Celle-fri udtryk systemer er kraftfulde og omkostningseffektive værktøjer til høj overførselshastighed syntese og screening af vigtige proteiner. Her beskriver vi udarbejdelsen af celle-fri protein udtryk system ved hjælp af Vibrio natriegens til hurtig protein produktion ved hjælp af plasmid DNA, lineære DNA og mRNA skabelon.
Marine bakterien Vibrio natriegens har høstet stor opmærksomhed som en spirende mikrobielle vært for bioteknologien på grund af sin hurtige vækst. En generel protokol er beskrevet til fremstilling af V. natriegens rå celle ekstrakter ved hjælp af fælles laboratorieudstyr. Denne høje højtydende protokol har været specielt optimeret til brugeren tilgængelighed og lavere omkostninger. Celle-fri proteinsyntesen (CFPS) kan udføres i lille skala 10 μL batch reaktioner i enten en 96 – eller 384-godt format og reproducerbar giver koncentrationer af > 260 μg/mL super mappen normal god landbrugspraksis (sfGFP) inden for 3 h. samlet, rå celle uddrag forberedelse og CFPS kan opnås i 1−2 fulde dage af en enkelt bruger. Denne protokol kan let integreres i eksisterende protein syntese rørledninger til at lette fremskridt inden for bio-produktion og syntetisk biologi applikationer.
Celle-fri proteinsyntesen er en alsidig og omkostningseffektiv metode til udtryk af værdifulde proteiner eller peptider1,2,3,4. Celle-fri proteinsyntesen har historisk set udført ved hjælp af Escherichia coli udtryk systemer; dog har der været en nylig bølge i brugen af alternative, ikke-model organismer med nye egenskaber som kabinet for celle-fri udtryk5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unikke metaboliske profiler er prime kandidater som alternativer til E. coli celle-fri systemer. For eksempel, fordobling marine bakterien Vibrio natriegens er det hurtigst voksende alle kendte organismer med en observerede tid på mindre end 10 min.13. Dette har høstet V. natriegens stor opmærksomhed som en spirende mikrobielle vært for forskning og bioteknologi14,15,16,17,18. Betragtning af, at den hurtige vækst af V. natriegens har været knyttet til høje priser af proteinsyntesen og metaboliske effektivitet19,20,21, udnytte dets cellulære maskiner til celle-fri Sammenfattende kan betydeligt udvide toolkit for hurtig protein produktion og høj overførselshastighed screening.
For nylig, en celle-gratis V. natriegens ekspressionssystem har påvist som er i stand til at producere super mappen normal god landbrugspraksis (sfGFP) i koncentrationer på > 260 μg/mL i 3 h med en T7 promotor9. Det overordnede formål at udvikle denne metode var at give brugere med et meget tilgængeligt, omkostningseffektiv, reproducerbare og højtydende celle-fri protein udtryk, der kan forberedes ved hjælp af fælles lab udstyr i en kort tid. Denne protokol udnytter 1 L kulturer i ryste kolber, celle lysering af pulse ultralydbehandling og små batch reaktioner i en 96 – eller 384-godt format at maksimere parallelization og screening overførselshastighed. En lang og vedvarende protein udtryk er muliggjort af tilskud af 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) som en energi kilde8,22,23. Efter endt denne protokol, en bruger vil have mulighed for at udtrykke en ønskede protein eller sæt af proteiner i en celle-fri format ved hjælp af V. natriegens rå celle uddrag.
Start fra en glycerol bestand, V. natriegens rå celle ekstrakter er fremstillet af celler høstet ved en optisk tæthed på 600 nm (OD600) 1.0. En 1 L kultur vil give ca 2−3 mL ekstrakt, som er tilstrækkelig for mere end 800 celle-fri reaktioner på 25% rå celle ekstrakt. Proteiner kan udtrykkes ved hjælp af plasmid DNA, lineære DNA eller mRNA skabelon; lineære DNA skabelon nedbrydning af endogene nukleaser er imidlertid en stor ulempe ved brug af vildtype V. natriegens celle-fri ordning9. Startende fra V. natriegens kulturer, kan protein brugbar for downstream applikationer opnås ved en enkelt bruger i 1−2 hele dage.
Denne protokol er blevet optimeret til vildtype V. natriegens og bakteriel vækst medier består af LB suppleret med V2 salte (Tabel af materialer). Andre stammer af V. natriegens kan ligeledes kulturperler for at generere rå celle ekstrakter til celle-fri reaktioner; deres anvendelse kræver imidlertid yderligere optimering af denne protokol. Derudover er denne celle-fri protein ekspressionssystem blevet optimeret ved hjælp af 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) som den primære energikilde regenerering. Andre energi regenerering kilder kan anvendes; men optimering af reagenser og kalibreringen vil sandsynligvis være forpligtet til at opnå høj højtydende protein udtryk10,11.
Særlig opmærksomhed til flere kritiske trin i denne protokol vil sikre maksimal ekstrakt produktivitet for højtforrentede celle-gratis protein produktion. Først, rå celle ekstrakt skal vaere tilberedt af V. natriegens cellekulturer høstet i en midt-eksponentiel vækst; protein udbytte er maksimal, når kulturer nå en OD600 = 1,0 ± 0,2. Mens celle-fri protein produktion er muligt fra celler høstet på en vifte af optiske tætheder, har vi tidligere fundet, at celler høstet i en eksponentiel tilstand af vækst giver betydeligt mere protein9. De observerede virkninger af optisk tæthed på rå celle ekstrakt ydeevne er i overensstemmelse med dem, der indberettes til andre celle-fri udtryk systemer stammer fra celler dyrkes i batch kultur betingelser1. Fordi V. natriegens vokser i et hastigt tempo, er det afgørende at nøje overvåge kulturer optisk tætheder. Generelt forventes det, at V. natriegens kulturer reproducerbar bør nå en OD600 1.0 inden for 1−1.5 h bruger denne protokol; dog forbløffet enkelte vækstbetingelser såsom brugen af versus ikke-forvirret kolber, hvilket påvirker luftning eller luft versus vand inkubation, der påvirker den hastighed og stabilitet i inkubation temperatur, kan ændre vækst tid. Det anbefales generelt at kultur mindst 250 mL af V. natriegens i en 1 L forbløffet kolbe til at sikre en stor celle pellet ved høst for easy manipulation og overførsel. Dette forbedrer succes af rå celle ekstrakt forberedelse samt øger den samlede mængde af ekstrakt fremstillet af en pellet. Når du bruger mindre skala forberedelse, justeres dyrkningsbetingelserne og reagenser korrekt. For storstilet gæring, kan yderligere optimering af kultur betingelser være påkrævet. Endelig, for at sikre høj protein udbytte, det er afgørende, at celle pellets forarbejdes straks efter høst, eller senest 1−2 dage oplagring ved-80 ° C.
Den ordentlig lysering af celle pellet ved puls sonikering er afgørende for succes af celle-fri protein udtryk og er ofte den vanskeligste aspekt af denne protokol for nye brugere. Typisk, en godt lysed pellet vil give en betydelig mængde af flydende ekstrakt, der er fri for snavs. Ekstrakten skal være lidt tyktflydende men kan være let pipetted, når aliquoting i opbevaring rør før flash fryser i flydende kvælstof. Figur 3 viser en repræsentation af en godt lysed pellet (figur 3A) i forhold til et dårligt lysed pellet (figur 3B) efter post lysis centrifugering skridt. En større angivelse af komplet celle lysis er en rå celle ekstrakt total protein koncentration > 20 mg / mL, som bestemmes af en total protein assay (trin 2.13). Overdreven sonikering eller overdreven opvarmning af rå celle ekstrakt vil skade den cellulære maskiner, der ikke kan fastsættes uden at udføre en celle-fri reaktion. Det er således meget gavnligt at teste ekstrakt effektivitet med en kontrol reaktion før afsætte betydelige tid og kræfter til downstream protein udtryk ansøgninger. Mens yderligere optimering kan være nødvendigt for forskellige sonikering udstyr, har pulse sonikering trinene beskrevet været stærkt reproducerbare i vores hænder.
