无细胞表达系统是用于高吞吐量合成和筛选重要蛋白质的功能强大且经济高效的工具。在这里, 我们描述了使用纳利根弧菌快速生产的无细胞蛋白表达系统的制备, 使用质粒 dna, 线性 dna 和 mrna 模板。
海洋细菌由于其快速生长速度, 作为生物技术的新微生物宿主, 受到了人们的广泛关注。介绍了利用常用实验室设备制备纳德里根粗细胞提取物的一般方案。这种高产协议经过专门针对用户的可访问性和降低成本进行了优化。无细胞蛋白合成 (cfps) 可在96或384井格式的小规模10μl 批处理反应中进行, 可重复产生浓度 > 260μml 超级文件夹 gfp (sfgfp), 时间为3小时。可在1-2天内由单个用户完成。该协议可以很容易地集成到现有的蛋白质合成管道, 以促进生物生产和合成生物学应用的进步。
无细胞蛋白合成是一种通用且经济高效的方法, 用于表达有价值的蛋白质或肽1,2,3,4。从历史上看, 无细胞蛋白的合成是使用大肠杆菌表达系统进行的;然而, 最近在使用具有新特性的替代非模型生物作为无细胞表达 5、6、7、8、9的底盘方面出现了激增的情况,10,11,12. 具有独特代谢特征的生物是无大肠杆菌系统的主要替代品。例如, 海洋细菌弧菌是所有已知生物中生长最快的, 观测到的加倍时间不到 10分钟13。作为 14、15、16、17、18的新兴微生物宿主, 这引起了人们的极大关注。鉴于纳特里根的快速生长速度与蛋白质合成率和代谢效率高有关19,20,21, 利用其细胞机制无细胞合成可能会显著扩大快速蛋白质生产和高通量筛选的工具包。
最近, 一个无细胞 v . natriegens表达系统已被证明能够产生超夹 gfp (sfgfp) 的浓度为 > 260μgml 在3小时与 t7 启动子 9.开发这种方法的总体目标是为用户提供一个高度可访问性、经济高效、可重复、高效的无细胞蛋白表达系统, 该系统可在短时间内使用普通实验室设备制备。该协议利用摇瓶中的1升培养物、脉冲超声的细胞裂解和96或384孔格式的小规模批处理反应, 以最大限度地提高并行度和筛选吞吐量。通过补充 3-磷酸甘油 (3-pga) 作为能量来源8,22,23, 可以进行长时间、持续的蛋白质表达。成功完成此协议后, 用户将有能力使用v. natriegens粗细胞提取物以无细胞格式表达所需的蛋白质或一组蛋白质。
从甘油库存开始,从在光学密度为1.0 的 600 nm (od600) 下采集的细胞中提取出的纳提根细胞提取物。1升培养将产生约2-3 毫升的提取物, 这足以满足超过800细胞自由反应在25% 粗细胞提取物。蛋白质可以使用质粒 dna、线性 dna 或 mrna 模板来表达;然而, 在使用野生 v. natriegens 无细胞系统9时, 内源性核酸酶的线性 dna 模板降解仍然是一个主要缺点。从v. natriegens培养开始, 一个用户可以在1-2天内实现可用于下游应用的蛋白质。
该协议针对野生 v型和细菌生长介质进行了优化, 这些培养基由补充 v2 盐 (材料表) 的 lb 组成。其他菌株的纳利根可以同样培养产生粗糙的细胞提取物无细胞反应;但是, 它们的使用需要对该协议进行额外的优化。此外, 该无细胞蛋白表达系统已被优化使用 3-磷酸甘油 (3-更加 pga) 作为主要能源再生源。可使用其他能源再生源;然而, 试剂的优化和校准可能需要获得高产蛋白表达10,11。
特别注意该协议中的几个关键步骤, 将确保高产无细胞蛋白生产的最大提取物生产率。首先, 必须从生长的中指数阶段收获的纳特里根细胞培养中制备粗细胞提取物;当培养物达到 od 600 = 1.0±0.2 时, 蛋白质产量最大。虽然无细胞蛋白的产生是可能的, 从在一系列光学密度下收获的细胞, 我们以前发现, 在指数状态下收获的细胞产生的蛋白质明显更多, 蛋白质9。光学密度对粗细胞提取性能的影响与从批培养条件1中生长的细胞中提取的其他无细胞表达系统的观察一致。由于v. natriegens生长速度快, 因此密切监测培养物的光学密度至关重要。一般来说, 使用该协议, 预计v. natriegens培养物应在 1-1. 5小时内可重现地达到1.0 的 od600 ;然而, 个别生长条件, 如使用困惑与非挡板烧瓶, 影响曝气, 或空气与水孵化, 影响孵化温度的速度和稳定性, 可能会改变生长时间。此外, 一般建议在1升的令人困惑的烧瓶中培养至少250毫升的 v. natriegens , 以确保在收获时有一个大的细胞颗粒, 以便于操作和转移。这大大提高了粗细胞提取物制备的成功率, 同时增加了从颗粒中产生的提取物的总量。使用较小的制备方法时, 可以适当调整培养条件和试剂。对于大规模发酵, 可能需要进一步优化培养条件。最后, 为了确保高蛋白质产量, 至关重要的是细胞颗粒在收获后立即进行处理, 或在-80°c 储存后1-2天内进行处理。
