Celle-frie uttrykk systemer er kraftige og kostnadseffektive verktøy for høy gjennomstrømming syntese og screening av viktige proteiner. Her beskriver vi utarbeidelse av celle-fri protein uttrykk systemet med Vibrio natriegens for rask protein produksjon plasmider DNA, lineær DNA og mRNA mal.
Marine bakterien Vibrio natriegens har fått stor oppmerksomhet som en fremvoksende mikrobiell vert for bioteknologi på grunn av sin raske vekst. En generell protokoll er beskrevet for utarbeidelse av V. natriegens råolje celle ekstrakter bruk vanlig laboratoriet. Denne høy gir protokollen er spesielt optimalisert for brukeren tilgjengelighet og reduserte kostnader. Cellen gratis proteinsyntese (CFPS) kan bli utført i liten skala 10 μL satsvise reaksjoner i enten en 96 – eller 384-godt format og reproduserbar gir konsentrasjoner av > 260 μg/mL super mappe GFP (sfGFP) i 3 h. samlet, råolje celle ekstra forberedelse og CFPS kan oppnås i 1−2 hele dager av en bruker. Denne protokollen kan enkelt integreres i eksisterende protein syntese rørledninger til rette fremskritt innen bio-produksjon og syntetisk biologi programmer.
Celle-fri proteinsyntese er en allsidig og kostnadseffektiv metode for uttrykket av verdifulle proteiner eller peptider1,2,3,4. Cellen gratis proteinsyntese er historisk utført med Escherichia coli uttrykk systemer; men har det vært en nylig økning i bruker alternative, ikke-modellen organismer med romanen egenskaper som kabinett for celle-frie uttrykk5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unike metabolske profiler er førsteklasses kandidater som alternativer til E. coli celle-frie systemer. For eksempel dobling marine bakterien Vibrio natriegens er de raskest voksende av alle kjente organismer med en observert tid mindre enn 10 min13. Dette har fått V. natriegens stor oppmerksomhet som en fremvoksende mikrobiell vert for forskning og bioteknologi14,15,16,17,18. Gitt at den raske veksten av V. natriegens har vært knyttet til høy forekomst av proteinsyntese og metabolsk effektivitet19,20,21, utnytte det cellulære maskineriet for celle-fri syntese kan betydelig utvide verktøysettet for rask protein produksjon og høy gjennomstrømming screening.
Nylig en celle-fri V. natriegens uttrykk systemet har vist som er produsere super mappen GFP (sfGFP) på konsentrasjoner av > 260 μg/mL i 3 h med en T7 promoter9. Det overordnete målet for å utvikle denne metoden var å gi brukerne et svært tilgjengelig, kostnadseffektiv, reproduserbare og høytytende celle-fri protein uttrykk system som kan tilberedes ved hjelp av vanlige laboratorieutstyr på kort tid. Denne protokollen bruker 1 L kulturer i riste flasker, celle lysis av puls sonication og småskala satsvise reaksjoner i 96 – eller 384-godt format å maksimere parallelization og screening gjennomstrømming. En lang, vedvarende protein uttrykk er gjort mulig ved påfylling av 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) som en energi kilde8,22,23. Ved å fullføre denne protokollen, en bruker vil ha evnen til å uttrykke en ønsket protein eller sett med proteiner i celle-fritt format med V. natriegens råolje cellen pakke.
Fra en glyserol lager, V. natriegens råolje celle ekstrakter er forberedt fra celler høstes ved en optisk densitet ved 600 nm (OD600) av 1.0. En 1 L kultur vil gi ca 2−3 mL ekstrakt som er tilstrekkelig for mer enn 800 celle-fri reaksjoner på 25% råolje celle ekstrakt. Proteiner kan uttrykkes med plasmider DNA, lineær DNA eller mRNA malen. lineær DNA mal nedbrytning av endogene nucleases imidlertid en stor ulempe ved vill type V. natriegens celle-ledig system9. Fra V. natriegens kulturer, kan protein brukbar for nedstrøms programmer oppnås ved en enkeltbruker i 1−2 hele dager.
