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Biology

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/59491
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,4,5
1Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford, 2Lund University Diabetes Centre, Unit of Molecular Metabolism, Clinical Research Centre, Malmö University HospitalMalmö, 3Institute of Neuroscience of Physiology, Department of Physiology, Metabolic Research Unit, University of Göteborg, 4Oxford National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre, 5Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

Summary

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging e la quantificazione della dinamica del calcio in popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule delle isolotiche pancreatiche. I reporter fluorescenti vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto, che viene poi immobilizzato e immagine, e viene eseguita l'analisi per cellula della dinamica dell'intensità della fluorescenza.

Abstract

Gli ormoni delle islet etiche regolano l'omeostasi della glicemia. I cambiamenti nella glicemia provocano oscillazioni di calcio citosolico nelle cellule delle issotiche pancreatiche che attivano la secrezione di tre ormoni principali: insulina (da cellule z), glucagone (cellule z) e somatostatina (cellule di zmetica). Le cellule z, che costituiscono la maggior parte delle cellule dell'isolotto e sono accoppiate elettricamente tra loro, rispondono allo stimolo del glucosio come un'unica entità. L'eccitabilità delle sottopopolazioni minori, le cellule zo-cellule e le cellule z e il 4% (10%) del roditore totale1 (umano2)impartita, rispettivamente) è meno prevedibile ed è quindi di particolare interesse.

I sensori di calcio vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto isolato. L'isolotto o un gruppo di isolotti viene quindi immobilizzato e immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza. La scelta della modalità di imaging è tra maggiore velocità effettiva (campo largo) e una migliore risoluzione spaziale (confocale). Convenzionalmente, la microscopia confocale a scansione laser viene utilizzata per l'imaging del tessuto, in quanto fornisce la migliore separazione del segnale tra le cellule vicine. Se il segnale contaminante proveniente dalla popolazione dominante delle cellule cellule è ridotto al minimo, è possibile utilizzare anche un sistema a campo largo, se il segnale contaminante proveniente dalla popolazione dominante delle cellule celle è ridotto al minimo.

Una volta registrate le dinamiche di calcio in risposta a stimoli specifici, i dati sono espressi in forma numerica come intensità di fluorescenza rispetto al tempo, normalizzati alla fluorescenza iniziale e corretti al basale, per eliminare gli effetti legati allo sbiancamento fluoroforo. Le variazioni della frequenza dei picchi o dell'area parziale sotto la curva (pAUC) vengono calcolate rispetto al tempo, per quantificare gli effetti osservati. pAUC è più sensibile e abbastanza robusto, mentre la frequenza di chiodare fornisce maggiori informazioni sul meccanismo di aumento del calcio.

Le sottopopolazioni di cellule minori possono essere identificate utilizzando risposte funzionali ai composti marcatori, come adrenalina e grelina, che inducono cambiamenti nel calcio citosolico in una specifica popolazione di cellule di isolotto.

Introduction

Lo scopo del metodo è quello di immaginare cambiamenti in tempo reale nella concentrazione di calcio citosolico ([Ca2]cyt) nelle sottopopolazioni minori di cellule dell'isolotto pancreatico. Questo permette di scoprire i meccanismi che regolano la secrezione ormonale in queste cellule, rivelando dettagli sul discorso incrociato tra diversi tipi di cellule e, potenzialmente, introducendo una dimensione della popolazione nel quadro più ampio della segnalazione dell'isolotto.

Le isole sono costituite da diversi tipi di cellule. Oltre alle più note cellule z che secernono insulina, ci sono almeno due sottopopolazioni che sono anche critiche nella regolazione della glicemia3. Le cellule di z (che costituiscono circa il 17% delle cellule di isolotto) secernono il glucagone quando la glicemia diventa troppo bassa, che segnala il rilascio di glucosio nel flusso sanguigno dai depositi nel fegato. Livelli eccessivi di glucagone (iperglucagonemia) e controllo alterato del rilascio di glucagone accompagnano (e, tecnicamente, possono contribuire alla condizione prediabetica della sensibilità all'insulina alterata4. Cellule (circa il 2%) somatostatina secernono in risposta all'elevazione del glucosio. Questo onnipresente ormone peptide è probabile che sia presente ad alte concentrazioni in prossimità di cellule di z e z all'interno delle isolotti, che ha un forte effetto attenuante mediato dalrecettore G su glucagone e secrezione di insulina.

Le cellule z e le cellule z condividono gran parte del meccanismo di rilevamento del glucosio con i loro parenti di lignaggio ravvicinato, le cellule z. Tutti e tre i tipi di cellule sono dotati dicanali K sensibili agli ATP, elaborati sensori metabolici5 che controllano il potenziale della membrana plasmatica di queste cellule eccitabili. Allo stesso tempo, la secrezione di insulina, somatostatina e glucagone è regolata in modo diverso dal glucosio. L'imaging delle dinamiche di Ca2 o nelle due sottopopolazioni minori di cellule inoteche può quindi fornire una visione del discorso incrociato tra la glicemia e la produzione segretante dell'isolotto.

I primi tentativi di monitorare l'eccitabilità delle cellule z- e z utilizzando l'elettrofisiologia del morsetto sono stati presto seguiti dall'imaging di Ca2o in singole cellule . L'identità delle cellule in questi esperimenti è stata verificata tramite una colorazione posteriore con anticorpi anti-glucagon o anti-somatostati. Questi sforzi sono stati spesso ostacolati dalla scoperta che le cellule dell'isolotto si comportano in modo molto diverso all'interno dell'isolotto e come singole cellule. Anche se le cellule z possono sembrare i principali benefattori della disposizione dell'isolotto (a causa della loro schiacciante maggioranza che sta alla base del loro forte accoppiamento elettrico), la discrepanza principale è stata, sorprendentemente, riscontrata nelle cellule a z. All'interno dell'isolotto, queste cellule sono costantemente e persistentemente attivate a basso glucosio, che è vero solo per circa il 7% delle singole cellule dello zonzoi disperso6. Si ritiene quindi che la segnalazione dell'attività delle cellule z- e z all'interno di isole intatte rappresenti un'approssimazione più ravvicinata delle condizioni in vivo.

