
| 1.7 | מדיה פיברובלסט | 4 מ ל | 20 מ ל |
טבלה 1: מדריך הכנה מגיב למידות שונות.
איור 1 : תמונות מייצגות של תרבויות מורמיות ראשיות. המוצגים הם 20x תמונות של פיברותקיעות מיד לאחרבידוד (א), כמו גם 24 (ב) ו 48 (ג) h לאחר בידוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : תמונות מייצגות של תרבויות מלנוציט הראשי. המוצגים הם 20x תמונות של תרבויות מלנוציט 1 (א), 2 (ב) ו 4 ימים (ג) לאחר בידוד. מזהם keratinocytes מסומנים על ידי החץ ' A '. (ד) דמות ייצוגית של תרבויות מלנוציט ראשיות לאחר הפסנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : הערכות הציטוטומטריות לזרימה של טוהר התרבות. היסטוגרמות מייצגות מראה gp100 (A; מלנוציטים), FSP1 (ב; פיברותקיעות) ו K14 (C; keratinocytes) חיוביות במלנוציטים הראשי (יום 10), פיברוהפיצוצים העיקריים (יום 6) ו-C5N keratinocytes. לאחר בידור על תאים חיים, 10,000 אירועים נותחו מכל אוכלוסיה. פקדי צבע יחיד שימשו לפיצוי והנתונים שנוצרו כתוצאה מכך היו מדמיינו עם תוכנת FlowJo. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : קורס הזמן ניתוח של טוהר מלנוציט. מציגים היסטלציט טוהר 1-10 ימים לאחר הבידוד הראשוני. הדגימות היו מוכתמות, נותחו ומנותחים כמתואר באיור 3. אוכלוסיית השליטה החיובית והשלילית הייתה כדלקמן: gp100--מלנוציטים אנושיים (+), מלנומה הראשי (-); FSP1--מלנוציטים מורטין (+), מלנומה אנושית (-); K14--C5N תאים (+), אדם מלנוציטים (-). החיוביות הממוצעת וסטיית התקן של לפחות שלוש תרבויות מלנוציט נפרדות מוצגות בפינה הימנית העליונה של כל גרף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התרבות החוץ-גופית של המלנוציטים והפיברומוטיות הראשונית הובילה להתקדמות משמעותית בהבנת הביולוגיה והמחלות של העור. פרוטוקול זה משתפר בשיטות הבידוד הקודמות של מלנוציט על-ידי הפחתת הזמן והניסיון הטכני הדרושים ליצירת תרבויות מלנוציט עקביות תוך התרת הבידוד הסימולטני של העור. רומן, חסכון בזמן של הליך זה הוא כי דרמיס ואת האפידרמיס לא צריך להיות מופרדים. במקום זאת, תאי העור מבודדים בעזרת כוח החיתוך העקבי וצפיפות הרשת של מסוק רקמות מכני יחד עם מדיה סלקטיבית וטכניקות ציפוי. על ידי הפחתת מורכבות העיבוד והידיים על הזמן, הליך זה גם מאפשר לחוקרים לבצע ניסויים בקנה מידה גדול ביעילות.
אנו ממליצים על מספר שלבים כדי לשפר את התשואה והעקביות באמצעות פרוטוקול זה. ראשית, לפני שלב 2.4, אנו ממליצים להשתמש מלקחיים מעוקל כדי לגרד את כל רקמת השומן מהצד העורי של העור. תהליך זה יקטין את עוגת השומן שנוצרה לאחר צנטריפוגה. הבא, דיסוציאציה מכנית נכונה של העור הוא קריטי להצלחת פרוטוקול זה והוא יכול להיות משופר על ידי סיבוב הדיסק הומוגניצר ~ 60 ° לאחר כל מעבר של הלהב. שלב מפתח נוסף הוא להבטיח שכל מאגר תקציר העור יוסר בשלב 2.10. כישלון לעשות זאת יהיה לעכב את הדבקה התא לצלחת ולהקטין באופן משמעותי את התשואה. מכיוון שהגלולה אינה מוצמדת היטב לתחתית של 15 מ"ל שפופרת חרוט בשלב 2.10, התאים יכולים להיות בקלות מנושמת אם supernatant לא להסיר לאט. אם ההסרה היסודית של מאגר עיכול העור הוא אתגר, אנו ממליצים לשטוף את הגלולה ב 2-3 mL של מלנוציט מדיה ולאחר מכן חוזר שלבים 2.9-2.10 לפני ציפוי. לבסוף, כאשר להשעות מחדש את הגלולה תא בשלב 2.11, חשוב pipet במרץ כדי לשבור את כל הגושים ולהבטיח כי התאים מופצים באופן שווה על פני השטח של הצלחת תרבות התא. פסולת ותאים מתים יובחנו בתרבות במהלך הימים הראשונים לאחר בידוד. תאים מתים אלה עלולים לעכב את התפתחותם של התרבות ויש להסירו על ידי שטיפת הצלחת עם PBS ולאחר מכן הוספת מדיה טרייה.
פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי ליצור תרבויות מלנוציט ומלנומה העיקרי מעכבר אחד. עם זאת, ניתן לכוונן את ההליך באופן יעיל כדי להתאים לגדודים גדולים יותר של עכברים (ראו טבלה 1). עבור כלים גדולים יותר, שילוב עור הומוגון מ4-5 כלבלבים תוצאות בתוספת של 30-40% confluent 10 ס מ של מלנוציטים בתוך 4-5 ימים של בידוד. ניתן להשתמש במספר טכניקות כדי לשפר את היעילות של פרוטוקול זה בעת עבודה עם בעלי חיים מרובים. ראשית, אנחנו בדרך כלל המתת בעלי החיים בקבוצות של ארבעה, מעבדים שתי חיות בכל פעם. מצאנו כי עור הומוגניים משני כלבלבים ניתן לשלב בשלבים 2.7-2.8 על ידי הגדלת נפח של מאגר תקציר העור כדי 6 מ ל. כדי לחסוך זמן, אנו מתחילים לבודד את העור מצמד הגורים הבא, בעוד הקבוצה הראשונה עוברת הומוקות ועיכול. גישה זו מבטיחה שאוכלוסיות התאים יהיו מבודדות זמן קצר לאחר המתת החסד ומפחיתות את משך העיבוד הנדרש עבור בעלי חיים מרובים. כאשר עובדים עם עכברים מבוגרים (כלומר, ימים לאחר הלידה 2-4), גילינו כי העברת העור פעם רביעית דרך המסוק רקמות פעיל (שלב 2.6) מגביר את העור המגון והתשואה התאית. באמצעות טכניקה זו, אנו לא רואים הבדל תלוי הגיל ביבול מלנוציט או פיברובלסט.
פרוטוקול זה מפרט כיצד ליצור בו תרבויות פיברובריות ומלנוציט מאותה דגימת עור. הבחנו כי keratinocytes בתרבות המלנוציט הראשונית נשארות בתוך המנה כאשר הטריזיזציה לטווח קצר מבוצעת יחד עם הdislodgement התקיף של מלנוציטים (ראה שלבים 3.2-3.3). בעוד אנחנו לא אופטימיזציה שיטות התפשטות עבור התאים הנותרים האלה, אנו ההשערה כי המשך התרבות של אוכלוסיות חסיד כגון מדיה keratinocyte שיושלם עם 100 ng/mL G418 יכול לגרום לאוכלוסיית תאים מועשר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
Acknowledgments
המחברים מודים לקרן דיימון ראניון (38-16 ל-C.E.B.) ופלואוטוניה (B.M.M.) לתמיכה כספית. אנחנו אסירי תודה לג היינס ולג וורmsbacher שסיפקו הערות לשיפור הטקסט בכתב היד. עבודה זו הסיוע מתוך מדינת אוהיו מקיף הסרטן המרכז האנליטי Cy, משאב משותף הנתמך על ידי NIH P30 CA016058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A.
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K.
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T.
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
