Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la toma de imágenes y la cuantificación de la dinámica de calcio en poblaciones de células heterogéneas, como las células de los islotes pancreáticos. Los reporteros fluorescentes se entregan en la capa periférica de las células dentro del islotes, que luego se inmoviliza e imagen, y se realiza un análisis por célula de la dinámica de la intensidad de la fluorescencia.
Abstract
Las hormonas de los islotes pancreáticos regulan la homeostasis de glucosa en sangre. Los cambios en la glucosa en la sangre inducen oscilaciones de calcio citosólico en las células de los islotes pancreáticos que desencadenan la secreción de tres hormonas principales: insulina (de las células de la sangre), glucagón (células) y somatostatina (células). Las células, que conforman la mayoría de las células de los isletes y están conectadas eléctricamente entre sí, responden al estímulo de la glucosa como una sola entidad. La excitabilidad de las subpoblaciones menores, las células y las células (que sube alrededor del 20% (30%) y 4% (10%) del total de números de celda de islote de roedores1 (humano2),respectivamente) es menos predecible y, por lo tanto, es de especial interés.
Los sensores de calcio se envían a la capa periférica de células dentro del islo aislado. El islotes o un grupo de islotes se inmoviliza e imagen mediante un microscopio de fluorescencia. La elección del modo de imagen es entre un mayor rendimiento (campo ancho) y una mejor resolución espacial (confocal). Convencionalmente, la microscopía confocal de escaneo láser se utiliza para la toma de imágenes del tejido, ya que proporciona la mejor separación de la señal entre las células vecinas. También se puede utilizar un sistema de campo ancho si se minimiza la señal contaminante de la población dominante de las células de la célula.
Una vez que se han registrado la dinámica de calcio en respuesta a estímulos específicos, los datos se expresan en forma numérica como intensidad de fluorescencia frente al tiempo, normalizada a la fluorescencia inicial y corregida en línea, para eliminar los efectos relacionados con el blanqueo del blanqueo Fluoróforo. Los cambios en la frecuencia de pico o el área parcial debajo de la curva (pAUC) se calculan frente al tiempo, para cuantificar los efectos observados. pAUC es más sensible y bastante robusto, mientras que la frecuencia de pico proporciona más información sobre el mecanismo de aumento de calcio.
Las subpoblaciones celulares menores se pueden identificar utilizando respuestas funcionales a compuestos marcadores, como la adrenalina y la ghrelina, que inducen cambios en el calcio citosólico en poblaciones específicas de células de isla.
Introduction
El propósito del método es imaginar cambios en tiempo real en la concentración de calcio citosólico ([Ca2+]cyt) en subpoblaciones menores de células de islotes pancreáticos. Esto permite descubrir los mecanismos que rigen la secreción hormonal en estas células, revelando detalles sobre la conversación cruzada entre diferentes tipos de células y, potencialmente, introduciendo una dimensión poblacional en el panorama más amplio de la señalización de islos.
Los islotes constan de varios tipos de celda. Además de las células más conocidas que segregan insulina, hay al menos dos subpoblaciones que también son críticas en la regulación de la glucosa en sangre3. Las células (que componen alrededor del 17% de las células de los islos) secretan el glucagón cuando la glucosa en sangre se vuelve demasiado baja, lo que indica la liberación de glucosa en el torrente sanguíneo desde los depósitos en el hígado. Los niveles excesivos de glucagón (hiperglucagonemia) y el control deteriorado de la liberación de glucagón acompañan (y, técnicamente, pueden contribuir a) la condición prediabética de la sensibilidad a la insulina deteriorada4. •Células (alrededor del 2%) secretar somatostatina en respuesta a la elevación de la glucosa. Es probable que esta hormona peptídica ubicua esté presente a altas concentraciones en las proximidades de las células de los islotes, que tiene un fuerte efecto atenuante mediado por el receptor Gi tanto en el glucagón como en la secreción de insulina.
Las células y las células comparten una gran parte de la maquinaria de la sensación de glucosa con sus parientes cercanos del linaje, las células. Los tres tipos de células están equipadas con canales K+ sensibles a ATP, sensores metabólicos elaborados5 que controlan el potencial de membrana plasmática de estas células excitables. Al mismo tiempo, la secreción de insulina, somatostatina y glucagón está regulada de manera diferente por glucosa. Por lo tanto, la toma de imágenes de la dinámica de Ca2+ en las dos subpoblaciones menores de las células de los isletes puede proporcionar una visión de la conversación cruzada entre la glucosa en sangre y la salida del secretor de los islos.
Los primeros intentos de monitorear la excitabilidad de las células de las células de los términos y células mediante la electrofisiología de la abrazadera de parche pronto fueron seguidos por imágenes de Ca2+ en células únicas y células. La identidad de las células en estos experimentos se verificó a través de la tinción a posteriori con anticuerpos antiglucagón o anti-somatostatina. Estos esfuerzos con frecuencia se vieron obstaculizados por el hallazgo de que las células del isla se comportan de manera muy diferente dentro del isla y como células individuales. A pesar de que las células de la célula pueden parecer los principales benefactores de la disposición de los islos (debido a su abrumadora mayoría que subyace a su fuerte acoplamiento eléctrico), la principal discrepancia se encontró, sorprendentemente, en las células. Dentro del islet intacto, estas células se activan constantemente y persistentemente a baja glucosa, lo que sólo es cierto para alrededor del 7% de las células dispersas individuales6. Por lo tanto, se cree que informar de la actividad de las células de los islotes intactos representa una aproximación más cercana de las condiciones in vivo.
