Summary
ここでは、膵島細胞などの異種細胞集団におけるカルシウム動態をイメージングおよび定量するためのプロトコルを提示する。蛍光レポーターは、イヌビレット内の細胞の末梢層に送達され、次いで固定化および画像化され、蛍光強度のダイナミクスの細胞単位分析が行われます。
Abstract
膵島ホルモンは血糖恒常性を調節する。血糖値の変化は、膵島の細胞内の細胞質カルシウムの発振を誘発し、インスリン(β細胞から)、グルカゴン(α細胞)、ソマトスタチン(δ細胞)の3つの主要なホルモンの分泌を引き起こす。大多数の小有限細胞を構成し、互いに電気的に結合しているβ細胞は、グルコース刺激に対して1つの単一の実体として応答する。マイナーな部分集団、α細胞およびδ細胞の興奮性(約20%(30%)を占める4% (10%)総げっ歯類1(ヒト2)島の細胞数のそれぞれ)は、予測しにくいので、特別な関心がある。
カルシウムセンサは、単離された小石内の細胞の末梢層に送達されます。島または小島のグループは、蛍光顕微鏡を使用して固定化され、画像化されます。イメージングモードの選択は、より高いスループット(広視野)とより良い空間分解能(共焦点)の間です。従来、レーザー走査共焦点顕微鏡は、隣接する細胞間のシグナルの最適な分離を提供するので、組織のイメージングに使用される。β細胞の支配集団からの汚染信号が最小限に抑えられるならば、広視野システムも利用することができる。
特定の刺激に応答してカルシウムダイナミクスが記録されると、データは蛍光強度対時間として数値形式で表され、初期蛍光およびベースライン補正に正規化され、漂白に関連する効果を除去する。蛍光体。曲線下のスパイク周波数または部分領域(pAUC)の変化は、観測された効果を定量するために、時間対時間を計算する。pAUCはより敏感で非常に堅牢であるのに対し、スパイク周波数はカルシウム増加のメカニズムに関するより多くの情報を提供します。
マイナーな細胞のサブ集団は、アドレナリンやグレリンなどのマーカー化合物に対する機能的応答を用いて同定することができ、これは島細胞の特定の集団における細胞質カルシウムの変化を誘発する。
Introduction
この方法の目的は、膵島細胞の小さな部分集団における細胞質カルシウム濃度([Ca2+cyt)のリアルタイム変化を画像化することです。これにより、これらの細胞におけるホルモン分泌を支配するメカニズムを明らかにし、異なる細胞型間のクロストークに関する詳細を明らかにし、潜在的に、集団次元を大きな画像に導入することができます。
島は複数の細胞タイプで構成されています。よりよく知られているインスリン分泌β細胞に加えて、血糖3の調節にも重要な少なくとも2つの亜集団がある。α細胞(島の細胞の約17%を構成する)は、血糖値が低くなりすぎるとグルカゴンを分泌し、肝臓のデポから血流にブドウ糖を放出するシグナルを送ります。過剰なグルカゴンレベル(高グルカゴネミア)およびグルカゴン放出の制御障害(および、技術的には、インスリン感受性障害の糖尿病状態に寄与し得る)4.δ細胞(約2%)グルコース上昇に応答してソマトスタチンを分泌する。このユビキタスペプチドホルモンは、小島内のα-およびβ細胞の近傍に高濃度で存在する可能性が高く、グルカゴンおよびインスリン分泌の両方に強いGi受容体媒介性減衰効果を有する。
α-細胞とδ細胞は、グルコース感知機械の大部分を近い系統親であるβ細胞と共有しています。3種類の全ての細胞にATP感受性K+チャネルが装備されており、これらの興奮性細胞の形質膜電位を制御する精巧な代謝センサ5が備え付けられている。同時に、インスリン、ソマトスタチンおよびグルカゴンの分泌は、グルコースによって異なる方法で調節される。したがって、島細胞の2つの小さな部分集団におけるCa2+ダイナミクスのイメージングは、血糖値と島分泌出力との間のクロストークに関する洞察を提供することができる。
パッチクランプ電気生理学を用いてα細胞およびδ細胞の興奮性をモニタリングする初期の試みは、すぐに単一のα-およびδ細胞におけるCa2+のイメージングに続いた。これらの実験における細胞の同一性は、抗グルカゴンまたは抗ソマトスタチン抗体による後部染色を介して検証した。これらの努力は、イシレット細胞が大口内で、単一の細胞として非常に異なって動作するという発見によってしばしば妨げられた。β細胞は、島の配置の主な恩人であるように見えるかもしれませんが(その強力な電気結合の根底にある圧倒的多数のために)、主な不一致は、驚くべきことに、α細胞に見つかりました。無傷の小有限では、これらの細胞は常に低グルコースで持続的に活性化され、これは単一分散α細胞6の約7%に対してのみ当てはまる。従って無傷の小島内のα−およびδ細胞の活性を報告することは、生体内条件のより近い近似を表すと考えられる。
一般に、α細胞またはδ細胞の部分集団から特異的にCa2+ダイナミクスを報告する2つの方法があります:(i)組織特異的プロモーターを介して遺伝子コードされたCa2+センサーを発現する、または(ii)マーカー化合物を使用して。よりエレガントな前者のアプローチは真の3Dイメージングの実質的な利点を追加し、したがって、小有に細胞分布の研究。しかし、無傷のヒトの小米科材料には適用できません。もう一つの潜在的な懸念は、特に高グルコースに対するβ/α細胞トランス分化またはα細胞応答が実施されている場合に、プロモーターの「漏れ」である。後者のアプローチは、ヒトサンプルまたは培養小島を含む新鮮な単離された組織で使用することができる。しかし、このデータは、イシレットアーキテクチャを変えることなく、より深い層に色素/マーカー分子を送り出すので、イレット細胞の末梢層からのみ収集されます。後者のアプローチの予想外の利点は、広視野イメージングモードとの互換性であり、実験を数百または数百の小島(すなわち数千から数万の細胞)の同時イメージングにスケールアップすることができます。
カルシウムは、遺伝子コードされたGCaMP7(またはペリカム8)ファミリーセンサを用いて生体内で画像化され、これは、カルシウム結合タンパク質カルモジュリンとその標的配列に融合した円形に透過緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異体であり、ミオシン軽鎖キナーゼ7、9のM13断片である。GCaMPは、ナノモルCa2+濃度の範囲で優れた信号対雑音比を有し、高い2光子断面を有し、生体内作業10、11に最適です。組換えセンサーを使用する難しい側面は、細胞への配信です。異種発現は、ウイルスベクターと複数時間のex vivo培養を使用する必要があり、これは細胞機能の潜在的な分化または悪化に関する懸念を頻繁に提起する。GCaMP を表現するように設計されたマウス モデルは、この問題に対処するために事前に設計されていますが、リード タイムを大幅に増やし、作業を非人間モデルに制限することで、新たな課題を追加します。細胞内pHの変化に対する非常に高い感受性は、タンパク質ベースのセンサ12のもう一つの不利な側面であり、しかし、Ca2+のような振動信号を感知する問題は少ない。
トラップ可能な色素(緑色蛍光Fluo4など)の利点は、約1時間以内に新鮮に単離された組織にロードできることです。予想通り、トラップ可能な染料は、組換えの色素よりも信号対雑音比が低く、(はるかに)光安定性が低くなります。トラップ可能色素14の毒性の報告を13件確認することはできないが、染料の過負荷が頻繁に問題となる。
円形順列に基づく赤色組換えCa2+センサーは、2011年15年から急速に進化しており、最近の開発は、赤色光の浸透深さが高いことを考えると、組織イメージングのためのGCaMP16に強い競争を示しています。市販の赤色捕捉性染料は、単一細胞イメージングに確実に使用できますが、組織レベルでは、緑色のアナログとうまく競合することはできません。
焦点が合っていない光が重大な問題となる組織の実験のためのイメージング技術の選択は一見ほとんどない。共焦点システムは、0.3(GCaMP6の場合)または0.8(トラップ可能な色素)上の任意の目的で焦点外光のキャンセルによって許容可能な単一細胞分解能を提供します。技術的な意味では、従来の共焦点顕微鏡は、数百個(GCaMP)または数十個の小島(トラップ可能な色素)から[Ca2+]の円を同時にイメージングするために使用することができます。組織におけるセンサの3D発現の場合の共焦点モードに対する唯一の現実的な代替手段は、おそらく光シート顕微鏡である。
センサーが小別の組織内の細胞の末梢層で発現する場合、物事はわずかに異なります。鮮やかな細胞内発現パターンを持つ明るい組換えセンサの場合、低NA目標の広視野イメージングモードを使用すると、十分な品質を提供し、視野領域の大幅な増加を研究者に報い、したがって、スループット。広いフィールド システムでは、フォーカスの低いライトがキャンセルされないので、空間的な解像度が低くなります。したがって、単一細胞信号が隣接する細胞によって大きく汚染されるため、高NA(被写界深度の低い)目的を持つイメージング組織はあまり有益ではありません。汚染は低NA(被写界深度の高い)目標のためにはるかに小さい。
ただし、高いスループットやサンプリング レートが重要な利点となるタスクもあります。α-細胞とδ細胞は相当な不均一性を示し、サブ集団の寄与を明らかにするために高いサンプルサイズの需要を生み出す。広視野イメージングは高速で感度が高く、工業規模の大きな視野システムは、それぞれ10または1つの小島での共焦点実験と同じ信号対雑音比で数百個(GCaMP)または数十個(Fluo4)の小島をイメージングします。このスループットの違いは、単一細胞分解能を有する集団イメージングに広視野システムを有利にし、δ細胞1のような小さなサブ集団にとって特に重要であり得る。同様に、Ca2+スパイク17からの電気活動を再構築しようとする試みは、広視野イメージングモードによって提供されるより高いサンプリングレートの恩恵を受けるだろう。同時に、支配的なβ細胞部分集団の刺激時の膵臓α細胞の活性のようないくつかの「ニッチ」問題は、共焦点系の使用を必要とする。共焦点モードに向けた決定に影響を与える要因は、β細胞亜集団からの実質的な汚染シグナルの存在である。