Brug af lineære DNA skabelon afledt af PCR forstærkning, begrænsning enzym digest eller kommercielle gen syntese kan øge kapaciteten til høj overførselshastighed og hurtige protein produktion i celle-fri udtryk systemer24. Mens protein produktion fra PCR forstærket lineær skabelon er blevet påvist, udbyttet af disse reaktioner er ca 13.5-fold lavere sammenlignet med reaktioner ved hjælp af plasmid DNA skabelon på equimolar nøgletal9. Dette skyldes primært ustabiliteten i den lineære DNA-skabelon, som er sandsynligvis nedbrudt af endogene nukleaser stede i V. natriegens rå celle ekstrakt. Mens lambda phage protein GamS har tidligere er blevet anvendt til at beskytte lineære DNA skabelon24,25, konstateredes det, at være uforenelig med V. natriegens ekstrakter9. Derudover mens øger koncentrationen af lineære DNA skabelon kan give mulighed for et højere protein udbytte, vil dens hurtig nedbrydning i rå celle ekstrakt stadig være et stort problem.
En løsning til at overvinde lineære DNA skabelon nedbrydning kan være at supplere celle-fri reaktioner med mRNA skabelon genereret fra in vitro-transskription af lineære DNA. På den anden side brugen af en RNase hæmmer tilbyder betydelig beskyttelse mod mRNA udskrift nedbrydning og mærkbar protein udbyttet kan fås i 10 μL celle-fri reaktion format (figur 5AB). Kloning af lineære DNA i en cirkulær skabelon gennem TA ligatur, kan TOPO kloning, Golden Gate forsamling eller andre rekombination metoder anvendes til at omgå skabelon nedbrydning. Ikke desto mindre vil yderligere tilgange til hæmning af nukleasen aktivitet være nødvendigt for effektiv protein udtryk ved hjælp af lineære DNA skabelon.
Til dato, er blevet foreslået flere forskellige tilgange til tilberedning af rå ekstrakt til celle-fri protein udtryk9,10,11,26. I udviklingen af denne protokol, forsøgte vi at maksimere bruger tilgængelighed, reducere samlede omkostninger og minimere tidskrævende trin. For eksempel, et højt proteinindhold udbytte er opnået ved hjælp af en simpel totrinsproces sonikering-centrifugering, og kræver ikke celle homogenizers, langvarige dialyse trin eller afstrømning reaktion. Det er simpelt at udføre i en kort periode og kræver ikke højt niveau af ekspertise, laboratorium. Det kan således bidrage til at lette celle-fri udtryk som en standard for Translationel akademisk forskning og industriel procesdesign.
Denne protokol udvider toolkit tilgængelig for undersøgelse og nytte af V. natriegens, en ikke-model organisme med unikke biologiske egenskaber. Højere protein udbytte kan opnås ved at ansætte semi – eller fuldt-løbende celle-fri reaktioner, at tillade energi regenerering, genlevering af aminosyrer, og fjernelse af affaldsprodukter3,5,27. Derudover engineering af vildtype V. natriegens at producere DNAse – eller RNAse-mangelfuld stammer, fjernelse af skadelige og konkurrerende stofskifteveje og udtryk for yderligere tRNAer kunne i høj grad øge produktionen af proteiner i Dette system28,29. Som vi optrævle biologi bag sin hurtige vækst, kan videreudvikling af V. natriegens celle-fri systemer fremskynde bioproduktion kapaciteter og aktiverer robust udtryk for terapeutisk peptider, små molekyler og syntetiske materialer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 og Institut for energi DE-FG02-02ER63445. Forfatterne vil gerne takke Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam og Dr. Edgar Goluch for nyttige råd om konstruere protokoltjenesten af dette manuskript.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |