Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا للتصوير وقياس ديناميات الكالسيوم في الخلايا غير المتجانسة السكان ، مثل خلايا جزيرة البنكرياس. يتم تسليم الصحفيين الفلورسنت إلى الطبقة الطرفية من الخلايا داخل الجزيرة ، والتي يتم بعد ذلك التعبئة والتصوير ، ويتم اجراء تحليل لكل خليه من ديناميات كثافة الفلورية.
Abstract
هرمونات جزيرة البنكرياس تنظم التوازن الجلوكوز في الدم. التغيرات في الجلوكوز في الدم تحفز تذبذبات الكالسيوم السيتووليك في خلايا جزيرة البنكرياس التي تؤدي إلى إفراز ثلاثه هرمونات رئيسيه: الانسولين (من الخلايا β) ، جلوكاجون (α-الخلايا) و سوماتوستاتين (خلايا δ). β-الخلايا ، التي تشكل غالبيه خلايا جزيرة ويتم بالاقتران كهربائيا إلى بعضها البعض ، والاستجابة لتحفيز الجلوكوز ككيان واحد. الاستثارة من ال [سوببوبولايشن] ثانويه, [الف-سل] و [δ-سل] (يجعل فوق حوالي 20% (30%) و 4 في المائة (10 في المائة) من مجموع القوارض1 (الإنسان2) جزيرة أرقام الخلية ، علي التوالي) اقل قابليه للتنبؤ التالي فهي ذات اهميه خاصه.
يتم تسليم أجهزه استشعار الكالسيوم في الطبقة الطرفية من الخلايا داخل جزيرة معزولة. ثم الجزيرة أو مجموعه من الجزر التي يتم تعبئتها والذين يستخدمون المجهر الفلوري. ويكون اختيار طريقه التصوير بين الانتاجيه العالية (المجال الواسع) والدقة المكانية الأفضل (التركيز البؤري). تقليديا ، يستخدم المجهر الضوئي بالليزر لتصوير الانسجه ، كما انه يوفر أفضل فصل للاشاره بين الخلايا المجاورة. [ويد-فيلد] نظامه يستطيع كنت استعملت أيضا, ان ال يلوث اشاره من ال يسيطر الالسكان من [β-سل] يكون قللت.
وبمجرد ان يتم تسجيل ديناميات الكالسيوم استجابه لمحفزات محدده ، يتم التعبير عن البيانات في شكل عددي ككثافة مضان مقابل الوقت ، وتطبيع إلى الفلورية الاوليه وتصحيح خط الأساس ، لأزاله الآثار المرتبطة بتبييض فلوروفوري. وتحسب التغيرات في التردد الحاد أو المنطقة الجزئية تحت المنحني (pAUC) مقابل الوقت ، لقياس الآثار الملحوظة. pAUC هو أكثر حساسية وقويه جدا في حين ان التردد الشائك يوفر المزيد من المعلومات حول اليه زيادة الكالسيوم.
يمكن تحديد الفئات الفرعية للخلايا الصغرى باستخدام الاستجابات الوظيفية لمركبات العلامات ، مثل الأدرينالين و ghrelin ، التي تحفز التغيرات في الكالسيوم السيتووليك في عدد محدد من السكان في خلايا الجزيرة.
Introduction
والغرض من هذه الطريقة هو صوره التغييرات في الوقت الحقيقي في تركيز الكالسيوم السيتووليك ([Ca2 +]cyt) في السكان الفرعيين الصغرى من خلايا جزيرة البنكرياس. وهذا يسمح الكشف عن أليات التي تحكم إفراز هرمون في هذه الخلايا, الكشف عن تفاصيل حول الحديث المتقاطع بين أنواع الخلايا المختلفة و, يحتمل, إدخال البعد الشعبي في صوره أكبر من الإشارات جزيرة.
تتكون الجزر من عده أنواع من الخلايا. الاضافه إلى الخلايا الأكثر شهره لإفراز الانسولين ، هناك ما لا يقل عن اثنين من السكان الفرعيين الذين هم أيضا حاسمه في تنظيم الجلوكوز في الدم3. خلايا α (التي تشكل حوالي 17 ٪ من خلايا الجزيرة) تفرز جلوكاجون عندما يحصل الجلوكوز في الدم منخفضه جدا ، والتي إشارات للإفراج عن الجلوكوز في مجري الدماء من مستودعات في الكبد. مستويات جلوكاجون المفرطة (فرط جلوغلوجوميا) وضعف السيطرة علي جلوكاجون-الإفراج مرافقه (و, من الناحية الفنية, يمكن ان تسهم) حاله ما قبل السكري من ضعف حساسية الانسولين4. خلايا δ (حوالي 2 ٪) تفرز السوماتوستاتين استجابه لارتفاع الجلوكوز. هذا الهرمون الببتيد في كل مكان من المرجح ان تكون موجودة في تركيزات عاليه في محيط α-و β-الخلايا داخل الجزر, التي لديها قويه Gi مستقبلات بوساطة تاثير المخفف علي كل من جلوكاجون وإفراز الانسولين.
تتشارك خلايا α وخلايا δ جزءا كبيرا من آلات استشعار الجلوكوز مع أقاربها المقربين ، الخلايا β. جميع أنواع الخلايا الثلاثة مجهزه بقنااتK + الحساسة من ATP ، والمستشعرات الايضيه المفصلة5 التي تتحكم في إمكانات غشاء البلازما لهذه الخلايا المثيرة. في الوقت نفسه ، يتم تنظيم إفراز الانسولين ، السوماتوستاتين والجلوكاجون بشكل مختلف عن طريق الجلوكوز. التصوير من Ca2 + ديناميات في اثنين من السكان الفرعيين ثانويه من الخلايا جزيرة يمكن لذلك ان توفر نظره ثاقبه في الكلام المتقاطع بين الجلوكوز في الدم والإخراج سيكريتوري جزيرة.
وسرعان ما تبعت المحاولات المبكرة لرصد استثاره الخلايا α و δ باستخدام التصحيح المشبك الكهربائية بواسطة التصوير من Ca2 + في واحد α-وخلايا δ. تم التحقق من هويه الخلايا في هذه التجارب عن طريق تلطيخ اللاحقة مع المضادة جلوكاجون أو مضادات السوماتوستاتين الأضداد. وكثيرا ما أعيقت هذه الجهود من خلال العثور علي ان خلايا جزيرة تتصرف بشكل مختلف جدا داخل الجزيرة وكخلايا واحده. علي الرغم من ان β-الخلايا قد يبدو ان المحسنين الرئيسيين للترتيب جزيرة (نظرا للاغلبيه الساحقة التي تكمن وراء اقترانها الكهربائية القوية) ، كان التناقض الرئيسي ، من المستغرب ، وجدت في خلايا α. داخل الجزيرة السليمة ، يتم تنشيط هذه الخلايا باستمرار وباستمرار في انخفاض الجلوكوز ، والذي هو صحيح فقط لحوالي 7 ٪ من واحد فرقت α-خلايا6. ولذلك يعتقد ان الإبلاغ عن نشاط خلايا α و δ داخل الجزر السليمة يمثل تقريبا تقريبيا للظروف المجرية.
بشكل عام ، هناك طريقتان للإبلاغ عن Ca2 + dynamics علي وجه التحديد من الفئات الفرعية للخلايا α أو δ: (1) التعبير عن مستشعر ca2 + المرمز وراثيا عن طريق مروج محدد بالانسجه أو (2) باستخدام مركبات العلامة. النهج السابق أكثر اناقه يضيف ميزه كبيره من التصوير 3D صحيح التالي دراسة توزيع الخلايا داخل الجزيرة. ومع ذلك لا يمكن تطبيقه علي المواد جزيرة الإنسان سليمه. ومن الشواغل المحتملة الأخرى "التسرب" من المروج ، ولا سيما عندما يكون التمايز بين الخلايا β/α أو استجابه الخلية α لارتفاع نسبه الجلوكوز في مكانها. ويمكن استخدام هذا النهج الأخير مع الانسجه المعزولة الطازجة بما في ذلك عينات الإنسان أو الجزر المستزرعة. البيانات, ومع ذلك, يتم جمعها فقط من الطبقة الطرفية من الخلايا جزيرة, كما تسليم جزيء صبغ/علامة في طبقات أعمق دون تغيير العمارة جزيرة هو التحدي. والميزة غير المتوقعة للنهج الأخير هي التوافق مع وضع التصوير الواسع النطاق ، الذي يسمح بزيادة التجارب إلى التصوير المتزامن لعشرات أو مئات الجزر الكبيرة (اي آلاف إلى عشرات آلاف من الخلايا).
الكالسيوم هو في الجسم الفيفو باستخدام المشفرة وراثيا gcamp7 (أو بيريكام8) أجهزه الاستشعار الاسره ، والتي هي المتغيرات من البروتين الفلوري الأخضر المتحول دائريا (gcamp) تنصهر في كالموديولين بروتين ملزم الكالسيوم وتسلسله المستهدف ، M13 جزء من سلسله ميوسين الخفيفة كيناز7،9. Gcampsات لديها ممتازة اشاره إلى الضوضاء نسب في نطاق نانومولار Ca2 + تركيزات وعاليه 2-الفوتون المقطع العرضي ، مما يجعلها الخيار المثالي للعمل في الجسم الخارجي10،11. الجانب الصعب من استخدام أجهزه الاستشعار المؤتلف هو تسليمها إلى الخلايا. التعبير المغاير يتطلب استخدام ناقل الفيروسية ومتعددة الساعات السابقة الجسم الوسيط ، الذي يثير في كثير من الأحيان مخاوف بشان امكانيه أزاله التمايز أو تدهور وظائف الخلية. علي الرغم من ان نماذج الماوس التي تم هندستها مسبقا للتعبير عن GCaMP معالجه هذه المشكلة ، فانها تضيف تحديات جديده من خلال زيادة الوقت الرصاص بشكل كبير والحد من العمل إلى نموذج غير البشرية. حساسية عاليه جدا للتغيرات من الحموضة داخل الخلايا هو الجانب السلبي آخر من أجهزه الاستشعار القائمة علي البروتين12، وهو ، ومع ذلك ، اقل من مشكله لاستشعار إشارات التذبذب ، مثل Ca2 +.
الاستفادة من الاصباغ يمكن تتبع (مثل الأخضر الفلورسنت Fluo4) هو انها يمكن تحميلها في الانسجه المعزولة الطازجة في غضون ساعة تقريبا. ويمكن التنبؤ بان الاصباغ اليمكن تتبعه لها نسب اقل من الاشاره إلى الضجيج و (الكثير) من الثبات الضوئي اقل من نظرائها المؤتلف. لا يمكننا تاكيد13 تقارير سميه الاصباغ يمكن تتبع14، ومع ذلك ، صبغ الحمولة الزائدة مشكله متكررة.
الأحمر المؤتلف Ca2 + أجهزه الاستشعار علي أساس التحول الدائري وقد تطورت بسرعة منذ 201115، وأحدث التطورات الاخيره تقدم منافسه قويه ل gcamps16 للتصوير الانسجه ، نظرا لعمق اعلي من تغلغل الضوء الأحمر. يمكن استخدام الاصباغ يمكن تتبع الحمراء المتاحة تجاريا بشكل موثوق للتصوير أحاديه الخلية ولكن ، علي مستوي الانسجه ، لا يمكن ان تتنافس جيدا مع النظير الأخضر.
ويبدو ان هناك القليل جدا من خيار تكنولوجيا التصوير للتجارب في الانسجه حيث يصبح الضوء خارج التركيز مشكله حرجه. ويوفر النظام المحوري حلا مقبولا للخلية الواحدة عن طريق إلغاء الضوء الخارج عن التركيز مع اي هدف علي الشبكة المذكورة أعلاه 0.3 (لحاله GCaMP6) أو 0.8 (صبغه يمكن تتبع). بمعني تقني ، يمكن استخدام المجهر البؤري التقليدي للتصوير المتزامن ل [Ca2 +]cyt من المئات (gcamp) أو عشرات الجزر (يمكن تتبع صبغ). البديل الواقعي الوحيد للوضع البؤري في حاله التعبير ثلاثي الابعاد لجهاز الاستشعار في الانسجه هو ربما المجهر الضوئي.
الأمور مختلفه قليلا عن الحالة عندما يتم التعبير عن جهاز الاستشعار في الطبقة الطرفية من الخلايا داخل الانسجه جزيرة. لأجهزه الاستشعار المؤتلف مشرق التي لديها نمط التعبير حيه داخل الخلايا ، وذلك باستخدام وضع التصوير حقل واسع مع الهدف منخفضه NA قد توفر نوعيه كافيه ومكافاه الباحث مع زيادة كبيره في مجال مجال الرؤية ، التالي الانتاجيه. ويوفر النظام الواسع النطاق استبانه مكانيه أكثر فقرا ، نظرا لعدم إلغاء الضوء الخارج عن التركيز ؛ التالي ، فان الانسجه التصويرية ذات الأهداف العالية (العمق المنخفض للحقل) اقل من المعلومات ، حيث ان اشاره الخلية الواحدة ملوثه بشده من قبل الخلايا المجاورة. التلوث هو أصغر بكثير لأهداف منخفضه NA (عمق عاليه من الميدان).