イメージング実験後にホルモン特異的抗体染色を用いて細胞の同一性を検証することは依然として選択肢であるが、α-18およびδ細胞19、20におけるCa2+ダイナミクスを選択的に刺激することが示されたアドレナリンおよびグレリンなどの機能マーカー化合物を用いて、マイナー細胞亜集団を同定することができる。
タイムラプスイメージングデータの分析は、集団の不均一性、相関、異なるシグナルの相互作用など、些細な薬理学を超えた情報を提供することを目的としています。従来、撮像データは強度対時間として解析され、初期蛍光に正規化される(F/F0)。ベースライン補正は、蛍光またはpHの変化による蛍光対気のシグナルの漂白または汚染に起因して頻繁に必要である(典型的にはグルコース12のミリモルレベルによって誘発される)。Ca2+データはさまざまな方法で分析できますが、3 つの主な傾向は、スパイク周波数、高原分数、または曲線の下の面積の変化を計算した場合と時間の値を測定することです。後者のアプローチは、特に重くアンダーサンプリングされた共焦点データへの適用において有利であることがわかりました。pAUCメトリックの利点は、信号周波数と振幅の両方の変化に対する感度であるのに対し、周波数を計算するには、従来のイメージングを使用して達成するのが困難であるかなりの数の振動21が必要である。pAUC分析の制限要因は、ベースラインの変化に対する高い感度です。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、英国動物(科学的手続き)法(1986)とオックスフォード大学の倫理ガイドラインに従って開発されました。
1. マウス膵島を分離する
- 培養培地と分離液を準備します。
- 培養培地を構成する:RMPI1640(材料表参照)、胎児子牛血清の10%、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを補充する。2つの60ミリメートルプラスチックペトリ皿(任意の接着剤で処理されていない)に媒体を分配し、インキュベーター(37°、5%CO2、絶対湿度)に皿を保ちます。
- 単離溶液(50mL/マウス):ハンクス培地に5mMグルコース、100単位/mLペニシリン100μg/mLストレプトマイシン。氷の上に置いてください(4°C)。
- 酵素溶液(例えば、リベラーゼ):分離溶液中で0.2mg/mL、マウスあたり2 mLを構成する。氷の上に置いてください(4°C)。場合によっては、リベラーゼの活性を事前に試験し、酵素22の各バッチに対するインキュベーションパラメータを最適化する。
- 酵素溶液をマウス胆管に注入します。
- 子宮頸部脱臼を介してマウス(12週齢の女性、C57Bl /6J)を犠牲にします。
- 解剖顕微鏡の下で、細かいはさみを使って皮膚と筋肉の層を切り開き、胆管を見つけます。
- 綿糸を使用して、胆管との接合部の両側の腸をリゲートします。
- 湾曲した細かい時計職人の鉗子で胆管を軽く持ち上げ、30G針で2mLの注射器を使用して、氷冷酵素溶液をダクトに導入します。膵臓のインフレは、この段階で観察されるべきである。
- 鈍い鼻の親指鉗子と細かい時計職人の鉗子を15 mLのハヤブサチューブに組み合わせて膨らませた膵臓を収集し、氷の上に保ちます(4 °)。酵素溶液をチューブに1mL加えます。
- 膵島を解放し、膵臓から収集します。
- 水浴中の酵素溶液で膨らませた膵臓を37°Cでインキュベートする。穏やかな揺れは使用できますが、インフレが良好であった場合、重要ではありません。
- 氷冷分離溶液を10mLまで加えて消化を停止します。軽くダイジェストを振る:それは小さな部分に落ちるはずです。
- 単離溶液の10mLで消化液を3回洗浄し、1×gで5分放置し、遊離した小島を氷上に堆積させる。10 mLの血清学的ピペットで、上清を穏やかに吸引します。
- ダイジェストにコールド RPMI を追加します (最大 10 mL を作成します)。
- プラスチック製のペトリ料理(ステップ1.1.1)を使用して、小島を選びます。ペトリ料理の1つからRMPI培地をデカントし、代わりにダイジェストの一部(4-5 mL)を穏やかに注ぎます。P10ピペットを2番目のペトリ皿に入れて、丸く滑らかで高密度の部分として現れる解放された小島を収集します。
- インキュベーター(37°、5%CO2、絶対湿度)で小島を培養する。実験は、この段階で一時停止することができます。1〜2時間島を離れることは、分離中の機械的ストレスから回復するのに役立つと考えられています。
2. 染料をロードするか、センサーを表現する
- トラップ可能な染料を準備します。
- DMSO中のトラプリケート性色素(通常は50μg)のアリコート(通常は50μg)をDMSOに溶解し、ストック濃度を2mMにする。プルロン酸を最終濃度1%に加え(DMSOの20%ストックを使用)、色素の可溶化を改善します。
- 小さなPCRチューブ(それぞれに2μL)で色素をアリコートします。染料は、数週間凍結(-20°)保存することができる。
- または、組換えセンサーを準備します。
- センサー(例えば、GCaMP6fをコードするアデノウイルスベクター)を10μLアリコートに分配し、-80°Cで保存します。
- (任意に)いくつかの連続希釈を用いて(以下のように)小島に感染させることによりウイルスストックの力を事前に試験し、感染に最適な濃度を明らかにする。
注:異なるベクター(レンチウイルス、BacMam、AAV)によってコードされる組換えセンサは、異なる感染プロトコルを必要とします。これをベクタープロバイダーで確認し、ニーズに合わせて作業比率を最適化してください。アデノウイルスの「働く」ストックは-20°Cで保存し、冷凍/解凍を数回行うことができます。過度の凍結融解サイクリングは、ウイルスの有効な力を減少させます。
- イメージング ソリューションを準備します。
- イメージング溶液を構成し、mM:140 NaCl、4.6 KCl、2.6 CaCl 2、1.2 MgCl2、1NaH2PO4、5NaHCO3、10HEPES(pH 7.4、NaOH付き)を構成します。
- イメージング溶液中のグルコース(0.5M)とマンニトール(0.5M)のストックを構成します。ストックは冷蔵庫(4°C)に数週間保存できます。
- トラップ可能な染料をロードします。
- 6mMグルコースを含むイメージング液の600μLに2μLの色素を溶解して、染料加工液を構成します。溶液を加熱またはボルテックスして可溶化を改善することができる。
- ステップ1で単離した小島を染料の作動溶液にロードします。積載は、マルチウェルプレートまたはペトリ皿を使用して行うことができます。後者の場合は、非粘着性のペトリ皿(35または60mm)とピペット10-30小島の底部に作業溶液の100 μLの液滴を入れます。
- 異なる小島のグループ(例えば、野生のタイプ/ノックアウト)の場合は、複数の井戸と複数の液滴を配置して、ロードを同時に行うことができます。
- 70〜90分間暗闇の中で室温で染料加工溶液中の小島をインキュベートします。インキュベートし過ぎないでください。
- 蛍光顕微鏡の下でローディングを確認してください。小島は軽度の蛍光を得るべきであり、一部の細胞は残りの細胞よりも明るい。細胞の切り上げと色素の核局在化は過負荷の兆候である。
- 6 mMのグルコースを含む色素のないイメージング溶液に小島を移します。島はすぐにイメージングに使用できますが、必要に応じて色素を残してさらに10〜15分間脱エステル化することができます。島は染料を数時間保持するので、いくつかのシフトでイメージングに使用することができます。
- あるいは、組換えベクターで小島に感染させる。
- RPMI培養培地(ステップ1.1.1)で小板をプレートし(例えば、30μL)、必要なベクターの体積を最小限に抑える。
- 感染の多重度を理想的に生じるはずの約105感染ユニット/小介の比率でベクターを追加する>2。理想的には、比率は、周辺層で式を提供する最小限の比率に最適化する必要があります。事前滴定(ステップ2.2.3)が役立つかもしれません。
- 20~50個の小島を液滴と培養物に8~48時間導入します。(理想的には、一晩)。島は、細胞形態の変化なしに、ほとんどの細胞でかすかな緑色蛍光を発症する必要があります。
注:感染と発現の成功は、ウイルス溶液への暴露の時間に依存します。理想的には、ウイルスは一晩溶液中にとどまる必要がありますが、必要に応じてわずか15分後に除去することができます。しかし、感染性、したがって発現は劇的に低くなる可能性が高い。
3. イメージング Ca2+ダイナミクス
- (反転)顕微鏡下で小島を固定化する。
- 逆顕微鏡用のイメージングチャンバを組み立てます。ガラスカバースリップ(厚さ1または1.5)をチャンバー内に置き、ガラスチャンバーインターフェースが水密であることを確認します。カバースリップが顕微鏡の目的の手の届くところにあることを確認します(かさばる高NAの目的の場合には重要です)。
- 固定化アクセサリーを準備します。細かいメッシュと粗いメッシュから小さな長方形(20 mm x 20 mm)をカットします。45~50μmの厚粘着テープを使用して、細かいメッシュに2つのスペーサー「壁」を導入します。画像化された小島の大きさが従来の100μmを大幅に超える場合は、スペーサーの二重層を使用してください。
- 35mmペトリ皿を使用して、メッシュと重量をイメージング溶液に浸します。プラスチックと金属が濡れていることを確認します。
- 解剖顕微鏡の下で、スペーサーの「壁」を逆さまにして細かいメッシュを上に向けます。トラップ可能な染料を搭載した複数の小島をピックするか、組換えセンサーをP20ピペットで表現し、2つのスペーサーの間に細かいメッシュの上にそっと置きます。メッシュとワッシャーに過剰な量のイメージングソリューションが含まれていないことを確認します。
- 時計職人の鉗子を使用して、小島でメッシュをピックアップし、スペーサーが下向きにしてチャンバーカバースリップに直接座るように、イメージングチャンバー内で逆さまに配置します。カバースリップの中央で、スペーサーとメッシュの間に小島が閉じ込められていることを確認します。
