Systèmes d’expression acellulaires sont des outils puissants et rentables pour la synthèse de haut débit et la présélection des protéines importantes. Nous décrivons ici la préparation du système d’expression de protéine acellulaire à l’aide de Vibrio natriegens pour la production de protéine rapide à l’aide de l’ADN plasmidique, ADN linéaire et messagère.
La bactérie marine Vibrio natriegens a suscité une attention considérable comme un hôte microbien émergent de biotechnologie en raison de son taux de croissance rapide. Un protocole général est décrit pour la préparation des extraits du V. natriegens cellulaire brut à l’aide d’équipement de laboratoire commun. Ce protocole à rendement élevé a été spécifiquement optimisé pour l’accessibilité de l’utilisateur et à un coût réduit. La synthèse des protéines acellulaire (CFPS) peut être effectuée à petite échelle 10 μL lot réactions selon un format de 96 ou 384 puits et reproductible des rendements des concentrations de 260 > dossier super μg/mL GFP (sfGFP) au sein de 3 h. Globalement, cellulaire brut extrait préparation et PFC est possible 1−2 jours complets à un seul utilisateur. Ce protocole peut être facilement intégré dans des conduites de synthèse de protéines existantes afin de faciliter les progrès de la bio-production et applications de la biologie synthétique.
La synthèse protéique acellulaire est une méthode souple et rentable pour l’expression de précieuses protéines ou de peptides1,2,3,4. Historiquement, la synthèse protéique acellulaire a été réalisée à l’aide de systèmes d’expression Escherichia coli ; Cependant, il y a eu une montée subite récente dans l’utilisation des organismes alternatifs, non-modèle avec nouvelles propriétés comme châssis pour expression acellulaire5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. les organismes avec des profils métaboliques uniques sont les candidats principaux comme alternatives aux systèmes acellulaires d’e. coli . Par exemple, la bactérie marine que Vibrio natriegens est la plus forte croissance de tous les organismes connus avec un observé doublement durée inférieure à 10 min13. Il a recueilli V. natriegens une attention considérable comme un hôte microbien émergent pour la recherche et la biotechnologie14,15,16,17,18. Étant donné que le taux de croissance rapide de V. natriegens a été liée à des taux élevés de la synthèse des protéines et de l’efficacité métabolique19,20,21, exploiter sa machinerie cellulaire pour acellulaire la synthèse peut élargir considérablement l’outil pour la production de protéines rapides et criblage à haut débit.
Récemment, un acellulaire V. natriegens système d’expression a été démontrée, qui est capable de produire des super dossier GFP (sfGFP) à des concentrations de 260 > μg/mL en 3 h avec un T7 promoteur9. L’objectif général de mettre au point cette méthode était de fournir aux utilisateurs un système d’expression très accessibles, rentables, reproductible et à rendement élevé de protéine acellulaire qui peut être préparé à l’aide de matériel de laboratoire commun dans un court laps de temps. Ce protocole utilise les cultures 1 L en flacons agitateurs, lyse cellulaire par sonication impulsion et réactions de lot à petite échelle dans un format de 96 ou 384 puits afin de maximiser la parallélisation et débit de dépistage. Une expression de la protéine longue et soutenue est rendue possible par la supplémentation d’acide 3-phosphoglycérique (3-PGA) comme une énergie source8,22,23. Après avoir réussi ce protocole, un utilisateur aura la capacité d’exprimer une protéine désirée ou d’un ensemble de protéines sous forme acellulaire utilisant V. natriegens cellulaire brut extrait.
À partir d’un stock de glycérol, V. natriegens des extraits cellulaires bruts sont préparés à partir de cellules prélevées sur une densité optique à 600 nm (OD600) de 1,0. Une culture de L 1 produira environ 2−3 mL d’extrait, qui est suffisante pour plus de 800 acellulaire des réactions à l’extrait cellulaire brut de 25 %. Les protéines peuvent être exprimées à l’aide de l’ADN plasmidique, l’ADN linéaire ou messagère ; dégradation de modèle ADN linéaire par les nucléases endogènes reste cependant un inconvénient majeur lors de l’utilisation de système de type sauvage, V. natriegens acellulaire9. À partir de cultures de V. natriegens , protéines utilisables pour les applications en aval est possible par un seul utilisateur 1−2 jours complets.