En general, hay dos maneras de informar la dinámica de Ca2+ específicamente a partir de las subpoblaciones de células o células: (i) expresar un sensor Ca2+ codificado genéticamente a través de un promotor específico del tejido o (ii) utilizando compuestos marcadores. El enfoque anterior más elegante añade la ventaja sustancial de la verdadera imagen 3D y, por lo tanto, el estudio de la distribución celular dentro del iselo. Sin embargo, no se puede aplicar para el material de islet humano intacto. Otra preocupación potencial es la "fuga" del promotor, especialmente cuando la transdiferenciación de las células o la respuesta de las células a la glucosa alta están en su lugar. Este último enfoque se puede utilizar con tejido recién aislado, incluyendo muestras humanas o islotes cultivados. Los datos, sin embargo, se recopilan únicamente de la capa periférica de las células del islet, ya que entregar la molécula de tinte/marcador en capas más profundas sin alterar la arquitectura del islet es un reto. Una ventaja inesperada de este último enfoque es la compatibilidad con el modo de imagen de campo ancho, que permite escalar verticalmente los experimentos a imágenes simultáneas de decenas o cientos de islotes (es decir, miles a decenas de miles de células).
El calcio se imágena in vivo utilizando sensores de familia GCaMP7 (o pericam8)codificados genéticamente, que son variantes de proteína fluorescente verde permutada circularmente (GFP) fusionadas a la proteína de unión al calcio calmodulin y su secuencia diana, fragmento M13 de la quinasa de cadena ligera de miosina7,9. Los GCAMP tienen excelentes relaciones señal-ruido en el rango de concentraciones nanomolares Ca2+ y una alta sección transversal de 2 fotónes, lo que los convierte en una opción ideal para el trabajo in vivo10,11. El aspecto desafiante del uso de sensores recombinantes es su entrega en las células. La expresión hetróloga requiere el uso de un vector viral y un cultivo ex vivo de varias horas, lo que con frecuencia plantea preocupaciones con respecto a la posible desdiferenciación o deterioro de las funciones celulares. Aunque los modelos de ratón pre-diseñados para expresar GCaMP abordan este problema, añaden nuevos desafíos aumentando el tiempo de entrega sustancialmente y limitando el trabajo a un modelo no humano. La sensibilidad muy alta a los cambios del pH intracelular es otro lado adverso de los sensores basados en proteínas12, que es, sin embargo, menos un problema para detectar señales oscilatorias, como Ca2+.
La ventaja de los colorantes trapables (como el fluorescente verde Fluo4) es que se pueden cargar en tejido recién aislado en aproximadamente una hora. Predeciblemente, los colorantes trapense tienen relaciones señal-ruido más bajas y (mucho) menor eslorabilidad que sus contrapartes recombinantes. No podemos confirmar13 los informes de toxicidad de los tintes intercambiables14, sin embargo, la sobrecarga de tinte es un problema frecuente.
Los sensores Rojos Recombinantes Ca2+ basados en la permutación circular han estado evolucionando rápidamente desde 201115,y los desarrollos más recientes presentan una fuerte competencia a GCaMPs16 para la toma de imágenes de tejido, dada una mayor profundidad de penetración de la luz roja. Los colorantes intercambiables rojos disponibles en el comercial se pueden utilizar de forma fiable para imágenes de una sola célula, pero, a nivel de tejido, no pueden competir bien con los análogos verdes.
Aparentemente hay muy poca elección de tecnología de imagen para experimentos en tejidos donde la luz desenfocada se convierte en un problema crítico. El sistema confocal proporciona una resolución de una sola célula aceptable mediante la cancelación de la luz fuera de foco con cualquier objetivo en el NA por encima de 0.3 (para el caso de GCaMP6) o 0.8 (tinte intercambiable). En un sentido técnico, un microscopio confocal convencional se puede utilizar para la toma simultánea de imágenes de [Ca2+]cyt de cientos (GCaMP) o decenas de islotes (tinte intercambiable). La única alternativa realista al modo confocal en caso de expresión 3D del sensor en tejido es tal vez microscopía de hoja de luz.
Las cosas son ligeramente diferentes para el caso cuando el sensor se expresa en la capa periférica de las células dentro del tejido del islet. Para sensores recombinantes brillantes que tienen un patrón de expresión intracelular vívido, el uso de un modo de imagen de campo ancho con un objetivo de bajo NA puede proporcionar suficiente calidad y recompensar al investigador con un aumento sustancial en el área de campo de visión y por lo tanto el Rendimiento. Un sistema de campo ancho proporciona una resolución espacial más pobre, ya que la luz desenfocada no se cancela; por lo tanto, el tejido de imágenes con objetivos de alta NA (baja profundidad de campo) es menos informativo, ya que la señal de una sola célula está muy contaminada por las células vecinas. La contaminación es mucho menor para los objetivos de baja NA (alta profundidad de campo).
Sin embargo, hay tareas para las que el alto rendimiento y/o la frecuencia de muestreo se convierten en una ventaja crítica. Las células y células de la clase presentan una heterogeneidad sustancial, lo que crea una demanda de tamaños de muestra altos para revelar la contribución de las subpoblaciones. Las imágenes de campo ancho son rápidas y más sensibles, con un sistema de campo de campo de visión grande a escala industrial cientos (GCaMP) o decenas (Fluo4) de islotes con la misma relación señal-ruido que los experimentos confocales en diez o un solo islotes, respectivamente. Esta diferencia en el rendimiento hace que el sistema de campo ancho sea ventajoso para la creación de imágenes poblacionales con una resolución de una sola célula, lo que puede ser especialmente crítico para subpoblaciones pequeñas, como la de la célula. Del mismo modo, los intentos de reconstruir la actividad eléctrica a partir de Ca2+ spiking17 se beneficiarían de la mayor frecuencia de muestreo proporcionada por un modo de imagen de campo ancho. Al mismo tiempo, varios problemas de "nicho", como la actividad de las células pancreáticas, tras la estimulación de la subpoblación de células dominantes, requieren el uso de un sistema confocal. Un factor que influye en la decisión hacia el modo confocal es la presencia de una señal contaminante sustancial de la subpoblación de células.
Aunque el uso de la tinción de anticuerpos específicos hormonales para verificar la identidad de las células después de los experimentos de imagen sigue siendo una opción, las subpoblaciones de células menores se pueden identificar utilizando compuestos marcadores funcionales, como la adrenalina y la ghrelina que se demostró para estimular selectivamente la dinámica de Ca2+ en las células19, 20,respectivamente.
El análisis de los datos de imágenes de lapso de tiempo tiene como objetivo proporcionar información más allá de la farmacología trivial, como la heterogeneidad poblacional, la correlación y la interacción de diferentes señales. Convencionalmente, los datos de imagen se analizan como intensidad frente al tiempo y se normalizan a la fluorescencia inicial (F/F0). Con frecuencia se necesita una corrección basal, debido al blanqueo de la señal de fluoróforo o contaminación por cambios en la autofluorescencia o el pH (típicamente inducido por los niveles milimolares de glucosa12). Los datos de Ca2+ se pueden analizar de muchas maneras diferentes, pero tres tendencias principales son medir los cambios en la frecuencia del pico, la fracción de la meseta o el área debajo de la curva, calculado frente al tiempo. Encontramos este último enfoque ventajoso, especialmente en aplicación a datos confocales muy submuestreados. La ventaja de la métrica pAUC es su sensibilidad tanto a los cambios en la frecuencia y amplitud de la señal, mientras que calcular la frecuencia requiere un número sustancial de oscilaciones21,que es difícil de lograr utilizando imágenes convencionales. El factor limitante del análisis pAUC es su alta sensibilidad a los cambios de línea de base.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los métodos descritos aquí fueron desarrollados de acuerdo con la Ley de Animales del Reino Unido (Procedimientos Científicos) (1986) y las directrices éticas de la Universidad de Oxford.
1. Aislar los islotes pancreáticos del ratón
- Prepare el medio de cultivo y la solución de aislamiento.
- Componer el medio de cultivo: RMPI1640 (ver Tabla de Materiales),complementado con 10% de suero de ternera fetal, 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina. Dispensar el medio en dos platos de plástico Petri de 60 mm (no tratados con ningún adhesivo), y mantener los platos en la incubadora (37 oC, 5% CO2,humedad absoluta).
- Conforman la solución de aislamiento (50 ml/ratón): Medio de Hanks con glucosa de 5 mM, 100 unidades/ml de penicilina 100 g/ml de estreptomicina. Mantener en hielo (4oC).
- Componer la solución enzimática (p. ej., Liberase): 0,2 mg/ml en la solución de aislamiento, 2 ml por ratón. Mantener en hielo (4oC). Opcionalmente, pre-probar la actividad de liberación, y optimizar los parámetros de incubación para cada lote de la enzima22.
- Inyecte la solución enzimática en el conducto biliar del ratón.
- Sacrificar el ratón (hembra de 12 semanas, C57Bl/6J) por luxación cervical.
- Bajo un microscopio de disección, abre las capas de piel y músculo usando tijeras finas y localiza el conducto biliar.
- Ligar el intestino en ambos lados de la unión con el conducto biliar, utilizando un hilo de algodón.
- Levante el conducto biliar suavemente con fórceps finos curvos e introduzca la solución enzimática de hielo frío en el conducto utilizando una jeringa de 2 ml con una aguja de 30 G. En esta etapa debe observarse una inflación del páncreas.
- Recoger el páncreas inflado utilizando una combinación de fórceps del pulgar de nariz contundente y fórceps de relojero fino en un tubo de halcón de 15 ml y mantenerlo en hielo (4 oC). Añadir 1 ml de la solución enzimática en el tubo.
- Libera y recoge los islotes pancreáticos del páncreas.
- Incubar la páncreata inflada con la solución enzimática durante 16 minutos en un baño de agua, a 37oC. Se puede utilizar un temblor suave, pero no es crítico, siempre que la inflación haya sido buena.
- Detener la digestión mediante la adición de solución de aislamiento en frío, hasta 10 ml. Agitar suavemente la digerida: debe caer en trozos pequeños.
- Lavar la digerida tres veces en 10 ml de la solución de aislamiento, dejar reposar 5 minutos a 1 x g para sedimentar los islotes liberados, sobre hielo. Aspirar el sobrenadante suavemente, con una pipeta serológica de 10 ml.
- Añadir RPMI frío a la digerida (para hacer hasta 10 ml).
- Utilice platos de plástico de Petri (paso 1.1.1) para recoger los islotes. Decantar el medio RMPI de uno de los platos Petri, y verter suavemente algunos (4-5 ml) de la digestión en su lugar. Recoge los islotes liberados que aparecen como piezas redondas, lisas y de alta densidad, con una pipeta P10 en la segunda placa Petri.
- Cultivo de los islotes en la incubadora (37oC, 5% CO2,humedad absoluta). El experimento se puede pausar en esta etapa. Dejar los islotes durante 1-2 horas se cree por algunos para ayudar a recuperarse de la tensión mecánica durante el aislamiento.
2. Cargue el tinte o exprese el sensor
- Prepara el tinte trapable.
- Disolver la alícuota (normalmente, 50 g) del tinte trapable (por ejemplo, Fluo-4) en DMSO a una concentración de stock de 2 mM. Añadir ácido plurónico a una concentración final del 1% (usando un 20% en DMSO), para mejorar la solubilización del tinte.
- Alícuota el tinte en pequeños tubos de PCR (2 l en cada uno). El tinte se puede almacenar congelado (-20 oC) durante varias semanas.
- Alternativamente, prepare el sensor recombinante.
- Distribuya el sensor (p. ej., codificación vectorial adenoviral GCaMP6f) en alícuotas de 10 ol y guárdelo a -80 oC.
- (Opcionalmente) pruebe previamente el diezmo de la población viral infectando islotes (como abajo) utilizando varias diluciones en serie, para revelar la concentración óptima para la infección.
NOTA: Los sensores recombinantes codificados por diferentes vectores (lentivirus, BacMam, AAV) requieren un protocolo de infección diferente. Asegúrese de comprobar esto con el proveedor de vectores y optimizar la relación de trabajo para sus necesidades. El stock "de trabajo" del adenovirus se puede almacenar a -20 oC y congelarse/descongelarse varias veces. El ciclo excesivo de congelación de descongelación reduce el titer efectivo del virus.
- Prepare la solución de diagnóstico por imágenes.
- Maquillaje de la solución de imagen, mM: 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl2, 1.2 MgCl2, 1 NaH2PO4, 5 NaHCO3, 10 HEPES (pH 7.4, con NaOH).
- Componer un stock de glucosa (0,5 M) y manitol (0,5 M) en la solución de imágenes. El stock se puede almacenar en la nevera (4 oC) durante varias semanas.
- Cargue el tinte trapense.
- Conforman la solución de trabajo con tinte disolviendo 2 ml del tinte en 600 ml de la solución de imagen que contiene glucosa de 6 mM. La solución se puede calentar o vórtice para mejorar la solubilización.
- Cargue los islotes aislados en el paso 1 en la solución de trabajo del tinte. La carga se puede hacer usando un plato multipocillo o un plato Petri. En este último caso, coloque una gota de 100 l de la solución de trabajo en la parte inferior de una placa Petri no adhesiva (35 o 60 mm) y pipeta 10-30 islotes en la gota.
- En el caso de diferentes grupos de islotes (por ejemplo, tipo salvaje/knock-out), organizar múltiples pozos y múltiples gotas para que la carga se pueda hacer simultáneamente.
- Incubar los islotes en la solución de trabajo tinte a temperatura ambiente en la oscuridad durante 70-90 minutos. No sobre-incubar.
- Compruebe la carga bajo el microscopio de fluorescencia; los islotes deben obtener una fluorescencia leve, con algunas células más brillantes que el resto. El redondeo de las células y la localización nuclear del tinte son signos de sobrecarga.
- Transfiera los islotes a una solución de imagen sin colorantes que contenga glucosa de 6 mM. Los islotes se pueden utilizar para la toma de imágenes inmediatamente, pero opcionalmente el tinte se puede dejar des-esterificar durante otros 10-15 minutos. Los islotes conservarán el tinte durante varias horas y, por lo tanto, se pueden utilizar para la toma de imágenes en varios turnos.
- Alternativamente, infecte los islotes con el vector recombinante.
- Placar los islotes en gotas en el medio de cultivo RPMI (paso 1.1.1) (por ejemplo, 30 l), para minimizar el volumen de vector necesario.
- Añadir el vector en una proporción de aproximadamente 105 unidades infecciosas / islet que idealmente debería dar lugar a la multiplicidad de infección >2. Idealmente, la relación debe optimizarse a la relación mínima que proporcionaría expresión en la capa periférica. La prevaloración (paso 2.2.3) puede ayudar.
- Introducir 20-50 islotes en la gota y el cultivo durante 8-48 horas. (Idealmente, durante la noche). Los islotes deben desarrollar una fluorescencia verde débil en la mayoría de las células, sin cambios en la morfología celular.
NOTA: El éxito de la infección y la expresión depende del momento de exposición a la solución del virus. Idealmente, el virus debe permanecer en la solución durante la noche, pero puede ser removido opcionalmente después de tan poco como 15 minutos. Sin embargo, es probable que la infectividad, y por lo tanto la expresión, sea dramáticamente menor.
3. Imagen Ca2+ dinámica
- Inmovilizar los islotes bajo el microscopio (invertido).
- Montar la cámara de imágenes para microscopía invertida. Coloque el cubrecristales (espesor 1 o 1.5) dentro de la cámara y asegúrese de que la interfaz de la cámara de vidrio sea hermética. Compruebe que el cubreobjetos está al alcance del objetivo del microscopio (crítico para el caso de un objetivo voluminoso de alto NA).
- Prepare los accesorios de inmovilización. Corta rectángulos pequeños (20 mm x 20 mm) de la malla fina y la malla gruesa. Introducir dos "paredes" espaciadoras en la malla fina usando una cinta pegajosa de 45-50 m de espesor. Utilice capas dobles del espaciador si el tamaño de los islotes a crear una imagen supera sustancialmente los 100 m convencionales.
- Sumerja las mallas y el peso en la solución de imagen utilizando una placa Petri de 35 mm. Asegúrese de que el plástico y el metal estén mojados.
- Bajo un microscopio de disección, gire la malla fina con las "paredes" espaciadora al revés, los espaciadores mirando hacia arriba. Escoja varios islotes cargados con el tinte trapable o exprese el sensor recombinante con una pipeta P20 y colóquelos suavemente encima de la malla fina, entre los dos espaciadores. Asegúrese de que la malla y las arandelas no contengan cantidades excesivas de la solución de imágenes en ellas.
- Recoja la malla con los islotes, utilizando fórceps del relojero, y colóquela boca abajo dentro de la cámara de imágenes, de modo que los espaciadores miren hacia abajo y se senten directamente en la cubierta de la cámara. Asegúrese de que los islotes estén atrapados entre los espaciadores y la malla, en el centro de la cubierta.
- Coloque la malla gruesa y el peso en la parte superior de la malla fina dentro de la cámara. Introducir la solución de imagen en la cámara. Asegúrese de que los islotes estén inmovilizados y listos para ser imágenes. Evitar el temblor excesivo de la cámara (pequeñas perturbaciones como llevar la cámara al microscopio e insertaren en una etapa calentada son aceptables).
NOTA: Se puede aplicar una disposición de inmovilización similar para un sistema vertical.
- Prepara el microscopio.
- Elija el modo de imagen y el objetivo, coloque la cámara con los islotes del paso 3.1 en la etapa de temperatura controlada del microscopio.
- Ajuste el control de temperatura (idealmente, entre 30oC y 36oC) y la perifusión. Para un sistema invertido, coloque la entrada por debajo de la salida dentro de la cámara y establezca el flujo de salida para que sea mayor que el de la entrada (que normalmente se logra mediante el uso de un tubo de un diámetro interior más amplio en una bomba peristáltica).
- Asegúrese de que la salida tenga una superficie de contacto mínima con la solución, de modo que elimine la solución en múltiples gotas pequeñas secuenciales, evitando largos intervalos de eliminación continua de la solución. Esta última es la principal fuente de artefacto en la toma de imágenes de lapso de tiempo de las señales periódicas, ya que aparecen como oscilaciones periódicas de intensidad regulares de cada píxel de imagen y con frecuencia se interpretan como "ondas lentas".
- Iniciar la perifusión con la solución de imágenes que contiene glucosa de 3 mM.
- Elija la trayectoria de luz y los filtros para la toma de imágenes de los fluoróforos verdes; excitación entre 470 y 500 y la emisión entre 505 y 550 funcionaría para cada uno de ellos.
- Ejecute imágenes en vivo para configurar los parámetros de imagen. Ajuste la vista para capturar los islotes de interés.
- Optimice la relación señal-ruido de la imagen. Para ello, ajuste la intensidad de la luz de excitación, el tiempo de exposición y el binning. Asegúrese de que la configuración permite una visualización distinta de cada celda dentro del islet con la mínima intensidad de luz y exposición posible.
- Realizar la adquisición de imágenes. Dependiendo de la tarea, las imágenes se pueden tomar a 0,1 a 5 Hz. Esto está muy por debajo de los criterios de Nyquist para las oscilaciones rápidas impulsadas por Na+en las células de las células de las células (>300 Hz), lo que significa que los datos están submuestreados por defecto. Sin embargo, aumentar la frecuencia de adquisición para que coincida con esta demanda no es factible en imágenes multicelulares/multiislet con un gran campo de visión. GCaMP se puede crear una imagen más rápida, mientras que Fluo4 inevitable lejía en condiciones de adquisición rápida.
NOTA: Dado que lasoscilaciones de las oscilantes [Ca2+] en las células del islet son impulsadas por la actividad eléctrica, el uso de bajas tasas de adquisición puede sonar contraproducente. En realidad, sin embargo, las tasas de adquisición alrededor o por encima de 1 Hz pueden ser suficientes para resolver el comportamiento de espiga de células13, mientras que el umbral para la detección de oscilaciones impulsadas por canal de sodio en células de células de tipo y de celdas es muy superior a 300 Hz. Ya sea que lasoscilaciones de tipo de celda o de celda [Ca2+] se adquieran a 1 Hz o 0,1 Hz, se submuestrearán gravemente y reflejarán el manejo de Ca2+ por la célula en lugar de la actividad eléctrica.- Compruebe la calidad de los datos adquiridos: a 3 mM de glucosa, la actividad celular debe ser claramente visible/detectable. Asegúrese de que este es el caso y proceda a la creación de imágenes de lapso de tiempo a escala completa.
- Elija el modo de imagen y el objetivo, coloque la cámara con los islotes del paso 3.1 en la etapa de temperatura controlada del microscopio.
- Imágenes de lapso de tiempo
- Hacer uso de un gráfico en línea de la dinámica de la señal, implementado en el software de adquisición si está disponible. Si la tabla en línea no es una opción, aplique una tabla de búsqueda que muestre la intensidad de la señal de la manera más completa (como "arco iris").
- Aplicar los estímulos de forma reversible: registrar la recuperación de la señal al nivel basal. Ignorar los artefactos al principio y al final de la grabación; este último puede parecer un "aumento"/"disminución" irreversible de la fluorescencia de la sonda debido a cambios en el pH o la muerte celular.
- Diferenciar las células por la dinámica de Ca2+ oscilatol, a baja glucosa. Introducir adrenalina o glutamato en la solución de baño, reversiblemente durante 2-5 min. Un salto rápido en [Ca2+]cyt seguido de una ralentización o cancelación de las oscilaciones seguirá.
NOTA: La adrenalina es un compuesto marcador reconocido para las células de la célula, que tiene un efecto positivo selectivo en esta subpoblación de células de islet, mediada por la liberación de Ca2+ de los depósitos intracelulares18. El glutamato se ha presentado como otro agonista específico de las células de la célula23. - Añadir/eliminar ghrelina, que se ha informado recientemente para activar la célula de la célula selectivamente19,20. Observe un rápido aumento reversible en [Ca2+]cyt en una pequeña subpoblación de células de islet.
- Añadir/eliminar 20 mM de glucosa. Observe una respuesta oscilatoria coordinada en la subpoblación de células. Tenga en cuenta la respuesta de las células que han sido activadas anteriormente por adrenalina o glutamato y ghrelina.
- Guarde la secuencia de imágenes. Considere la posibilidad de usar "Autoguardar" durante la grabación.
4. Análisis de los datos
- Analice la imagen de lapso de tiempo.
- Importe la imagen de lapso de tiempo en un software de análisis de imágenes, como un ImageJ/FIJI de código abierto.
- Si se ha producido un movimiento sustancial/rápido durante la grabación, deseche los datos como no reparables. Utilice los plugins StackReg o TurboReg24 para corregir derivas menores.
- Cree una imagen de máscara para la detección de celdas y la asignación de regiones de interés (ROI). La forma preferida de lograr esto sería hacer una imagen de pila utilizando una de las funciones como "intensidad media" o "intensidad máxima". La función a utilizar es la que proporcionará el mejor reconocimiento de las células individuales.
- Umbral de la imagen de máscara, elimine todos los datos fuera de la región del islet. La función funciona en modo automático para imágenes de 32 bits.
- Detectar máxima en la imagen de umbral. El maxima se puede representar por puntos, regiones o incluso sectores, si la imagen es densa.
- Aplique la función 'find maxima' sin restricciones de tamaño y pegue el maxima detectado en el editor de región de interés (ROI).
- Suavizar/interpolar cada uno de los ROIs asignados; posiblemente, los IRI requerirán expansión. Un script simple se puede escribir para (4.1.6-4.1.8) y ejecutar varias veces para proporcionar los mejores resultados de detección de celdas. Varios ROIs pueden superponerse, pero esto es raro.
- Analice la posición de los ROI y pegue los datos X e Y respectivos en el software de tabla electrónica (por ejemplo, Microsoft Excel).
- Analice la intensidad gris frente al tiempo de todos los ROI y pegue los datos en el software de tabla electrónica.
- Analice los datos numéricos.
- Importe los datos en el software de análisis de datos. Dependiendo de la elección del software y la duración / muestreo / tamaño del experimento, esto puede ser una operación de copiar y pegar simple o un procedimiento independiente. Asegurar la disposición y el almacenamiento de los datos numéricos.
- Importe las marcas de tiempo o las notas de tiempo, si están disponibles.
- Normalizar los datos de intensidad de fluorescencia en bruto ("F") al valor inicial de la fluorescencia ("F0"). Esto no tiene que ser la fluorescencia en el primer punto, pero podría ser el promedio de varios primeros puntos. La normalización debe reducir la variabilidad de los datos y, en un caso ideal (sin línea de base de deriva) da como resultado un dataset analizable ("F/F0").
- Si la variabilidad de celda a celda del dataset F/F0 sigue siendo sustancial (grabación larga, blanqueo), realice la corrección de línea base. Para ello, defina una región de «control», es decir, el intervalo de tiempo durante el cual se aplicó la solución de control (para los islotes pancreáticos de ratón, glucosa de 3 mM sin agonistas/antagonistas).
- Si la región de control tiene una señal clara no oscilatoria, suponga que F/F0 estaba volviendo al valor inicial (F/F0-1) después de cada aplicación de la solución de control. Corrija los datos de lapso de tiempo para cada celda dividiendo los datos en segmentos, separados por los puntos cuando se agregó la solución de control, y aplicando la corrección lineal a cada segmento. No utilice polinomio u otra corrección no lineal, ya que esto da como resultado artefactos.
- Si el rango de control tiene oscilaciones claras o factores adicionales (como la autofluorescencia FAD) están presentes, utilice un algoritmo de detección de picos17. Una vuelta trivial y rápida para eso es una transformación de wavelet máxima-sensible(Figura 3A).
- Cuantifique los datos. Aunque Ca2+ es una señal altamente dinámica, presentar los datos de Ca2+ en términos de valores absolutos de F /F0 es ampliamente aceptable en la literatura biomédica. Si es necesario comparar los resultados de varios experimentos, elija una métrica.
- Mida la frecuencia de los picos De2+ (Figura 4A,D)y su respuesta a la adición de (ant)agonistas. Para ello, divida la grabación en intervalos de tiempo iguales y calcule el intervalo de tiempo de la frecuencia parcial (frecuencia de pico en cada uno de los intervalos) contando los picos dentro del intervalo y normalizando la duración del intervalo.
- Alternativamente, establezca el umbral y calcule la fracción de meseta (pf) para cada uno de los intervalos definidos anteriormente(Figura 4B,F). La fracción indica el porcentaje de tiempo dentro del intervalo que la celda pasó en el estado "emocionado".
- Alternativamente, calcule el área parcial debajo de la curva (pAUC) para cada uno de los intervalos definidos anteriormente (Figura 4C,G). Esta métrica es sensible a los cambios en la frecuencia y amplitud de spiking.
NOTA: Una advertencia para medir la frecuencia es su falta de sensibilidad para la duración del pico y la poca estabilidad. Como los datos están muy submuestreados frente a la escupitación eléctrica, el número de picos por intervalo es bastante pequeño y, por lo tanto, un pico adicional único puede afectar dramáticamente el resultado. El "cuello de botella" del pAUC es su sensibilidad a los cambios en la línea de base. Aunque es menos propenso a artefactos y más sensible a los cambios en [Ca2+]cyt que la frecuencia, pAUC sin embargo no es muy informativo sobre la naturaleza de la dinámica de Ca2+. La fracción de meseta es una expansión del concepto de probabilidad abierta al sistema de células enteras. Sin embargo, es menos robusto que pAUC, debido a su dependencia del valor umbral.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los islotes se cargan bastante bien con los colorantes trapables(Figura 1A),a menos que la composición lipídica de la membrana se haya visto afectada (por ejemplo, por la exposición crónica a ácidos grasos). El vector de adenovirus humano tipo 5 (Ad5) también se dirige a todas las células de los islos(Figura 1B). Pueden surgir problemas cuando se está expresando más de un sensor recombinante en la misma célula. Además, los islotes suelen estar muy bien inmovilizados utilizando la tecnología descrita anteriormente, que proporciona una estabilidad excepcional y acceso a la solución.
Ca2+ spiking en las células de la célula se puede detectar fácilmente a niveles bajos de glucosa(Figura 2). Existe una alta correlación célula por célula entre la actividad a baja glucosa y la respuesta a la adrenalina y el glutamato. Ghrelin activa algunas células que responden a la adrenalina (¿células?) a baja glucosa, pero no tiene ningún efecto sobre la dinámica de Ca2+ en la mayoría de las células que se activan por la glucosa baja (células).
Cuando se analizan en términos de frecuencia parcial(Figura 4A,C),las células estimuladas por la adrenalina o la ghrelina muestran un aumento sustancial en las condiciones de todo o nada. Es decir, una célula con baja actividad basal que se activa por la adrenalina o la ghrelina exhibe un aumento dramático en esta métrica. Sin embargo, los cambios generales entre el pico basal y el efecto de adrenalina son muy sutiles(Figura 4A,C). Por el contrario, el AUC parcial es sensible a los cambios introducidos por la adrenalina en todas las células, incluso cuando la actividad basal es alta(Figura 4B,D).
Figura 1: Carga del tinte acomodado y expresión del sensor recombinante en los islotes. Islotes de ratón típicos cargados con el tinte trapable Fluo-4 (A) o que expresan el sensor recombinante GCaMP6 en la capa periférica de las células (B) o en la capa más profunda (C). El trazador polar sulforhodamine B (SRB, mostrado como blanco) se ha utilizado para esbozar células individuales dentro de cada islet25. (D) Cinética representativa de Ca2+ en respuesta a la glucosa registrada de células individuales dentro del islet utilizando Fluo4. Tenga en cuenta la heterogeneidad dentro de las poblaciones de células menores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Respuesta típica de Ca2+ de las células del isla a varios estímulos. Dinámica típica de células(A) y de células(B) Ca2+, en respuesta a adrenalina, glutamato, ghrelina, glucosa. (C)-(D) Mapas de calor de la respuesta de la célula del islet que muestran subpoblaciones adrenalina positivas (C) y ghrelina-positivas (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Corrección de línea base. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de los datos de lapso de tiempo. Análisis de la dinámica De Ca2+ en las células de la célula. Frecuencia parcial (A), fracción de meseta (B) y área bajo la curva (C) de una traza de células de á [Ca2+]i. Datos poblacionales [Ca2+]i de un islotes pancreáticos de ratón expresados como crudos (F/F0) (D), frecuencia parcial (E), fracción de meseta (F) y área bajo la curva (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hay tres etapas en el protocolo que son críticas para el éxito general. La inyección exitosa de la enzima Liberase en el conducto biliar determina no sólo el éxito cuantitativo del procedimiento de aislamiento, sino que también afecta la calidad de los islotes aislados. La páncreata no inflada puede resultar en la falta de algunas respuestas metabólicas importantes en los islotes aislados. En segundo lugar, la carga del tinte/la expresión del sensor define la relación señal-ruido de la grabación de lapso de tiempo. Las señales están ausentes o atenuadas en islotes sobrecargados. Por último, el posicionamiento exitoso y denso del tejido dentro de la cámara de imágenes es un momento decisivo para experimentos significativos y analizables. El tejido mal posicionado o en movimiento da como resultado una recuperación del tiempo experimental y/o datos poco claros.
El método se puede modificar para tener en cuenta múltiples señales (utilizando el sistema confocal) y múltiples grupos de islotes (por ejemplo, de diferentes genotipos). La toma de imágenes de múltiples señales supone la entrega de un segundo sensor en cada célula del islet, espectralmente compatible con el reportero Ca2+ (como un sensor de pH SNARF5f26,27). Para ello, los islotes se pueden cocargar/co-infectar con sensores Ca2+ y pH, que luego se crean imágenes secuenciales dentro de cada período de tiempo.
La toma de imágenes de la señal en grupos de islotes con resolución de una sola célula requiere el uso de un amplio objetivo de campo de visión. Es probable que el objetivo tenga menor aumento y apertura numérica (NA), reduciendo así la resolución espacial. Debido al aumento de la profundidad de enfoque del objetivo de baja NA, la creación de imágenes se puede realizar en un sistema de campo amplio. Las desventajas de esta disposición son la contaminación cruzada de células celulares de la señal de luz y la capacidad reducida de imagen de la señal 3D (por ejemplo, ratones que expresan el sensor Ca2+ bajo los promotores de insulina). Al mismo tiempo, la señal expresada desde las células del islote de superficie se puede resolver perfectamente con alta resolución temporal de grupos incluyendo decenas a cientos de islotes18.
Aunque puede sonar desagradable, pero realizar análisis de imágenes y análisis de datos numéricos en paquetes de software separados es una buena idea. En la actualidad, ImageJ/FIJI domina el análisis científico de imágenes. Los entornos más populares para la codificación científica son Python y Matlab, pero también hay esfuerzos conocidos para analizar los datos Ca2+ en R28. La mejor usabilidad es proporcionada por paquetes más nicho como IgorPro. Nuestra elección es crear prototipos en Matlab/Python y luego implementar el código en IgorPro para su uso de 'pipeline'. Adaptar los paquetes de análisis de señales para electrofisiología (por ejemplo, Clampfit, Neuroexplorer) para necesidades analíticas puede ser útil para imágenes de una sola célula, pero es difícil escalar verticalmente. Muchas opciones proporcionadas por estos paquetes no son aplicables para la toma de imágenes de islet debido a la baja frecuencia de muestreo.
Es importante recordar que esta metodología está limitada por una serie de factores. En primer lugar, como se mencionó anteriormente, la toma de imágenes se basa en gran medida en el submuestreo de los datos, lo que significa que no indica y, por lo tanto, no se puede comparar directamente con la actividad eléctrica de la célula. En segundo lugar, los datos provienen de la periferia del islet y no reflejan procesos de acoplamiento importantes que son, en términos generales, tridimensionales. En tercer lugar, el nivel de carga/expresión afecta a la percepción de la intensidad del sensor. Por último, no se puede descartar la activación de subpoblaciones de células de islote menos bien investigadas (por ejemplo, células PP y células de PP) por los compuestos marcadores, aunque debido a la baja cantidad de estas células dentro del islote cualquier contaminación potencial será mínima.
El método es un verdadero "campeón" en términos de efecto visual, ya que los procesos oscilatorios ofrecen una fuerte impresión de un tejido genuinamente vivo. Aplicado a subpoblaciones de células menores, el método sondea la función de cada una de ellas de forma fiable, permitiendo la identificación de subgrupos y reflejando la heterogeneidad.
La dinámica del calcio se ha estudiado en células de islotes pancreáticos durante más de 40 años, impulsadas principalmente por el progreso en la tecnología de adquisición/detección. Los primeros estudios utilizaron la espectroscopia de absorción atómica29,pero no fue hasta la llegada de los sensores fluorescentes Ca2+ 30 que la cinética detallada pudo resolverse en células de islet individuales, utilizando fotometría31,32,33. Poco después, el componente espacial de la cinética Ca2+ se mejoró a medida que Ca2+ imaging34,35,36 se convirtió en una tecnología de rutina, gracias a los detectores de dispositivos acoplados a carga (CCD) recién disponibles. El problema de la luz desenfocada, que dificultó la imagen de la señal de células individuales dentro del tejido, se resolvió a mediados de la década de 1990 a través de la microscopía confocal de escaneo láser (LSCM)37 y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM)38. Ambos métodos, complementados con la llegada de una nueva generación de sensores fluorescentes Ca2+ excitables con un láser de 488 nm, se han utilizado con éxito para la imagen de la dinámica Ca2+ en las subpoblaciones de células de isla39,40,41.
El nuevo siglo adelantó dos nuevas tendencias que se derivaron de los desarrollos tecnológicos relacionados con la neurociencia. En primer lugar, los sensores fluorescentes recombinantes basados en la permutación circular de las variantes GFP aumentaron sustancialmente la relación señal-ruido para la detección de Ca2+, llevando eficazmente los estudios al nivel de las poblaciones de células grandes, en la que se pudo resolver la dinámica de [Ca2+]cyt en cada célula. En segundo lugar, el uso de promotores específicos del tejido permitió dirigir la expresión del sensor a subpoblaciones menores.
Aunque generalmente se piensa que reflejan los desarrollos en neurociencia, estudios sobre el islet Ca2+ dinámica tiene dos diferencias clave. En primer lugar, tecnológicamente, cualquier imagen in vivo de la señalización de islotes es más compleja que la imagen en el cerebro debido a la anatomía impredecible del páncreas y la ubicación de los islotes42. En segundo lugar, el excelente acoplamiento eléctrico entre las células del isla esencialmente convierte los islotes en poblaciones eléctricamente inertes que muestran una respuesta aparentemente perfecta de todo o nada al estímulo de alta glucosa. Creemos que los estudios de [Ca2+]i cinética en subpoblaciones de islet menores, tales como las células, basados en la segmentación específica del tejido son propensos a ampliar nuestro conocimiento de su farmacología/fisiología. Al mismo tiempo, las sondas altamente sensibles permiten ampliar la potencia estadística de tales mediciones, contabilizar la variabilidad de islotes a islotes y permitir la creación de imágenes de islotes de diferentes grupos dentro de un experimento paralelo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los Autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
AH fue galardonado con un doctorado en diabetes en el Reino Unido, EV fue apoyado por el programa de formación OXION-Wellcome Trust, AIT celebró una beca postdoctoral del Oxford Biomedical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | Thermo Fisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
References
- Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629 (1995).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
- Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
- Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
- Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137 (2001).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
- Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039 (2018).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727 (2016).
- Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
- Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
- Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
- Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
- Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
- Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
- Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
- Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
- Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
- Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
- Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
- Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
- Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
- van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).