- 粗いメッシュと重量をチャンバー内の細かいメッシュの上に置きます。チャンバーにイメージング液を導入します。島が固定化され、イメージ化する準備ができていることを確認します。チャンバーの過度の揺れを避けます(チャンバーを顕微鏡に運び、加熱された段階に挿入するような小さな摂動は許容されます)。
注:直立システムにも同様の固定化配置を適用できます。
- 顕微鏡をセットアップします。
- 撮像モードと目的を選択し、顕微鏡の温度制御ステージにステップ3.1から小島でチャンバーを配置します。
- 温度制御(理想的には、30°Cと36°Cの間)と灌流を設定します。反転システムの場合は、流入量よりも低い流入量をチャンバー内に配置し、流出流束を流入量よりも大きく設定します(通常、ペリスタリックポンプでより広い内径のチューブを使用して達成されます)。
- 流出は、連続的な溶液除去の長い間隔を避けるために、複数のシーケンシャル小滴で溶液を除去するように、溶液との接触面が最小限であることを確認します。後者は、すべての画像ピクセルの周期的な強度振動として表示され、頻繁に「遅い波」として解釈されるように、周期的な信号のタイムラプスイメージングにおけるアーティファクトの主要なソースです。
- 3 mMグルコースを含むイメージング溶液で灌流を開始します。
- 緑色の蛍光色素のイメージングのための光のパスとフィルタを選択します。470 から 500 の間の励起と 505 と 550 の間の放出は、それぞれに対して機能します。
- ライブ イメージングを実行して、イメージング パラメータを設定します。目的の島をキャプチャするようにビューを調整します。
- 画像の信号対雑音比を最適化します。そのために、励起光強度、露光時間、ビニングを調整します。設定により、可能な限り最小限の光強度と露出で、小道内の各セルを個別に視覚化できることを確認します。
- 画像取得を実行します。タスクに応じて、0.1 ~5 Hz で画像を撮影できます。これは、αセルとδセル(>300 Hz)の高速Na+駆動振動のナイキスト基準を大きく下回っており、これはデータがデフォルトでアンダーサンプリングされていることを意味します。しかし、この需要に合わせて集録頻度を増やすことは、大きな視野を持つ多細胞/多小電子イメージングでは実現不可能である。GCaMPはより速く画像化することができますが、Fluo4は高速取得条件下で漂白剤を避けられません。
注:小有病細胞の[Ca2+]シット振動が電気的活動によって駆動されることを考えると、低い取得率を使用すると逆効果に聞こえるかもしれません。しかし、実際には、β細胞スパイク挙動13を解決するのに1Hz付近または上回る集録率で十分であり、α細胞およびδ細胞におけるナトリウムチャネル駆動振動の検出の閾値は300Hzをはるかに上回る。α-またはδ-細胞[Ca2+]シット振動が1Hzまたは0.1Hzで取得されるかどうかにかかわらず、それらは重度にアンダーサンプリングされ、電気的活動ではなくセルによるCa2+ハンドリングを反映します。- 取得したデータの品質を確認する:3 mMグルコースでは、α細胞活性ははっきりと見える/検出可能でなければなりません。この場合に当てはまることを確認し、本格的なタイムラプスイメージングに進みます。
- 撮像モードと目的を選択し、顕微鏡の温度制御ステージにステップ3.1から小島でチャンバーを配置します。
- タイムラプスイメージング
- これが利用可能な場合は、取得ソフトウェアに実装された信号ダイナミクスのオンラインチャートを利用してください。オンラインチャートがオプションでない場合は、最も包括的な方法(「虹」など)で信号強度を表示する検索テーブルを適用します。
- リバーシブルな方法で刺激を適用する:基底レベルに信号の回復を記録します。録音の開始時と終了時のアーティファクトは無視します。後者は、pHまたは細胞死の変化によるプローブ蛍光の不可逆的な「増加/減少」のように見えるかもしれません。
- 低グルコースで振動Ca2+ダイナミクスによってα細胞を分化させます。2〜5分間可逆的に、入浴液にアドレナリンまたはグルタミン酸を導入する。[Ca2+]cytの急激なジャンプの後に、振動のスローダウンまたはキャンセルが続きます。
注:アドレナリンは、α細胞に対して認識されたマーカー化合物であり、これは、膵細胞のこの部分集団に選択的な陽性効果を有し、細胞内デポ18からのCa2+の放出によって媒介される。グルタミン酸は、別のα細胞特異的アゴニスト23として出されている。 - 最近、δ細胞を選択的に活性化することが報告されているグレリンを追加/削除する。小さな微小な部分集団における[Ca2+]cytの急速な可逆的な増加を観察する。
- 20 mM のブドウ糖を追加または削除します。β細胞亜集団における協調振動応答を観察する。アドレナリンまたはグルタミン酸およびグレリンによって以前に活性化された細胞の応答に注意してください。
- イメージ シーケンスを保存します。録画中に「自動保存」の使用を検討してください。
4. データの分析
