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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

प्राथमिक मूत्र मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की तीव्र पीढ़ी

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59468
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University, 2Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

Summary

इस प्रोटोकॉल एक साथ 0-4 दिन पुराने चूहों की त्वचा से मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए एक तेजी से विधि की रूपरेखा. इन प्राथमिक संस्कृतियों को बनाए रखा जा सकता है और त्वचा कोशिका जीव विज्ञान, pigmentation, घाव भरने और मेलेनोमा सहित शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाओं की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए इन प्राथमिक संस्कृतियों में हेरफेर किया जा सकता है।

Abstract

फाइब्रोब्लास्ट या मेलेनोसाइट समारोह में दोष त्वचा रोगों के साथ जुड़े रहे हैं, गरीब बाधा समारोह सहित, दोषपूर्ण घाव भरने, pigmentation दोष और कैंसर. इन रोगों की समझ और सुधार के लिए महत्वपूर्ण प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट और मेलेनोसाइट संस्कृतियों में प्रयोग कर रहे हैं। फिर भी, मेलेनोसाइट अलगाव के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की आवश्यकता है कि त्वचा के एपिडर्मल और dermal परतों trypsinized और मैन्युअल रूप से असंबद्ध हैं. इस प्रक्रिया में समय लगता है, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और असंगत पैदावार के लिए योगदान देता है. इसके अलावा, एक साथ एक ही ऊतक नमूना से शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए तरीकों आसानी से उपलब्ध नहीं हैं. यहाँ, हम प्रसव के बाद के दिनों में चूहों की त्वचा से मेलेनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स को अलग करने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन 0-4. इस प्रोटोकॉल में, पूरी त्वचा यंत्रवत् एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग कर homogenized है और फिर संक्षेप में collagenase और trypsin के साथ पचा. सेल आबादी तो चयनात्मक चढ़ाना G418 उपचार के बाद के माध्यम से अलग कर रहे हैं. इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप संगत मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट की पैदावार एक ही माउस से 90 मिनट से कम समय में होती है। इस प्रोटोकॉल भी आसानी से स्केलेबल है, शोधकर्ताओं के हाथ पर समय में एक महत्वपूर्ण वृद्धि के बिना जानवरों के बड़े साथियों को संसाधित करने के लिए अनुमति देता है. हम प्रवाह साइटोमेट्रिक आकलन के माध्यम से दिखाते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्थापित संस्कृतियां मेलेनोसाइट्स या फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए अत्यधिक समृद्ध हैं।

Introduction

मैमलियन त्वचा एक बहुस्तरीय अंग है जो शरीर को विदेशी रोगजनकों और अल्ट्रा वायलेट विकिरण (यूवीआर) से बचाता है। त्वचा भी घाव भरने , तापमान विनियमन और विटामिन डी उत्पादन1,2,3 के रूप में homeostatic प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै. मैमलेशियन त्वचा में तीन प्रमुख कोशिका प्रकार होते हैं: मेलेनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट और केराटिनोसाइट्स। इन कोशिका प्रकारों त्वचा की विभिन्न परतों को आबाद, केराटिनसाइट्स के साथ बाह्य त्वचा बनाने, फाइब्रोब्लास्ट्स dermis और मेलेनोसाइट्स में रहने वाले epidermal-dermal जंक्शन और बाल follicles4के लिए स्थानीयकृत. यहाँ, हम एक सरल प्रक्रिया है कि murine त्वचा से प्राथमिक मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की समवर्ती पीढ़ी सक्षम बनाता है विस्तार.

मेलेनोसाइट्स वर्णक-उत्पादक कोशिकाएं हैं जो मानव शरीर में कई स्थानों पर पाई जाती हैं, जिनमें बेसल एपिडरमिस, आईरिस, कोचला, मस्तिष्क और बाल कूप5शामिल हैं। मेलेनोसाइट्स का प्राथमिक कार्य मेलेनिन युक्त vesicles को उत्पन्न और स्रावित करना है जिसे मेलेनोसोम5,6कहा जाता है . मेलेनोसोम मेलेनिन के दो प्रमुख वर्गों होते हैं: भूरे / मेलेनोसाइट के भीतर जैव रासायनिक प्रक्रियाएं प्रत्येक मेलेनिन प्रजातियों की सापेक्ष बहुतायत को नियंत्रित करती हैं और बाल, त्वचा और आंखों का रंग8,9 निर्धारित करने में मदद करतीहैं. Melanin भी UVR को अवशोषित और mutagenesis10से सूर्य उजागर ऊतकों की रक्षा के लिए कार्य करता है.

मेलेनोसाइट रोग वर्णक दोष पैदा कर सकता है और त्वचा कैंसर की संवेदनशीलता को बढ़ा सकता है। उदाहरण के लिए, अति-पिगमेंटेड त्वचा पैच मेल्स्मा की विशेषता फोकल मेलेनिन overproduction का परिणाम है, जबकि germline आनुवंशिक उत्परिवर्तन जो मेलेनिन संश्लेषण में शामिल जीन समझौता albinism के लिए नेतृत्व11,12 . मेलेनोसाइट जीव विज्ञान के अंतरंग ज्ञान के लिए रणनीति है कि इस तरह के pigmentary दोषों को सही और अंततः इन रोगों से पीड़ित व्यक्तियों की मनोसामाजिक भलाई में सुधार होगा विकसित करने के लिए आवश्यक है. मेलेनिन उत्पादन में कमी और / या फीओमेलानिन के अधिमानी संश्लेषण भी त्वचा कैंसर के जोखिम10के साथ जुड़े रहे हैं . ऐसा माना जाता है कि यह जोखिम कम यूवीआर संरक्षण6,13से होता है . इस प्रकार, मेलेनोसाइट्स में यूमेलेनिन उत्पादन को बढ़ाने या बहाल करने के तरीके इन आबादी में त्वचा कैंसर की घटनाओं को कम कर सकते हैं।

मेसेन्काइमल फाइब्रोब्लास्ट्स त्वचा 14 की त्वचा परत सहित शरीर के सभीअंगों के लिए संयोजी ऊतक और संरचनात्मक समर्थन की स्थापना करते हैं। कोलेजन, इलेस्टिन, लेमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन जैसे प्रोटीनों का उत्सर्जन फाइब्रोब्लास्टकोन को ऊतक अखंडता 1,14के लिए आवश्यक अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) बनाने में सक्षम करता है। फाइब्रोब्लास्ट्स भी घाव भरने, सूजन, एंजियोजेनेसिस और कैंसर गठन / प्रगति1,15,16के रूप में प्रक्रियाओं में आवश्यक भूमिका निभाते हैं।

मेलेनोसाइट्स के समान, फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण और समारोह में दोष ट्यूमरजनन और रोग को बढ़ावा दे सकते हैं। उदाहरण के लिए, अनुचित फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण आमतौर पर फाइब्रोसिस के गठन की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप आसपास के ऊतकों में अतिरिक्त ईसीएम घटकों के बढ़ाया जमाव होता है। फाइब्रोब्लास्ट्स शरीर की संरचनात्मक अखंडता के बहुत बनाए रखने के रूप में, फाइब्रोसिस रोगों है कि कई ऊतकों और अंगों को प्रभावित को बढ़ावा देता है, अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस, प्रणालीगत स्क्लेरोसिस, लीवर सिरोसिस और हृदय फाइब्रोसिस15सहित. फाइब्रोब्लास्ट्स भी कैंसर16में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) कई ट्यूमर के microenvironment में सबसे प्रचुर मात्रा में गैर घातक कोशिकाओं रहे हैं। CAFs ऊतक कठोरता, स्थानीय cytokine उत्पादन और प्रतिरक्षा समारोह16नियमन द्वारा ट्यूमर प्रसार, प्रगति और चिकित्सीय प्रतिरोध को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है.

प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की पहचान करने और रोग के लिए नेतृत्व करने वाले मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट दोषों को कम करने के लिए आनुवंशिक रूप से पथ्य मॉडल के साथ शोधकर्ताओं को प्रदान करते हैं। हालांकि, melanocyte संस्कृतियों की स्थापना के लिए वर्तमान तरीकों समय लगता है और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं. बाह्य त्वचा और dermis के trypsinization और नाजुक जुदाई के लिए की जरूरत प्रयोगात्मक उपज में परिवर्तनशीलता के लिए योगदान देता है और यह मुश्किल बड़े पैमाने पर प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए बनाता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल एक साथ पूरी त्वचा से मेलेनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्टकोश को अलग करने के लिए वर्तमान में क्षेत्र में कमी कर रहे हैं।

हम प्रसंस्करण कदम, परिवर्तनशीलता और एक ही पूरे त्वचा के नमूने से मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की स्थापना के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए एक विधि विकसित की है। एक संक्षिप्त पाचन के बाद एक यांत्रिक homogenization विधि का उपयोग करना, हमारी रणनीति काफी समवर्ती फाइब्रोब्लास्ट अलगाव को सक्षम करते हुए प्राथमिक मेलेनोसाइट्स को अलग करने के लिए आवश्यक हाथों पर समय की मात्रा कम हो जाती है। वृद्धि की गति, दक्षता और इस प्रोटोकॉल की स्थिरता, 0-4 दिन पुराने चूहों से मेलेनोसाइट्स को अलग करने की क्षमता के साथ संयोजन में, शोधकर्ताओं को पहले से संभव प्रयोगों की एक व्यापक सरणी प्रदर्शन करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है.

