Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.
Abstract
Hormônios das ilhotas pancreáticas regulam a homeostase de glicose no sangue. Alterações na glicose no sangue induzem oscilações de cálcio citosólico em células de ilhotas pancreáticas que desencadeiam a secreção de três hormônios principais: insulina (de células β), glucagon (α-células) e somatostatina (células δ). β-Células, que compõem a maioria das células ilhotas e são eletricamente acoplados uns aos outros, respondem ao estímulo da glicose como uma única entidade. A excitabilidade das subpopulações menores, das células α e das células-δ (representando cerca de 20% (30%) e 4% (10%) do total de roedores1 (humano2)números de células ilhotas, respectivamente) é menos previsível e, portanto, é de interesse especial.
Sensores de cálcio são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota isolada. A ilhota ou um grupo de ilhotas é então imobilizada e imagem usando um microscópio de fluorescência. A escolha do modo de imagem está entre maior taxa de rendimento (wide-field) e melhor resolução espacial (confocal). Convencionalmente, a microscopia confocal da exploração do laser é usada para o tecido da imagem latente, porque fornece a melhor separação do sinal entre as pilhas vizinhas. Um sistema de campo largo também pode ser utilizado, se o sinal de contaminação da população dominante de células β for minimizado.
Uma vez registrada a dinâmica do cálcio em resposta a estímulos específicos, os dados são expressos em forma numérica como intensidade de fluorescência versus tempo, normalizados para a fluorescência inicial e corrigidos na linha de base, para remover os efeitos ligados ao branqueamento fluorofofóbico. As alterações na frequência de picos ou na área parcial a curva (pAUC) são computadas versus tempo, para quantificar os efeitos observados. PAUC é mais sensível e bastante robusto, enquanto a frequência de aumento fornece mais informações sobre o mecanismo de aumento de cálcio.
Subpopulações celulares menores podem ser identificadas usando respostas funcionais a compostos de marcadores, como adrenalina e grelina, que induzem alterações no cálcio citosólico em populações específicas de células ilhotas.
Introduction
O objetivo do método é a imagem em tempo real mudanças na concentração citossólica de cálcio ([Ca2 +]cyt) em subpopulações menores de células de ilhotas pancreáticas. Isso permite descobrir os mecanismos que regem a secreção hormonal nessas células, revelando detalhes sobre a conversa cruzada entre diferentes tipos de células e, potencialmente, introduzindo uma dimensão populational na imagem maior da sinalização de ilhotas.
Ilhotas consistem em vários tipos de células. Além das células β-secretadas mais conhecidas pela insulina, há pelo menos duas subpopulações que também são críticas na regulação da glicose no sangue3. α-Células (que compõem cerca de 17% das células ilhotas) secretam glucagon quando a glicose no sangue fica muito baixa, o que sinaliza para a liberação de glicose na corrente sanguínea a partir de depósitos no fígado. Níveis excessivos de glucagon (hiperlucagonemia) e controle prejudicado da liberação de glucagon acompanham (e, tecnicamente, pode contribuir para) a condição pré-diabética da sensibilidade à insulina prejudicada4. δ-Células (cerca de 2%) secretar somatostatina em resposta à elevação da glicose. Este hormônio peptídeo onipresente é susceptível de estar presente em altas concentrações nas proximidades de α- e β-células dentro ilhotas, que tem um forte Gi receptor mediado efeito atenuante em glucagon e secreção de insulina.
α-Células e células-δ compartilham uma grande parte da maquinaria de detecção de glicose com seus parentes de linhagem próxima, células β. Todos os três tipos de células estão equipados com canais K+ sensíveis ao ATP, sensores metabólicos elaborados5 que controlam o potencial de membrana plasmática dessas células excitáveis. Ao mesmo tempo, a secreção de insulina, somatostatina e glucagon é regulada de forma diferente pela glicose. A imagem latente da dinâmica de Ca2+ nas duas subpopulações menores de pilhas da ilhota pode conseqüentemente fornecer uma introspecção na cruz-conversa entre a glicose de sangue e a saída secretory da ilhota.
As primeiras tentativas de monitorar a excitabilidade das células α e δ usando eletrofisiologia de grampo de remendo foram logo seguidas por imagens de Ca2+ em células α e δ únicas. A identidade das células nesses experimentos foi verificada através de uma coloração posterior com anticorpos anti-glucagon ou anti-somatostatina. Estes esforços foram frequentemente dificultados pela constatação de que as células ilhotas se comportam de forma muito diferente dentro da ilhota e como células únicas. Embora as células β pareçam ser os principais benfeitores do arranjo das ilhotas (devido à sua esmagadora maioria subjacente ao seu forte acoplamento elétrico), a principal discrepância foi, surpreendentemente, encontrada nas células α. Dentro da ilhota intacta, estas células são constantemente e persistentemente ativadas em baixa glicose, o que só é verdade para cerca de 7% das únicas células α dispersas6. Acredita-se, portanto, que relatar a atividade das células α e δ dentro de ilhotas intactas represente uma aproximação mais próxima das condições in vivo.