ومع ذلك ، هناك مهام ، والتي الانتاجيه العالية و/أو معدل أخذ العينات تصبح ميزه حاسمه. [α-] و [δ-سل] يبدي تغاير جوهريه, اي يخلق طلب لحجم عال عينه ان يكشف المساهمة من ال [سوببوبولايشن]. التصوير في الحقول الواسعة سريع وأكثر حساسية ، مع النطاق الصناعي الكبير لتصوير النظام في المئات (GCaMP) أو عشرات (Fluo4) من الجزر الصغيرة في نفس نسبه الاشاره إلى الضوضاء كالتجارب المحورية علي عشره أو جزيرة واحده ، علي التوالي. هذا الاختلاف في الانتاجيه يجعل نظام واسع النطاق المفيد للتصوير الشعبي مع دقه خليه واحده ، والتي يمكن ان تكون حاسمه خاصه بالنسبة للسكان الفرعيين الصغيرة مثل الخلية δ واحد. المثل ، فان محاولات أعاده بناء النشاط الكهربائي من Ca2 + ارتفاع17 ستستفيد من معدل أخذ العينات الأعلى الذي يوفره وضع التصوير الميداني الواسع. وفي الوقت نفسه ، تتطلب عده مشاكل "متخصصة" مثل نشاط خلايا α البنكرياس عند تحفيز السكان الفرعيين المسيطرين علي الخلايا β ، استخدام النظام المركزي. والعامل الذي يؤثر علي القرار نحو الوضع البؤري هو وجود اشاره ملوثه كبيره من السكان الفرعيين في الخلية β.
علي الرغم من ان استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالهرمونات للتحقق من هويه الخلايا بعد تجارب التصوير لا يزال خيارا ، يمكن تحديد الفئات الفرعية للخلايا الثانوية باستخدام مركبات العلامات الوظيفية ،مثل الأدرينالين و جريلين التي أظهرت انها تحفز بشكل انتقائي Ca2 + dynamics
ويهدف تحليل بيانات التصوير بالفواصل الزمنيه إلى توفير معلومات تتجاوز الصيدلة التافهة ، مثل التجانس الشعبي والترابط والتفاعل بين الإشارات المختلفة. تقليديا ، يتم تحليل بيانات التصوير وكثافة مقابل الوقت وتطبيعها إلى فلوري الاولي (F/F0). وكثيرا ما تكون هناك حاجه إلى تصحيح خط الأساس ، وذلك بسبب تبييض اشاره فلوكوفيري أو التلوث بالتغيرات في الفلورية أو الحموضة (التي عاده ما تكون مستحثه بمستويات ميليمولار من الجلوكوز12). Ca2 + يمكن تحليل البيانات في العديد من الطرق المختلفة ، ولكن ثلاثه اتجاات رئيسيه هي لقياس التغيرات في وتيره الارتفاع ، وكسر الهضبة ، أو المنطقة تحت المنحني ، محسوبة مقابل الوقت. وقد وجدنا ان النهج الأخير مفيد ، وخاصه في تطبيقه علي البيانات المنسقة التي أخذت في النقص الشديد. والميزة التي يمتاز بها مقياس pAUC هي حساسيته لكل من التغيرات في تردد الاشاره والسعه ، بينما يتطلب حساب التردد عددا كبيرا من الذبذبات21، وهو أمر يصعب تحقيقه باستخدام التصوير التقليدي. والعامل المقيد لتحليل الفقراء هو حساسيته العالية للتغيرات الاساسيه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وضعت جميع الطرق الموصوفة هنا وفقا لقانون المملكة المتحدة للحيوانات (الإجراءات العلمية) (1986) والمبادئ التوجيهية الاخلاقيه لجامعه أكسفورد.
1. عزل الفئران البنكرياس الجزر
- اعداد الثقافة المتوسطة وحل العزلة.
- تشكل الثقافة المتوسطة: RMPI1640 (انظر جدول المواد) ، تستكمل مع 10 ٪ من مصل الساق الجنين ، 100 وحده/مل البنسلين ، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين. الاستغناء عن المتوسطة إلى 2 60 مم البلاستيك الاطباق بيتري (لا تعامل مع اي لاصق) ، والحفاظ علي الاطباق في الحاضنة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، الرطوبة المطلقة).
- تشكل حل العزلة (50 mL/الماوس): هانكس ' المتوسطة مع 5 مم الجلوكوز ، 100 وحده/مل البنسلين 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين. يحفظ علي الجليد (4 درجه مئوية).
- يشكلون الحل الانزيم (علي سبيل المثال ، Liberase): 0.2 ملغ/مل في محلول العزلة ، 2 مل لكل الماوس. يحفظ علي الجليد (4 درجه مئوية). اختياريا ، قبل اختبار نشاط liberase ، وتحسين المعلمات حضانة لكل دفعه من الانزيم22.
- حقن محلول الانزيم في القناة الصفراوية الماوس.
- التضحية بالماوس (12 أسبوعا من العمر الإناث ، C57Bl/6J) عن طريق خلع عنق الرحم.
- تحت مجهر تشريح ، وقطع فتح الجلد وطبقات العضلات باستخدام مقص غرامه وتحديد موقع القناة الصفراوية.
- Ligate الأمعاء علي كلا الجانبين من تقاطع مع القناة الصفراوية ، وذلك باستخدام خيوط القطن.
- ارفع القناة الصفراوية برفق مع ملقط الساعات المنحنية الناعمة واعرض محلول انزيم الجليد البارد في القناة باستخدام حقنه 2 مل مع ابره 30 جرام. وينبغي ملاحظه تضخم في البنكرياس في هذه المرحلة.
- اجمع البنكرياس المتضخم باستخدام مزيج من ملقط الإبهام الحاد وملقط المراقبة الدقيقة في أنبوب الصقر 15 مل واحتفظ به علي الجليد (4 درجات مئوية). أضف 1 مل من محلول الانزيم إلى الأنبوب.
- حرر واجمع الجزر البنكرياس من البنكرياس.
- احتضان بانكريتا تضخم مع محلول انزيم لمده 16 دقيقه في حمام مائي ، في 37 درجه مئوية. يمكن استخدام اهتزاز لطيف ولكن ليست حرجه ، شريطه ان التضخم كان جيدا.
- وقف الهضم بالاضافه إلى حل العزلة الجليد الباردة ، وتصل إلى 10 مل. هز الخلاصة برفق: يجب ان تسقط إلى قطع صغيره.
- اغسل الخلاصة ثلاث مرات في 10 مل من محلول العزل ، واسمحوا الوقوف 5 دقيقه في 1 × ز إلى الرواسب الجزر المحررة ، علي الجليد. يستنشق سوبرناتانت برفق ، مع ماصه المصلية 10 مل.
- أضافه RPMI الباردة إلى الخلاصة (لجعل ما يصل إلى 10 مل).
- استخدام الاطباق البلاستيكية بتري (الخطوة 1.1.1) لاختيار الجزر. Decant المتوسطة RMPI قباله واحده من اطباق بيتري ، وصب بلطف بعض (4-5 mL) من الخلاصة بدلا من ذلك. جمع الجزر المحررة التي تظهر كقطع مستديرة وسلسه وعاليه الكثافة ، مع ماصه P10 في صحن بيتري الثاني.
- ثقافة الجزر في الحاضنة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، الرطوبة المطلقة). يمكن إيقاف التجربة مؤقتا في هذه المرحلة. ويعتقد ان ترك الجزر لساعات 1-2 من قبل البعض للمساعدة في التعافي من الإجهاد الميكانيكية اثناء العزلة.