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Protocol

इस या जानवरों से जुड़े किसी भी अन्य अध्ययन शुरू करने से पहले अपनी संस्थागत पशु नैतिकता समिति से अनुमोदन प्राप्त करें। इस प्रोटोकॉल में किए गए प्रयोगों ओहियो राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC, प्रोटोकॉल #2012A00000134) द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. प्रोटोकॉल तैयारी

नोट: निम्नलिखित अभिकर्मक तैयारी निर्देश एक माउस से 9 सेमी2 मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए उपयुक्त हैं। बड़े पैमाने पर अलगाव के लिए तालिका 1 में अभिकर्मक तैयारी मार्गदर्शिका देखें।

  1. 0ण्1 एम हिमनदीय ऐसीटिक अम्ल में 50 ग्राम/एमएल कोलेजन युक्त कोलेजन समाधान की 1.5 एमएल तैयार की।
  2. एक laminar प्रवाह कैबिनेट में, कोट एक अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति पकवान के साथ 8 g/cm2 (1.44 एमएल) कोलेजन समाधान. सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से पूरी तरह से कोलेजन समाधान द्वारा कवर किया जाता है। पकवान को 3 डिग्री सेल्सियस या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। उपयोग करने से पहले, कोलेजन लेपित अच्छी तरह से दो बार बाँझ फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 1.35 एमएल के साथ धोने (पीबीएस के 150 डिग्री सेल्सियस प्रति 1 सेमी2)।
  3. ध्यान से ऊतक हेलिकॉप्टर मंच पर एक काट डिस्क रखकर और चल हाथ करने के लिए एक बाँझ ब्लेड हासिल करके एक laminar प्रवाह कैबिनेट में ऊतक हेलिकॉप्टर इकट्ठा।
  4. बाँझ पीबीएस में 100x एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक स्टॉक समाधान को कम करके 1x एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक समाधान के 3 एमएल तैयार करें।
  5. तैयार 3 एमएल ताजा त्वचा पाचन बफर युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन /स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, 1% एल-ग्लूटामाइन, 10 मिलीग्राम/एमएल कोलैजानेस प्रकार I, 0.25% porcin trypsin और 0.02 mg/mL deoxyribonuce I में RPMI 1640.
  6. ताजा Melanocyte मीडिया के 6 एमएल जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 7% घोड़े सीरम, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, 1% एल-ग्लूटामाइन, 0.5 एमएम डि-ब्यूटिरिल चक्रीय एएमपी (dbcAMP), 20 एन एम tetradecanoylbo13-ऐसीटेट (टीपीए) और 200 पी.टी.एम. पोषक तत्व मिक्स एफ-12 हैम मीडिया.
    नोट: केंद्रित डीबीसीएमपी, टीपीए और सीटी स्टॉक समाधान किए जा सकते हैं, aliकोव्ड और के लिए संग्रहीत किया जा सकता है -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष। बेस मीडिया इन घटकों की कमी 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है.
  7. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त Fibroblast मीडिया के 4 एमएल तैयार, 1% पेनिसिलिन / इस मीडिया को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. पीबीएस में 16% पैराफॉर्मेल्डिहाइड को कम करके 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान का 40 एमएल तैयार करें। किसी भी अतिरिक्त को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. पीबीएस के 50 एमएल में 0.5 ग्राम सैपोनिन को 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाकर 1% सैपोनिन स्टॉक समाधान तैयार करें जब तक कि सैपोनिन पूरी तरह से घुल न जाए। एक 0.2 डिग्री पीएस फिल्टर के साथ लगे एक 50 एमएल सिरिंज का उपयोग कर लंबी अवधि के भंडारण के लिए समाधान बाँझ। जिसके परिणामस्वरूप saponin स्टॉक समाधान 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है.
  10. 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) युक्त पीबीएस में 1% saponin स्टॉक समाधान को कम करके माउस प्रति 0.1% Saponin समाधान के 200 $L तैयार करें।
  11. पीबीएस के 1 एमएल में स्थायी व्यवहार्यता डाई के 1 डिग्री एल को कम करके 1 एमएल की व्यवहार्यता समाधान की तैयारी की।

2. मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट आइसोलेशन

  1. Euthanize 0 से 4 दिन पुराने पुरुष और / या महिला C57Bl/6J पिल्ले decapitation द्वारा और शल्य कैंची का उपयोग कर ethanized चूहों से extremities हटा दें.
  2. एक laminar प्रवाह कैबिनेट में, संक्षेप में 70% इथेनॉल युक्त एक बाँझ पेट्री डिश में प्रत्येक माउस के ट्रंक रोल. इथेनॉल से ट्रंक निकालें और इसे एक खाली, बाँझ पेट्री डिश में रखें।
  3. शल्य कैंची का उपयोग करना, 70% इथेनॉल में बाँझ, गर्दन से पूंछ के लिए शुरू ट्रंक के अधर पक्ष पर त्वचा में एक चीरा बनाते हैं। बाँझ संदंश का उपयोग कर के माउस के ट्रंक से त्वचा छील.
  4. त्वचा dermis पक्ष एक 6 अच्छी तरह से 1x एंटीबायोटिक / Antimycotic समाधान के 3 एमएल युक्त पकवान में नीचे रखें और 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट.
  5. जगह में निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ ऊतक हेलिकॉप्टर चालू करें: स्लाइस मोटाई: 1 डिग्री; ब्लेड बल: अधिकतम का $60%; गति: अधिकतम का $50%.
  6. त्वचा स्थानांतरण, dermis पक्ष नीचे, एक बाँझ ऊतक हेलिकॉप्टर डिस्क के लिए और सक्रिय ऊतक हेलिकॉप्टर के माध्यम से पूरी तरह से त्वचा से गुजारें 3 बार.
  7. एक बाँझ, 15 एमएल शंकु ट्यूब त्वचा पाचन बफर के 3 एमएल युक्त homogenized त्वचा स्थानांतरण. एक P1000 micropipette के साथ ऊपर और नीचे 10-15 बार pipeting द्वारा जिसके परिणामस्वरूप निलंबन मिक्स.
  8. शंकु ट्यूब कैप और 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नमूना इनक्यूबेट, ट्यूब हर 3-5 मिनट उलटा.
  9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 750 x ग्राम पर एक झूलबाल्टी रोटर में शंकु ट्यूब centrifuging द्वारा त्वचा homogenate में कोशिकाओं को गोली।
  10. एक P1000 micropipette का उपयोग करना, धीरे धीरे और पूरी तरह से त्वचा पाचन बफर को दूर गोली परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है.
    नोट: पूरी त्वचा का एक हिस्सा इस स्तर पर बचाया जा सकता है और चरण 3 के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया: सेलुलर पवित्रता की पुष्टि. इन कोशिकाओं को 70 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से छान लें और फिर आगे के प्रसंस्करण के लिए चरण 3.5 पर शुरू करें।
  11. पूरी तरह से एक P1000 micropipette के साथ ऊपर और नीचे 15-20 बार पाइपिंग द्वारा Melanocyte मीडिया के 1 एमएल में सेल गोली resuspend. एक 6 अच्छी तरह से मेलनोसाइट मीडिया के 1 एमएल युक्त एक uncoated अच्छी तरह से करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप सेल समाधान dropwise जोड़ें.
  12. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेट एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट्ड त्वचा homogenate रखें। संस्कृतियों को 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    नोट: इस समय के दौरान, त्वचा homogenate में कुछ फाइब्रोब्लास्ट uncoated पकवान का पालन करेंगे, जबकि मेलेनोसाइट्स और keratincytes निलंबन में रहते हैं.
  13. संस्कृति supernatant uncoated पकवान से एक अच्छी तरह से एक पूर्व धोया, कोलेजन लेपित 6 अच्छी तरह से पकवान के लिए स्थानांतरण. मीडिया में G418 इस प्रकार जोड़ें कि अंतिम सांद्रता 100 एनजी/एमएल है।
  14. uncoated पकवान के एक अच्छी तरह से करने के लिए Fibroblast मीडिया के 2 एमएल जोड़ें, अब अनुयायी फाइब्रोब्लास्टयुक्त.
  15. एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रात भर दोनों संस्कृतियों इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सेट .
  16. अलग से मीडिया और प्रत्येक संस्कृति से किसी भी मलबे, चढ़ाना के बाद 16-24 एच aspirate. बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार प्रत्येक डिश धो लें, और फिर फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति के लिए मेलेनोसाइट संस्कृति के लिए ताजा मेलेनोसाइट मीडिया प्लस 100 एनजी/एमएल जी418 के 2 एमएल जोड़ें।
  17. के बाद मेलेनोसाइट संस्कृतियों 48 एच के लिए G418 के साथ इलाज किया गया है, बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने और संस्कृति के लिए G418 बिना ताजा Melanocyte मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।
    नोट: के रूप में मेलेनोसाइट संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट्स के बाद G418 उपचार से मरने के लिए जारी है, बाँझ पीबीएस के साथ पकवान धोने मृत कोशिकाओं को हटाने और ताजा Melanocyte मीडिया जोड़ने के लिए. Melanocyte और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों पारित किया जाना चाहिए जब वे 70-80% संगम तक पहुँचने.

3. सेलुलर पवित्रता की पुष्टि

  1. प्रत्येक संस्कृति से मीडिया को प्रेरित करें और ध्यान से बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ प्रत्येक पकवान धो लें।
  2. प्रत्येक संस्कृति के लिए 0.25% trypsin के 0.7 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर trypsin में संस्कृतियों incubate और 1 मिनट के लिए 5% सीओ 2.
  3. P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके डिश के नीचे के खिलाफ ट्रिप्सिन को पाइप करके कोशिकाओं को हटा दें।
  4. प्रत्येक trypsinized संस्कृति के लिए उपयुक्त मीडिया के 0.7 एमएल जोड़ें और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में सेल समाधान हस्तांतरण.
  5. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 750 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली। ध्यान से निकालें और एक P1000 micropipette का उपयोग कर supernatant त्याग दें.
    नोट: चरण 3-1-3.5 का उपयोग मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों को पारित करने के लिए किया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप गोली उचित मीडिया में resuspended किया जाना चाहिए और एक नया, uncoated (fibroblasts) या पूर्व धोया, कोलेजन लेपित (मेलैनोसाइट्स) पकवान में रखा.
  6. बर्फ ठंडा पीबीएस के 0.5 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. एन्यूमरेट करें और 0.5 मिलियन कोशिकाओं को एक पूर्व-चिल्ड 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. चरण 3.5 दोहराएँ और फिर Viability Solution के 100 $L में कोशिकाओं को पुनः निलंबित करें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेल निलंबन इनक्यूबेट करें।
  9. 3.5-3.6 दो बार चरणों को दोहराएँ.
  10. चरण 3.5 दोहराएँ, फिर 100 डिग्री सेल्सियस बर्फ की ठंड 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान में गोली को फिर से ठीक कर के द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए निलंबन इनक्यूबेट करें।
  11. कदम 3.5 दो बार दोहराएँ, हर बार 1x पीबीएस में 3% बीएसए के 0.5 एमएल में गोली resssing.
  12. चरण 3.5 दोहराएँ, फिर 0ण्1% सपोनिन समाधान के 100 डिग्री एल में कोशिका गोली को पुन: स्टेप करें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए निलंबन इनक्यूबेट करें।
  13. कदम 3.5 दोहराएँ, तो 0.1% Saponin समाधान के 100 $L में सेल गोली resuspend खरगोश विरोधी gp100 एंटीबॉडी के 0.5 डिग्री ग्राम, खरगोश विरोधी-Fibroblast-विशिष्ट प्रोटीन 1 (FSP1) एंटीबॉडी के 0.5 डिग्री और माउस विरोधी Cytokeratin 14 (K14) एंटीबॉडी के 0.025 ग्राम. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए निलंबन इनक्यूबेट करें।
    नोट: जबकि K14 एंटीबॉडी एलेक्सा Fluor 647 के लिए पूर्व-कंजुटेड खरीदा गया था, gp100 और FSP1 एंटीबॉडी CF 555 और CF 488 के लिए conugated थे, क्रमशः. नियंत्रण आबादी के दाग भी इस कदम पर शुरू करना चाहिए. नियंत्रण कक्ष की जनसंख्या को संस्कृति से अलग किया जाना चाहिए और इसे 3-5-3-12 में वर्णित संसाधित किया जाना चाहिए।
  14. चरण 3.11 दोहराएँ दो बार, किसी भी असीमित एंटीबॉडी को दूर करने के लिए.
  15. चरण 3.5 दोहराएँ, फिर 1x पीबीएस में 3% बीएसए के 200-400 $L में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  16. कोशिका विलयन को 40 डिग्री कोशिका छलनी के माध्यम से 5 एमएल पॉलीस्टाइरीन गोल-तल नली में प्रवाहित कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

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Representative Results

पुरुष और महिला C57Bl/6J चूहों प्रसव के बाद के दिनों में ethanized थे 0-4 और truncal त्वचा यांत्रिक वियोजन के अधीन के रूप में ऊपर वर्णित किया गया था. काटने के बाद, त्वचा एक चिपचिपा घोल संरचनात्मक ऊतक के किसी भी संकेत की कमी का गठन किया. इस घोल के सेंट्रीफ्यूगेशन के परिणामस्वरूप शंकु नली के तल पर एक बड़ी कोशिका गोली का निर्माण हुआ और वसा की एक परत सुपरनेंट के शीर्ष पर तैर रही थी। इस वसा परत supernatant के साथ खारिज कर दिया गया था, जबकि शेष सेल गोली resuspended और एक 6 अच्छी तरह से पकवान के एक uncoated अच्छी तरह से स्थानांतरित किया गया था. कोशिकाओं के उच्च घनत्व के कारण मीडिया बादल दिखाई देते हैं. तथापि, 40 मिनट के ऊष्मायन के बाद, मीडिया में बड़े सेल और ऊतक समूह देखे गए और अनुशील ित्वक फाइब्रोब्लास्टएक उल्टे प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के साथ देखा जा सकता है (चित्र 1)।

फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति से गैर-अनुकूल कोशिकाओं को मेलेनोसाइट्स को अलग करने के लिए एक कोलेजन लेपित 6-वेल डिश के एक कुएं में स्थानांतरित कर दिया गया था। G418 के अलावा homogenate में किसी भी शेष फाइब्रोब्लास्ट्स को मार डाला, कई मृत कोशिकाओं को अगले 5 दिनों के लिए मीडिया में चल छोड़ने (चित्र 2ए सी). विकास के 4-5 दिनों के बाद, प्लेट्ड मेलेनोसाइट्स मेलेनोसाइटिक ग्रैन्युल्स के साथ एक स्टीरियोटाइप डेन्ड्रिटिक फीनोटाइप पर लेने लगे (चित्र 2ग)। यह परितोष संस्कृति के गुजरने के बाद भी बना रहा (चित्र 2छ) जबकि दूषित केरातिनोसाइट्स के समूहों को शुरू में मेलेनोसाइट संस्कृतियों में देखा गया था (चित्र 2ए) इन आबादी को बाद में गुजरने पर खो दिया गया था।

प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण परिणामी प्राथमिक मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया। C5N माउस keratincytes17, दिन 10 प्राथमिक मेलेनोसाइट संस्कृतियों और दिन 6 प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों के साथ दाग थे: विरोधी gp100 (अलग मेलेनोसाइट्स), विरोधी Cytokeratin 14 (K14; keratincytes) और विरोधी Fibroblast-विशिष्ट प्रोटीन ( FSP1; तंतोतंत) (चित्र 3) इन कोशिकाओं में, gp100 धुंधला प्राथमिक मेलेनोसाइट्स के लिए विशिष्ट था, जबकि FSP1 सकारात्मकता केवल फाइब्रोब्लास्ट्स में मनाया गया था (चित्र 3ए, बी)। K14 की अभिव्यक्ति C5N keratincytes तक सीमित था (चित्र 3ग)  अलगाव के बाद 1, 2, 3, 4 और 10 दिनों के बाद हमारी मेलेनोसाइट संस्कृतियों की शुद्धता निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त विश्लेषण किए गए (चित्र 4)। संयुक्त फाइब्रोब्लास्ट और केराटिनोसाइट संदूषण कभी भी संस्कृति में कुल कोशिकाओं का 25% से अधिक नहीं होता है (चित्र 4ठ,ब्)। फिर भी, जीपी100 में नाटकीय वृद्धि संस्कृति में चौथे दिन तक नहीं देखी गई (चित्र 4क)। हम इस प्रेक्षण को मेलेनोसाइट अग्रदूतों (अर्थात, मेलेनोब्लास्ट) में gp100 की कम अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार हैं, जिनमें से कई संस्कृति में दिन 10 से पूरी तरह से अंतर करते हैं (चित्र 4ए)। सारांश में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि हमारे तेजी से अलगाव प्रोटोकॉल एक साथ मेलेनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट के लिए समृद्ध संस्कृतियों का उत्पादन.

चरण # अभिकर्मक 1 प्यूप 5 पिल्ले
1.1 कोलेजन समाधान 1.5 एमएल 4.5 एमएल
१.२ प्लेट का आकार 6-वेल 10 से.मी.
1.4 एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक समाधान 3 एमएल 15 एमएल
1.5 त्वचा पाचन बफर 3 एमएल 15 एमएल
1.6 मेलानोसाइट मीडिया 6 एमएल 30 एमएल
1.7 फाइब्रोब्लास्ट मीडिया 4 एमएल 20 एमएल

तालिका 1: विभिन्न सहगण आकारों के लिए अभिकर्मक तैयारी मार्गदर्शिका.

Figure 1
चित्र 1 : प्राथमिक murine फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवियों. दिखाया गया है फाइब्रोब्लास्ट्स के 20x छवियों को तुरंत अलगाव के बाद (ए), साथ ही साथ 24 (बी) और 48 (सी) एच पोस्ट-आइसोलेशन हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : प्राथमिक मेलेनोसाइट संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवियों. दिखाया गया है मेलेनोसाइट संस्कृतियों के 20x चित्र हैं 1 (ए), 2 (बी) और 4 दिन (सी) अलगाव के बाद. दूषित केरातिनोसाइट्स 'ए' में तीर द्वारा इंगित किए जाते हैं। (घ) पासिंग के बाद प्राथमिक मेलेनोसाइट संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : प्रवाह cytometric संस्कृति शुद्धता के आकलन. प्रतिनिधि हिस्टोग्राम दिखा gp100(एक; विभेदित मेलेनोसाइट्स), FSP1 (बी; फाइब्रोब्लास्ट्स) और K14 (सी; केराटिनसाइट्स) प्राथमिक मेलेनोसाइट्स में सकारात्मकता (दिन 10), प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट (दिन 6) और C5N keratincytes. लाइव सेल पर गेटिंग के बाद, प्रत्येक आबादी से 10,000 घटनाओं का विश्लेषण किया गया। एकल रंग नियंत्रण मुआवजे के लिए इस्तेमाल किया गया और जिसके परिणामस्वरूप डेटा FlowJo सॉफ्टवेयर के साथ कल्पना की गई थी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : मेलेनोसाइट शुद्धता का समय पाठ्यक्रम विश्लेषण। प्रतिनिधि हिस्टोग्राम प्रारंभिक अलगाव के बाद 1-10 दिनों के मेलेनोसाइट शुद्धता दिखा रहा है। नमूने दागे गए, उनका विश्लेषण किया गया और चित्र 3में वर्णित रेखांकन किया गया। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण आबादी इस प्रकार थे: gp100--मानव मेलेनोसाइट्स (+), प्राथमिक murine फाइब्रोब्लास्ट्स (-); FSP1--प्राथमिक murine फाइब्रोब्लास्ट्स (+), मानव मेलेनोसाइट्स (-); K14--C5N कोशिकाओं (+), मानव मेलेनोसाइट्स (-) औसत सकारात्मकता और मानक विचलन कम से कम तीन अलग मेलेनोसाइट संस्कृतियों के लिए प्रत्येक ग्राफ के ऊपरी दाएँ हाथ के कोने में दिखाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्राथमिक मेलेनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स की इन विट्रो संस्कृति ने त्वचा जीव विज्ञान और रोग की हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति की है। इस प्रोटोकॉल त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स के एक साथ अलगाव के लिए अनुमति देते हुए लगातार मेलेनोसाइट संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय और तकनीकी प्रेमी को कम करने से पूर्व मेलेनोसाइट अलगाव तरीकों पर सुधार. इस प्रक्रिया का एक उपन्यास, समय की बचत तत्व यह है कि डर्मिस और बाह्य त्वचा को अलग करने की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, त्वचा कोशिकाओं चयनात्मक मीडिया और चढ़ाना तकनीक के साथ एक यांत्रिक ऊतक हेलिकॉप्टर के लगातार काट बल और दानेदारता का उपयोग कर अलग कर रहे हैं। प्रसंस्करण जटिलता और हाथ पर समय को कम करके, इस प्रक्रिया को भी शोधकर्ताओं को कुशलता से बड़े पैमाने पर प्रयोगों का संचालन करने के लिए सक्षम बनाता है.

हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्ति और संगतता को बढ़ाने के लिए कई चरणों की अनुशंसा करते हैं। सबसे पहले, चरण 2.4 से पहले, हम त्वचा के चर्मीय पक्ष से किसी भी वसा ऊतक को दूर करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करने की सलाह देते हैं। इस प्रक्रिया से सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद बने वसा केक को कम किया जा सकेगा। अगले, त्वचा के उचित यांत्रिक वियोजन इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है और ब्लेड के प्रत्येक पास के बाद homogenizer डिस्क [60] घूर्णन द्वारा बढ़ाया जा सकता है. एक अन्य महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि त्वचा डाइजेस्ट बफर के सभी चरण 2.10 में हटा दिया जाता है. ऐसा करने में विफलता पकवान के लिए सेल आसंजन में बाधा और काफी उपज कम हो जाएगा. क्योंकि गोली मजबूती से चरण 2.10 में 15 एमएल शंकु ट्यूब के नीचे चिपका नहीं है, कोशिकाओं को आसानी से aspirated किया जा सकता है अगर supernatant धीरे धीरे नहीं हटाया जाता है. यदि त्वचा पाचन बफर की पूरी तरह से हटाने के एक चुनौती है, हम Melanocyte मीडिया के 2-3 एमएल में गोली धोने और फिर कदम दोहरा सुझाव 2.9-2.10 चढ़ाना से पहले. अंत में, जब चरण 2.11 में सेल गोली ressssssssssson, यह महत्वपूर्ण है कि किसी भी clumps को तोड़ने के लिए और यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समान रूप से सेल संस्कृति पकवान की सतह पर वितरित कर रहे हैं के लिए तेजी से पाइप. अलगाव के बाद पहले कुछ दिनों के दौरान संस्कृति में मलबे और मृत कोशिकाओं को देखा जाएगा। इन मृत कोशिकाओं संस्कृति के विकास में बाधा हो सकती है और पीबीएस के साथ पकवान धोने और फिर ताजा मीडिया जोड़ने से हटाया जाना चाहिए.

इस प्रोटोकॉल एक एकल माउस से प्राथमिक मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए एक विधि की रूपरेखा. हालांकि, प्रक्रिया प्रभावी ढंग से चूहों के बड़े सहगण को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है (तालिका 1देखें ). बड़े सहगणों के लिए, 4-5 पिल्ले से त्वचा homogenate के संयोजन अलगाव के 4-5 दिनों के भीतर एक 30-40% confluent 10 सेमी पकवान में परिणाम. कई तकनीकों के लिए इस प्रोटोकॉल की दक्षता में सुधार जब कई जानवरों के साथ काम किया जा सकता है. सबसे पहले, हम आम तौर पर चार के सेट में जानवरों ethanize, एक समय में दो जानवरों प्रसंस्करण. हमने पाया है कि दो पिल्ले से homogenized त्वचा 6 एमएल करने के लिए त्वचा डाइजेस्ट बफर की मात्रा में वृद्धि करके कदम 2.7-2.8 पर जोड़ा जा सकता है. समय बचाने के लिए, हम पिल्ले की अगली जोड़ी से त्वचा को अलग करना शुरू करते हैं, जबकि पहला सेट एकरूपता और पाचन के दौर से गुजर रहा है। यह दृष्टिकोण सुनिश्चित करता है कि सेल आबादी इच्छामृत्यु के बाद जल्द ही अलग कर रहे हैं और प्रसंस्करण कई जानवरों के लिए आवश्यक समय कम कर देता है. जब पुराने चूहों के साथ काम कर (यानी, प्रसव के बाद के दिन 2-4), हमने पाया है कि त्वचा सक्रिय ऊतक हेलिकॉप्टर के माध्यम से एक चौथी बार गुजर (कदम 2.6) त्वचा homogenization और सेलुलर उपज को बढ़ाता है. इस तकनीक का उपयोग करके, हम मेलेनोसाइट या फाइब्रोब्लास्ट उपज में कोई आयु-निर्भर अंतर नहीं देखते हैं।

इस प्रोटोकॉल विवरण कैसे एक साथ एक ही त्वचा के नमूने से फाइब्रोब्लास्ट और मेलेनोसाइट संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए. हमने देखा है कि प्रारंभिक मेलेनोसाइट संस्कृति में केराटिनसाइट्स पकवान का पालन करते हैं जब अल्पकालिक ट्रिप्सिनाइजेशन मेलेनोसाइट्स के सशक्त विच्छेदन के साथ किया जाता है (देखें चरण 3-2-3.3)। हालांकि हम इन शेष कोशिकाओं के लिए प्रचार विधियों अनुकूलित नहीं है, हम hypothesize कि keratincyte मीडिया में इस तरह के अनुयायी आबादी की निरंतर संस्कृति 100 ng/mL G418 के साथ पूरक एक समृद्ध सेल आबादी में परिणाम सकता है.

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.

Acknowledgments

लेखकवित्तीय सहायता के लिए दामन रनियन फाउंडेशन (#38-16 से C.E.B.) और पेलोटोनिया (बी.एम.एम.) का धन्यवाद करते हैं। हम सी Haines और सी Wormsbaecher जो पांडुलिपि पाठ में सुधार करने के लिए टिप्पणी प्रदान करने के लिए आभारी हैं. यह काम ओहियो राज्य व्यापक कैंसर केंद्र विश्लेषणात्मक Cytometry साझा संसाधन जो NIH P30 CA016058 द्वारा समर्थित है से लाभान्वित.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm PES sterile syringe filter VWR 28145-501
10 cm cell culture dish Corning 430167
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22363547
5 mL polystyrene round-bottom tubes Fisher Scientific 352008
6-well cell culture dish Sigma-Aldrich SIAL0516
70 µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) Sigma-Aldrich A5955
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit Biotium 92273
CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit Biotium 92274
Cholera Toxin Sigma-Aldrich C8052
Collagen from rat tail Sigma-Aldrich C7661
Collagenase Type I Worthington Biochemicals LS004156
Corning Penicillin/Streptomycin Solution Fisher Scientific 30-002-CL
Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 Novus Biologicals NBP2-34403AF647
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemicals LS002058
Di-butyryl cyclic AMP Sigma-Aldrich D0627
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 12800-082
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermo Fisher 65-0865-14
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 22032601
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12306C
FSP1/S100A4 antibody Millipore Sigma 07-2274
G418 Disulfide P212121 LGB-418-1
Glacial Acetic Acid VWR VWRV0714
Horse Serum Fisher Scientific 26050088
HyClone L-Glutamine Fisher Scientific SH3003402
McIlwain Tissue Chopper Ted Pella 10180
Melanoma gp100 antibody Abcam ab137078
Nutrient Mix F-12 Ham's Media Sigma-Aldrich N6760
Phorbol 12-Myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P8139
Pierce 16% Formaldehyde Thermo Fisher 28908
Porcine Trypsin Sigma-Aldrich 85450C
RPMI 1640 media Sigma-Aldrich R8758
Saponin Sigma-Aldrich S-7900
Tissue Chopper Blade Ted Pella 121-6
Tissue Chopper Plastic Disk Ted Pella 10180-01
Trypsin VWR VWRL0154-0100

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References

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प्राथमिक मूत्र मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की तीव्र पीढ़ी
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Murphy, B. M., Weiss, T. J., Burd, C. E. Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures. J. Vis. Exp. (148), e59468, doi:10.3791/59468 (2019).

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