Em geral, existem duas maneiras de relatar a dinâmica Ca2+ especificamente das subpopulações α-célula ou células-δ: (i) expressando um sensor Ca2+ geneticamente codificado através de um promotor específico do tecido ou (ii) usando compostos de marcadores. A abordagem anterior mais elegante acrescenta a vantagem substancial da verdadeira imagem 3D e, portanto, o estudo da distribuição celular dentro da ilhota. No entanto, não pode ser aplicado para material intacto de ilhota humana. Outra preocupação potencial é o 'vazamento' do promotor, particularmente quando a transdiferenciação β/α-célula ou a resposta de células α à alta glicose está em vigor. Esta última abordagem pode ser usada com tecido recém-isolado, incluindo amostras humanas ou ilhotas cultivadas. Os dados, no entanto, são coletados exclusivamente da camada periférica de células ilhotas, pois a entrega da molécula de tintura/marcador em camadas mais profundas sem alterar a arquitetura da ilhota é desafiadora. Uma vantagem inesperada desta última abordagem é a compatibilidade com o modo de imagem de campo largo, que permite a ampliação dos experimentos para imagens simultâneas de dezenas ou centenas de ilhotas (ou seja, milhares a dezenas de milhares de células).
O cálcio é imaged in vivo usando sensores familiares GCaMP7 (ou pericam8)geneticamente codificados, que são variantes de proteína fluorescente verde mutada circularmente (GFP) fundida à calmodulina de proteína de ligação ao cálcio e sua seqüência alvo, fragmento M13 da cadeia de luz de miosina kinase7,9. GCaMPs têm excelentes índices de sinal para ruído na faixa de concentrações nanomolar Ca2 + e uma alta seção transversal de 2 fótons, o que os torna uma escolha ideal para in vivo trabalho10,11. O aspecto desafiador do uso de sensores recombinantes é a sua entrega nas células. A expressão heterologous exige usar um vetor viral e um culturing ex vivo multi-hour, que levante freqüentemente interesses a respeito da desdiferenciação ou da deterioração potencial de funções da pilha. Embora os modelos de mouse pré-projetados para expressar gcamp resolver este problema, eles adicionam novos desafios, aumentando o prazo de entrega substancialmente e limitando o trabalho a um modelo não-humano. A sensibilidade muito alta às mudanças do pH intracelular é um outro lado adverso dos sensores proteína-baseados12,que seja, entretanto, menos de um problema para sensoriamento de sinais oscilatórios, tais como Ca2+.
A vantagem de corantes trappable (tais como fluo4 fluorescente verde) é que podem ser carregados no tecido recentemente isolado dentro ao redor de uma hora. Previsivelmente, corantes trappable têm menores relações sinal-ruído e (muito) menor fotostability do que os seus homólogos recombinantes. Não podemos confirmar13 os relatos de toxicidade dos corantes trapistas14, no entanto, a sobrecarga de corante é um problema frequente.
Os sensores Vermelhos Recombinant Ca2+ baseados na permutação circular têm evoluído rapidamente desde 201115,e os desenvolvimentos mais recentes apresentam uma forte concorrência aos GCaMPs16 para imagens de tecido, dada a maior profundidade de penetração da luz vermelha. As tinturas trappable vermelhas comercialmente disponíveis podem ser usadas confiantemente para a imagem latente da único-pilha mas, no nível do tecido, não podem competir bem com os análogos verdes.
Há aparentemente muito pouca escolha de tecnologia de imagem para experimentos em tecidos onde a luz fora de foco se torna um problema crítico. O sistema confocal fornece resolução de célula única aceitável pelo cancelamento da luz fora de foco com qualquer objetivo sobre o NA acima de 0,3 (para o caso de GCaMP6) ou 0,8 (corantes trapaceiros). Em um sentido técnico, um microscópio confocal convencional pode ser usado para imagens simultâneas de [Ca2+]cyt de centenas (GCaMP) ou dezenas de ilhotas (tinuoso trapaceiro trapaceiro). A única alternativa realista ao modo confocal em caso de expressão 3D do sensor no tecido é talvez microscopia de folha de luz.
As coisas são ligeiramente diferentes para o caso quando o sensor é expresso na camada periférica de pilhas dentro do tecido da ilhota. Para sensores recombinantes brilhantes que tenham um padrão de expressão intracelular vívido, o uso de um modo de imagem de campo largo com um objetivo de baixo NA pode fornecer qualidade suficiente e recompensar o pesquisador com um aumento substancial na área de campo de visão e, portanto, Transferência. Um sistema de campo largo fornece uma resolução espacial mais pobre, uma vez que a luz fora de foco não é cancelada; Portanto, o tecido de imagem com objetivos de alta NA (baixa profundidade de campo) é menos informativo, já que o sinal unicelular está muito contaminado pelas células vizinhas. A contaminação é muito menor para objetivos de baixo NA (alta profundidade de campo).
Há tarefas, no entanto, para as quais a alta taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de mortalidade e/ou amostragem se torna uma vantagem crítica. as células α e δ apresentam heterogeneidade substancial, o que cria uma demanda por tamanhos amostrais elevados para revelar a contribuição das subpopulações. A imagem latente wide-field é rápida e mais sensível, com um sistema de grande escala industrial de grande imagem de imagem de centenas (GCaMP) ou dezenas (Fluo4) de ilhotas na mesma relação sinal-ruído que as experiências confocal em dez ou uma única ilhota, respectivamente. Esta diferença de perceção torna o sistema de campo largo vantajoso para a imagem de imagem populational com uma resolução unicelular, que pode ser especialmente crítica para pequenas subpopulações, como a célula-δ. Da mesma forma, as tentativas de reconstruir a atividade elétrica de Ca2 + spiking17 se beneficiaria matução da maior taxa de amostragem fornecida por um modo de imagem de campo largo. Ao mesmo tempo, vários problemas de "nicho", como a atividade das células α pancreáticas após a estimulação da subpopulação β-célula dominante, requerem o uso de um sistema confocal. Um fator que influencia a decisão em relação ao modo confocal é a presença de sinal contaminante substancial da subpopulação β-célula.
Embora o uso de coloração de anticorpos específicos para o hormônio para verificar a identidade das células após os experimentos de imagem ainda seja uma opção, subpopulações celulares menores podem ser identificadas usando compostos de marcadores funcionais, como adrenalina e grelina que foram mostrados para estimular seletivamente a dinâmica Ca2+ em α-18 e células-δ19,20, respectivamente.
A análise dos dados de imagem de lapso de tempo visa fornecer informações além da farmacologia trivial, como heterogeneidade populacional, correlação e interação de diferentes sinais. Convencionalmente, os dados de imagem são analisados como intensidade versus tempo e normalizados para a fluorescência inicial (F/F0). A correção de base é frequentemente necessária, devido ao branqueamento do sinal de floroffora ou contaminação por alterações na autofluorescência ou pH (normalmente induzidas por níveis milimolar de glicose12). Os dados ca2+ podem ser analisados de muitas maneiras diferentes, mas três tendências principais são medir mudanças na frequência de pico, na fração do platô ou na área a curva, computadas versus tempo. Nós encontramos a última aproximação vantajosa, especial na aplicação aos dados confocal pesadamente undersampled. A vantagem da métrica pAUC é a sua sensibilidade para ambas as alterações na frequência e amplitude do sinal, enquanto a computação da frequência requer um número substancial de oscilações21, o que é difícil de alcançar usando imagens convencionais. O fator limitante da análise pAUC é sua alta sensibilidade às mudanças de base.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram desenvolvidos de acordo com a Lei de Animais do Reino Unido (Procedimentos Científicos) (1986) e as diretrizes éticas da Universidade de Oxford.
1. Isolar ilhotas pancreáticas de camundongos
- Prepare o meio cultural e a solução de isolamento.
- Compõem o meio cultural: RMPI1640 (ver Tabela de Materiais),complementada com 10% do soro de vitela fetal, 100 unidades/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina. Dispense o meio em duas placas de Petri de plástico de 60 mm (não tratadas com qualquer adesivo), e mantenha os pratos na incubadora (37 °C, 5% CO2, umidade absoluta).
- Compõem a solução de isolamento (50 mL/mouse): Hanks' médio com 5 mm de glicose, 100 unidades/mL penicilina 100 μg/mL estreptomicina. Mantenha o gelo (4 °C).
- Compõem a solução enzimática (por exemplo, Liberase): 0,2 mg/mL na solução de isolamento, 2 mL por mouse. Mantenha o gelo (4 °C). Opcionalmente, pré-teste a atividade da liberase, e otimizar os parâmetros de incubação para cada lote da enzima22.
- Injete a solução enzimática no duto biliar do rato.
- Sacrifique o rato (fêmea idosa de 12 semanas, C57Bl/6J) através da deslocação cervical.
- um microscópio de dissecação, corte a pele e as camadas musculares usando tesourafina e localize o duto biliar.
- Ligate o intestino em ambos os lados da junção com o duto biliar, usando um fio de algodão.
- Levante o duto biliar suavemente com fórceps finos curvos do relojoeiro e introduza a solução de enzima sem gelo no duto usando uma seringa de 2 mL com uma agulha 30G. Uma inflação do pâncreas deve ser observada nesta fase.
- Colete o pâncreas inflado usando uma combinação de fórceps de nariz contundente e fórceps finos do relojoeiro em um tubo de falcão de 15 mL e mantê-lo no gelo (4 °C). Adicione 1 mL da solução enzimática no tubo.
- Liberte e colete as ilhotas pancreáticas do pâncreas.
- Incubar a pancreata inflada com a solução enzimática por 16 min em um banho de água, a 37 °C. Agitação suave pode ser usado, mas não é crítico, desde que a inflação tem sido bom.
- Pare a digestão por adição de solução de isolamento gelado, até 10 mL. Agite delicadamente o resumo: deve cair em partes pequenas.
- Lave o digerem três vezes em 10 mL da solução de isolamento, deixe ficar 5 min a 1 x g para sedimentar as ilhotas liberadas, no gelo. Ascute o supernatant delicadamente, com uma pipeta serológica de 10 mL.
- Adicione RPMI frio ao resumo (para fazer até 10 mL).
- Use placas de plástico Petri (passo 1.1.1) para escolher as ilhotas. Decantar o meio RMPI fora de uma das placas de Petri, e gentilmente despeje alguns (4-5 mL) do resumo em seu lugar. Recolher as ilhotas liberadas que aparecem como peças redondas, suaves e de alta densidade, com uma pipeta P10 na segunda placa de Petri.
- Cultura as ilhotas na incubadora (37 °C, 5% CO2, umidade absoluta). O experimento pode ser pausado nesta fase. Deixar as ilhotas por 1-2 horas é acreditado por alguns para ajudar a recuperar do estresse mecânico durante o isolamento.
2. Carregar o tinuino ou expressar o sensor
- Prepare o tinuoso trapista.
- Dissolva o alíquota (normalmente, 50 μg) do corantes trapacáveis (por exemplo, Fluo-4) no DMSO a uma concentração de estoque de 2 mM. Adicione o ácido plurônico a uma concentração final de 1% (usando um estoque de 20% no DMSO), para melhorar a solubilização do tintura.
- Aliquot o tinuoso em pequenos tubos PCR (2 μL em cada). O tinuoso pode ser armazenado congelado (-20 °C) por várias semanas.
- Alternativamente, prepare o sensor recombinante.
- Distribua o sensor (por exemplo, vetores adenovirais codificando GCaMP6f) em 10 μL alíquotas e guarde a -80 °C.
- (Opcionalmente) pré-teste o d't.t., infectando ilhotas (como abaixo) usando várias diluições em série, para revelar a concentração ideal para a infecção.
NOTA: Sensores recombinantes codificados por diferentes vetores (lentivírus, BacMam, AAV) exigem um protocolo de infecção diferente. Certifique-se de verificar isso com o provedor de vetores e otimizar a relação de trabalho para suas necessidades. O estoque "de trabalho" do adenovírus pode ser armazenado a -20 °C e congelado/descongelado várias vezes. Ciclo excessivo de congelamento-degelo reduz o titer eficaz do vírus.
- Prepare a solução de imagem.
- Compo a solução de imagem, mM: 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl2,1.2 MgCl2,1 NaH2PO4,5 NaHCO3,10 HEPES (pH 7.4, com NaOH).
- Compõem um estoque de glicose (0,5 M) e mannitol (0,5 M) na solução de imagem. O estoque pode ser armazenado na geladeira (4 °C) por várias semanas.
- Carregue o tinuoso trapista.
- Compõem a solução de trabalho de tinuoso dissolvendo 2 μL do tinuino em 600 μL da solução de imagem contendo 6 mm de glicose. A solução pode ser aquecida ou vórtice para melhorar a solubilização.
- Carregue as ilhotas isoladas na etapa 1 na solução de trabalho da tinuosidade. O carregamento pode ser feito usando uma placa multiwell ou uma placa de Petri. Neste último caso, coloque uma gota de 100 μL da solução de trabalho na parte inferior de uma placa de Petri não adesiva (35 - ou 60 mm) e pipette 10-30 ilhotas na gota.
- No caso de diferentes grupos de ilhotas (por exemplo, wild-type/knock-out), organizar vários poços e várias gotículas para que o carregamento pode ser feito simultaneamente.
- Incubar as ilhotas na solução de trabalho de tinuoso à temperatura ambiente na escuridão por 70-90 minutos. Não incubar demais.
- Verifique o carregamento o microscópio de fluorescência; as ilhotas devem ganhar fluorescência leve, com algumas células sendo mais brilhantes do que o resto. Arredondamento de células e localização nuclear do tinuismo são sinais de sobrecarga.
- Transfira as ilhotas para a solução de imagem sem tine contendo 6 mm de glicose. As ilhotas podem ser usadas para imagem imediatamente, mas opcionalmente o tinativo pode ser deixado para desisterificar por mais 10-15 minutos. As ilhotas manterão a tinativa por diversas horas e conseqüentemente podem ser usadas para a imagem latente em diversos deslocamentos.
- Alternativamente, infecte as ilhotas com o vetor recombinante.
- Placa as ilhotas em gotículas em RPMI culturing médio (passo 1.1.1) (por exemplo, 30 μL), para minimizar o volume de vetor necessário.
- Adicione o vetor em uma proporção de aproximadamente 105 unidades infecciosas/ilhota que deve idealmente conduzir ao multiplicity da infecção >2. Idealmente, a razão deve ser otimizada para a proporção mínima que forneceria expressão na camada periférica. Pré-titration (passo 2.2.3) pode ajudar.
- Introduzir 20-50 ilhotas na gotícula e cultura por 8-48 horas. (Idealmente, durante a noite). Ilhotas devem desenvolver uma fluorescência verde fraca na maioria das células, sem alterações na morfologia celular.
NOTA: O sucesso da infecção e expressão depende do tempo de exposição à solução do vírus. Idealmente, o vírus deve permanecer na solução durante a noite, mas pode ser removido opcionalmente após tão pouco quanto 15 minutos. No entanto, a infectividade e, portanto, a expressão, provavelmente serão dramaticamente menores.
3. Imagem Ca2+ dinâmica
- Imobilize as ilhotas o microscópio (invertido).
- Monte a câmara de imagem para microscopia invertida. Posicione o deslizamento de vidro (espessura 1 ou 1,5) dentro da câmara e certifique-se de que a interface de câmara de vidro é à prova d'água. Verifique se o deslizamento de cobertura está ao alcance do objetivo do microscópio (crítico para o caso de um objetivo volumoso de alta NA).
- Prepare os acessórios de imobilização. Corte pequenos retângulos (20 mm x 20 mm) da malha fina e da malha grossa. Introduza duas "paredes" espaçadorna na malha fina usando uma fita adesiva grossa de 45-50 μm. Use camadas duplas do espaçador se o tamanho das ilhotas a serem imagemdas exceder substancialmente os 100 μm convencionais.
- Mergulhe as malelas e o peso na solução de imagem usando uma placa de Petri de 35 mm. Certifique-se de que o plástico e o metal estão molhados.
- um microscópio de dissecação, vire a malha fina com o espaçador paredes de cabeça para baixo, os espaçadores voltados para cima. Escolha várias ilhotas carregadas com o tininho trapacável ou expressando o sensor recombinante com uma pipeta P20 e posicione-as suavemente em cima da malha fina, entre os dois espaçadores. Certifique-se de que a malha e as arlavaras não contenham quantidades excessivas da solução de imagem nelas.
- Pegue a malha com as ilhotas, usando fórceps do relojoeiro, e posicione-a de cabeça para baixo dentro da câmara de imagem, para que os espaçadores enfrentem para baixo e se sentar diretamente no coverslip da câmara. Certifique-se de que as ilhotas estão presas entre os espaçadores e a malha, no meio do deslizamento de capa.
- Posicione a malha grossa e o peso em cima da malha fina dentro da câmara. Introduza a solução de imagem na câmara. Certifique-se de que as ilhotas estejam imobilizadas e prontas para serem imagemdas. Evite agitação excessiva da câmara (pequenas perturbações como levar a câmara ao microscópio e inserir em um estágio aquecido são aceitáveis).
NOTA: Um arranjo similar da imobilização pode ser aplicado para um sistema ereto.
- Configure o microscópio.
- Escolha o modo de imagem e o objetivo, posicione a câmara com as ilhotas do passo 3.1 no estágio de temperatura controlada do microscópio.
- Defina o controle de temperatura (idealmente, entre 30 °C e 36 °C) e a perifusão. Para um sistema invertido, posicione a entrada mais baixa do que a saída dentro da câmara, e ajuste o fluxo de saída para ser maior do que aquele da entrada (que é conseguida tipicamente usando uma tubulação de um diâmetro interno mais largo em uma bomba peristaltic).
- Certifique-se de que a saída tenha uma superfície de contato mínima com a solução, para que ele remova a solução em várias gotículas seqüenciais pequenas, evitando longos intervalos de remoção contínua da solução. Este último é a principal fonte de artefato em imagens de lapso de tempo dos sinais periódicos, pois eles aparecem como oscilações periódicas regulares de intensidade de cada pixel com imagem e são frequentemente interpretados como "ondas lentas".
- Inicie a perifusão com a solução de imagem contendo glicose 3 mM.
- Escolha o caminho de luz e filtros para imagens dos fluorofos verdes; excitação entre 470 e 500 e emissão entre 505 e 550 iria trabalhar para cada um deles.
- Executar imagens ao vivo para configurar os parâmetros de imagem. Ajuste a visão para capturar as ilhotas de interesse.
- Otimizar a relação sinal/ruído da imagem. Para esse fim, ajuste a intensidade da luz de excitação, o tempo de exposição e o binning. Certifique-se de que as configurações permitam uma visualização distinta de cada célula dentro da ilhota com o mínimo possível de intensidade e exposição de luz.
- Realizar a aquisição de imagem. Dependendo da tarefa, as imagens podem ser tiradas de 0,1 a 5 Hz. Isso está bem abaixo dos critérios de Nyquist para as oscilações rápidas de Na+-driven em células α e δ (>300 Hz), o que significa que os dados são subamostrados por padrão. No entanto, aumentar a frequência de aquisição para corresponder a essa demanda não é viável em imagens multicelulares/multiiléias com um grande campo de visão. GCaMP pode ser imagemmais rápido, enquanto Fluo4 será inevitável lixívia em condições de aquisição rápida.
NOTA: Dado que as oscilaçõesde cyt [Ca2+]nas células ilhotas são impulsionadas pela atividade elétrica, o uso de baixas taxas de aquisição pode parecer contraproducente. Na realidade, no entanto, as taxas de aquisição em torno ou superior a 1 Hz podem ser suficientes para resolver o comportamento de aumento de células β13,enquanto o limiar para a detecção de oscilações impulsionadas por canais de sódio nas células α e δ está bem acima de 300 Hz. Se as oscilaçõesde cyt α- ou δ-cell [Ca2+]são adquiridas a 1 Hz ou 0,1 Hz, elas serão severamente subamostradas e refletirão o manuseio Ca2+ pela célula em vez da atividade elétrica.- Verifique a qualidade dos dados adquiridos: a 3 m de glicose, a atividade α-célula deve ser claramente visível/detectável. Certifique-se de que este é o caso e proceder a imagens em grande escala time-lapse.
- Escolha o modo de imagem e o objetivo, posicione a câmara com as ilhotas do passo 3.1 no estágio de temperatura controlada do microscópio.
- Imagens de lapso de tempo
- Faça uso de um gráfico on-line da dinâmica do sinal, implementado no software de aquisição, se isso estiver disponível. Se o gráfico on-line não for uma opção, aplique uma mesa de aparência que visualie a intensidade do sinal da maneira mais abrangente (como o "arco-íris").
- Aplique os estímulos de forma reversível: registre a recuperação do sinal no nível basal. Ignore os artefatos no início e no final da gravação; este último pode parecer um "aumento" irreversível/"diminuição" da fluorescência da sonda devido a alterações no pH ou na morte celular.
- Diferenciar as α-células por dinâmica oscilatória de Ca2+, com baixa glicose. Introduzir adrenalina ou glutamato na solução de banho, reversivelmente para 2-5 min. Um salto rápido em [Ca2 +]cyt seguido por uma desaceleração ou cancelamento das oscilações seguirá.
NOTA: A adrenalina é um composto marcador reconhecido para as células α, que tem um efeito positivo seletivo sobre essa subpopulação de células ilhotas, mediada pela liberação de Ca2+ de depósitos intracelulares18. Glutamato foi apresentado como outro agonista específico da célula α23. - Adicionar / remover grelina, que foi recentemente relatado para ativar δ-célula seletivamente19,20. Observe um rápido aumento reversível em [Ca2 +]cyt em uma pequena subpopulação de células ilhotas.
- Adicionar/remover 20 m de glicose. Observe uma resposta oscilatória coordenada na subpopulação β-célula. Observe a resposta das células que foram ativadas anteriormente pela adrenalina ou glutamato e grelina.
- Salve a sequência da imagem. Considere usar "AutoSave" durante a gravação.
4. Analisando os dados
- Analise a imagem de lapso de tempo.
- Importe a imagem de lapso de tempo em um software de análise de imagem, como um ImageJ/FIJI de código aberto.
- Se o movimento substancial/rápido ocorreu durante a gravação, descarte os dados como inreparáveis. Use plugins StackReg ou TurboReg24 para corrigir pequenas derivas.
- Crie uma imagem de máscara para detecção celular e mapeamento da região de interesse (ROI). A maneira preferida de conseguir isso seria fazer uma imagem de pilha usando uma das funções como "intensidade média" ou "intensidade máxima". A função a ser usada é essa que fornecerá o melhor reconhecimento de pilhas individuais.
- Limite a imagem da máscara, remova todos os dados fora da região da ilhota. A função funciona no modo automático para imagens de 32 bits.
- Detecte máxima na imagem do limiar. A maxima pode ser representada por pontos, regiões ou mesmo setores, se a imagem for densa.
- Aplique a função 'encontrar maxima' sem restrições de tamanho e colar a maxima detectada na região de interesse (ROI) editor.
- Smooth/interpolar cada um dos ROIs mapeados; possivelmente, os ROIs exigirão expansão. Um script simples pode ser escrito para (4.1.6-4.1.8) e executado várias vezes para fornecer os melhores resultados de detecção de células. Vários ROIs podem se sobrepor, mas isso é raro.
- Analise a posição dos ROIs e pubure os respectivos dados X e Y no software de tabela eletrônica (por exemplo, Microsoft Excel).
- Analise a intensidade cinza versus tempo para todos os ROIs e colar os dados no software de tabela eletrônica.
- Analise os dados numéricos.
- Importe os dados para o software de análise de dados. Dependendo da escolha do software e da duração/amostragem/tamanho do experimento, esta pode ser uma operação simples de copiar pasta ou um procedimento autônomo. Certifique-se do arranjo e armazenamento dos dados numéricos.
- Importe os carimbos de tempo ou as notas de tempo, se disponível.
- Normalize os dados brutos de intensidade da fluorescência ("F") com o valor inicial da fluorescência ("F0"). Isso não precisa ser a fluorescência no primeiro ponto, mas pode ser a média de vários primeiros pontos. A normalização deve reduzir a variabilidade dos dados e, em um caso ideal (sem deriva de base) resultar em um conjunto de dados analyzable ("F / F0").
- Se a variabilidade celular-a-célula do conjunto de dados F/F0 ainda for substancial (gravação longa, branqueamento), realize a correção de base. Para esse fim, definir uma região de "controle", ou seja, o intervalo de tempo durante o qual a solução de controle (para ilhotas pancreáticas do rato, 3 mm de glicose sem agonistas / antagonistas) foi aplicada.
- Se a região de controle tiver um sinal claro não oscilante, assuma que o F/F0 estava retornando ao valor inicial (F/F0=1) após cada aplicação da solução de controle. Corrija os dados de lapso de tempo para cada célula dividindo os dados em segmentos, separados pelos pontos quando a solução de controle foi adicionada e aplicando correção linear a cada segmento. Não use correção polinomial ou outra não linear, pois isso resulta em artefatos.
- Se a faixa de controle tiver oscilações claras ou fatores adicionais (como a autofluorescência fad) estiverem presentes, use um algoritmo de detecção de picos17. Um encontro trivial e rápido para isso é uma transformação de ondas sensíveis à máxima (Figura 3A).
- Quantifique os dados. Embora o Ca2+ seja um sinal altamente dinâmico, apresentar os dados Ca2+ em termos de valores absolutos de F/F0 é amplamente aceitável na literatura biomédica. Se os resultados de vários experimentos precisarem ser comparados, escolha uma métrica.
- Medir a frequência de picos Ca2 + (Figura 4A,D),e sua resposta à adição de (formiga) agonistas. Para esse fim, divida a gravação em intervalos de tempo iguais e compute o prazo da frequência parcial (frequência de picos em cada um dos intervalos) contando picos dentro do intervalo e normalizando a duração do intervalo.
- Alternativamente, definir o limiar e calcular a fração platô (pf) para cada um dos intervalos definidos acima (Figura 4B,F). A fração indica a porcentagem de tempo dentro do intervalo que a célula passou no estado "animado".
- Alternativamente, compute a área parcial a curva (pAUC) para cada um dos intervalos definidos acima (Figura 4C,G). Esta métrica é sensível a alterações na frequência e amplitude de picos.
NOTA: Uma ressalva para medir a frequência é a sua falta de sensibilidade para a duração do pico e baixa estabilidade. Como os dados são fortemente subestimados contra o aumento elétrico, o número de picos por intervalo é bastante pequeno e, portanto, um único pico extra pode afetar drasticamente o resultado. O "gargalo" da pAUC é a sua sensibilidade às mudanças na linha de base. Embora menos propenso a artefatos e mais sensível a mudanças em [Ca2 +]cyt do que a freqüência, pAUC, no entanto, não é muito informativo sobre a natureza da dinâmica Ca2 +. A fração do platô é uma expansão do conceito aberto da probabilidade ao sistema da inteiro-pilha. É menos robusto do que pAUC, porém, devido à sua dependência do valor limiar.
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Representative Results
Ilhotas carregar bastante bem com os corantes trappable(Figura 1A), a menos que a composição lipídica da membrana tenha sido afetada (por exemplo, pela exposição crônica a ácidos graxos). O vetor humano do tipo 5 do adenovirus (Ad5) igualmente alveja todas as pilhas da ilhota(figura 1B). Problemas podem surgir quando mais de um sensor recombinante está sendo expresso na mesma célula. Além disso, as ilhotas são tipicamente muito bem imobilizadas usando a tecnologia descrita acima, que proporciona estabilidade excepcional e acesso à solução.
Ca2 + spiking em α-células podem ser facilmente detectados em níveis baixos de glicose ( Figura2). Há uma alta correlação célula por célula entre a atividade em baixa glicose e a resposta à adrenalina e glutamato. A grelina ativa algumas células responsivas à adrenalina (α-células?) com baixa glicose, mas não tem efeito sobre a dinâmica Ca2+ na maioria das células que são ativadas por baixa glicose (células β).
Quando analisadas em termos de frequência parcial (Figura 4A,C),células estimuladas por adrenalina ou grelina apresentam um aumento substancial as condições de tudo ou nada. Ou seja, uma célula com baixa atividade basal que é ativada pela adrenalina ou grelina exibe um aumento dramático nesta métrica. No entanto, as mudanças globais entre o aumento do basal e o efeito da adrenalina são muito sutis(Figura 4A,C). Em contraste, a AUC parcial é sensível às mudanças introduzidas pela adrenalina em todas as células, mesmo quando a atividade basal é alta(Figura 4B,D).
Figura 1: Carregamento da tintendência trappable e expressão do sensor recombinante nas ilhotas. Ilhotas típicas do rato carregadas com o corante trapaceiro Fluo-4(A)ou expressando o sensor recombinante GCaMP6 na camada periférica das células (B)ou na camada mais profunda (C). O traçador polar sulforhodamine B (SRB, mostrado como branco) foi utilizado para esboçar pilhas individuais dentro de cada ilhota25. (D)Cinética representativa de Ca2+ em resposta à glicose registrada a partir de células individuais dentro da ilhota usando Fluo4. Observe a heterogeneidade dentro das populações celulares menores. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Resposta típica de Ca2+ de pilhas da ilhota a vários estímulos. Típica α-célula (A)e δ-célula (B) Ca2 + dinâmica, em resposta à adrenalina, glutamato, grelina, glicose. (C)-(D)Mapas de calor da resposta das células ilhotas mostrando adrenalina positiva (C) e grelina positiva (D)subpopulações. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Correção de linha de base. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Análise dos dados de lapso de tempo. Análise da dinâmica Ca2+ em α-células. Frequência parcial (A),fração de platô (B)e área a curva(C)de um α-células [Ca2 +]i traço. Populational [Ca2+]i dados de uma ilhota pancreática de camundongoexpressa como crua (F/F0)(D), frequência parcial (E),fração de platô (F) e área a curva(G). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Há três etapas no protocolo que são críticas para o sucesso global. A injeção bem sucedida da enzima Liberase no duto biliar determina não apenas o sucesso quantitativo do procedimento de isolamento, mas também afeta a qualidade das ilhotas isoladas. Pancreata não inflado pode resultar em falta de algumas respostas metabólicas importantes nas ilhotas isoladas. Em segundo lugar, o carregamento do tintendência/a expressão do sensor define a relação sinal/ruído da gravação de lapso de tempo. Os sinais estão ausentes ou atenuados em ilhotas sobrecarregadas. Por último, o posicionamento bem sucedido e denso do tecido dentro da câmara de imagem é um momento decisivo para experimentos significativos e analyzable. Tecido mal posicionado ou em movimento resulta em tempo experimental desperdiçado e/ou dados pouco claros.
O método pode ser modificado para dar conta de vários sinais (usando o sistema confocal) e vários grupos de ilhotas (por exemplo, de diferentes genótipos). Imagens de múltiplos sinais assumem a entrega de um segundo sensor em cada célula da ilhota, espectrally compatível com o repórter Ca2 + (como um sensor de pH SNARF5f26,27). Para esse fim, as ilhotas podem ser co-carregadas/co-infectadas com sensores Ca2+ e pH, que são então sequencialmente imageados dentro de cada período de tempo.
A imagem do sinal em grupos de ilhotas com resolução unicelular requer o uso de um amplo objetivo de campo de visão. É provável que o objetivo tenha menor ampliação e abertura numérica (NA), reduzindo assim a resolução espacial. Devido ao aumento da profundidade de foco do objetivo de baixo NA, a imagem pode ser realizada em um sistema de campo largo. As desvantagens deste arranjo são a contaminação cruzada célula-célula do sinal de luz e a capacidade reduzida de imagem do sinal 3D (por exemplo, camundongos expressando o sensor Ca2+ os promotores de insulina). Ao mesmo tempo, o sinal expresso das células ilhotas de superfície pode ser perfeitamente resolvido com alta resolução temporal de grupos, incluindo dezenas a centenas de ilhotas18.
Embora possa parecer desagradável, mas a análise de imagem e análise de dados numéricos em pacotes de software separados é uma boa idéia. No momento atual, ImageJ / FIJI domina a análise de imagem científica. Os ambientes mais populares para codificação científica são Python e Matlab, mas também há esforços conhecidos para analisar os dados Ca2 + em R28. A melhor usabilidade é fornecida por mais pacotes de nicho como o IgorPro. Nossa escolha é protótipo em Matlab / Python e, em seguida, implementar o código em IgorPro para uso 'pipeline'. Adaptar pacotes de análise de sinal para eletrofisiologia (por exemplo, Clampfit, Neuroexplorer) para necessidades analíticas pode ser útil para imagens unicelulares, mas é difícil de aumentar. Muitas opções fornecidas por tais pacotes não são aplicáveis para a imagem da ilhota por causa da baixa taxa de amostragem.
É importante lembrar que essa metodologia é limitada por uma série de fatores. Em primeiro lugar, como mencionado acima, a imagem é em grande parte baseada na subamostragem dos dados, o que significa que não indica e, portanto, não pode ser diretamente comparada à atividade elétrica da célula. Em segundo lugar, os dados provêm da periferia das ilhotas e não refletem importantes processos de acoplamento que são, de um modo geral, tridimensionais. Em terceiro lugar, o nível de carga/expressão afeta a percepção da intensidade do sensor. Por fim, a ativação de subpopulações de células ilhotas menos bem pesquisadas (por exemplo, células PP e células ε) pelos compostos marcador não pode ser descartada, embora devido ao baixo número dessas células dentro da ilhota, qualquer contaminação potencial seja mínima.
O método é um verdadeiro "campeão" em termos de efeito visual, como os processos oscilatórios entregar uma forte impressão de um tecido genuinamente vivo. Aplicado a subpopulações celulares menores, o método sonda a função de cada um de forma confiável, permitindo a identificação de subgrupos e refletindo a heterogeneidade.
A dinâmica do cálcio tem sido estudada em ilhotas pancreáticas β-células há mais de 40 anos, impulsionado principalmente pelo progresso na tecnologia de aquisição / detecção. Os primeiros estudos utilizaram espectroscopia de absorção atômica29,mas não foi até a chegada dos sensores Ca2+ fluorescentes30 que a cinética detalhada poderia ser resolvida em células ilhotas individuais, usando fotometria31,32,33. Logo depois disso, o componente espacial da cinética Ca2 + foi melhorado como Ca2 + imagem34,35,36 tornou-se uma tecnologia de rotina, graças ao então recém-disponível dispositivo acoplado à carga (CCD) detectores. O problema da luz fora de foco, que dificultou a imagem do sinal de células individuais dentro do tecido, foi então resolvido em meados da década de 1990 através de microscopia confocal de varredura a laser (LSCM)37 e microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM)38. Ambos os métodos, complementados pela chegada de uma nova geração de sensores ca2+ fluorescentes excitáveis com um laser de 488 nm, têm sido usados com sucesso para imagem Ca2+ dinâmica nas subpopulações de células ilhotas39,40,41.
O novo século apresentou duas novas tendências decorrentes de desenvolvimentos tecnológicos relacionados à neurociência. Em primeiro lugar, sensores fluorescentes recombinantes baseados na permutação circular das variantes GFP aumentaram substancialmente a relação sinal/ruído para detecção de Ca2+, efetivamente trazendo os estudos para o nível de populações de células grandes, em que a dinâmica dacíciem [Ca2+]em cada célula poderia ser resolvida. Em segundo lugar, o uso de promotores específicos de tecidopermitiu a segmentação da expressão do sensor para subpopulações menores.
Embora geralmente pensado para refletir os desenvolvimentos na neurociência, estudos sobre a ilhota Ca2 + dinâmica têm duas diferenças fundamentais. Em primeiro lugar, tecnologicamente, qualquer imagem in vivo de sinalização de ilhotas é mais complexa do que a imagem no cérebro devido à anatomia imprevisível do pâncreas e à localização42das ilhotas. Em segundo lugar, excelente acoplamento elétrico entre as ilhotas β-células essencialmente torna ilhotas em populações eletricamente inertes exibindo uma resposta aparentemente perfeita de tudo ou nada para o estímulo de glicose alta. Acreditamos que estudos de [Ca2+i cinética em subpopulações de ilhotas menores, como células-δ, com base em segmentação específica de tecidos provavelmente ampliarão nosso conhecimento de sua farmacologia/fisiologia. Ao mesmo tempo, sondas altamente sensíveis permitem expandir o poder estatístico de tais medições, contabilizando a variabilidade de ilhotas para ilhotas e permitindo imagens de ilhotas de diferentes grupos dentro de um experimento paralelo.
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Disclosures
Os Autores declaram que não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
AH foi um destinatário de um Diabetes UK PhD Studentship, EV foi apoiado pelo OXION-Wellcome Trust Training Programme, AIT realizou uma Bolsa de Pós-doutorado oxford Biomedical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | Thermo Fisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
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