In generale, ci sono due modi per riportare le dinamiche di Ca2 o specificamente dalle sottopopolazioni di cellule z-cellule o che si esprimono un sensore Ca2 o codificato geneticamente tramite un promotore specifico del tessuto o (ii) utilizzando composti marcatori. L'approccio precedente più elegante aggiunge il vantaggio sostanziale della vera imaging 3D e quindi dello studio della distribuzione cellulare all'interno dell'isolotto. Non può tuttavia essere applicato per materiale isolotto umano intatto. Un'altra preoccupazione potenziale è la "perdita" del promotore, in particolare quando è in atto la trasdifferenza delle cellule di z-z o la risposta delle cellule dell'alto glucosio. Quest'ultimo approccio può essere utilizzato con tessuto appena isolato, compresi campioni umani o isole coltivate. I dati, tuttavia, vengono raccolti esclusivamente dallo strato periferico delle cellule dell'isolotto, in quanto è difficile fornire la molecola di tintura/marcatore in strati più profondi senza alterare l'architettura dell'isolotto. Un vantaggio inaspettato di quest'ultimo approccio è la compatibilità con la modalità di imaging a campo largo, che consente di aumentare gli esperimenti per l'imaging simultaneo di decine o centinaia di isolotti (cioè da migliaia a decine di migliaia di cellule).

Il calcio è immaginato in vivo utilizzando sensori di famiglia GCaMP7 (o pericam8)geneticamente codificati, che sono varianti di proteina fluorescente verde permutata in modo circolare (GFP) fusa alla proteina calmodulin che lega il calcio e alla sua sequenza bersaglio, frammento di M13 della filiera luminosa della miosinacinsia 7,9. I GCaMP hanno eccellenti rapporti segnale-rumore nella gamma delle concentrazioni nanomolare Ca2 e un'alta sezione trasversale a 2 fotoni, che li rende una scelta ideale per il lavoro in vivo10,11. L'aspetto impegnativo dell'utilizzo di sensori ricombinanti è la loro consegna nelle cellule. L'espressione eterologa richiede l'uso di un vettore virale e di una coltura ex vivo di più ore, che spesso solleva preoccupazioni per quanto riguarda la potenziale dedifferenziazione o deterioramento delle funzioni cellulari. Sebbene i modelli murini preprogettati per esprimere GCaMP risolvano questo problema, aggiungono nuove sfide aumentando notevolmente i tempi di anticipo e limitando il lavoro a un modello non umano. Un'elevata sensibilità ai cambiamenti del pH intracellulare è un altro aspetto negativo dei sensori a base di proteine12, che è, tuttavia, meno un problema per il rilevamento dei segnali oscillatori, come Ca2 .

Il vantaggio dei coloranti trappable (come il Fluo4 fluorescente verde) è che possono essere caricati in un tessuto appena isolato entro circa un'ora. Prevedibilmente, i coloranti trappable hanno rapporti segnale-rumore più bassi e (molto) una fotostabilità inferiore rispetto alle loro controparti ricombinanti. Non possiamo confermare13 le segnalazioni di tossicità dei coloranti trappable14, tuttavia, il sovraccarico di coloranti è un problema frequente.

I sensori red ricombinanti Ca2o basati sulla permutazione circolare si sono evoluti rapidamente dal 201115,e gli sviluppi più recenti presentano una forte concorrenza per i GP16 per l'imaging dei tessuti, data una maggiore profondità di penetrazione della luce rossa. I coloranti rossi trappable disponibili in commercio possono essere utilizzati in modo affidabile per l'imaging a una singola cellula, ma, a livello tissutale, non possono competere bene con gli analoghi verdi.

C'è apparentemente pochissima scelta di tecnologia di imaging per esperimenti nel tessuto in cui la luce fuori fuoco diventa un problema critico. Il sistema confocale prevede una risoluzione accettabile a cella singola mediante la cancellazione della luce sfocata con qualsiasi obiettivo sulla NA superiore a 0,3 (per il caso di GCaMP6) o a 0,8 (colorante trappable). In senso tecnico, un microscopio confocale convenzionale può essere utilizzato per l'imaging simultaneo di [Ca2 ]cyt da centinaia (GCaMP) o decine di isolotti (tintura trappable). L'unica alternativa realistica alla modalità confocale in caso di espressione 3D del sensore nel tessuto è forse la microscopia a foglio luminoso.

Le cose sono leggermente diverse per il caso in cui il sensore è espresso nello strato periferico delle cellule all'interno del tessuto dell'isolotto. Per i sensori ricombinanti luminosi che hanno un modello di espressione intracellulare vivido, l'utilizzo di una modalità di imaging a campo largo con un obiettivo a basso NA può fornire una qualità sufficiente e premiare il ricercatore con un aumento sostanziale nel campo visivo e quindi Velocità effettiva. Un sistema a campo largo fornisce una risoluzione spaziale più scarsa, in quanto la luce fuori fuoco non viene annullata; pertanto, l'imaging del tessuto con obiettivi ad alta NA (bassa profondità di campo) è meno informativo, in quanto il segnale a singola cellula è notevolmente contaminato dalle cellule vicine. La contaminazione è molto più piccola per gli obiettivi a bassa NA (alta profondità di campo).