2. تحميل الصبغة أو التعبير عن جهاز الاستشعار
- اعداد صبغه يمكن تتبع.
- ذوبت ال [اليقووت] (عاده, 50 ميكروغرام) من ال [يمكن تتبع صبغ] ([ا. غ.], [فلوو-4]) في [دسو] إلى [ستوك كنسنترايشن] من 2 [م]. أضافه حمض التعددية إلى تركيز نهائي من 1 ٪ (باستخدام 20 ٪ من الأسهم في DMSO) ، لتحسين ذوبان الصبغة.
- Aliquot صبغ في أنابيب PCR الصغيرة (2 μL في كل). يمكن تخزين الصبغة المجمدة (-20 درجه مئوية) لعده أسابيع.
- بدلا من ذلك ، اعداد جهاز استشعار المؤتلف.
- توزيع جهاز الاستشعار (علي سبيل المثال ، ناقلات الفيروسية ترميز GCaMP6f) إلى 10 μl قسامات وتخزين في-80 درجه مئوية.
- (اختياريا) قبل اختبار عيار من الأسهم الفيروسية عن طريق أصابه الجزر الكبيرة (علي النحو التالي) باستخدام عده المخففات التسلسلية ، للكشف عن التركيز الأمثل للعدوى.
ملاحظه: أجهزه الاستشعار المؤتلف المرمزة بواسطة ناقلات مختلفه (لينتيفيروس ، BacMam ، AAV) تتطلب بروتوكول عدوي مختلفه. تاكد من التحقق من ذلك مع موفر ناقلات وتحسين نسبه العمل لاحتياجاتك. ويمكن تخزين "العمل" المخزون من الفيروس اللحمية في-20 درجه مئوية والمجمدة/أذابه عده مرات. الإفراط في تجميد-ذوبان الجليد الدراجات يقلل من عيار فعاله من الفيروس.
- اعداد حل التصوير.
- يشكلون الحل التصوير ، مم: 140 NaCl ، 4.6 KCl ، 2.6 CaCl2، 1.2 mgcl2، 1 الجناح2PO4، 5 نهكو3، 10 hepes (pH 7.4 ، مع naoh).
- تشكل مخزونا من الجلوكوز (0.5 m) و مانيتول (0.5 m) في حل التصوير. يمكن تخزين المخزون في الثلاجة (4 درجه مئوية) لعده أسابيع.
- تحميل صبغه يمكن تتبع.
- تشكل الحل صبغ العمل عن طريق تذويب 2 μL من الصبغة في 600 μL من محلول التصوير التي تحتوي علي 6 مم الجلوكوز. الحل يمكن تسخينها أو فورتيكسد لتحسين الاذابه.
- تحميل الجزر المعزولة في الخطوة 1 في حل العمل من الصبغة. يمكن ان يتم التحميل باستخدام لوحه متعددة البئر أو طبق بيتري. في الحالة الاخيره ، ضع قطره 100 μL من الحل العمل علي الجزء السفلي من طبق بيتري غير لاصقه (35-أو 60-مم) والجزر الماصة 10-30 في القطرات.
- في حاله مجموعات مختلفه من الجزر (مثل البرية من نوع/الخروج) ، وترتيب الآبار متعددة وقطرات متعددة بحيث يمكن ان يتم التحميل في وقت واحد.
- احتضان الجزر في محلول صبغ العمل في درجه حرارة الغرفة في الظلام لمده 70-90 دقيقه. لا الإفراط في احتضان.
- تحقق من التحميل تحت المجهر مضان; وينبغي لهذه الجزر الحصول علي فلوري خفيف ، مع بعض الخلايا تكون أكثر إشراقا من بقية. التقريب من الخلايا والتوطين النووي لصبغ علامات الحمولة الزائدة.
- نقل الجزر إلى محلول التصوير خاليه من الصبغة التي تحتوي علي 6 مم الجلوكوز. ويمكن استخدام الجزر للتصوير علي الفور ، ولكن اختياريا يمكن ترك الصبغة ل de-esterify لمده 10-15 دقيقه أخرى. وسوف تحتفظ الجزر الجزيرة صبغ لعده ساعات ، التالي يمكن استخدامها للتصوير في عده نوبات.
- بدلا من ذلك ، تصيب الجزر مع ناقلات المؤتلف.
- لوحه الجزر في قطرات في الخياطة RPMI المتوسطة (الخطوة 1.1.1) (علي سبيل المثال ، 30 μL) ، للتقليل من حجم المتجات اللازمة.
- أضافه المتجه بنسبه حوالي 105 وحدات المعدية/جزيرة التي ينبغي ان تؤدي بشكل مثالي في تعدد العدوى > 2. ومن الناحية المثالية يجب ان تكون النسبة الأمثل لنسبه الحد الأدنى التي من شانها ان توفر التعبير في الطبقة الطرفية. قد يساعد المعايرة المسبقة للمعايرة (الخطوة 2-2-3).
- إدخال 20-50 الجزر في القطرات والثقافة لمده 8-48 ساعة. (من الناحية المثالية ، بين عشيه وضحيها). وينبغي ان تتطور الجزر الجزيرات الفلورية الخضراء باهته في معظم الخلايا ، دون تغييرات في المورفولوجية الخلية.
ملاحظه: يعتمد نجاح العدوى والتعبير علي وقت التعرض لمحلول الفيروس. من الناحية المثالية ، يجب ان يبقي الفيروس في الحل بين عشيه وضحيها ولكن يمكن ازالتها اختياريا بعد اقل من 15 دقيقه. ومع ذلك ، من المرجح ان يكون العدوى ، التالي التعبير ، اقل بشكل كبير.
3. التصوير Ca2 + ديناميات
- التعبئة الجزر تحت المجهر (مقلوب).
- تجميع غرفه التصوير لمجهر مقلوب. وضع الزجاج كوفيرسليب (سمك 1 أو 1.5) داخل الغرفة وتاكد من ان واجهه الغرفة الزجاجية هي المياه ضيق. تحقق من ان المنظار هو في متناول الهدف المجهر (الحرجة لحاله ضخمه عاليه-NA الهدف).
- اعداد الملحقات التجميد. قطع المستطيلات الصغيرة (20 مم × 20 ملم) من شبكه غرامه وشبكه الخشنة. إدخال اثنين من "الجدران" فاصل علي شبكه غرامه باستخدام شريط لاصق سميك 45-50 μm. استخدام طبقات مزدوجة من فاصل إذا كان حجم الجزر إلى-يكون-imaged يتجاوز إلى حد كبير التقليدية 100 μm.
- اغمر الشبكات والوزن في محلول التصوير باستخدام طبق بيتري 35 مم. تاكد من ان البلاستيك والمعدن الرطب.