脉冲超声对细胞颗粒进行适当的裂解是无细胞蛋白表达成功的关键, 对于新用户来说, 通常是该协议中最困难的方面。通常情况下, 裂解良好的颗粒会产生大量的液体提取物, 没有碎片。提取物应略带粘性, 但在液氮闪存冻结前, 当进入存储管时, 可以很容易地进行移液。图 3描述了裂解良好的颗粒 (图 3a) 与裂解后离心步骤后裂解不良的颗粒 (图 3A) 的表示。完整细胞裂解的一个主要迹象是由总蛋白测定 (步骤 2.13) 确定的粗细胞提取物总蛋白浓度 > 20 mg/ml。过度超声或过度加热粗细胞提取物将损坏细胞机械, 而不进行无细胞反应就无法确定。因此, 在将大量时间和精力用于下游蛋白表达应用之前, 用控制反应测试提取效率是非常有益的。虽然对于不同的声纳设备可能需要额外的优化, 但所描述的脉冲超声步骤在我们手中具有高度的重现性。
使用从 pcr 扩增、限制性酶消化或商业基因合成中提取的线性 dna 模板, 可以显著提高无细胞表达系统中高通量和快速蛋白质生产的能力24。虽然 pcr 扩增线性模板产生的蛋白质已经被证明, 但与在等摩尔比9处使用质粒 dna 模板的反应相比, 这些反应的产率大约低13.5倍。这主要是由于线性 dna 模板的不稳定性, 这可能是由存在于纳酸粗细胞提取物中的内源性核酸酶降解的。虽然 lambda 噬菌体蛋白 gams 以前曾被用来保护线性 dna 模板24,25, 但它被发现与v. natriegens提取物9不兼容。此外, 虽然增加线性 dna 模板的浓度可能会带来更高的蛋白质产量, 但其在粗细胞提取物中的快速降解仍将是一个主要问题。
克服线性 dna 模板降解的一种方法可能是补充线性 dna 体外转录产生的 mrna 模板的无细胞反应。另一方面, 使用 rnase 抑制剂可以显著防止 mrna 转录降解, 并且可以在10μl 无细胞反应格式中获得可观的蛋白质产量 (图 5a, b)。可采用 tta 结扎、topo 克隆、金门组装或其他重组方法将线性 dna 克隆到圆形模板中, 以避免模板的降解。然而, 进一步的方法来抑制核酸酶活性将是必要的, 有效的蛋白质表达使用线性 dna 模板。
到目前为止, 已经提出了几种不同的方法来制备无细胞蛋白表达的粗提取物 9,10,11,26。在开发此协议时, 我们力求最大限度地提高用户的可访问性, 降低总体成本, 并最大限度地减少耗时的步骤。例如, 使用简单的两步声离心过程可实现较高的蛋白质产量, 并且不需要细胞均质机、冗长的透析步骤或径流反应。它很容易在短时间内执行, 不需要高水平的实验室专业知识。因此, 它可以帮助促进无细胞表达作为翻译学术研究和工业过程设计的标准。
该协议扩展了可用于研究和利用具有独特生物特性的非模型生物v. natriegens 的工具包。通过采用半连续或完全连续的无细胞反应, 可以实现更高的蛋白质产量, 从而实现能量再生、氨基酸的再供应和废品的去除 3,5,27.此外, 野生 v . natriegens的工程, 以产生 dnase 或 DNAse-缺乏菌株, 消除有害和竞争代谢途径, 并表达额外的 rna 可以大大提高蛋白质的生产这个系统28,29。当我们解开其快速增长背后的生物学, 进一步开发无纳泰格斯细胞系统可能会加速生物生产能力, 并使治疗肽、小分子和合成物质的有力表达材料。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由国家普通医学研究所1u01g11014-01 和能源部 de-fg02-02er63445 资助。作者要感谢理查德·科曼博士、詹妮·谭博士和埃德加·戈鲁赫博士就构建这份手稿的协议部分提出了有益的建议。
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |