Summary
Denne protokollen skisserer en rask metode for å samtidig generere melanocyte og Fibroblast kulturer fra huden på 0-4 dag gamle mus. Disse primære kulturene kan opprettholdes og manipuleres in vitro for å studere en rekke fysiologisk relevante prosesser, inkludert hud cellebiologi, pigmentering, sår helbredelse og melanom.
Abstract
Defekter i Fibroblast eller melanocyte funksjon er forbundet med hudsykdommer, inkludert dårlig barrierefunksjon, defekt sår helbredelse, pigmentering defekter og kreft. Avgjørende for forståelsen og forbedring av disse sykdommene er eksperimenter i primære Fibroblast og melanocyte kulturer. Likevel, gjeldende protokoller for melanocyte isolasjon krever at epidermal og dermal lag av huden er trypsinized og manuelt disassociated. Denne prosessen er tidkrevende, teknisk utfordrende og bidrar til inkonsekvent avkastning. Videre metoder for å samtidig generere rene Fibroblast kulturer fra samme Vevsprøve er ikke lett tilgjengelig. Her beskriver vi en forbedret protokoll for å isolere melanocytter og fibroblaster fra huden til mus på postnatal dager 0-4. I denne protokollen er hele huden mekanisk homogenisert ved hjelp av et vev helikopter og deretter kort fordøyd med kollagenase og Trypsin. Celle populasjoner blir deretter isolert gjennom selektiv plating etterfulgt av G418 behandling. Denne prosedyren resulterer i konsekvent melanocyte og Fibroblast gir fra en enkelt mus på mindre enn 90 min. Denne protokollen er også lett skalerbar, slik at forskerne kan behandle store kohorter av dyr uten en betydelig økning i hands-on tid. Vi viser gjennom Flow analytiske vurderinger som kulturer etablert ved hjelp av denne protokollen er svært beriket for melanocytter eller fibroblaster.
Introduction
Pattedyr hud er en flerlags organ som beskytter kroppen fra utenlandske patogener og Ultra Violet bestråling (UVR). Huden spiller også en avgjørende rolle i homøostatisk prosesser som sår helbredelse, temperaturregulering og vitamin D produksjon1,2,3. Pattedyr hud består av tre store celletyper: melanocytter, fibroblaster og keratinocytter. Disse celletyper fylle forskjellige lag av huden, med keratinocytter gjør opp epidermis, fibroblaster bosatt i dermis og melanocytter lokalisere til epidermal-dermal veikryss og hårsekker4. Her detalj vi en enkel prosedyre som gjør det mulig for samtidig generering av primære melanocyte og Fibroblast kulturer fra murine hud.
Melanocytter er pigment-produserende celler som finnes i mange steder i hele kroppen, inkludert basal epidermis, Iris, cochlea, hjerne og hårsekker5. Den primære funksjon av melanocytter er å generere og skiller melanin inneholder blemmer kalt melanosomer5,6. Melanosomer inneholder to store klasser av melanin: brun/svart eumelanin og gul/rød pheomelanin6,7. Biokjemiske prosesser innenfor melanocyte regulere den relative overflod av hver melanin arter og bidra til å bestemme hår, hud og øyenfarge8,9. Melanin tjener også til å absorbere UVR og beskytte sol-eksponert vev fra mutagenese10.
Melanocyte dysfunksjon kan forårsake pigmentær defekter og øke hudkreft mottakelighet. For eksempel, den hyper-pigmentert hud patcher karakteristisk for melasma er resultatet av fokal melanin overproduksjon, mens germline genetiske mutasjoner som kompromiss gener involvert i melanin syntese føre til albinisme11,12 . Intim kjennskap til melanocyte biologi er nødvendig for å utvikle strategier som vil rette opp slike pigmentær defekter og til slutt forbedre den psykososiale trivsel for individer plaget med disse sykdommene. Underskudd i melanin produksjon og/eller fortrinnsrett syntese av pheomelanin er også forbundet med økt hudkreft risiko10. Denne risikoen antas å skyldes redusert UVR Protection6,13. Således, metoder å forsterke eller restaurere eumelanin produksjon inne melanocytter kanskje nedskrive forekomsten av hud kreften inne disse befolkninger.
Mesenchymal fibroblaster etablere bindevev og strukturell støtte for alle organer i kroppen, inkludert dermal laget av huden14. Utskillelse av proteiner som kollagen, elastin, laminin og fibronektin muliggjør fibroblaster for å danne ekstracellulære Matrix (ECM) som er essensielt for vev integritet1,14. Fibroblaster spiller også viktige roller i prosesser som sår helbredelse, inflammasjon, angiogenese og kreft dannelse/progresjon1,15,16.
Analog med melanocytter, feilene inne Fibroblast aktivisering og funksjonen kanne fremme tumorigenesis og sykdommen. For eksempel, upassende Fibroblast aktivering vanligvis fører til dannelsen av fibrose, som følge av den forbedrede deponering av overflødige ECM komponenter i det omkringliggende vevet. Som fibroblaster opprettholde mye av kroppens strukturelle integritet, fibrose fremmer sykdommer som påvirker mange vev og organer, inkludert idiopatisk lunge fibrose, systemisk sklerose, skrumplever og hjerte fibrose15. Fibroblaster spiller også en avgjørende rolle i kreft16. Kreft assosiert fibroblaster (CAFs) er den mest tallrike ikke-ondartet celler i mikromiljøet av mange svulster. CAFs har vist å fremme tumor spredning, progresjon og terapeutisk motstand ved modulerende vev stivhet, lokal cytokin produksjon og immun funksjon16.
Primær cellekulturer gi forskere med genetisk medgjørlig modeller for å identifisere og dempe melanocyte og Fibroblast defekter som fører til sykdom. Men dagens metoder for å etablere melanocyte kulturer er tidkrevende og teknisk utfordrende. Behovet for trypsinization og delikat separasjon av epidermis og dermis bidrar til variasjon i eksperimentell avkastning og gjør det vanskelig å utføre store eksperimenter. Videre, protokoller å samtidig isolere melanocytter og fibroblaster fra hele hud er aktuelle mangler inne feltet.
Vi har utviklet en metode for å redusere behandlingstrinnene, variasjonen og tiden som kreves for å etablere melanocyte og Fibroblast kulturer fra samme hele hud prøve. Ved hjelp av en mekanisk homogenisering metode etterfulgt av en kort fordøyelse, vår strategi betydelig reduserer mengden av hands-on tid som kreves for å isolere primære melanocytter mens muliggjør samtidige Fibroblast isolasjon. Den økte hastigheten, effektiviteten og konsistensen i denne protokollen, i kombinasjon med evnen til å isolere melanocytter fra 0-4 dag gamle mus, gir forskerne fleksibilitet til å utføre et bredere spekter av eksperimenter enn det som tidligere var mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Få godkjennelse fra din institusjonelle dyreetikk komité før du starter denne eller andre studier som involverer dyr. Eksperimenter utført i denne protokollen ble godkjent av Ohio State universitetets institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC, protokoll #2012A00000134).
1. klargjøring av protokoll
Merk: Følgende instruksjoner for klargjøring av reagens er egnet for generering av 9 cm2 melanocyte og Fibroblast kulturer fra én enkelt mus. Se veiledningen for reagens forberedelse i tabell 1 for større skala isolasjoner.
- Forbered 1,5 mL kollagen oppløsning inneholdende 50 μg/mL kollagen i 0,1 M isbre eddiksyre.
- I et laminær Flow kabinett, frakk en brønn av en 6-brønn cellekultur parabolen med 8 μg/cm2 (1,44 ml) kollagen Solution. Sørg for at brønnen er fullstendig dekket av kollagen Solution. Ruge fatet ved 37 ° c i 3 t eller ved 4 ° c over natten. Før bruk, vask den kollagen belagte brønnen to ganger med 1,35 mL sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) (150 μL av PBS per 1 cm2).
- Monter vevet helikopter i en laminær Flow kabinett ved nøye å plassere en hakke disk på vevet helikopterplattform og sikre et sterilt blad til den bevegelige armen.
- Forbered 3 mL 1x antibiotika/Antimykotisk løsning ved å fortynne 100/antimykotisk lagerløsning i steril PBS.
- Forbered 3 mL fersk hud fordøyelsen buffer som inneholder 10% fosterets storfe serum, 1% penicillin/Streptomycin løsning, 1% L-glutamin, 10 mg/mL kollagenase type I, 0,25% svin Trypsin og 0,02 mg/mL deoxyribonuclease jeg i RPMI 1640.
- Forbered 6 mL fersk melanocyte Media inneholder 10% fosterets storfe serum, 7% hest serum, 1% penicillin/Streptomycin løsning, 1% L-glutamin, 0,5 mM di-butyryl syklisk AMP (dbcAMP), 20 nM tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA) og 200 pM kolera gift (CT) i Næringsstoff Mix F-12 ham ' s Media.
Merk: Konsentrerte dbcAMP-, TPA-og CT-lager løsninger kan lages, aliquoted og oppbevares for > 1 år ved-80 ° c. Base medier som mangler disse komponentene kan oppbevares i inntil 1 måned ved 4 ° c. - Forbered 4 mL Fibroblast Media inneholder 10% fosterets storfe serum, 1% penicillin/Streptomycin og 1% L-glutamin i Dulbecco ' s modifisert Eagle medium. Dette mediet kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 1 måned.
- Forbered 40 mL 4% Paraformaldehyde løsning ved å fortynne 16% Paraformaldehyde i PBS. Oppbevares overflødig ved 4 ° c i 1 måned eller-20 ° c i opptil 1 år.
- Forbered en 1% saponin lagerløsning ved å blande 0,5 g saponin i 50 mL PBS ved 37 ° c til saponin er helt oppløst. Sterilisere oppløsningen for langvarig lagring ved hjelp av en 50 mL sprøyte utstyrt med en 0,2 μm PES-filter. Den resulterende saponin lager løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i 1 måned.
- Forbered 200 μL av 0,1% saponin løsning per mus ved å fortynne 1% saponin lagerløsning i PBS inneholder 3% storfe serum albumin (BSA).
- Forbered 1 mL levedyktighet løsning ved å fortynne 1 μL av fixable levedyktighet fargestoff i 1 mL PBS.
2. melanocyte og Fibroblast isolasjon
- Euthanize 0 å 4 dag-gamle mannlig og/eller kvinner C57Bl/6J pups av halshogging og fjerne ekstremiteter fra det euthanized mus benytter kirurgisk saks.
- I en laminær Flow kabinett, kort rulle stammen av hver mus i en steril Petri parabolen inneholder 70% etanol. Fjern stammen fra etanol og legg den i en tom, steril Petri parabolen.
- Ved hjelp av kirurgisk saks, sterilisert i 70% etanol, gjør et snitt i huden på den ventrale siden av stammen fra nakken til halen. Skrell huden fra stammen av musen ved hjelp av steril tang.
- Plasser huden dermis side ned i en 6-brønn parabolen inneholder 3 mL 1x antibiotika/Antimykotisk Solution og ruge ved romtemperatur i 2-3 min.
- Slå på vevs helikopteret med følgende innstillinger på plass: Slice tykkelse: 1 μm; Blade kraft: ~ 60% av maksimal; Hastighet: ~ 50% av maksimum.
- Overfør huden, dermis side ned, til en steril vev Chopper disk og pass huden helt gjennom aktivert vev Chopper 3 ganger.
- Overfør homogenisert huden til et sterilt, 15 mL konisk rør som inneholder 3 mL av hudens fordøyelse buffer. Bland den resulterende suspensjonen ved å pipettering opp og ned 10-15 ganger med en P1000 micropipette.
- Cap den koniske røret og ruge prøven i et 37 ° c vannbad i 15 min, invertere røret hver 3-5 min.
- Pellet cellene i huden homogenate ved sentrifugering den koniske røret i en svingende bøtte rotor på 750 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Ved hjelp av en P1000 micropipette, sakte og fullstendig fjerne Skin fordøyelsen buffer være forsiktig med å forstyrre pellet.
Merk: En del av hele huden kan lagres på dette stadiet og brukes som en kontroll for trinn 3: bekreftelse av Cellular renhet. Sil disse cellene gjennom en 70 μm celle sil og deretter begynne på trinn 3,5 for videre behandling. - Grundig resuspend celle pellet i 1 mL melanocyte Media ved pipettering opp og ned 15-20 ganger med en P1000 micropipette. Legg den resulterende celle løsningen dråpevis til en ubehandlede brønn av en 6-brønn som inneholder 1 mL melanocyte Media.
- Plasser belagt hud homogenate i en vev kultur inkubator satt til 37 ° c og 5% CO2. Tillat kulturer å ruge for 40 min.
Merk: I løpet av denne tiden, vil noen fibroblaster i huden homogenate holde seg til den blanke parabolen mens melanocytter og keratinocytter forblir i suspensjon. - Overfør kulturen supernatanten fra den blanke parabolen til en brønn av en pre-vasket, kollagen-belagt 6-brønn parabolen. Legg G418 til Media slik at den endelige konsentrasjonen er 100 ng/mL.
- Tilsett 2 mL Fibroblast Media til en brønn av den blanke parabolen, som nå inneholder tilhenger fibroblaster.
- Ruge begge kulturer over natten i en vev kultur inkubator satt til 37 ° c og 5% CO2.
- Separat aspirer Media og eventuelle rusk fra hver kultur, 16-24 h etter plating. Vask hver tallerken to ganger med 1 mL steril PBS, og tilsett deretter 2 mL fersk melanocyte Media pluss 100 ng/mL G418 til melanocyte kulturen og 2 mL fersk Fibroblast Media til Fibroblast kulturen.
- Etter at melanocyte kulturer har blitt behandlet med G418 for 48 h, vask cellene to ganger med 1 mL steril PBS og tilsett 2 mL fersk melanocyte media uten G418 til kulturen.
Merk: Som fibroblaster i melanocyte kulturen fortsetter å dø av post-G418 behandling, vaske parabolen med steril PBS å fjerne døde celler og legge fersk melanocyte Media. Melanocyte og Fibroblast kulturer bør være passert når de når 70-80% confluency.
3. bekreftelse av cellulær renhet
- Aspirer mediene fra hver kultur og vask forsiktig hver tallerken med 1 mL sterilt PBS.
- Tilsett 0,7 mL av 0,25% Trypsin til hver kultur og ruge kulturene i Trypsin ved 37 ° c og 5% CO2 for 1 min.
- Løsne cellene ved å pipettering Trypsin mot bunnen av fatet ved hjelp av en P1000 micropipette.
- Tilsett 0,7 mL av de aktuelle mediene til hver trypsinized kultur og Overfør celle løsningen til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 750 x g for 2 min ved romtemperatur. Fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en P1000 micropipette.
Merk: Trinn 3.1-3.5 kan brukes til å passasje melanocyte og Fibroblast kulturer. Den resulterende pellet bør være resuspendert i riktig media og plassert i en ny, ubehandlede (fibroblaster) eller pre-vasket, kollagen-belagt (melanocytter) parabolen. - Resuspend celle pellet i 0,5 mL av iskald PBS.
- Nummerere og overføre 500 000 celler til en pre-kjølt 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
- Gjenta trinn 3,5 og resuspend deretter cellene i 100 μL av levedyktighet løsning. Ruge celle fjæringen i 30 minutter ved 4 ° c i mørket.
- Gjenta trinn 3.5-3.6 to ganger.
- Gjenta trinn 3,5, og fest deretter cellene ved å blanding pellet i 100 μL av iskald 4% Paraformaldehyde løsning. Ruge suspensjonen i 15 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Gjenta trinn 3,5 to ganger, hver gang blanding pellet i 0,5 mL 3% BSA i 1x PBS.
- Gjenta trinn 3,5, og resuspend deretter celle pellet i 100 μL av 0,1% saponin Solution. Ruge suspensjonen i 15 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Gjenta trinn 3,5, deretter resuspend celle pellet i 100 μL av 0,1% saponin oppløsning som inneholder 0,5 mikrogram kanin anti-gp100 antistoff, 0,5 mikrogram kanin anti-Fibroblast-spesifikt protein 1 (FSP1) antistoff og 0,025 mikrogram mus anti-Cytokeratin 14 (K14) antistoff. Ruge suspensjonen for 1 time ved romtemperatur i mørket.
Merk: Mens K14-antistoff ble kjøpt pre-bøyd til Alexa fluor 647, ble gp100 og FSP1 antistoffer bøyd til henholdsvis CF 555 og CF 488. Den farging av kontroll populasjoner bør også starte på dette trinnet. Celle populasjoner i kontroll celler bør isoleres fra kultur og behandles som beskrevet i trinn 3.5-3.12. - Gjenta trinn 3,11 to ganger for å fjerne ubundet antistoff.
- Gjenta trinn 3,5, og resuspend deretter celle pellet i 200-400 μL av 3% BSA i 1x PBS.
- Pass cellen løsningen gjennom en 40 μm celle sil i en 5 mL polystyren runde-Bottom tube og analysere anstrengt celler ved flyt flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannlige og kvinnelige C57Bl/6J mus ble euthanized på postnatal dager 0-4 og koordinasjonen huden ble utsatt for mekaniske dissosiasjon som beskrevet ovenfor. Etter hakking, huden dannet en viskøs slurry mangler noen tegn på strukturelle vev. Sentrifugering av denne slurry resulterte i dannelsen av en stor celle pellet på bunnen av den koniske rør og et lag av fett flytende på toppen av supernatanten. Dette fettlaget ble forkastet med supernatanten mens den resterende celle pellet var resuspendert og overført til en ubehandlede brønn av en 6-brønn parabolen. Den høye tettheten av celler forårsaket at mediene vises skyet. Imidlertid, etter 40 min av inkubasjons, større celle og vev konglomerater ble observert i Media og tilhenger fibroblaster kunne sees med en invertert lys mikroskop (figur 1).
De ikke-tilhenger cellene fra Fibroblast kulturen ble overført til en brønn av en kollagen-belagt 6-brønn parabolen for å isolere melanocytter. Tilsetting av G418 drepte eventuelle gjenværende fibroblaster i homogenate, etterlot mange døde celler flytende i media for de neste 5 dager (figur 2A-C). Etter 4-5 dager med vekst, den belagte melanocytter begynte å ta på en stereotype dendrittiske fenotype med melanocytic granulater (figur 2C). Denne fenotype fortsatte etter passaging av kulturen (figur 2D). Mens klynger av forurensende keratinocytter ble først observert i melanocyte kulturer (figur 2A), ble disse populasjoner tapt ved påfølgende passaging.
Flow analytiske analyser ble brukt for å bekrefte renheten av den resulterende primære melanocyte og Fibroblast kulturer. C5N mus keratinocytter17, dag 10 primære melanocyte kulturer og dag 6 primære Fibroblast kulturer ble farget med: anti-gp100 (differensiert melanocytter), anti-Cytokeratin 14 (K14; keratinocytter) og anti-Fibroblast-spesifikke protein 1 ( FSP1; fibroblaster) (Figur 3). I disse cellene var gp100 farging spesifikk for den primære melanocytter, mens FSP1 positivitet bare ble observert i fibroblaster (Figur 3A, B). Uttrykk for K14 var begrenset til C5N keratinocytter (Figur 3C). Ytterligere analyser ble utført for å bestemme renheten av våre melanocyte kulturer 1, 2, 3, 4 og 10 dager etter isolasjon (Figur 4). Kombinert Fibroblast og Keratinocyte forurensning oversteg aldri 25% av de totale cellene i kulturen (Figur 4B, C). Likevel ble det ikke observert dramatiske økninger i gp100 før den fjerde dagen i kulturen (Figur 4A). Vi tilskriver denne observasjonen til den reduserte uttrykk for gp100 i melanocyte forløpere (dvs. melanoblasts), hvorav mange synes fullt skille etter dag 10 i kultur (Figur 4A). Oppsummert viser disse dataene at vår raske isolasjons protokoll samtidig produserer kulturer beriket for melanocytter og fibroblaster.
| Trinn # | Reagens | 1 valp | 5 valper |
| 1,1 | Kollagen løsning | 1,5 mL | 4,5 mL |
| 1,2 | Plate størrelse | 6-brønn | 10 cm |
| 1,4 | Antibiotika/Antimykotisk løsning | 3 mL | 15 mL |
| 1,5 | Skin fordøyelse buffer | 3 mL | 15 mL |
| 1,6 | Melanocyte medier | 6 mL | 30 mL |
| 1,7 | Fibroblast medier | 4 mL av | 20 mL |
Tabell 1: klargjørings veiledning for reagenser for ulike kohort størrelser.
Figur 1 : Representative bilder av primær murine Fibroblast kulturer. Vist er 20x bilder av fibroblaster umiddelbart etter isolering (A), samt 24 (B) og 48 (C) h post-isolasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representative bilder av primære melanocyte kulturer. Vist er 20x bilder av melanocyte kulturer 1 (A), 2 (B) og 4 dager (C) post-isolasjon. Forurensende keratinocytter indikeres av pilen i ' A '. (D) representativt bilde av primær melanocyte kulturer etter passaging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Flow analytiske vurderinger av kultur renhet. Representative histogrammer som viser gp100 (A; differensiert melanocytter), FSP1 (B; fibroblaster) og K14 (C; keratinocytter) positivitet i primær melanocytter (dag 10), primær fibroblaster (dag 6) og C5N keratinocytter. Etter gating på levende celler, ble 10 000 hendelser analysert fra hver populasjon. Én fargekontroller ble brukt til kompensasjon, og de resulterende dataene ble visualisere med FlowJo programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Time kurs analyse av melanocyte renhet. Representative histogrammer viser melanocyte renhet 1-10 dager etter første isolasjon. Prøvene ble flekkete, analysert og grafisk som beskrevet i Figur 3. Positive og negative kontroll populasjoner var som følger: gp100-Human melanocytter (+), primære murine fibroblaster (-); FSP1--primær murine fibroblaster (+), Human melanocytter (-); K14--C5N celler (+), humant melanocytter (-). Gjennomsnittlig positivitet og standardavvik for minst tre distinkte melanocyte kulturer vises øverst i høyre hjørne av hver graf. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den in vitro kulturen i primær melanocytter og fibroblaster har ført til betydelige fremskritt i vår forståelse av hud biologi og sykdom. Denne protokollen forbedrer på tidligere melanocyte isolasjon metoder ved å redusere tiden og tekniske savvy nødvendig for å generere konsistente melanocyte kulturer samtidig som for samtidig isolering av huden fibroblaster. En roman, tidsbesparende element i denne prosedyren er at dermis og epidermis ikke trenger å skilles. I stedet, hudceller er isolert ved hjelp av konsekvent hakke kraft og detaljnivå av en mekanisk vev Chopper sammen med selektiv Media og plating teknikker. Ved å redusere kompleksiteten ved behandlingen og hands-on-tid, gjør denne fremgangsmåten det også mulig for forskere å utføre omfattende eksperimenter på en effektiv måte.
Vi anbefaler flere trinn for å forbedre avkastningen og konsistensen ved hjelp av denne protokollen. Først, før trinn 2,4, anbefaler vi at du bruker buet tang for å skrape bort noen fettvev fra dermal siden av huden. Denne prosessen vil redusere fett kaken dannet etter sentrifugering. Neste, riktig mekanisk dissosiasjon av huden er avgjørende for suksessen til denne protokollen og kan forsterkes ved å rotere homogenisator disken ~ 60 ° etter hvert pass av bladet. Et annet viktig trinn er å sikre at alle Skin Digest buffer fjernes i trinn 2,10. Unnlatelse av å gjøre dette vil hindre celle vedheft til parabolen og betydelig reduksjon yield. Fordi pellet ikke er fast festet til bunnen av 15 mL koniske rør i trinn 2,10, kan cellene enkelt pustende hvis supernatanten ikke er langsomt fjernet. Hvis grundig fjerning av hudens fordøyelsen buffer er en utfordring, foreslår vi at du vasker pellet i 2-3 mL melanocyte Media og deretter gjenta trinn 2.9-2.10 før plating. Til slutt, når blanding cellen pellet i trinn 2,11, er det viktig å Pipet kraftig for å bryte opp noen klumper og sikre at cellene er jevnt fordelt på overflaten av cellen kultur parabolen. Rusk og døde celler vil bli observert i kulturen i løpet av de første dagene etter isolasjon. Disse døde celler kan hindre veksten av kulturen og bør fjernes ved å vaske parabolen med PBS og deretter legge til nye medier.
Denne protokollen skisserer en metode for å generere primære melanocyte og Fibroblast kulturer fra en enkelt mus. Prosedyren kan imidlertid justeres effektivt for å imøtekomme større kohorter av mus (se tabell 1). For større kohorter, som kombinerer hud homogenate fra 4-5 pups resulterer i en 30-40% confluent 10 cm rett av melanocytter innen 4-5 dager av isolasjon. Flere teknikker kan brukes til å forbedre effektiviteten av denne protokollen når du arbeider med flere dyr. For det første, vi vanligvis euthanize dyrene inne apparater av fire, bearbeiding to dyrene med ett tid. Vi har grunnlegge det homogenisert hud fra to pups kan kombinert for skritt 2.7-2.8 av i tiltagende det kvantum av hud oversikten buffer å 6 mL. Å bevare tid, vi begynne isolere hud fra morgendagen par av pups stund det for det første sette er gjennomgår homogenisering og oversikten. Denne tilnærmingen sikrer at celle populasjoner er isolert kort tid etter døds kraft og reduserer behandlingstiden som kreves for flere dyr. Når du arbeider med eldre mus (dvs. postnatal dager 2-4), har vi funnet ut at bestått huden en fjerde gang gjennom det aktive vevet Chopper (trinn 2,6) forbedrer huden homogenisering og cellulære yield. Ved hjelp av denne teknikken, ser vi ingen alder avhengig forskjell i melanocyte eller Fibroblast yield.
Denne protokollen detaljer hvordan du samtidig generere Fibroblast og melanocyte kulturer fra samme hud prøve. Vi har observert at keratinocytter i den innledende melanocyte kulturen forblir overholdt parabolen når kortsiktig trypsinization utføres sammen med den kraftfulle koagulater av melanocytter (se trinn 3,2-3.3). Selv om vi ikke har optimalisert forplantning metoder for disse resterende cellene, hypothesize vi at fortsatt kultur av slike tilhenger populasjoner i Keratinocyte Media supplert med 100 ng/mL G418 kan resultere i en beriket celle befolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 til C.E.B.) og Pelotonia (B.M.M.) for økonomisk støtte. Vi er takknemlige for C. Haines og C. Wormsbaecher som ga kommentarer for å forbedre manuskriptet tekst. Dette arbeidet dratt nytte av Ohio State Comprehensive Cancer Center ' s Analytical flowcytometri delt ressurs som er støttet av NIH P30 CA016058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Melanocytes and their diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43 (2007).
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. UV radiation and the skin. International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