- تحت المجهر تشريح ، وتحويل شبكه غرامه مع فاصل "الجدران" راسا علي عقب ، والفواصل التي تواجه صعودا. اختيار العديد من الجزر التي تحمل صبغه يمكن تتبع أو التعبير عن جهاز استشعار المؤتلف مع ماصه P20 ووضعها برفق علي راس شبكه غرامه ، بين الفواصل اثنين. تاكد من ان شبكه وغسالات لا تحتوي علي كميات زائده من الحل التصوير عليها.
- التقاط الشبكة مع الجزر ، وذلك باستخدام ملقط صانع الشعار ، ووضعه راسا علي عقب داخل غرفه التصوير ، بحيث الفواصل وجها إلى أسفل والجلوس مباشره علي coverslip الغرفة. تاكد من ان الجزر محصورة بين الفواصل والشبكة ، في منتصف المشبك.
- وضع الشبكة الخشنة والوزن علي راس شبكه غرامه داخل الغرفة. إدخال حل التصوير في الغرفة. التاكد من ان الجزر التي يتم تعبئتها وجاهزه ليتم الحصول علي العمر. تجنب الإفراط في الاهتزاز من الغرفة (الاضطرابات الصغيرة مثل حمل الغرفة إلى المجهر وادراجها في مرحله ساخنه مقبوله).
ملاحظه: يمكن تطبيق ترتيب مماثل التجميد لنظام تستقيم.
- قم باعداد المجهر.
- اختيار وضع التصوير والهدف ، ووضع الغرفة مع الجزر من الخطوة 3.1 علي المرحلة درجه الحرارة التي تسيطر عليها من المجهر.
- تعيين التحكم في درجه الحرارة (من الناحية المثالية ، بين 30 درجه مئوية و 36 درجه مئوية) و perifusion. النسبة للنظام المقلوب ، ضع التدفق الوارد اقل من التدفق داخل الغرفة ، واضبط تدفق التدفق ليكون أكبر من التدفق الوافد (الذي يتحقق عاده باستخدام أنابيب من قطر داخلي أوسع علي المضخة التمعجيه).
- تاكد من ان التدفق لديه سطح الاتصال الحد الأدنى مع الحل ، بحيث انه يزيل الحل في قطرات صغيره متتابعة متعددة ، وتجنب فترات طويلة من أزاله الحل المستمر. وهذا الأخير هو المصدر الرئيسي للتحفة الحرفية في تصوير الإشارات الدورية بالفواصل الزمنيه لأنها تظهر كذبذبات دوريه منتظمة لكل بيكسل في السن وكثيرا ما تفسر علي انها "موجات بطيئه".
- البدء في الانصهار مع حل التصوير الذي يحتوي علي 3 مم الجلوكوز.
- اختيار مسار الضوء والمرشحات للتصوير من الفلوريبورس الخضراء. الاثاره بين 470 و 500 والانبعاثات بين 505 و 550 ستعمل لكل واحد منهم.
- قم بتشغيل التصوير المباشر لاعداد معلمات التصوير. اضبط طريقه العرض للتقاط الجزر المهمة.
- تحسين نسبه الاشاره إلى الضوضاء للصورة. لهذه الغاية ، وضبط كثافة ضوء الاثاره ، والوقت التعرض والتسلق. تاكد من ان الإعدادات تسمح بالتصور المميز لكل خليه داخل الجزيرة عند الحد الأدنى من شده الضوء الممكنة والتعرض.
- تنفيذ الحصول علي الصور. اعتمادا علي المهمة ، يمكن ان تؤخذ الصور في 0.1 إلى 5 هرتز. هذا هو اقل بكثير من معايير نيكويست لذبذباتNa +يحركها بسرعة في α-وخلايا δ (≫ 300 هرتز) ، مما يعني ان البيانات الناقصة بشكل افتراضي. ومع ذلك ، فان زيادة وتيره الاستحواذ لتتناسب مع هذا الطلب غير ممكنة في التصوير متعدد الخلايا/العديد من الجزيرات مع مجال واسع من الرؤية. يمكن ان يكون GCaMP بشكل أسرع ، في حين ان Fluo4 سوف لا مفر منه التبييض تحت ظروف الاستحواذ السريع.
ملاحظه: بالنظر إلى ان [Ca2 +] التذبذباتcyt في خلايا الجزيرة مدفوعة بالنشاط الكهربائي ، وذلك باستخدام معدلات الاستحواذ منخفضه قد تبدو عكسية. في الواقع, ومع ذلك, معدلات الاستحواذ في حوالي أو فوق 1 هرتز قد تكون كافيه لحل الخلية β السلوك الشائك13, في حين ان عتبه الكشف عن الذبذبات التي يحركها قناه الصوديوم في α-وخلايا δ اعلي بكثير 300 هرتز. ما إذا كان يتم الحصول علي α-أو δ الخلية [Ca2 +] التذبذباتcyt في 1 هرتز أو 0.1 هرتز ، وسوف تكون العينات بشده وتعكس Ca2 + المناولة من قبل الخلية بدلا من النشاط الكهربائي.- التحقق من جوده البيانات المكتسبة: في الجلوكوز 3 مم ، يجب ان يكون نشاط الخلية α مرئيا بوضوح/قابلا للكشف. تاكد من ان هذا هو الحال والمضي قدما في التصوير الفاصل الزمني كامل النطاق.
- اختيار وضع التصوير والهدف ، ووضع الغرفة مع الجزر من الخطوة 3.1 علي المرحلة درجه الحرارة التي تسيطر عليها من المجهر.
- تصوير بفواصل زمنيه
- الاستفادة من الرسم البياني علي الإنترنت لديناميكيات الاشاره ، التي يتم تنفيذها في برنامج الاستحواذ إذا كان هذا متاحا. إذا كانت الرسوم البيانية عبر الإنترنت ليست خيارا ، فقم بتطبيق جدول البحث الذي يعرض كثافة الاشاره بالطريقة الأكثر شمولية (مثل "قوس قزح").
- تطبيق المحفزات بطريقه عكسية: تسجيل استعاده الاشاره إلى المستوي القاعدي. تجاهل القطع الاثريه في بداية ونهاية التسجيل. قد تبدو هذه الاخيره مثل لا رجعه فيه "زيادة"/"انخفاض" من المسبار فلوري بسبب التغيرات في درجه الحموضة أو وفاه الخلية.
- التفريق بين الخلايا α عن طريق التذبذب Ca2 + ديناميات ، في انخفاض الجلوكوز. إدخال الأدرينالين أو الغلوتامات في حل الحمام ، بعكس لمده 2-5 دقيقه. والقفزة السريعة في [Ca2 +]cyt تليها تباطؤ أو إلغاء التذبذبات سوف تتبع.
ملاحظه: الأدرينالين هو مركب علامة المعترف بها للخلايا α ، التي لها تاثير إيجابي انتقائي علي هذا السكان الفرعيين من خلايا جزيرة ، توسط من قبل الإفراج عن Ca2 + من مستودعات داخل الخلايا18. وقد وضعت عليها الغلوتامات واخر α خليه مؤثر محدد23. - أضافه/أزاله ghrelin ، التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا لتنشيط δ-الخلية انتقائي19،20. لاحظ زيادة سريعة عكسها في [Ca2 +]cyt في السكان فرعيه صغيره من خلايا جزيرة.
- أضافه/أزاله الجلوكوز 20 ملم. مراقبه استجابه التذبذب منسقه في السكان الفرعية β الخلية. لاحظ استجابه الخلايا التي تم تنشيطها في وقت سابق من قبل الأدرينالين أو الغلوتامات و ghrelin.
- حفظ تسلسل الصور. النظر في استخدام "الحفظ التلقائي" اثناء التسجيل.
4. تحليل البيانات
- تحليل صوره الفاصل الزمني.
- استيراد صوره الفاصل الزمني إلى برنامج تحليل الصور ، مثل المصدر المفتوح ImageJ/فيجي.
- إذا حدثت حركه كبيره/سريعة اثناء التسجيل ، فقم بتجاهل البيانات باعتبارها غير قابله للإصلاح. استخدام الإضافات ستالتيريج أو توربو24 لتصحيح الانجرافات الطفيفة.
- إنشاء صوره قناع للكشف عن الخلايا وتعيين منطقه الاهتمام (ROI). والطريقة المفضلة لتحقيق ذلك هي جعل صوره المكدس باستخدام أحدي الوظائف مثل "متوسط الكثافة" أو "الكثافة القصوى". الدالة التي سيتم استخدامها هي التي ستوفر أفضل تقدير للخلايا الفردية.
- عتبه صوره قناع ، وأزاله جميع البيانات خارج منطقه جزيرة. تعمل الدالة في الوضع التلقائي للصور 32 بت.
- الكشف عن الحد الأقصى في صوره عتبه. يمكن تمثيل الحد الأقصى بالنقاط أو المناطق أو حتى القطاعات ، إذا كانت الصورة كثيفه.
- تطبيق وظيفة "العثور علي ماكسيما" دون اي قيود الحجم ولصق الحدود القصوى المكتشفة في منطقه الاهتمام (ROI) محرر.
- علي نحو سلس/محرف كل من ROIs المعينة; ربما ، وسوف ROIs تتطلب التوسع. يمكن كتابه برنامج نصي بسيط ل (4.1.6-4.1.8) وتشغيل عده مرات لتوفير أفضل نتائج الكشف عن الخلايا. قد تتداخل عده ROIs ولكن هذا أمر نادر الحدوث.
- تحليل موقف ROIs ولصق البيانات الخاصة X و Y في برنامج الجدول الكتروني (علي سبيل المثال ، Microsoft Excel).
- تحليل الكثافة الرمادية مقابل الوقت لجميع ROIs ولصق البيانات في برنامج الجدول الكتروني.
- تحليل البيانات الرقمية.
- استيراد البيانات إلى برنامج تحليل البيانات. اعتمادا علي اختيار البرنامج ومده/أخذ العينات/حجم التجربة ، وهذا يمكن ان يكون عمليه بسيطه النسخ واللصق أو اجراء مستقل. ضمان ترتيب وتخزين البيانات الرقمية.
- استيراد الطوابع الزمنيه أو الملاحظات الزمنيه ، إذا كانت متوفرة.
- تطبيع بيانات كثافة الفلورية الخام ("F") إلى القيمة الاوليه للمضان ("F0"). هذا لا يحتاج إلى ان يكون مضان في النقطة الاولي ولكن يمكن ان يكون متوسط عده نقاط الاولي. وينبغي ان يقلل التطبيع من تقلب البيانات ، وفي حاله مثاليه (لا يوجد خط أساس عائم) يؤدي إلى مجموعه بيانات قابله للتحليل ("F/F0").
- إذا كانت الاختلافات بين خليه إلى خليه من مجموعه البيانات F/F0 لا تزال كبيره (التسجيل الطويل ، التبييض) ، قم باجراء تصحيح الأساس. وتحقيقا لهذه الغاية ، حدد منطقه "السيطرة" ، اي نطاق الوقت الذي تم فيه تطبيق حل التحكم (لجزر البنكرياس الفئران ، 3 مم الجلوكوز دون اي منبات/الخصوم).
- إذا كانت منطقه التحكم اشاره واضحة غير الذبذبات ، تفترض ان F/F0 كانت العودة إلى القيمة الاوليه (F/f0= 1) بعد كل تطبيق من حل التحكم. تصحيح بيانات الفاصل الزمني لكل خليه عن طريق تقسيم البيانات إلى مقاطع ، مفصوله بالنقاط عند أضافه حل عنصر التحكم ، وتطبيق التصحيح الخطي علي كل مقطع. لا تستخدم التصحيح متعدد الحدود أو غير الخطية الأخرى لان هذه النتائج في المصنوعات اليدوية.
- إذا كان نطاق التحكم يحتوي علي تذبذبات واضحة أو عوامل اضافيه (مثل الفلورية التلقائية) موجودة ، استخدم خوارزميه الكشف عن سبايك17. A تافه وسريعة التشغيل في جميع انحاء لذلك هو تحويل المويجات الحساسة ماكسيما (الشكل 3ا).
- تحديد حجم البيانات. علي الرغم من ان Ca2 + هو اشاره ديناميكية للغاية ، وتقديم ca2 + البيانات من حيث القيم المطلقة f/f0 مقبول علي نطاق واسع في الأدب الطبي الحيوي. إذا كانت نتائج التجارب المتعددة بحاجه إلى المقارنة ، فاختر مقياسا.
- قياس وتيره Ca2 + المسامير (الشكل 4ا ، د) ، واستجابتها لأضافه (النمل) منبات. ولهذه الغاية ، تقسيم التسجيل إلى فترات زمنيه متساوية وحساب التيميكورسي من التردد الجزئي (التردد الشائك في كل من الفواصل) عن طريق عد المسامير داخل الفاصل الزمني وتطبيع لمده الفاصل الزمني.
- وبدلا من ذلك ، قم بتعيين العتبة وحساب كسر الهضبة (pf) لكل من الفواصل الزمنيه المحددة أعلاه (الشكل 4ب ، و). يشير الكسر إلى النسبة المئوية للوقت ضمن الفاصل الزمني الذي أنفقته الخلية في الحالة "المتحمسة".
- بدلا من ذلك ، حساب المنطقة الجزئية تحت المنحني (pAUC) لكل من الفواصل الزمنيه المحددة أعلاه (الشكل 4C ، G). هذا المقياس حساس للتغيرات في كل من التردد والسعه لspiking.