Esistono tuttavia attività per le quali una velocità effettiva elevata e/o una frequenza di campionamento diventano un vantaggio critico. Le cellule z- e z mostrano una sostanziale eterogeneità, che crea una domanda di campioni di dimensioni elevate per rivelare il contributo delle sottopopolazioni. L'imaging a campo largo è veloce e più sensibile, con un sistema su larga scala su larga scala su larga scala centinaia (GCaMP) o decine (Fluo4) di isolotti allo stesso rapporto segnale-rumore degli esperimenti confocali su dieci o un singolo isolotto, rispettivamente. Questa differenza di throughput rende il sistema a campo largo vantaggioso per l'imaging populationale con una risoluzione a cella singola, che può essere particolarmente critica per le piccole sottopopolazioni come quella a cellule z. Allo stesso modo, i tentativi di ricostruire l'attività elettrica da Ca2' spiking17 beneficerebbero della più alta frequenza di campionamento fornita da una modalità di imaging a campo largo. Allo stesso tempo, diversi problemi di nicchia come l'attività delle cellule z pancreatiche dopo la stimolazione della sottopopolazione dominante delle cellule z, richiedono l'uso di un sistema confocale. Un fattore che influenza la decisione verso la modalità confocale è la presenza di un sostanziale segnale di contaminazione proveniente dalla sottopopolazione a celle z.

Sebbene l'uso della colorazione ormonale specifica degli anticorpi per verificare l'identità delle cellule dopo gli esperimenti di imaging sia ancora un'opzione, le sottopopolazioni di cellule minori possono essere identificate utilizzando composti marcatori funzionali, come adrenalina e grelina che hanno dimostrato di stimolare selettivamente le dinamiche di Ca2 o in z- 18 e diz-18 , rispettivamente.

L'analisi dei dati di imaging time-lapse mira a fornire informazioni al di là della banale farmacologia, come l'eterogeneità della popolazione, la correlazione e l'interazione di diversi segnali. Convenzionalmente, i dati di imaging vengono analizzati come intensità rispetto al tempo e normalizzati alla fluorescenza iniziale (F/F0). La correzione della linea di base è spesso necessaria, a causa dello sbiancamento del segnale fluoroforo o della contaminazione da cambiamenti nell'autofluorescenza o nel pH (tipicamente indotta da livelli di glucosio12). I dati di Ca2 possono essere analizzati in molti modi diversi, ma tre tendenze principali sono misurare i cambiamenti nella frequenza dei picchi, nella frazione dell'altopiano o nell'area sotto la curva, calcolata rispetto al tempo. Abbiamo trovato quest'ultimo approccio vantaggioso, soprattutto in applicazione per dati confocali fortemente sottocampionati. Il vantaggio della metrica pAUC è la sua sensibilità a entrambe le variazioni nella frequenza del segnale e nell'ampiezza, mentre calcolare la frequenza richiede un numero sostanziale di oscillazioni21, che è difficile da raggiungere utilizzando l'imaging convenzionale. Il fattore limitante dell'analisi pAUC è la sua elevata sensibilità alle modifiche di base.

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Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati sviluppati in conformità con il United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986) e l'University of Oxford ethical guidelines.

1. Isolare le isole pancreatiche del topo

  1. Preparare il supporto di coltura e la soluzione di isolamento.
    1. Comporre il mezzo di coltura: RMPI1640 (vedi Tabella dei materiali), integrato con il 10% del siero di vitello fetale, 100 unità/mL di penicillina, 100 streptomicino. Distribuisci il mezzo in due piatti Petri in plastica da 60 mm (non trattati con adesivo) e mantieni i piatti nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2, umidità assoluta).
    2. Trucco della soluzione di isolamento (50 mL/mouse): mezzo di Hanks con glucosio a 5 mM, 100 unità/mL penicillina 100 g/mL streptomycin. Tenere il ghiaccio (4 gradi centigradi).
    3. Costituisci la soluzione enzimatica (ad esempio, Libera): 0,2 mg/mL nella soluzione di isolamento, 2 mL per mouse. Tenere il ghiaccio (4 gradi centigradi). Facoltativamente, pre-testare l'attività di liberazione e ottimizzare i parametri di incubazione per ogni lotto dell'enzima22.
  2. Iniettare la soluzione enzimatica nel condotto biliare del topo.
    1. Sacrificare il topo (12 settimane di vecchia imbecille, C57Bl/6J) tramite lussazione cervicale.
    2. Al microscopio a dissezione, tagliare aprire la pelle e gli strati muscolari utilizzando forbici fini e individuare il dotto biliare.
    3. Ligate l'intestino su entrambi i lati della giunzione con il dotto biliare, utilizzando un filo di cotone.
    4. Sollevare delicatamente il dotto biliare con le pinze curve dell'orologiaio fine e introdurre la soluzione enzimatica ghiacciata nel condotto utilizzando una siringa da 2 mL con un ago da 30G. Un'inflazione del pancreas dovrebbe essere osservata in questa fase.
    5. Raccogliere il pancreas gonfiato utilizzando una combinazione di pinze del pollice dal muso smussato e pinze dell'orologiaio fine in un tubo falco da 15 mL e tenerlo sul ghiaccio (4 gradi centigradi). Aggiungere 1 mL della soluzione enzimatica nel tubo.
  3. Liberare e raccogliere le isole pancreatiche dal pancreas.
    1. Incubare il pandicaro inammato con la soluzione enzimatica per 16 min in un bagno d'acqua, a 37 gradi centigradi. È possibile usare una leggera scossa, ma non è critica, a condizione che l'inflazione sia stata buona.
    2. Fermare la digestione mediante l'aggiunta di una soluzione di isolamento ghiacciato, fino a 10 mL. Scuotere delicatamente il digest: dovrebbe cadere in piccoli pezzi.
    3. Lavare il digest tre volte in 10 mL della soluzione di isolamento, lasciare riposare 5 min a 1 g per sedimentare le isole liberate, sul ghiaccio. Aspirare delicatamente il supernatante, con una pipetta sierologica da 10 mL.
    4. Aggiungere RPMI freddo al digest (per fare fino a 10 mL).
    5. Utilizzare piatti Petri in plastica (passaggio 1.1.1) per prelevare le isole. Decant il mezzo RMPI da uno dei piatti Petri, e versare delicatamente un po '(4-5 mL) del digest invece. Raccogliere le isole liberate che appaiono come pezzi rotondi, lisci e ad alta densità, con una pipetta P10 nel secondo piatto Petri.
    6. Coltura le isole nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2, umidità assoluta). L'esperimento può essere messo in pausa in questa fase. Lasciare le isole per 1-2 ore è creduto da alcuni per aiutare a recuperare dallo stress meccanico durante l'isolamento.

2. Caricare il tasino o esprimere il sensore

  1. Preparare il tallonanti trappable.
    1. Sciogliere l'aliquota (normalmente, 50 g) del colorante trappable (ad esempio, Fluo-4) in DMSO ad una concentrazione di scorte di 2 mM. Aggiungere l'acido pluronico a una concentrazione finale dell'1% (utilizzando uno stock del 20% in DMSO), per migliorare la solubilità del coloranti.
    2. Aliquota in piccoli tubi PCR (2 gradi in ciascuno). Il colorante può essere conservato congelato (-20 gradi centigradi) per diverse settimane.
  2. In alternativa, preparare il sensore ricombinante.
    1. Distribuire il sensore (ad es. la codifica vettoriale adenovirale GCaMP6f) in 10 aliquote e conservare a -80 gradi centigradi.
    2. (Opzionalmente) pre-testre il titolo del titolo virale infettando le isole (come di seguito) utilizzando diversi diluizioni seriali, per rivelare la concentrazione ottimale per l'infezione.
      NOTA: I sensori ricombinanti codificati da diversi vettori (lentivirus, BacMam, AAV) richiedono un protocollo di infezione diverso. Assicurati di controllare questo con il provider di vettori e ottimizzare il rapporto di lavoro per le tue esigenze. Lo stock "di lavoro" dell'adenovirus può essere immagazzinato a -20 gradi centigradi e congelato/scongelato più volte. L'eccessivo ciclo di congelamento riduce il titro efficace del virus.
  3. Preparare la soluzione di imaging.
    1. Make up the imaging solution, mM: 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl2, 1.2 MgCl2, 1 NaH2PO4, 5 NaHCO3, 10 HEPES (pH 7.4, con NaOH).
    2. Fare uno stock di glucosio (0,5 M) e mannitolo (0,5 M) nella soluzione di imaging. Il brodo può essere conservato in frigorifero (4 gradi centigradi) per diverse settimane.
  4. Caricare il tallonanti trappable.
    1. Comporre la soluzione di lavoro del tintura sciogliendo 2 -L del tinrito in 600 -L della soluzione di imaging contenente 6 mM di glucosio. La soluzione può essere riscaldata o vortice per migliorare la solubilità.
    2. Caricare gli isolotti isolati nel passaggio 1 nella soluzione di lavoro del tinri. Il caricamento può essere fatto utilizzando un piatto multiwell o un piatto Petri. In quest'ultimo caso, inserire una goccia da 100 l una della soluzione di lavoro sul fondo di una parabola Petri non adesiva (35 o 60 mm) e di una pipetta 10-30 isolotti nella goccia.
    3. In caso di diversi gruppi di isolotti (ad es. wild-type/knock-out), disporre più pozzetti e goccioline multiple in modo che il caricamento possa essere effettuato contemporaneamente.
    4. Incubare le isole nella soluzione di lavoro coloranti a temperatura ambiente al buio per 70-90 minuti. Non incubare eccessivamente.
    5. Controllare il carico al microscopio a fluorescenza; le isole dovrebbero ottenere una lieve fluorescenza, con alcune cellule più luminose delle altre. L'arrotondamento delle cellule e la localizzazione nucleare del colorante sono segni di sovraccarico.
    6. Trasferire le isole in una soluzione di imaging senza coloranti contenente 6 m di glucosio. Gli isolotti possono essere utilizzati per l'imaging immediatamente, ma opzionalmente il coloranti può essere lasciato per dissidratare per altri 10-15 minuti. Le isole manterranno il tinriper per diverse ore e quindi possono essere utilizzate per l'imaging in diversi turni.
  5. In alternativa, infettare le isole con il vettore ricombinante.
    1. Innilare le isolotti nelle goccioline nel mezzo di coltura RPMI (passaggio 1.1.1) (ad es., 30 gradi centigradi), per ridurre al minimo il volume del vettore necessario.
    2. Aggiungere il vettore a un rapporto di circa 105 unità infettive/isolotto che dovrebbe idealmente provocare la molteplicità di infezione >2. Idealmente il rapporto dovrebbe essere ottimizzato al rapporto minimo che fornirebbe espressione nel livello periferico. La pre-titolazione (passaggio 2.2.3) può essere d'aiuto.
    3. Introdurre 20-50 isolotti nella goccia e nella coltura per 8-48 ore. (Idealmente, durante la notte). Le isole dovrebbero sviluppare una debole fluorescenza verde nella maggior parte delle cellule, senza cambiamenti nella morfologia cellulare.
      NOTA: Il successo dell'infezione e dell'espressione dipende dal tempo di esposizione alla soluzione del virus. Idealmente, il virus dovrebbe rimanere in soluzione durante la notte, ma può essere facoltativamente rimosso dopo un minimo di 15 minuti. Tuttavia, l'infettività, e quindi l'espressione, è probabile che sia drammaticamente inferiore.