- タイムラプス画像を分析します。
- タイムラプス画像をオープンソースのImageJ/FIJIなどの画像解析ソフトウェアに読み込みます。
- 記録中に実質的/迅速な移動が発生した場合は、データを修復不能として破棄します。マイナードリフトを修正するには、StackRegまたはTurboRegプラグイン24を使用します。
- セル検出と対象領域 (ROI) マッピング用のマスク イメージを作成します。これを実現する好ましい方法は、「平均強度」や「最大強度」などの機能のいずれかを使用してスタック画像を作成することです。使用される関数は、個々のセルを最大限に認識できる関数です。
- マスクイメージをしきい値し、islet 領域外のすべてのデータを削除します。この関数は、32 ビット イメージの自動モードで動作します。
- しきい値画像の最大値を検出します。画像が密集している場合、最大値はポイント、リージョン、またはセクタで表すことができます。
- サイズ制限なしで'find maxima'関数を適用し、検出された最大値を対象領域(ROI)エディタに貼り付けます。
- マップされた各 ROA をスムーズまたは補間します。場合によっては、ROI を拡張する必要があります。(4.1.6-4.1.8) 用に簡単なスクリプトを記述し、最適なセル検出結果を提供するために数回実行できます。複数の ROI が重複する可能性がありますが、これはまれです。
- ROI の位置を分析し、それぞれの X データと Y データを電子テーブル ソフトウェア (Microsoft Excel など) に貼り付けます。
- すべてのROIのグレーの強度対時間を分析し、データを電子テーブルソフトウェアに貼り付けます。
- 数値データを分析します。
- データ分析ソフトウェアにデータをインポートします。ソフトウェアの選択と実験の継続時間/サンプリング/サイズに応じて、これは単純なコピー/貼り付け操作またはスタンドアロンの手順にすることができます。数値データの配置と保存を確認します。
- タイムスタンプまたはタイム ノートをインポートします (使用可能な場合)。
- 生蛍光強度データ(「F」)を蛍光の初期値(「F0」)に正規化します。これは、最初のポイントで蛍光である必要はありませんが、いくつかの最初のポイントの平均である可能性があります。正規化は、データの変動性を減らし、理想的な場合 (ドリフトベースラインなし) によって分析可能なデータセット ("F/F0")になります。
- F/F0データセットの細胞間変動が依然として相当な場合 (長い記録、漂白)、ベースライン補正を実行します。そのために、「対照」領域、すなわち対照溶液(マウス膵島の場合、アゴニスト/アンタゴニストを含まない3mMグルコース)が適用された時間の範囲を定義する。
- 制御領域に明確な非振動信号がある場合は、制御ソリューションの各適用後にF/F0が初期値(F/F0=1)に戻っていたと仮定します。各セルのタイムラプス データを修正するには、制御ソリューションの追加時にデータをセグメントに分割し、各セグメントに線形補正を適用します。アーティファクトの結果として多項式補正やその他の非線形補正は使用しないでください。
- 制御範囲に明確な振動がある場合、または追加の因子(FAD自己蛍光など)が存在する場合は、スパイク検出アルゴリズム17を使用する。そのために些細で高速な走り回りは、最大に敏感なウェーブレット変換です (図 3A)。
- データを定量化します。Ca2+は非常に動的な信号であるが、絶対F/F0値の観点からCa2+データを提示することは、生物医学文献において広く許容される。 複数の実験の結果を比較する必要がある場合は、メトリックを選択します。
- Ca2+スパイクの頻度 (図 4A,D)と(アリ)アゴニストの添加に対する応答を測定します。そのために、記録を等しい時間間隔に分割し、間隔内のスパイクをカウントし、間隔期間に正規化することにより、部分周波数(各区間のスパイク周波数)のタイムコースを計算します。
- または、しきい値を設定し、上記で定義した各間隔の高原分数 (pf) を計算します (図 4B,F)。分数は、セルが「励起」状態で費やした間隔内の時間のパーセンテージを示します。
- または、上記で定義した間隔ごとに曲線の下の部分面積 (pAUC) を計算します (図 4C,G)。このメトリックは、スパイクの周波数と振幅の両方の変化に敏感です。
注:周波数を測定するための注意点の1つは、スパイク持続時間に対する感度の欠如と安定性の低下です。データは、電気スパイクに対して大きくアンダーサンプリングされているため、間隔あたりのスパイク数は非常に少ないので、唯一の余分なスパイクが結果に劇的に影響を与える可能性があります。pAUCの「ボトルネック」は、ベースラインの変化に対する感度です。アーティファクトを起こしやすく、周波数よりも[Ca2+]cytの変化に敏感であるが、それにもかかわらず、pAUCはCa2+ダイナミクスの性質についてあまり有益ではない。高原分率は、全細胞系へのオープン確率概念の拡張である。ただし、しきい値に依存しているため、pAUC よりも堅牢性は低くなります。
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Representative Results
イレットは、膜の脂質組成が影響を受けていない限り(例えば、脂肪酸への慢性暴露によって)、トラップ可能な色素(図1A)とかなりよく負荷する。ヒトアデノウイルス5型(Ad5)ベクターも全ての島細胞を標的とする(図1B)。複数の組換えセンサーが同じセル内で発現している場合に問題が発生する可能性があります。さらに、小島は、典型的には、例外的な安定性とソリューションアクセスを提供する上述の技術を使用して非常によく固定化されています。
α細胞におけるCa2+スパイクは、低グルコースレベルで容易に検出することができる(図2)。低グルコースでの活性とアドレナリンおよびグルタミン酸に対する応答との間には、細胞間の相関が高い。グレリンは、低グルコースでいくつかのアドレナリン応答性細胞(α細胞?)を活性化しますが、低グルコース(β細胞)によって活性化されるほとんどの細胞ではCa2+ダイナミクスに影響を与えていません。
部分周波数(図4A,C)の観点から分析すると、アドレナリンまたはグレリン刺激細胞は、すべてまたは何もない条件下で実質的な増加を示す。すなわち、アドレナリンまたはグレリンによって活性化される低基底活性を有する細胞は、この指標の劇的な増加を示す。しかし、基底スパイキングとアドレナリン効果の全体的な変化は非常に微妙です(図4A,C)。対照的に、部分AUCは、基底活性が高い場合でも、すべての細胞においてアドレナリンによって生じる変化に敏感である(図4B,D)。
図1:捕捉可能な色素の積載と組換えセンサの組換えセンサの発現を小島にトラッパブル性色素Fluo-4(A)を搭載した典型的なマウス島、または組換えセンサGCaMP6を細胞の周辺層(B)または深層(C)で発現させる。極性トレーサースルフォルホダミンB(SRB、白色として示す)は、各島25内の個々の細胞の概要を示すために利用されている。(D)Fluo4を用いて島内の個々の細胞から記録されたグルコースに応答してCa2+の代表的な動態。マイナーな細胞集団内の不均一性に注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:種々の刺激に対する小%)細胞の典型的なCa2+応答。典型的なα細胞(A)およびδ細胞(B)Ca2+ダイナミクスは、アドレナリン、グルタミン酸、グレリン、グルコースに応答する。(C)-(D)アドレナリン陽性(C)およびグレリン陽性(D)亜集団を示す島細胞応答の熱マップ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: ベースライン補正この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:タイムラプスデータの分析α細胞におけるCa2+ダイナミクスの解析α細胞の部分周波数(A)、高原分率(B)及び曲線下面積(C)及びα細胞の[Ca2+]iトレース。生(F/F 0)(D)、部分周波数(E)、高原分率(F)および曲線下面積(G)として表されるマウス膵島からの人口[Ca2+]iデータ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルには、全体的な成功に不可欠な 3 つの段階があります。胆管へのリベラーゼ酵素の注入の成功は、単離手順の定量的成功だけでなく、単離された島の品質にも影響を与えます。膨張していない膵臓は、単離された小島でいくつかの重要な代謝応答の欠如をもたらす可能性があります。第二に、センサの色素/発現の負荷は、タイムラプス記録の信号対雑音比を定義する。過負荷の小島では信号が存在しないか、減衰している。最後に、イメージングチャンバ内の組織の位置決めが成功し、有意義で分解可能な実験の決定的な瞬間です。組織の位置が不十分または移動すると、実験時間や不明確なデータが無駄になります。
この方法は、複数のシグナル(共焦点系を使用)および複数の島のグループ(例えば、異なる遺伝子型)を考慮して変更することができる。複数の信号のイメージングは、第2のセンサを島の各セルに送達することを前提とし、Ca2+レポーター(pHセンサSNARF5f26、27など)とスペクトル的に互換性がある。そのために、島はCa2+およびpHセンサーと共にロード/共に感染し、各時間枠内で順次画像化することができます。
単一細胞分解能を持つ小島群の信号をイメージングするには、広い視野目標を使用する必要があります。目的は、より低い倍率と数値絞り(NA)を有する可能性が高く、それによって空間分解能を低減する。低NA目標の焦点の深さが増加したため、広いフィールドシステムでイメージングを行うことができます。この配置の欠点は、光信号の細胞間汚染および3Dシグナルを画像化する能力の低下である(例えば、インスリン促進剤の下でCa2+センサを発現するマウス)。同時に、表面島細胞から発現される信号は、数十〜数百の島18を含む群からの高い時間分解能で完全に解決することができる。