ملاحظه: تحذير واحد لقياس التردد هو افتقارها للحساسية لمده الارتفاع وضعف الاستقرار. بما ان المعطيات يكون بثقل [اوندرستيفس] مقابل ال [رسكينغ] كهربائيه, الرقم من طفرات لكل فاصله صغيره إلى حد بعيد ولذلك ارتفاع وحيد اضافيه يستطيع بشكل كبير أثرت النتيجة. ' عنق الزجاجة ' من الفقير هو حساسيته للتغيرات في خط الأساس. علي الرغم من ان اقل عرضه للقطع الاثريه وأكثر حساسية للتغيرات في [Ca2 +]cyt من التردد ، pauc ومع ذلك ليست مفيده جدا حول طبيعة Ca2 + ديناميات. هضبة كسر توسع من المفتوحة احتمال مفهوم إلى ال [وهول-سل] نظامه. هو اقل قويه من [بول] رغم ذلك, واجبه إلى اعتماده علي العتبة قيمه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الجزر تحميل بشكل جيد إلى حد ما مع الاصباغ يمكن تتبع (الشكل 1ا) ، ما لم يتاثر تكوين الدهون من الغشاء (علي سبيل المثال ، عن طريق التعرض المزمن للأحماض الدهنية). الفيروس الأنفي البشري نوع 5 (Ad5) ناقلات يستهدف أيضا جميع الخلايا جزيرة (الشكل 1ب). قد تنشا مشاكل عندما يتم التعبير عن أكثر من جهاز استشعار المؤتلف في نفس الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان الجزر الكبيرة عاده ما يتم تعبئتها بشكل جيد جدا باستخدام التكنولوجيا الموصوفة أعلاه ، والتي توفر استقرارا استثنائيا ووصولا إلى الحلول.
Ca2 + ارتفاع في الخلايا α يمكن الكشف عنها بسهوله في مستويات الجلوكوز منخفضه (الشكل 2). هناك ارتباط خليه بخليه عاليه بين النشاط في انخفاض مستوي الجلوكوز والاستجابة إلى الأدرينالين والغلوتامات. Ghrelin ينشط بعض الخلايا الأدرينالين المستجيبة (α-الخلايا ؟) في انخفاض الجلوكوز ومع ذلك فانه ليس له تاثير علي Ca2 + ديناميات في معظم الخلايا التي يتم تنشيطها من قبل الجلوكوز منخفضه (β-الخلايا).
عند تحليلها من حيث التردد الجزئي (الشكل 4ا ، ج) ، فان الخلايا المحفزة علي الأدرينالين أو الغريلين تعرض زيادة كبيره تحت ظروف الكل أو لا شيء. وهذا هو ، خليه مع النشاط القاعدي منخفضه التي يحصل علي تفعيلها من قبل الأدرينالين أو جريلين يسلك زيادة كبيره في هذا المقياس. ومع ذلك ، فان التغيرات العامة بين الحنفية القاعدية وتاثير الأدرينالين خفيه جدا (الشكل 4ا ، ج). وعلي النقيض من ذلك ، فان اوك الجزئية حساسة للتغيرات التي ادخلها الأدرينالين في جميع الخلايا ، حتى عندما يكون النشاط القاعدي مرتفعا (الشكل 4ب ، د).
الشكل 1: تحميل الصبغة اليمكن تتبعه والتعبير عن المستشعر المؤتلف في الجزر الجزيرة. الجزر الماوس نموذجيه محمله يمكن تتبع صبغ فلوو-4 (ا) أو التعبير عن جهاز استشعار المؤتلف GCaMP6 في الطبقة الطرفية من الخلايا (B) أو في طبقه أعمق (C). وقد استخدمت sulforhodamine المقتفي القطبية B (تمثيل ، كما هو مبين الأبيض) لتحديد الخلايا الفردية داخل كل جزيرة25. (د) حركيه تمثيليه من Ca2 + استجابه للجلوكوز المسجلة من الخلايا الفردية داخل جزيرة باستخدام Fluo4. لاحظ التباين داخل الخلايا الصغيرة السكان. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نموذجي Ca2 + استجابه الخلايا جزيرة لمختلف المحفزات. النموذجية α-خليه (A) و δ (B) Ca2 + ديناميات ، استجابه للأدرينالين ، الغلوتامات ، ghrelin ، الجلوكوز. (ج)-(د) خرائط الحرارة لاستجابه الخلية الجزيرة تظهر الأدرينالين ايجابيه (ج) و ghrelin-ايجابيه (د) السكان الفرعيين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصحيح خط الأساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل بيانات الفاصل الزمني. تحليل Ca2 + ديناميات في خلايا α. التردد الجزئي (A) ، والجزء هضبة (B) والمنطقة التي تحت المنحني (ج) للخلايا α [Ca2 +]انا تتبع. الشعبي [Ca2 +]انا البيانات من جزيرة البنكرياس الفار وأعرب عن الخام (f/f0) (د) ، والتردد الجزئي (E) ، هضبة الجزء (و) والمنطقة تحت المنحني (ز). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك ثلاث مراحل في البروتوكول التي هي حاسمه للنجاح الشامل. الحقن الناجح لانزيم Liberase في القناة الصفراوية يحدد ليس فقط النجاح الكمي لاجراء العزل ولكن أيضا يؤثر علي نوعيه الجزر المعزولة. قد يؤدي البانكريتا غير المتضخمة إلى عدم وجود بعض الاستجابات الايضيه الهامه في الجزر المنعزلة. ثانيا ، ان تحميل الصبغة/التعبير عن المستشعر يحدد نسبه الاشاره إلى الضوضاء الخاصة بتسجيل الفاصل الزمني. الإشارات غائبه أو موهنه في الجزر الزائدة. وأخيرا ، فان التمركز الناجح والكثيف للانسجه داخل غرفه التصوير هو لحظه حاسمه للتجارب المجدية والقابلة للتحليل. يؤدي سوء وضع الانسجه أو نقلها إلى إهدار الوقت التجريبي و/أو البيانات غير الواضحة.
ويمكن تعديل الأسلوب لحساب الإشارات المتعددة (باستخدام النظام المحوري) ومجموعات متعددة من الجزر (علي سبيل المثال ، من النمط الجيني المختلف). التصوير من إشارات متعددة يفترض تسليم جهاز استشعار ثان في كل خليه من الجزيرة ، متوافقة طيفيا مع Ca2 + مراسل (مثل جهاز استشعار الأس الهيدروجيني SNARF5f26،27). وتحقيقا لهذه الغاية ، يمكن ان تكون الجزر مشتركه التحميل/المشتركة المصابة مع Ca2 + وأجهزه استشعار الأس الهيدروجيني ، والتي يتم بعد ذلك بالتسلسل الذين تتراوح أعمارهم داخل كل اطار زمني.
يتطلب تصوير الاشاره في مجموعات من الجزر التي تحتوي علي دقه أحاديه الخلية استخدام هدف واسع لمجال الرؤية. ومن المرجح ان يكون الهدف اقل من التكبير والفتحة العددية (NA) ، مما يقلل من الاستبانة المكانية. نظرا لزيادة عمق التركيز للهدف منخفض-NA ، يمكن اجراء التصوير علي نظام واسع المجال. مساوئ هذا الترتيب هي خليه خلوية عبر التلوث من اشاره الضوء وانخفاض القدرة علي صوره اشاره 3D (علي سبيل المثال ، الفئران التعبير عن Ca2 + الاستشعار تحت المروجين الانسولين). وفي الوقت نفسه ، يمكن ان تكون الاشاره المعبر عنها من خلايا الجزيرة السطحية محلوله تماما مع دقه زمنيه عاليه من المجموعات بما في ذلك عشرات إلى مئات من الجزر18.