3. Imaging Ca2 o dinamica

  1. Immobilizzare le isole al microscopio (invertito).
    1. Assemblare la camera di imaging per la microscopia invertita. Posizionare il coperchio di vetro (spessore 1 o 1,5) all'interno della camera e assicurarsi che l'interfaccia della camera di vetro sia a tenuta stagna. Verificare che il coperchio sia alla portata dell'obiettivo del microscopio (critico per il caso di un obiettivo ingombrante high-NA).
    2. Preparare gli accessori di immobilizzazione. Tagliare piccoli rettangoli (20 mm x 20 mm) dalla maglia fine e dalla mesh grossolana. Introdurre due "pareti" distanziali sulla maglia fine utilizzando un nastro adesivo spesso 45-50 m. Utilizzare doppi strati del distanziale se le dimensioni delle isole da immagine superano sostanzialmente i 100 m convenzionali.
    3. Immergere le maglie e il peso nella soluzione di imaging utilizzando una parabola Petri da 35 mm. Assicurarsi che la plastica e il metallo siano bagnati.
    4. Sotto un microscopio a dissezione, girare la maglia fine con le "pareti" distanziale a testa in giù, i distanziali rivolti verso l'alto. Scegli diversi isolotti caricati con il tintura trappable o esprimendo il sensore ricombinante con una pipetta P20 e posizionali delicatamente sopra la maglia fine, tra i due distanziali. Assicurarsi che la rete e le lavaforme non contengano quantità eccessive della soluzione di imaging su di esse.
    5. Raccogliere la maglia con le isole, utilizzando le pinze dell'orologiaio, e posizionarla a testa in giù all'interno della camera di imaging, in modo che i distanziali rivolti verso il basso e si siedano direttamente sulla copertina della camera. Assicurarsi che le isole siano intrappolate tra i distanziali e la mesh, al centro della coverslip.
    6. Posizionare la maglia grossolana e il peso sulla parte superiore della maglia fine all'interno della camera. Introdurre la soluzione di imaging nella camera. Assicurarsi che gli isolotti siano immobilizzati e pronti per essere immagine. Evitare l'eccessiva agitazione della camera (piccole perturbazioni come portare la camera al microscopio e l'inserimento in una fase riscaldata sono accettabili).
      NOTA: Una disposizione di immobilizzazione simile può essere applicata per un sistema verticale.
  2. Impostare il microscopio.
    1. Scegliere la modalità di imaging e l'obiettivo, posizionare la camera con le isole dal punto 3.1 sullo stadio a temperatura controllata del microscopio.
      1. Impostare il controllo della temperatura (idealmente, tra i 30 e i 36 gradi centigradi) e la perifusione. Per un sistema invertito, posizionare l'afflusso più in basso rispetto al deflusso all'interno della camera e impostare il flusso di deflusso in modo che sia maggiore di quello dell'afflusso (che in genere si ottiene utilizzando un tubo di un diametro interno più ampio su una pompa peristaltica).
      2. Assicurarsi che il deflusso abbia una superficie di contatto minima con la soluzione, in modo che rimuova la soluzione in più piccole goccioline sequenziali, evitando lunghi intervalli di rimozione continua della soluzione. Quest'ultimo è la principale fonte di artefatto nell'imaging time-lapse dei segnali periodici in quanto appaiono come oscillazioni periodiche periodiche di intensità regolare di ogni pixel immagine e sono spesso interpretate come "onde lente".
      3. Avviare la perifusione con la soluzione di imaging contenente 3 mM di glucosio.
    2. Scegliere il percorso della luce e i filtri per l'imaging dei fluorofori verdi; eccitazione tra 470 e 500 e le emissioni tra 505 e 550 funzionerebbero per ciascuno di essi.
    3. Eseguire l'imaging dal vivo per impostare i parametri di imaging. Regolare la vista per acquisire le isole di interesse.
    4. Ottimizzare il rapporto segnale-rumore dell'immagine. A tal fine, regolare l'intensità della luce di eccitazione, il tempo di esposizione e il binning. Assicurarsi che le impostazioni consentano una visualizzazione distinta di ogni cella all'interno dell'isolotto al minimo possibile intensità e esposizione della luce.
    5. Eseguire l'acquisizione dell'immagine. A seconda del compito, le immagini possono essere scattate da 0,1 a 5 Hz. Questo è ben al di sotto dei criteri Nyquist per le oscillazioni veloci Na-guidate nelle celle zo e z (>300 Hz), il che significa che i dati sono sottocampionati per impostazione predefinita. Tuttavia, aumentare la frequenza di acquisizione per soddisfare questa domanda non è fattibile nell'imaging multicellulare/multi-ilet con un ampio campo visivo. GCaMP può essere ripreso più velocemente, mentre Fluo4 inevitabile candeggina in condizioni di acquisizione rapida.
      NOTA: Dato che le oscillazioni cit [Ca2]nelle celle dell'isolotto sono guidate dall'attività elettrica, l'utilizzo di bassi tassi di acquisizione può sembrare controproducente. In realtà, tuttavia, i tassi di acquisizione a circa o sopra 1 Hz possono essere sufficienti per risolvere il comportamento di chiodare cellularez 13, mentre la soglia per il rilevamento delle oscillazioni basate sul canale di sodio nelle cellule z- e z-i - è ben al di sopra di 300 Hz. Se le oscillazionidel cit a cellule [Ca2]vengono acquisite a 1 Hz o 0,1 Hz, saranno gravemente sottocampionate e rifletteranno la manipolazione della cellada 2 o più piuttosto che l'attività elettrica.
      1. Controllare la qualità dei dati acquisiti: a 3 mM di glucosio, l'attività delle cellule z dovrebbe essere chiaramente visibile/rilevabile. Assicurarsi che questo sia il caso e procedere all'imaging time-lapse su larga scala.
  3. Imaging time-lapse
    1. Utilizzare un grafico online delle dinamiche del segnale, implementato nel software di acquisizione se questo è disponibile. Se la creazione di grafici online non è un'opzione, applicare una tabella di ricerca che visualizza l'intensità del segnale nel modo più completo (ad esempio "arcobaleno").
    2. Applicare gli stimoli in modo reversibile: registrare il recupero del segnale al livello basale. Ignorare gli artefatti all'inizio e alla fine della registrazione; quest'ultimo può sembrare irreversibile "aumento"/"diminuzione" della fluorescenza sonda a causa di cambiamenti nel pH o morte cellulare.
    3. Differenziare le cellule z con la dinamica oscillatoria Di Ca2 o a basso contenuto di glucosio. Introdurre adrenalina o glutammato nella soluzione di bagno, reversibilmente per 2-5 min. Seguirà un rapido salto nelcit [Ca2]seguito da un rallentamento o dalla cancellazione delle oscillazioni.
      NOTA: L'adrenalina è un composto marcatore riconosciuto per le cellule a z, che ha un effetto positivo selettivo su questa sottopopolazione di cellule di isolotto, mediata dal rilascio di Ca2 , da depositi intracellulari18. Il glutammato è stato messo in atto come un altro agonista specifico di cellule di z23 .
    4. Aggiungere/rimuovere la grelina, che è stata recentemente segnalata per attivare selettivamente le cellule di z19,20. Osservare un rapido aumento reversibile delcit [Ca2]in una piccola sottopopolazione di celle di isolotto.
    5. Aggiungere/rimuovere 20 mM di glucosio. Osservare una risposta oscillatoria coordinata nella sottopopolazione a celle a z. Si noti la risposta delle cellule che sono state attivate in precedenza da adrenalina o glutammato e grelina.
    6. Salvare la sequenza di immagini. Considerare l'utilizzo di "Salvataggio automatico" durante la registrazione.

4. Analisi dei dati

  1. Analizzare l'immagine time-lapse.
    1. Importare l'immagine time-lapse in un software di analisi delle immagini, ad esempio un ImageJ/FIJI open source.
    2. Se durante la registrazione si è verificato un movimento sostanziale/rapido, eliminare i dati come non riparabili. Utilizzare i plug-in StackReg o TurboReg24 per correggere le derive minori.
    3. Creare un'immagine maschera per il rilevamento delle celle e la mappatura dell'area di interesse (ROI). Il modo migliore per raggiungere questo obiettivo sarebbe quello di fare un'immagine di stack utilizzando una delle funzioni come "intensità media" o "intensità massima". La funzione da utilizzare è quella che fornirà il miglior riconoscimento delle singole cellule.
    4. Soglia l'immagine della maschera, rimuovere tutti i dati al di fuori dell'area dell'isolotto. La funzione funziona in modalità automatica per le immagini a 32 bit.
    5. Rilevare maxima nell'immagine di soglia. Il maxima può essere rappresentato da punti, regioni o anche settori, se l'immagine è densa.
    6. Applicare la funzione 'find maxima' senza alcuna limitazione di dimensione e incollare il maxima rilevato nell'editor della regione di interesse (ROI).
    7. Uniformare/interpolare ciascuno dei ROI mappati; possibile, i ROI richiederanno un'espansione. Uno script semplice può essere scritto per (4.1.6-4.1.8) ed eseguito più volte per fornire i migliori risultati di rilevamento delle celle. Diversi ROI possono sovrapporsi, ma questo è raro.
    8. Analizzare la posizione dei ROI e incollare i rispettivi dati X e Y nel software della tabella elettronica (ad esempio, Microsoft Excel).
    9. Analizzare l'intensità del grigio rispetto al tempo per tutte le ROI e incollare i dati nel software della tabella elettronica.
  2. Analizzare i dati numerici.
    1. Importare i dati nel software di analisi dei dati. A seconda della scelta del software e della durata/campionamento/dimensione dell'esperimento, può trattarsi di una semplice operazione di copia-incolla o di una procedura autonoma. Garantire la disposizione e l'archiviazione dei dati numerici.
    2. Importare gli indicatori di data e ora o le note di data e ora, se disponibili.
    3. Normalizzare i dati sull'intensità della fluorescenza non elaborata ("F") al valore iniziale della fluorescenza ("F0"). Questa non deve essere la fluorescenza nel primo punto, ma potrebbe essere la media di diversi primi punti. La normalizzazione dovrebbe ridurre la variabilità dei dati e, in un caso ideale (nessuna linea di base di deriva) si traducono in un set di dati analizzabile ("F/F0").
    4. Se la variabilità da cella a cella del set di dati F/F0 è ancora sostanziale (registrazione lunga, sbiancamento), eseguire la correzione della linea di base. A tal fine, definire una regione di controllo, vale a dire l'intervallo di tempo durante il quale è stata applicata la soluzione di controllo (per le isole pancreatiche dei topi, 3 mm di glucosio senza agonisti/antagonisti).
      1. Se l'area di controllo dispone di un segnale non oscillatorio chiaro, si supponga che F/F0 stesse tornando al valore iniziale (F/F0) dopo ogni applicazione della soluzione di controllo. Correggere i dati time-lapse per ogni cella suddividendo i dati in segmenti, separati dai punti in cui è stata aggiunta la soluzione di controllo e applicando una correzione lineare a ogni segmento. Non utilizzare una correzione polinomiale o non lineare in quanto ciò si traduce in artefatti.
      2. Se l'intervallo di controllo presenta oscillazioni chiare o fattori aggiuntivi (ad esempio l'autofluorescenza FAD), utilizzare un algoritmo di rilevamento dei picchi17. Una corsa banale e veloce per questo è una trasformazione wavelet massima sensibile (Figura 3A).
    5. Quantificare i dati. Anche se Ca2 è un segnale altamente dinamico, la presentazione dei dati di Ca2 in termini di valori F/F0 assoluti è ampiamente accettabile nella letteratura biomedica. Se è necessario confrontare i risultati di più esperimenti, scegliere una metrica.
      1. Misurare la frequenza dei picchi di Ca2 (Figura 4A,D) e la sua risposta all'aggiunta di (ant)agonisti. A tal fine, dividere la registrazione in intervalli di tempo uguali e calcolare il percorso temporale della frequenza parziale (frequenza di bloccamento in ciascuno degli intervalli) contando i picchi all'interno dell'intervallo e normalizzando la durata dell'intervallo.
      2. In alternativa, impostare la soglia e calcolare la frazione dell'altopiano (pf) per ciascuno degli intervalli definiti in precedenza (Figura 4B,F). La frazione indica la percentuale di tempo all'interno dell'intervallo trascorso dalla cella nello stato "eccitato".
      3. In alternativa, calcolare l'area parziale sotto la curva (pAUC) per ciascuno degli intervalli definiti in precedenza (Figura 4C,G). Questa metrica è sensibile ai cambiamenti sia nella frequenza che nell'ampiezza dell'abbaiare.
        NOTA: Un avvertimento per misurare la frequenza è la sua mancanza di sensibilità per la durata del picco e scarsa stabilità. Poiché i dati sono fortemente sottocampionati rispetto all'icona elettrica, il numero di picchi per intervallo è piuttosto piccolo e quindi un unico picco in più può influenzare notevolmente il risultato. Il "collo di bottiglia" del pAUC è la sua sensibilità alle variazioni della linea di base. Anche se meno soggetto a artefatti e più sensibile ai cambiamenti nelcit [Ca2]rispetto alla frequenza, pAUC tuttavia non è molto informativo sulla natura delle dinamiche di Ca2. La frazione di plateau è un'espansione del concetto di probabilità aperta all'intero sistema cellulare. È meno robusto di pAUC, tuttavia, a causa della sua dipendenza dal valore soglia.

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Representative Results

Le isole si caricano abbastanza bene con i coloranti trappable (Figura 1A), a meno che la composizione lipidica della membrana non sia stata influenzata (ad esempio, dall'esposizione cronica agli acidi grassi). Il vettore adenovirus umano di tipo 5 (Ad5) si rivolge anche a tutte le celle dell'isolotto(Figura 1B). I problemi possono sorgere quando più di un sensore ricombinante viene espresso nella stessa cella. Inoltre, gli isolotti sono in genere molto ben immobilizzati utilizzando la tecnologia descritta in precedenza, che fornisce una stabilità eccezionale e l'accesso alla soluzione.

È possibile rilevare immediatamente i chiodi dicIl2 nelle cellule a z a bassi livelli di glucosio(Figura 2). C'è un'alta correlazione cellula per cellula tra l'attività a basso glucosio e la risposta all'adrenalina e al glutammato. Ghrelin attiva alcune cellule che rispondono all'adrenalina (cellule-cellule?) a basso contenuto di glucosio, ma non ha alcun effetto sulla dinamica di Ca2 o nella maggior parte delle cellule che vengono attivate da glucosio basso (cellule z).

Quando vengono analizzate in termini di frequenza parziale (Figura 4A,C), le cellule stimolate dall'adrenalina o dalla grelina mostrano un aumento sostanziale in condizioni tutto o niente. Cioè, una cella con bassa attività basale che viene attivata da adrenalina o grelina mostra un drammatico aumento di questa metrica. Tuttavia, i cambiamenti complessivi tra chiodare basale e l'effetto adrenalina sono molto sottili (Figura 4A,C). Al contrario, l'AUC parziale è sensibile ai cambiamenti introdotti dall'adrenalina in tutte le cellule, anche quando l'attività basale è elevata (Figura 4B,D).

Figure 1
Figura 1: Caricamento del tincolo trappable ed espressione del sensore ricombinante nelle isole. Itipi ciclici tipici del mouse caricati con il colorante trappable Fluo-4 (A) o che esprimono il sensore ricombinante GCaMP6 nello strato periferico delle cellule (B) o nello strato più profondo (C). Il tracciante polare sulforhodamine B (SRB, mostrato come bianco) è stato utilizzato per delineare singole cellule all'interno di ogni isolotto25. (D) Cinetica rappresentativa di Ca2 in risposta al glucosio registrato da singole cellule all'interno dell'isolotto utilizzando Fluo4. Si noti l'eterogeneità all'interno di popolazioni di cellule minori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: tipica risposta Ca2 o delle cellule di isolotto a vari stimoli. Tipichedinamiche di z-cellula (A) e cellule z-cellula (B),in risposta all'adrenalina, al glutammato, alla grelina, al glucosio. (C)-(D) Mappe di calore della risposta della cella dell'isolotto che mostrano sottopopolazioni adrenaliniche positive (C) e grerelin-positive (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Correzione della linea di base. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: analisi dei dati time-lapse. Analisi delle dinamiche di Ca2 o nelle cellule a z. Frequenza parziale (A), frazione pialto (B) e area sotto la curva (C) di una traccia di z-cells [Ca2 ]i. Popolazione [Ca2 ]i dati da una lese pancreatica del topo espressi come grezzi (F/F0) (D), frequenza parziale (E), frazione plateau (F) e area sotto la curva (G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ci sono tre fasi del protocollo che sono fondamentali per il successo generale. Il successo dell'iniezione dell'enzima Liberase nel dotto biliare determina non solo il successo quantitativo della procedura di isolamento, ma influisce anche sulla qualità delle isole isolate. Pancreata non gonfiata può provocare la mancanza di alcune importanti risposte metaboliche nelle isole isolate. In secondo luogo, il caricamento del colorno/l'espressione del sensore definisce il rapporto segnale-rumore della registrazione time-lapse. I segnali sono assenti o attenuati in isolotti sovraccarichi. Infine, il posizionamento riuscito e denso del tessuto all'interno della camera di imaging è un momento decisivo per esperimenti significativi e analizzabili. Tessuto mal posizionato o in movimento si traduce in tempo sperimentale sprecato e/o dati poco chiari.

Il metodo può essere modificato per tenere conto di più segnali (utilizzando il sistema confocale) e di più gruppi di isolotti (ad esempio, di genotipo diverso). L'imaging di più segnali presuppone la consegna di un secondo sensore in ogni cella dell'isolotto, compatibile con il reporter Ca2o (come un sensore pH SNARF5f26,27). A tal fine, gli isolotti possono essere co-caricati/co-infettati con sensori Ca2 e pH, che vengono poi immagini sequenziali all'interno di ogni intervallo di tempo.

L'imaging del segnale in gruppi di isolotti con risoluzione a cella singola richiede l'utilizzo di un ampio obiettivo di campo visivo. È probabile che l'obiettivo abbia un minore ingrandimento e apertura numerica (NA), riducendo così la risoluzione spaziale. A causa della maggiore profondità di messa a fuoco dell'obiettivo a bassa NA, l'imaging può essere eseguito su un sistema a campo largo. Gli svantaggi di questa disposizione sono la contaminazione incrociata cellulare-cellula del segnale luminoso e la ridotta capacità di immagine del segnale 3D (ad esempio, topi che esprimono il sensore Ca2 o più sotto i promotori dell'insulina). Allo stesso tempo, il segnale espresso dalle cellule dell'isolotto superficiale può essere perfettamente risolto con alta risoluzione temporale da gruppi tra cui decine a centinaia di isolotti18.

Anche se può sembrare spiacevole, ma l'esecuzione di analisi delle immagini e l'analisi numerica dei dati in pacchetti software separati è una buona idea. Al momento attuale, ImageJ/FIJI domina l'analisi scientifica delle immagini. Gli ambienti più popolari per la codifica scientifica sono Python e Matlab, ma ci sono anche sforzi noti per analizzare i dati Ca2 in R28. La migliore usabilità è fornita da pacchetti più di nicchia come IgorPro. La nostra scelta è quella di prototipo in Matlab/ Python e quindi implementare il codice in IgorPro per l'uso 'pipeline'. L'adattamento dei pacchetti di analisi del segnale per l'elettrofisiologia (ad esempio, Clampfit, Neuroexplorer) per le esigenze analitiche può essere utile per l'imaging a cella singola, ma è difficile scalare. Molte opzioni fornite da tali pacchetti non sono applicabili per l'imaging istonico a causa della bassa frequenza di campionamento.

È importante ricordare che questa metodologia è limitata da una serie di fattori. In primo luogo, come accennato in precedenza, l'imaging si basa in gran parte sul sottocampionamento dei dati, il che significa che non indica e quindi non può essere paragonato direttamente all'attività elettrica della cellula. In secondo luogo, i dati provengono dalla periferia dell'isolotto e non riflettono importanti processi di accoppiamento che sono, in generale, tridimensionali. In terzo luogo, il livello di caricamento/espressione influisce sulla percezione dell'intensità del sensore. Infine, non si può escludere l'attivazione di sottopopolazioni di cellule impazienti meno studiate (ad es. cellule PP e cellule di z) da parte dei composti marcatori, anche se a causa del basso numero di queste cellule all'interno dell'isolotto qualsiasi potenziale contaminazione sarà minima.

Il metodo è un vero e proprio "campione" in termini di effetto visivo, in quanto i processi oscillatori offrono una forte impressione di un tessuto realmente vivente. Applicato ai sottopopolazioni di cellule minori, il metodo sonda la funzione di ciascuno in modo affidabile, consentendo l'identificazione dei sottogruppi e riflettendo l'eterogeneità.

La dinamica del calcio è stata studiata nelle cellule di z-cellule delle isole pancreatiche per oltre 40 anni, per lo più guidate dai progressi nella tecnologia di acquisizione/rilevamento. I primi studi hanno utilizzato la spettroscopia atomica ad assorbimento atomico29, ma non è stato fino all'arrivo dei sensori fluorescenti Ca2 , 30 che la cinetica dettagliata potrebbe essere risolta in singole celle di isolotto, utilizzando la fotometria31,32,33. Poco dopo, la componente spaziale della cinetica di Ca2 è stata migliorata con ca2 imaging 34,35,36 è diventato una tecnologia di routine, grazie ai rilevatori di dispositivi accoppiati a carica (CCD) appena disponibili. Il problema della luce sfocata, che ostacolava l'imaging del segnale proveniente da singole cellule all'interno del tessuto, è stato poi risolto a metà degli anni '90 attraverso la microscopia confocale a scansione laser (LSCM)37 e la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRFM)38. Entrambi i metodi, completati dall'arrivo di una nuova generazione di sensori fluorescenti Ca2 o eccitabili con un laser da 488 nm, sono stati utilizzati con successo per l'immagine della dinamica di Ca2 nelle sottopopolazioni di celle immerite39,40,41.

Il nuovo secolo ha portato avanti due nuove tendenze che derivano dagli sviluppi tecnologici legati alle neuroscienze. In primo luogo, i sensori fluorescenti ricombinanti basati sulla permutazione circolare delle varianti GFP hanno notevolmente aumentato il rapporto segnale-rumore per il rilevamento Ca2o, portando efficacemente gli studi al livello di grandi popolazioni di cellule, in cui la dinamica delcit [Ca2]in ogni cellula poteva essere risolta. In secondo luogo, l'uso di promotori specifici dei tessuti ha permesso di indirizzare l'espressione del sensore a sottopopolazioni minori.

Anche se generalmente pensato per riflettere gli sviluppi nelle neuroscienze, gli studi sulle dinamiche isolotto Ca2 o hanno due differenze fondamentali. In primo luogo, dal punto di vista tecnologico, qualsiasi immagine in vivo della segnalazione dell'isolotto è più complessa dell'imaging nel cervello a causa dell'imprevedibile anatomia del pancreas e della posizione delle isole42 . In secondo luogo, un eccellente accoppiamento elettrico tra le cellule z dell'isolotto rende essenzialmente le isole in popolazioni elettricamente inerti, mostrando una risposta apparentemente perfetta all'alto stimolo del glucosio. Crediamo che gli studi su [Ca2]i cinetica in sottopopolazioni di isolotto minori, come le cellule z, sulla base del targeting specifico del tessuto, potrebbero ampliare la nostra conoscenza della loro farmacologia/fisiologia. Allo stesso tempo, le sonde altamente sensibili consentono di espandere la potenza statistica di tali misurazioni, la contabilità alla variabilità islet-to-ilet e consentendo l'imaging di isolotti di diversi gruppi all'interno di un esperimento parallelo.

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Disclosures

Gli Autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

AH ha ricevuto un Dottorato di ricerca nel Regno Unito sul diabete, EV è stato sostenuto dal programma di formazione post-dottorato OXION-Wellcome Trust, AIT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F7524-500ML
Fluo4 Thermo Fisher (Life Technologies) F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector Vector Biolabs 1910
Hanks' solution Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase Sigma-Aldrich 5401020001
penicillin/streptomycin Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 15140122
RPMI medium Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 61870044
Zeiss LSM510-META confocal system Carl Zeiss

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References

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Biologia numero 153 dinamica del calcio imaging time-lapse isolotti di Langerhans cellule z microscopia confocale a scansione laser elaborazione del segnale di serie temporali
Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo
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Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells. J. Vis. Exp. (153), e59491, doi:10.3791/59491 (2019).

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