Ce protocole a été optimisé pour sauvage V. natriegens et milieux de culture bactérienne composée de LB additionné de sels V2 (Table des matières). Autres souches de V. natriegens peuvent être cultivées de la même façon pour générer cellulaire brut extraits des réactions acellulaire ; Toutefois, leur utilisation nécessite une optimisation supplémentaire du présent protocole. En outre, ce système d’expression de protéine acellulaire a été optimisé à l’aide de l’acide 3-phosphoglycérique (3-PGA) comme la source de régénération d’énergie primaire. Autres sources de régénération d’énergie peuvent être utilisés ; Cependant, optimisation de réactifs et l’étalonnage sera probablement obligée d’obtenir haut rendement protéines expression10,11.
Une attention particulière à plusieurs étapes cruciales dans ce protocole assurera la productivité maximale extrait pour haut rendement acellulaire la production de protéines. Tout d’abord, extrait cellulaire brut doit être préparé à partir V. natriegens cell cultures récoltées dans une phase de milieu-exponentielle de croissance ; rendement de protéine est maximale quand cultures atteignent une OD600 = 1,0 ± 0,2. La production de protéines acellulaire est possible à partir de cellules prélevées à différentes densités optiques, nous avons constaté précédemment que cellules récoltées dans un état exponentiels de croissance donnent beaucoup plus de protéines9. Les effets observés de la densité optique sur performance extrait cellulaire brut concordent avec ceux rapportés pour d’autres systèmes acellulaires expression dérivées de cellules cultivées dans des conditions de culture lot1. Parce que V. natriegens croît à un rythme rapid, il est essentiel de suivre de près les densités optiques des cultures. En général, il est prévu que V. natriegens cultures devraient atteindre reproductible un OD600 de 1,0 dans les 1−1.5 h utilisant ce protocole ; Toutefois, des conditions de croissance individuels tels que l’utilisation de dérouté par rapport aux flacons non-déconcerté, qui affecte l’aération, ou l’air contre l’incubation de l’eau, qui influe sur le taux et la stabilité de la température d’incubation, peuvent modifier les temps de croissance. En outre, il est généralement recommandé d’au moins 250 mL de V. natriegens dans un ballon jaugé de 1 L dérouté afin d’assurer une boulette de grandes cellules à la récolte pour une manipulation facile et le transfert de la culture. Cela améliore grandement le succès de la préparation d’extrait cellulaire brut ainsi que des augmentations le volume total d’extrait issu une boulette. Lorsque vous utilisez la plus petite préparation d’échelle, les réactifs et les conditions de culture peuvent être ajustés correctement. Pour la fermentation à grande échelle, outre l’optimisation des conditions de culture peut être nécessaire. Enfin, afin d’assurer un rendement de haute teneur en protéines, il est primordial que les granules cellulaires soient traités immédiatement après la récolte, ou 1−2 jours de stockage à-80 ° C.
Provoquer la lyse adéquate dans le culot cellulaire par sonication impulsion est essentielle à la réussite de l’expression protéique acellulaire et est souvent l’aspect le plus difficile du présent protocole pour les nouveaux utilisateurs. En règle générale, une boulette bien lysée produira un volume important d’extrait liquide exempt de débris. L’extrait doit être légèrement visqueux, mais peut être facilement distribué lorsque aliquotage en stock tubes avant congélation dans l’azote liquide flash. La figure 3 illustre une représentation d’une pastille bien lysée (Figure 3 a) en comparaison avec une boulette de mal lysée (Figure 3 b) après l’étape de centrifugation de lyse post. Une indication majeure de la lyse cellulaire complet est un cellulaire brut extrait de protéine totale concentration > 20 mg / mL, tel que déterminé par un dosage des protéines totales (étape 2.13). Sonication excessive ou un réchauffement excessif de l’extrait cellulaire brut risquent d’endommager la machinerie cellulaire, qui ne peut être déterminée sans effectuer une réaction acellulaire. Ainsi, il est très bénéfique pour tester l’efficacité d’extrait avec une réaction de contrôle avant de consacrer beaucoup de temps et d’efforts aux applications expression de protéine en aval. Une optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour l’équipement de sonication différents, les étapes de sonication impulsions décrites ont été hautement reproductibles dans nos mains.
L’utilisation de la matrice d’ADN linéaire provenant de PCR amplification, digest de l’enzyme de restriction ou synthèse de gène commerciales peut augmenter considérablement la capacité de production de la protéine rapide et à haut débit à l’expression acellulaire systèmes24. Alors que la production de protéines du modèle linéaire amplification PCR a été démontrée, le rendement de ces réactions sont environ 13.5-fold inférieur par rapport aux réactions à l’aide de plasmide matrice d’ADN à des taux équimolaires9. C’est principalement en raison de l’instabilité de la matrice d’ADN linéaire qui est probablement dégradé par les nucléases endogènes présents dans V. natriegens cellulaire brut extrait. Tandis que phage lambda protéine GamS a été précédemment utilisé pour protéger l’ADN linéaire modèle24,25, il a été constaté incompatible avec V. natriegens extraits9. En outre, alors que l’augmentation de la concentration de la matrice d’ADN linéaire peut permettre un rendement plus élevé de protéine, sa dégradation rapide dans l’extrait cellulaire brut sera toujours un problème majeur.
Une solution pour surmonter la dégradation de l’ADN linéaire pour modèle peut-être compléter acellulaire réactions avec messagère généré par transcription in vitro de l’ADN linéaire. En revanche, l’utilisation d’un inhibiteur de RNase offre une protection significative contre la dégradation des ARNm transcription et peuvent obtenir des rendements de protéines appréciable dans le format de réaction acellulaire 10 μL (Figure 5 aB). Clonage d’ADN linéaire dans un modèle circulaire par ligature TA, TOPO clonage, un assemblage de Golden Gate ou autres méthodes de recombinaison peuvent servir à contourner la dégradation du modèle. Néanmoins, outre des approches pour l’inhibition de l’activité nucléasique sera nécessaires pour l’expression de la protéine efficace à l’aide de la matrice d’ADN linéaire.
A ce jour, plusieurs approches différentes ont été proposées pour la préparation d’extrait brut de proteines acellulaires expression9,10,11,26. Dans l’élaboration de ce protocole, nous avons cherché à maximiser l’accessibilité de l’utilisateur, réduire le coût global et minimiser les étapes fastidieuses. Par exemple, un rendement de haute teneur en protéines est obtenu grâce à un processus de sonication-centrifugation simple en deux étapes et ne nécessite pas d’homogénéisateurs de cellule, marches de dialyse longue ou réaction de ruissellement. Il est simple à exécuter dans un court laps de temps et ne nécessite pas de haut niveau d’expertise de laboratoire. Ainsi, il peut aider à faciliter l’expression sans cellule comme un standard pour la recherche translationnelle et conception des procédés industriels.
Ce protocole s’étend de la boîte à outils disponible pour l’enquête et l’utilité du V. natriegens, un organisme non-modèle avec des propriétés biologiques uniques. Rendement plus élevé de protéine peut être réalisé en employant les réactions acellulaire semi – ou entièrement-continu, afin de permettre la régénération de l’énergie, pour ravitailler des acides aminés et l’élimination des déchets produits3,5,27. En outre, l’ingénierie de type sauvage V. natriegens pour produire des souches de DNAse – ou RNAse-deficient, enlèvement des voies métaboliques délétères qui se font concurrence et l’expression des Arnt supplémentaires pourraient améliorer considérablement la production de protéines dans ce système28,29. Comme nous démêler la biologie qui sous-tendent sa croissance rapide, poursuite de V. natriegens systèmes acellulaires peut-être accélérer les capacités de bioproduction et activer l’expression robuste de peptides thérapeutiques, de petites molécules et synthétique matériaux.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par le National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 et le ministère de l’énergie DE-FG02-02ER63445. Les auteurs aimeraient remercier Dr. Richard Kohman, Dre Jenny Tam et Dr Edgar Goluch pour obtenir des conseils utiles sur la construction de la section protocole de ce manuscrit.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |