Summary
Dieses Protokoll skizziert eine schnelle Methode, um gleichzeitig Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus der Haut von 0-4 Tage alten Mäusen zu erzeugen. Diese Primärkulturen können in vitro gepflegt und manipuliert werden, um eine Vielzahl physiologisch relevanter Prozesse zu untersuchen, einschließlich Hautzellbiologie, Pigmentierung, Wundheilung und Melanom.
Abstract
Defekte in der Fibroblasten- oder Melanozytenfunktion sind mit Hautkrankheiten verbunden, einschließlich schlechter Barrierefunktion, defekter Wundheilung, Pigmentierungsdefekten und Krebs. Entscheidend für das Verständnis und die Verbesserung dieser Krankheiten sind Experimente in primären Fibroblasten- und Melanozytenkulturen. Dennoch erfordern aktuelle Protokolle zur Melanozytenisolation, dass die epidermalen und dermalen Hautschichten trypsinisiert und manuell getrennt werden. Dieser Prozess ist zeitaufwändig, technisch anspruchsvoll und trägt zu inkonsistenten Erträgen bei. Darüber hinaus sind Methoden zur gleichzeitigen Erzeugung reiner Fibroblastenkulturen aus derselben Gewebeprobe nicht ohne weiteres verfügbar. Hier beschreiben wir ein verbessertes Protokoll zur Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus der Haut von Mäusen an postnatalen Tagen 0-4. In diesem Protokoll wird die gesamte Haut mit einem Gewebehäcksler mechanisch homogenisiert und dann kurz mit Kollagenase und Trypsin verdaut. Die Zellpopulationen werden dann durch selektive Beschichtung isoliert, gefolgt von der Behandlung durch G418. Dieses Verfahren führt zu konsistenten Melanozyten- und Fibroblastenausbeuten einer einzelnen Maus in weniger als 90 min. Dieses Protokoll ist auch leicht skalierbar, so dass Forscher große Kohorten von Tieren ohne signifikante Erhöhung der Hands-on-Zeit verarbeiten können. Wir zeigen durch zytometrische Fließbewertungen, dass Kulturen, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, stark für Melanozyten oder Fibroblasten angereichert sind.
Introduction
Säugetierhaut ist ein mehrschichtiges Organ, das den Körper vor fremden Krankheitserregern und ultravioletter Bestrahlung (UVR) schützt. Die Haut spielt auch eine entscheidende Rolle bei panostatischen Prozessen wie Wundheilung, Temperaturregulierung und Vitamin-D-Produktion1,2,3. Säugetierhaut besteht aus drei Hauptzelltypen: Melanozyten, Fibroblasten und Keratinozyten. Diese Zelltypen bevölkern verschiedene Hautschichten, wobei Keratinozyten die Epidermis, Fibroblasten in der Dermis und Melanozyten, die sich an die epidermal-dermalische Kreuzung und Haarfollikel localisieren, und Haarfollikel4. Hier beschreiben wir ein einfaches Verfahren, das die gleichzeitige Erzeugung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus muriner Haut ermöglicht.
Melanozyten sind pigmentproduzierende Zellen, die an vielen Orten im gesamten menschlichen Körper gefunden werden, einschließlich der Basalepidermis, Iris, Cochlea, Gehirn und Haarfollikel5. Die primäre Funktion von Melanozyten ist es, Melanin-haltige Vesikel zu erzeugen und abzusondern, die Melanosomen genannt werden5,6. Melanosomen enthalten zwei Hauptklassen von Melanin: braun/schwarz Eumelanin und gelb/rot Pheomelanin6,7. Biochemische Prozesse innerhalb der Melanozyten regulieren die relative Fülle jeder Melanin-Art und helfen, Haar, Haut und Augenfarbe zu bestimmen8,9. Melanin dient auch dazu, UVR zu absorbieren und sonnenexponierte gewebe vor Mutagenese10zu schützen.
Melanozytenfunktionsstörungen können pigmentäre Defekte verursachen und die Anfälligkeit für Hautkrebs erhöhen. Zum Beispiel sind die für Melasma charakteristischen hyperpigmentierten Hautflecken das Ergebnis einer fokalen Melanin-Überproduktion, während genetische Mutationen aus keimlinen, die Die an der Melaninsynthese beteiligten Gene gefährden, zu Albinismus führen11,12 . Intime Kenntnisse der Melanozytenbiologie sind erforderlich, um Strategien zu entwickeln, die solche pigmentären Defekte korrigieren und letztlich das psychosoziale Wohlbefinden von Personen verbessern, die von diesen Krankheiten betroffen sind. Defizite in der Melaninproduktion und/oder die bevorzugte Synthese von Phäomelanin sind auch mit einem erhöhten Hautkrebsrisiko10verbunden. Dieses Risiko wird angenommen, dass durch reduzierten UVR-Schutz6,13. So, Methoden zur Verbesserung oder Wiederherstellung der Eumelanin-Produktion in Melanozyten können die Inzidenz von Hautkrebs in diesen Populationen zu reduzieren.
Mesenchymale Fibroblasten etablieren das Bindegewebe und die strukturelle Unterstützung für alle Organe des Körpers, einschließlich der dermalen Schicht der Haut14. Die Ausscheidung von Proteinen wie Kollagen, Elastin, Laminin und Fibronectin ermöglicht Fibroblasten, die extrazelluläre Matrix (ECM) zu bilden, die für die Gewebeintegrität unerlässlich ist1,14. Fibroblasten spielen auch eine wesentliche Rolle in Prozessen wie Wundheilung, Entzündung, Angiogenese und Krebsbildung/Progression1,15,16.
Ähnlich wie bei Melanozyten können Defekte bei der Fibroblastenaktivierung und -funktion Die Tumorgenese und Krankheit fördern. Beispielsweise führt eine unangemessene Fibroblastenaktivierung häufig zur Bildung von Fibrose, die sich aus der verstärkten Ablagerung überschüssiger ECM-Komponenten in das umgebende Gewebe ergibt. Da Fibroblasten einen Großteil der strukturellen Integrität des Körpers erhalten, fördert Fibrose Krankheiten, die zahlreiche Gewebe und Organe betreffen, einschließlich idiopathischer Lungenfibrose, systemischer Sklerose, Leberzirrhose und Herzfibrose15. Fibroblasten spielen auch eine entscheidende Rolle bei Krebs16. Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) sind die am häufigsten vorkommenden nicht-bösartigen Zellen in der Mikroumgebung vieler Tumoren. CAFs haben gezeigt, dass Tumorproliferation, Progression und therapeutische Resistenz durch modulationende Gewebesteifigkeit, lokale Zytokinproduktion und Immunfunktion16zu fördern.
Primäre Zellkulturen bieten Forschern genetisch bewegliche Modelle, um Melanozyten- und Fibroblastendefekte, die zu Krankheiten führen, zu identifizieren und zu mildern. Die derzeitigen Methoden zur Etablierung von Melanozytenkulturen sind jedoch zeitaufwändig und technisch anspruchsvoll. Die Notwendigkeit einer Trypsinisierung und einer delikaten Trennung von Epidermis und Dermis trägt zur Variabilität der experimentellen Ausbeute bei und erschwert die Durchführung groß angelegter Experimente. Darüber hinaus fehlen derzeit Protokolle zur gleichzeitigen Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus der gesamten Haut auf dem Feld.
Wir haben eine Methode entwickelt, um die Verarbeitungsschritte, die Variabilität und den Zeitaufwand für die Herstellung von Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus derselben gesamten Hautprobe zu reduzieren. Mit einer mechanischen Homogenisierungsmethode, gefolgt von einer kurzen Verdauung, verringert unsere Strategie die Menge an hands-on-Zeit, die erforderlich ist, um primäre Melanozyten zu isolieren, während gleichzeitige Fibroblastenisolation ermöglicht wird. Die erhöhte Geschwindigkeit, Effizienz und Konsistenz dieses Protokolls in Kombination mit der Fähigkeit, Melanozyten von 0-4 Tage alten Mäusen zu isolieren, bietet Forschern die Flexibilität, eine breitere Palette von Experimenten durchzuführen, als bisher möglich.
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Protocol
Erhalten Sie die Genehmigung Ihrer institutionellen Tierethikkommission, bevor Sie mit dieser oder einer anderen Studie mit Tieren in Sendepolitik verfahren. Die in diesem Protokoll durchgeführten Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Protokoll #2012A00000134) der Ohio State University genehmigt.
1. Protokollvorbereitung
HINWEIS: Die folgenden Reagenzpräparationsanweisungen sind für die Erzeugung von 9 cm2 Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus einer Maus geeignet. Siehe die Reagenzvorbereitungsanleitung in Tabelle 1 für größere Isolationen.
- Bereiten Sie 1,5 ml Kollagenlösung vor, die 50 g/ml Kollagen in 0,1 M Eisessigsäure enthält.
- In einem laminaren Strömungsschrank einen Brunnen einer 6-Well-Zellkulturschale mit 8 g/cm2 (1,44 ml) Kollagenlösung beschichten. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen vollständig von der Collagen-Lösung abgedeckt ist. Die Schale bei 37 °C für 3 h oder bei 4 °C über Nacht inkubieren. Vor der Verwendung den kollagenbeschichteten Brunnen zweimal mit 1,35 ml steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS) (150 l PBS pro 1 cm2)waschen.
- Montieren Sie den Tissue-Chopper in einem laminaren Strömungsschrank, indem Sie sorgfältig eine Schneidescheibe auf die Tissue-Chopper-Plattform legen und eine sterile Klinge am beweglichen Arm sichern.
- Bereiten Sie 3 ml 1x Antibiotikum/Antimykotische Lösung durch Verdünnung 100x Antibiotikum/Antimykotische Lagerlösung in sterilem PBS vor.
- Bereiten Sie 3 ml frischen Hautverdauungspuffer mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung, 1% L-Glutamin, 10 mg/ml Kollagennase Typ I, 0,25% Schweinetrypsin und 0,02 mg/ml Desoxyribonuclease I in RPMI 1640 vor.
- Bereiten Sie 6 ml frische Melanozytenmedien vor, die 10% fetales Rinderserum, 7% Pferdeserum, 1% Penicillin/Streptomycinlösung, 1% L-Glutamin, 0,5 mM Di-Butyryl-zyklisches AMP (dbcAMP), 20 nM Tetradecanoylphorbol 13-Acetat (TPA) und 200 pM Choleratoxin (CT) enthalten Nutrient Mix F-12 Schinken Medien.
HINWEIS: Konzentrierte dbcAMP-, TPA- und CT-Lagerlösungen können hergestellt, aliquoted und für >1 Jahr bei -80 °C gelagert werden. Basismedien ohne diese Komponenten können bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden. - Bereiten Sie 4 ml Fibroblastenmedien vor, die 10% fetales Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium enthalten. Dieses Medium kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie 40 ml 4% Paraformaldehydlösung vor, indem Sie 16% Paraformaldehyd in PBS verdünnen. Lagern Sie einen Überschuss bei 4 °C für 1 Monat oder -20 °C für bis zu 1 Jahr.
- Bereiten Sie eine 1% Saponin-Lagerlösung vor, indem Sie 0,5 g Saponin in 50 ml PBS bei 37 °C mischen, bis sich das Saponin vollständig aufgelöst hat. Sterilisieren Sie die Lösung für die Langzeitlagerung mit einer 50 ml Spritze, die mit einem 0,2 m PES-Filter ausgestattet ist. Die resultierende Saponin-Lagerlösung kann 1 Monat lang bei 4 °C aufbewahrt werden.
- Bereiten Sie 200 l 0,1% Saponin-Lösung pro Maus vor, indem Sie 1% Saponin-Stammlösung in PBS verdünnen, die 3% Rinderserumalbumin (BSA) enthält.
- Bereiten Sie 1 ml Viability Solution vor, indem Sie 1 l fixierbaren Isse-Farbstoff in 1 ml PBS verdünnen.
2. Melanozyten- und Fibroblastenisolierung
- Euthanisieren Sie 0 bis 4 Tage alte männliche und/oder weibliche C57Bl/6J Welpen durch Enthauptung und entfernen Sie Extremitäten von den eingeschläferten Mäusen mit chirurgischer Schere.
- In einem laminaren Fließschrank den Kofferraum jeder Maus kurz in einer sterilen Petrischale mit 70% Ethanol rollen. Entfernen Sie den Stamm aus dem Ethanol und legen Sie ihn in eine leere, sterile Petrischale.
- Mit chirurgischen Scheren, sterilisiert in 70% Ethanol, machen einen Schnitt in der Haut auf der ventralen Seite des Rumpfes von hals bis zum Schwanz. Schälen Sie die Haut aus dem Rumpf der Maus mit sterilen Zangen.
- Legen Sie die Haut dermis Seite nach unten in eine 6-Well-Schale mit 3 ml 1x Antimykotische Lösung und inkubieren bei Raumtemperatur für 2-3 min.
- Schalten Sie den Gewebe-Chopper mit den folgenden Einstellungen ein: Scheibendicke: 1 m; Klingenkraft: 60 % des Maximums; Geschwindigkeit: 50 % des Maximums.
- Übertragen Sie die Haut, Dermis Seite nach unten, auf eine sterile Gewebe-Chopper-Scheibe und passieren Sie die Haut vollständig durch den aktivierten Gewebe-Chopper 3 mal.
- Übertragen Sie die homogenisierte Haut in ein steriles, 15 ml konisches Rohr mit 3 ml Hautverdauungspuffer. Mischen Sie die resultierende Suspension, indem Sie 10-15 Mal mit einer P1000-Mikropipette nach oben und unten pfeifen.
- Kappen Sie das konische Rohr und inkubieren Sie die Probe in einem 37 °C Wasserbad für 15 min, invertieren Sie das Rohr alle 3-5 min.
- Pellet die Zellen in der Haut homogenisieren durch Zentrifugieren des konischen Rohres in einem schwingenden Schaufelrotor bei 750 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Mit einer P1000 Mikropipette, langsam und vollständig entfernen Sie die Haut Verdauung Puffer darauf achten, das Pellet nicht zu stören.
HINWEIS: Ein Teil der gesamten Haut kann in diesem Stadium gespeichert und als Kontrolle für Schritt 3: Bestätigung der Zellreinheit verwendet werden. Dehnen Sie diese Zellen durch ein 70 m Zellsieb und beginnen Sie dann bei Schritt 3.5 für die Weiterverarbeitung. - Das Zellpellet in 1 ml Melanozyten-Medien gründlich wieder aufhängen, indem es 15-20 Mal mit einer P1000-Mikropipette nach oben und unten pipet. Fügen Sie die resultierende Zelllösung tropfenweise in einen unbeschichteten Brunnen einer 6-Well-Schale mit 1 ml Melanozyten-Medien.
- Legen Sie die beschichtete Haut homogenat in einem Gewebekultur-Inkubator auf 37 °C und 5% CO2eingestellt. Lassen Sie die Kulturen für 40 min brüten.
HINWEIS: Während dieser Zeit haften einige Fibroblasten in der Haut homogenat an der unbeschichteten Schale, während die Melanozyten und Keratinozyten in Suspension bleiben. - Übertragen Sie den Kulturüberstand von der unbeschichteten Schale auf einen Brunnen einer vorgewaschenen, mit Kollagen beschichteten 6-Well-Schale. Fügen Sie G418 zu den Medien hinzu, so dass die endgültige Konzentration 100 ng/ml beträgt.
- Fügen Sie 2 ml Fibroblasten-Medien in einen Brunnen der unbeschichteten Schale, die jetzt anhaftende Fibroblasten enthält.
- Inkubieren Sie beide Kulturen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator, der bei 37 °C und 5%CO2eingestellt ist.
- Separat die Medien und alle Trümmer aus jeder Kultur, 16-24 h nach der Beschichtung. Waschen Sie jedes Gericht zweimal mit 1 ml sterilem PBS, und fügen Sie dann 2 ml frischemelanozyte Medien plus 100 ng/mL G418 in die Melanozytenkultur und 2 ml frisches Fibroblastenmedium zur Fibroblastenkultur hinzu.
- Nachdem die Melanozytenkulturen 48 h lang mit G418 behandelt wurden, waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml sterilem PBS und fügen Sie der Kultur 2 ml frischemelanozyten Medien ohne G418 hinzu.
HINWEIS: Da Fibroblasten in der Melanozytenkultur nach der Behandlung nach G418 weiter absterben, waschen Sie die Schale mit sterilem PBS, um abgestorbene Zellen zu entfernen und frische Melanozytenmedien hinzuzufügen. Melanozyten- und Fibroblastenkulturen sollten durchgesieben werden, wenn sie 70-80% Konfluenz erreichen.
3. Bestätigung der zellulären Reinheit
- Aspirieren Sie die Medien aus jeder Kultur und waschen Sie sorgfältig jedes Gericht mit 1 ml sterilem PBS.
- Fügen Sie 0,7 ml 0,25% Trypsin zu jeder Kultur hinzu und bebrüten die Kulturen in Trypsin bei 37 °C und 5% CO2 für 1 min.
- Lösen Sie die Zellen, indem Sie das Trypsin mit einer P1000-Mikropipette gegen den Boden der Schale pfeifen.
- Fügen Sie 0,7 ml des entsprechenden Mediums zu jeder trypsinisierten Kultur hinzu und übertragen Sie die Zelllösung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 750 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P1000-Mikropipette.
HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.5 können verwendet werden, um Melanozyten- und Fibroblastenkulturen zu durchlaufen. Das resultierende Pellet sollte in den entsprechenden Medien resuspendiert und in eine neue, unbeschichtete (Fibroblasten) oder vorgewaschene, kollagenbeschichtete Schale (Melanozyten) gegeben werden. - Das Zellpellet in 0,5 ml eiskaltem PBS wieder aufsetzen.
- Aufzählen und Übertragen von 0,5 Millionen Zellen in ein vorgekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5, und setzen Sie die Zellen dann in 100 L der Viability Solution wieder aus. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6 zweimal.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5, und fixieren Sie dann die Zellen, indem Sie das Pellet in 100 l eiskalte 4% Paraformaldehydlösung wieder aufhängen. Inkubieren Sie die Suspension für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Wiederholen Sie Schritt 3,5 zweimal, wobei das Pellet jedes Mal in 0,5 ml von 3% BSA in 1x PBS wieder aufsetzt wird.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5, und setzen Sie dann das Zellpellet in 100 l 0,1% Saponin-Lösung wieder aus. Inkubieren Sie die Suspension für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5, und setzen Sie dann das Zellpellet in 100 l 0,1% Saponin-Lösung mit 0,5 g Kaninchen-Anti-gp100-Antikörper, 0,5 g Kaninchen-Anti-Fibroblast-spezifischem Protein-1 (FSP1)-Antikörper und 0,025 g Maus-Anti-Cytokeratin 14 (K14) Antikörper wieder aus. Inkubieren Sie die Suspension für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
HINWEIS: Während der K14-Antikörper vorkonjugiert an Alexa Fluor 647 erworben wurde, wurden die Antikörper gp100 und FSP1 mit CF 555 bzw. CF 488 konjugiert. Auch die Färbung der Kontrollpopulationen sollte bei diesem Schritt beginnen. Kontrollzellpopulationen sollten von der Kultur isoliert und wie in den Schritten 3.5-3.12 beschrieben verarbeitet werden. - Wiederholen Sie Schritt 3.11 zweimal, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5, und setzen Sie dann das Zellpellet in 200-400 l von 3% BSA in 1x PBS wieder auf.
- Übergeben Sie die Zelllösung durch ein 40-m-Zellsieb in ein 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr und analysieren Sie die belasteten Zellen durch Durchflusszytometrie.
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Representative Results
Männliche und weibliche C57Bl/6J-Mäuse wurden an den postnatalen Tagen 0-4 eingeschläfert und die truncal Haut wurde einer mechanischen Dissoziation unterzogen, wie oben beschrieben. Nach dem Hacken bildete die Haut eine zähflüssige Gülle ohne Anzeichen von Strukturgewebe. Die Zentrifugierung dieser Gülle führte zur Bildung eines großen Zellpellets am Boden des konischen Rohres und einer Fettschicht, die auf dem Überstand schwebte. Diese Fettschicht wurde mit dem Überstand entsorgt, während das verbleibende Zellpellet resuspendiert und in einen unbeschichteten Brunnen einer 6-Well-Schale übertragen wurde. Die hohe Dichte der Zellen führte dazu, dass die Medien trüb wurden. Nach 40 min Inkubation wurden jedoch größere Zell- und Gewebekonglomerate in den Medien beobachtet und anhaftende Fibroblasten mit einem invertierten Lichtmikroskop beobachtet werden (Abbildung 1).
Die nicht haftenden Zellen aus der Fibroblastenkultur wurden auf einen Brunnen einer kollagenbeschichteten 6-Well-Schale übertragen, um Melanozyten zu isolieren. Durch die Zugabe von G418 wurden alle verbleibenden Fibroblasten im Homogenat getötet, so dass zahlreiche abgestorbene Zellen für die nächsten 5 Tage in den Medien schweben (Abbildung2A-C). Nach 4-5 Tagen Wachstum begannen die vergoldeten Melanozyten einen stereotypen dendritischen Phänotyp mit melanozytären Granulaten zu übernehmen (Abbildung 2C). Dieser Phänotyp blieb nach dem Durchlaufen der Kultur bestehen (Abbildung 2D). Während Cluster von kontaminierenden Keratinozyten zunächst in den Melanozytenkulturen beobachtet wurden (Abbildung 2A), gingen diese Populationen bei der anschließenden Passierung verloren.
Durchflusszytometrische Analysen wurden verwendet, um die Reinheit der resultierenden primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen zu bestätigen. C5N Maus keratinocytes17, Tag 10 primäre Melanozytenkulturen und Tag 6 primäre Fibroblastenkulturen wurden mit gefärbt: Anti-gp100 (differenzierte Melanozyten), Anti-Cytokeratin 14 (K14; Keratinozyten) und Anti-Fibroblast-spezifisches Protein 1 ( FSP1; Fibroblasten) (Abbildung 3). In diesen Zellen war die gp100-Färbung spezifisch für die primären Melanozyten, während FSP1-Positivität nur bei Fibroblasten beobachtet wurde (Abbildung 3A,B). Der Ausdruck von K14 war auf C5N-Keratinozyten beschränkt (Abbildung 3C). Zusätzliche Analysen wurden durchgeführt, um die Reinheit unserer Melanozytenkulturen 1, 2, 3, 4 und 10 Tage nach der Isolierung zu bestimmen (Abbildung 4). Die kombinierte Fibroblasten- und Keratinozytenkontamination überstieg nie 25 % der gesamten Zellen in Kultur (Abbildung 4B,C). Dennoch wurden dramatische Zuwächse bei gp100 erst am vierten Tag in der Kultur beobachtet (Abbildung 4A). Wir führen diese Beobachtung auf die reduzierte Expression von gp100 in Melanozyten-Vorstufen (d.h. Melanoblasten) zurück, von denen viele durch Tag 10 in der Kultur vollständig differenziert erscheinen (Abbildung 4A). Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass unser Schnellisolationsprotokoll gleichzeitig Kulturen produziert, die für Melanozyten und Fibroblasten angereichert sind.
| schritt # | Reagenz | 1 Welpen | 5 Welpen |
| 1.1 | Kollagenlösung | 1,5 ml | 4,5 ml |
| 1.2 | Plattengröße | 6-gut | 10 cm |
| 1.4 | Antibiotikum / Antimykotische Lösung | 3 mL | 15 ml |
| 1.5 | Skin Digestion Buffer | 3 mL | 15 ml |
| 1.6 | Melanozyten-Medien | 6 ml | 30 ml |
| 1.7 | Fibroblast Enmedia | 4 ml | 20 ml |
Tabelle 1: Reagenzvorbereitungsleitfaden für verschiedene Kohortengrößen.
Abbildung 1 : Repräsentative Bilder von primären murinen Fibroblastenkulturen. Gezeigt werden 20x Bilder von Fibroblasten unmittelbar nach Isolation (A), sowie 24 (B) und 48 (C) h nach der Isolation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Repräsentative Bilder der primären Melanozytenkulturen. Gezeigt werden 20x Bilder von Melanozytenkulturen 1 (A), 2 (B) und 4 Tage (C) post-isolation. Kontaminierende Keratinozyten werden durch den Pfeil in "A" angezeigt. (D) Repräsentatives Bild der primären Melanozytenkulturen nach der Passierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Fließen zytometrische Bewertungen der Kulturreinheit. Repräsentative Histogramme, die gp100 (A; differenzierte Melanozyten), FSP1 (B; Fibroblasten) und K14 (C; Keratinozyten) Positivität in primären Melanozyten (Tag 10), primären Fibroblasten (Tag 6) und C5N Keratinozyten zeigen. Nach dem Gating auf lebenden Zellen wurden 10.000 Ereignisse aus jeder Population analysiert. Zur Kompensation wurden einfarbige Steuerelemente verwendet und die resultierenden Daten mit der FlowJo-Software visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Zeitverlaufsanalyse der Melanozytenreinheit. Repräsentative Histogramme mit Melanozytenreinheit 1-10 Tage nach der ersten Isolierung. Die Proben wurden wie in Abbildung 3beschrieben gefärbt, analysiert und grafisch dargestellt. Positive und negative Kontrollpopulationen waren wie folgt: gp100--humane Melanozyten (+), primäre murine Fibroblasten (-); FSP1--primäre murinische Fibroblasten (+), humane Melanozyten (-); K14--C5N-Zellen (+), humane Melanozyten (-). Die durchschnittliche Positivität und Standardabweichung für mindestens drei verschiedene Melanozytenkulturen wird in der oberen rechten Ecke jedes Diagramms angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die In-vitro-Kultur von primären Melanozyten und Fibroblasten hat zu signifikanten Fortschritten in unserem Verständnis von Hautbiologie und Krankheiten geführt. Dieses Protokoll verbessert frühere Melanozyten-Isolationsmethoden, indem es die Zeit und das technische Geschick reduziert, die erforderlich sind, um konsistente Melanozytenkulturen zu erzeugen, während gleichzeitig die Isolierung von Hautfibroblasten ermöglicht wird. Ein neuartiges, zeitsparendes Element dieses Verfahrens ist, dass Dermis und Epidermis nicht getrennt werden müssen. Stattdessen werden Hautzellen mit der konsistenten Hackkraft und Granularität eines mechanischen Gewebehäckslers zusammen mit selektiven Medien- und Beschichtungstechniken isoliert. Durch die Reduzierung der Verarbeitungskomplexität und der praktischen Zeit ermöglicht dieses Verfahren den Forschern auch, groß angelegte Experimente effizient durchzuführen.
Wir empfehlen mehrere Schritte, um die Ausbeute und Konsistenz mithilfe dieses Protokolls zu verbessern. Zunächst empfehlen wir vor Schritt 2.4, gekrümmte Zangen zu verwenden, um fettes Gewebe von der dermalen Seite der Haut wegzukratzen. Dieser Prozess reduziert den Fettkuchen, der nach der Zentrifugation gebildet wird. Als nächstes ist die richtige mechanische Dissoziation der Haut entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls und kann durch Drehen der Homogenisatorscheibe um 60° nach jedem Durchgang der Klinge verbessert werden. Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass der gesamte Skin Digest Buffer in Schritt 2.10 entfernt wird. Geschieht dies nicht, wird die Zellhaftung an der Schale behindert und die Ausbeute deutlich verringert. Da das Pellet in Schritt 2.10 nicht fest am Boden des 15 ml konischen Rohres befestigt ist, können die Zellen leicht angesaugt werden, wenn der Überstand nicht langsam entfernt wird. Wenn eine gründliche Entfernung des Hautverdauungspuffers eine Herausforderung ist, empfehlen wir, das Pellet in 2-3 ml Melanozytenmedien zu waschen und dann die Schritte 2.9-2.10 vor der Beschichtung zu wiederholen. Schließlich ist es beim Wiederaufsetzen des Zellpellets in Schritt 2.11 wichtig, kräftig pipetieren, um Klumpen aufzubrechen und sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig auf der Oberfläche der Zellkulturschale verteilt sind. Trümmer und abgestorbene Zellen werden in den ersten Tagen nach der Isolation in der Kultur beobachtet. Diese abgestorbenen Zellen können das Wachstum der Kultur behindern und sollten entfernt werden, indem die Schale mit PBS gewaschen und dann frische Medien hinzugefügt werden.
Dieses Protokoll skizziert eine Methode zum Generieren primärer Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus einer einzigen Maus. Das Verfahren kann jedoch effektiv an größere Mäusekohorten angepasst werden (siehe Tabelle 1). Bei größeren Kohorten führt die Kombination von Hauthomogenat von 4-5 Welpen zu einer 30-40% konfluenten 10 cm Schale melanozyten innerhalb von 4-5 Tagen nach Isolation. Es können verschiedene Techniken verwendet werden, um die Effizienz dieses Protokolls bei der Arbeit mit mehreren Tieren zu verbessern. Erstens euthanisieren wir die Tiere in der Regel in Vierergruppen und verarbeiten zwei Tiere gleichzeitig. Wir haben herausgefunden, dass homogenisierte Haut von zwei Welpen in den Schritten 2.7-2.8 kombiniert werden kann, indem das Volumen des Skin Digest Buffer auf 6 ml erhöht wird. Um Zeit zu sparen, beginnen wir, die Haut vom nächsten Welpenpaar zu isolieren, während der erste Satz homogenisiert und vergängt wird. Dieser Ansatz stellt sicher, dass die Zellpopulationen bald nach der Euthanasie isoliert werden und reduziert die Verarbeitungszeit, die für mehrere Tiere benötigt wird. Bei der Arbeit mit älteren Mäusen (d.h. postnatalen Tagen 2-4) haben wir herausgefunden, dass das Vierte Mal die Haut durch den aktiven Gewebehäcksler (Schritt 2.6) die Homogenisierung der Haut und die zelluläre Ausbeute verbessert. Mit dieser Technik sehen wir keinen altersabhängigen Unterschied in der Melanozyten- oder Fibroblastenausbeute.
Dieses Protokoll beschreibt, wie gleichzeitig Fibroblasten- und Melanozytenkulturen aus derselben Hautprobe erzeugt werden. Wir haben beobachtet, dass Keratinozyten in der ursprünglichen Melanozytenkultur an der Schale haften bleiben, wenn die kurzfristige Trypsinisierung zusammen mit der gewaltsamen Dislodgeierung von Melanozyten durchgeführt wird (siehe Schritte 3.2-3.3). Obwohl wir die Ausbreitungsmethoden für diese verbleibenden Zellen nicht optimiert haben, gehen wir davon aus, dass eine fortgesetzte Kultur solcher anhaftenden Populationen in Keratinozytenmedien, ergänzt durch 100 ng/ml G418, zu einer angereicherten Zellpopulation führen könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 an C.E.B.) und Pelotonia (B.M.M.) für die finanzielle Unterstützung. Wir danken C. Haines und C. Wormsbaecher, die Kommentare zur Verbesserung des Manuskripttextes gegeben haben. Diese Arbeit profitierte von der Analytical Cytometry Shared Resource des Ohio State Comprehensive Cancer Center, die von NIH P30 CA016058 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
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