不快に聞こえるかもしれませんが、画像解析と数値データ解析を別々のソフトウェアパッケージで実行することをお勧めします。現時点では、ImageJ/FIJI は科学的画像解析を支配しています。科学的コーディングのための最も一般的な環境はPythonとMatlabですが、R28のCa2+データを分析する取り組みも知られています。最高の使いやすさは、IgorProのようなよりニッチなパッケージによって提供されます。私たちの選択は、Matlab/Pythonでプロトタイプを作成し、'パイプライン'を使用するためにIgorProでコードを実装することです。電気生理学(例えば、クランプフィット、ニューロエクスプローラー)のための信号分析パッケージを分析ニーズに適応させることは、単一細胞イメージングに役立ちますが、スケールアップすることは困難です。このようなパッケージによって提供される多くのオプションは、サンプリングレートが低いため、アイレットイメージングには適用できません。
この方法論は、いくつかの要因によって制限されることを覚えておくことが重要です。第一に、上述したように、イメージングは主にデータのアンダーサンプリングに基づいており、細胞の電気的活動と直接比較することはできないことを意味する。第二に、データはイコの周辺から来て、一般的に言えば、3次元である重要な結合プロセスを反映していません。第三に、読み込み/発現のレベルは、センサーの強度の知覚に影響を与えます。最後に、マーカー化合物によるあまりよく研究されていない島細胞のサブ集団(例えば、PP細胞&ε細胞)の活性化は排除できないが、島内のこれらの細胞の数が少ないため、潜在的な汚染は最小限に抑えられる。
振動プロセスは、本物の生きている組織の強い印象を提供するので、この方法は、視覚効果の面で真の「チャンピオン」です。マイナーな細胞部分集団に適用されるこのメソッドは、各細胞の機能を確実にプローブし、サブグループの同定と不均一性を反映することを可能にする。
カルシウムダイナミクスは、膵島β細胞で40年以上にわたり研究されており、主に取得/検出技術の進歩によって駆動されています。初期の研究は、原子吸光分析法29を用いたが、蛍光Ca2+センサ30が到着するまでは、光測定31、32、33を用いて、個々の膵細胞において詳細な動態を解決することができた。その後すぐに、Ca2+運動量の空間成分は、Ca2+イメージング34、35、36が日常的な技術となり、当時の新たに利用可能な電荷結合デバイス(CCD)検出器のおかげで改善されました。焦点外光の問題は、組織内の個々の細胞からのシグナルのイメージングを妨げ、その後、レーザー走査共焦点顕微鏡(LSCM)37および全内部蛍光顕微鏡(TIRFM)38を介して1990年代半ばに解決された。 両方の方法は、488nmレーザーで興奮可能な新世代の蛍光Ca2+センサの到着を補完し、微小細胞部分集団39、40、41におけるCa2+ダイナミクスの画像化に成功している。
新世紀は、神経科学関連の技術開発に起因する2つの新しいトレンドを前進させました。第一に、GFP変異体の円形順列に基づく組換え蛍光センサは、Ca2+検出の信号対雑音比を大幅に増加させ、すべての細胞における[Ca2+]cytのダイナミクスを解決できる大きな細胞集団のレベルに効果的に研究をもたらします。第二に、組織特異的プロモーターの使用は、マイナーな亜集団に対するセンサー発現の標的化を可能にした。
一般的に神経科学の発展を反映すると考えられているが、島Ca2+ダイナミクスに関する研究には2つの重要な違いがある。第一に、技術的には、膵臓および膵島の位置42の予測不可能な解剖学的構造に起因する脳内イメージングよりも、膵島シグナル伝達の生体内イメージングが複雑である。第二に、島β細胞間の優れた電気結合は、本質的に高グルコース刺激に対する一見完全な全または何もない応答を示す電気的に不活性な集団に島をレンダリングする。組織特異的ターゲティングに基づくδ細胞のような小さな島分亜集団における[Ca2+i動態学]の研究は、彼らの薬理学/生理学に関する知識を広げる可能性が高いと考えています。同時に、高感度プローブは、このような測定の統計的能力を拡大し、島と島の変動性を考慮し、1つの並列実験内で異なるグループからの島のイメージングを可能にします。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
AHは糖尿病英国博士課程の学生シップの受領者であり、EVはOXION-ウェルカム・トラスト・トレーニング・プログラムの支援を受け、AITはオックスフォード生物医学研究評議会の博士研究員を開催しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | Thermo Fisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
References
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