علي الرغم من انه قد يبدو غير ساره ولكن أداء تحليل الصور وتحليل البيانات العددية في حزم البرمجيات منفصلة فكره جيده. في الوقت الحالي ، تهيمن ImageJ/فيجي علي تحليل الصور العلمية. البيئات الأكثر شعبيه لترميز العلمية هي بيثون و Matlab ، ومع ذلك هناك أيضا جهود معروفه لتحليل Ca2 + البيانات في R28. يتم توفير أفضل قابليتها للاستخدام من قبل المزيد من حزم المتخصصة مثل IgorPro. اختيارنا هو النموذج في Matlab/بيثون ومن ثم تنفيذ التعليمات البرمجية في IgorPro لاستخدام "خط أنابيب". ويمكن ان يكون تكييف حزم تحليل الإشارات الخاصة بالفيزيولوجيا الكهربية (علي سبيل المثال ، كلامبفيت ، Neuroexplorer) لتلبيه الاحتياجات التحليلية مفيدا للتصوير بالخلايا الواحدة ولكن من الصعب توسيع نطاقه. العديد من الخيارات التي تقدمها هذه الحزم لا تنطبق علي التصوير جزيرة بسبب انخفاض معدل أخذ العينات.
ومن المهم ان نتذكر ان هذه المنهجية محدوده بعدد من العوامل. أولا ، علي النحو المذكور أعلاه ، يستند التصوير إلى حد كبير إلى اختزال البيانات ، وهذا يعني انه لا يشير التالي لا يمكن مقارنته مباشره بالنشاط الكهربائي للخلية. ثانيا ، تاتي البيانات من محيط الجزيرة ولا تعكس عمليات الاقتران المهمة التي هي ، بصفه عامه ، ثلاثية الابعاد. ثالثا ، يؤثر مستوي التحميل/التعبير علي ادراك شده المستشعر. وأخيرا ، لا يمكن استبعاد تنشيط الخلايا الفرعية للخلايا الصغيرة التي يتم بحثها بشكل جيد (علي سبيل المثال ، خليه PP & ε) بواسطة مركبات العلامات ، علي الرغم من انه نظرا لقله عدد هذه الخلايا داخل الجزيرة ، فان اي تلوث محتمل سيكون ضئيلا.
والأسلوب هو "بطل" حقيقي من حيث التاثير البصري ، حيث ان العمليات المتذبذبة تعطي انطباعا قويا عن الانسجه الحية حقا. يطبق إلى [سوببوبولايشن] ثانويه خليه, الأسلوب مجسات العمل من كل واحده بثقة, يسمح تحديد من مجموعه فرعيه ويعكس التباين.
وقد درست ديناميات الكالسيوم في جزيرة البنكرياس β-خلايا لأكثر من 40 سنه ، مدفوعة في الغالب من التقدم في اقتناء/الكشف عن التكنولوجيا. وقد استخدمت الدراسات المبكرة التحليل الطيفي للامتصاص الذري29، ولكن لم يكن حتى وصول الفلورسنت Ca2 + مجسات30 ان حركيه مفصله يمكن حلها في خلايا جزيرة الفردية ، وذلك باستخدام القياس الضوئي31،32،33. بعد ذلك بفترة وجيزة ، تم تحسين العنصر المكاني من ca2 + حركيه كما ca2 + التصوير34،35،36 أصبحت التكنولوجيا الروتينية ، وذلك بفضل لأجهزه الشحن المتاحة حديثا الجهاز المقترن (CCD). وحلت مشكله الضوء خارج التركيز ، الذي أعاق تصوير الاشاره من الخلايا الفردية داخل الانسجه ، في منتصف تسعينات القرن العشرين عن طريق الفحص بالليزر المجهر البؤري المجهري (LSCM)37 والمجهر الداخلي الكلي للانعكاس المجهري (tirfm)38. وقد تم استخدام كلا الأسلوبين ، استكمالا بوصول جيل جديد من الفلورسنت ca2 + مجسات مثير مع ليزر 488 nm ، بنجاح لصوره ca2 + ديناميات في الخلايا جزيرة فرعيه39،40،41.
وقد طرح القرن الجديد اتجاهين جديدين نابعين من التطورات التكنولوجية المتصلة بعلوم الأعصاب. أولا ، أجهزه الاستشعار الفلورية المؤتلف استنادا إلى التحويل الدائري للمتغيرات GFP زيادة كبيره في نسبه الاشاره إلى الضوضاء ل Ca2 + الكشف ، وبشكل فعال جلب الدراسات إلى مستوي السكان خليه كبيره ، والتي ديناميات [Ca2 +]cyt في كل خليه يمكن حلها. وثانيا ، يسمح استخدام المروجين المتخصصين في الانسجه باستهداف التعبير عن المستشعر للفئات الفرعية الصغرى.
علي الرغم من التفكير عموما لتعكس التطورات في علم الأعصاب ، والدراسات علي جزيرة Ca2 + ديناميات لديها اثنين من الاختلافات الرئيسية. أولا ، من الناحية التكنولوجية ، اي في التصوير المجري من الإشارات جزيرة هو أكثر تعقيدا من التصوير في الدماغ بسبب التشريح لا يمكن التنبؤ بها من البنكرياس والجزر ' الموقع42. ثانيا ، اقتران الكهربائية ممتازة بين جزيرة β-الخلايا يجعل أساسا الجزر إلى السكان خاملة كهربائيا عرض الكمال علي ما يبدو كل أو لا شيء استجابه لتحفيز الجلوكوز عاليه. ونحن نعتقد ان الدراسات من [Ca2 +]انا حركيه في السكان الفرعيين جزيرة صغيره ، مثل خلايا δ ، علي أساس استهداف الانسجه محدده من المرجح ان يوسع معرفتنا من الصيدلة/علم الوظائف الفسيولوجية. وفي الوقت نفسه ، تسمح التحقيقات الشديدة الحساسية بتوسيع القوه الاحصائيه لهذه القياسات ، والمحاسبة علي التغير في جزيرة إلى جزيرة ، والسماح بتصوير الجزر من مختلف المجموعات في تجربه موازيه واحده.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
[آه] كان مستلمه من مرض السكري [اوك] دكتوراه [ستثنتشيب], [ايف] كان ساندت ب ال [اوكسون-ويلس] ثقة برنامج تدريب, [ايت] يمسك [ااكسفورد] [بيومديكل] [رسرش] مجلس دكتوراه زمالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | Thermo Fisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
References
- Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629 (1995).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
- Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
- Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
- Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137 (2001).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
- Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039 (2018).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727 (2016).
- Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
- Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
- Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
- Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
- Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
- Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
- Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
- Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
- Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
- Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
- Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
- Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
- Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
- van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).