Denne protokollen er optimalisert for vill-type V. natriegens og bakteriell vekst medier består av LB supplert med V2 salter (Tabell for materiale). Andre stammer av V. natriegens kan tilsvarende kultivert for å generere rå celle ekstrakter for celle-fri reaksjoner; imidlertid trenger flere optimalisering av denne protokollen. I tillegg er celle-fri protein uttrykk systemet optimalisert med 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) som primær energi gjenfødelse kilden. Andre energikilder gjenfødelse kan brukes; optimalisering av reagenser og kalibrering vil imidlertid trolig være nødvendig for å oppnå høy gir protein uttrykk10,11.
Spesiell oppmerksomhet til flere avgjørende skritt i denne protokollen sikrer maksimal ekstrakt produktivitet for høytytende celle-fri protein produksjon. Først råolje celle ekstrakt må være forberedt fra V. natriegens cellekulturer høstet i en midt-eksponentiell vekstfase; protein avkastning er maksimal når kulturer når en OD600 = 1.0 ± 0,2. Cellen gratis protein produksjon er mulig fra celler høstes ved en rekke optiske tettheter, har vi tidligere funnet at celler høstes i en eksponentiell delstaten vekst gi betydelig mer protein9. Observerte effekten av optisk tetthet på råolje celle ekstrakt ytelse er samsvarer med de rapporterte for andre celle-frie uttrykk systemer fra celler dyrket i batch kultur forhold1. Fordi V. natriegens vokser i et hurtig tempo, er det viktig å nøye overvåke kulturer optisk tetthet. Generelt er det forventet at V. natriegens kulturer reproduserbar skal nå et OD600 1,0 innen 1−1.5 h bruker denne protokollen; imidlertid forvirret personlige vekst forhold som bruk av versus ikke-forbløffet flasker, som påvirker lufting eller air versus vann inkubasjon som påvirker hastigheten og stabiliteten til inkubasjon temperatur, kan endre vekst tid. Videre er det generelt anbefalt å kultur minst 250 mL av V. natriegens i en 1 L forbløffet bolle å sikre stor celle pellets på harvest for enkel manipulering og overføring. Dette forbedrer suksessen av råolje celle ekstrakt forberedelse som øker det totale volumet av ekstrakt produsert fra pellets. Når du bruker mindre skala forberedelse, kan kultur forhold og reagenser justeres riktig. For storskala gjæring, kan ytterligere optimalisering av oppdrettsforholdene være nødvendig. Til slutt, for å sikre høy protein avkastning, er det avgjørende at cellen pellets behandles umiddelbart etter høsting eller i 1−2 dager lagring på-80 ° C.
Den riktige lysis av cellen pellet av puls sonication er avgjørende for suksess for cellen uten protein uttrykk og er ofte den vanskeligste delen av denne protokollen for nye brukere. Vel lysed pellets vil vanligvis gi en betydelig mengde flytende ekstrakt som er fri for rusk. Ekstraktet bør være litt tyktflytende, men kan være lett pipetted når aliquoting til lagring rør før flash fryse i flytende nitrogen. Figur 3 viser en representasjon av godt lysed pellets (figur 3A) i forhold til dårlig lysed pellets (figur 3B) etter innlegget lysis sentrifugering trinn. En viktig indikasjon på komplett celle lysis er en grov celle ekstra totale protein konsentrasjon > 20 mg / mL som en total protein analysen (trinn 2.13). Over sonication eller overdreven varme av råolje celle ekstraktet vil skade den cellulære maskineriet, som ikke kan avgjøres uten å utføre en celle-fri reaksjon. Dermed er det svært gunstig å teste ekstra effektivitet med en kontroll reaksjon før vie mye tid og krefter til nedstrøms protein uttrykk programmer. Mens ytterligere optimalisering kan være nødvendig for forskjellige sonication utstyr, vært impuls sonication trinnene beskrevet svært reproduserbare i våre hender.
Bruk av lineære DNA mal fra PCR forsterkning, begrensning enzym ufullstendig eller kommersielle gen syntese kan signifikant øke kapasiteten for høy gjennomstrømming og rask protein produksjon i celle-frie uttrykk systemer24. Mens protein produksjon fra PCR forsterket lineær mal har vist, avkastningen av disse reaksjonene er ca 13.5-fold lavere sammenlignet reaksjoner med plasmider DNA mal på ekvimolare prosenter9. Dette er hovedsakelig på grunn av ustabilitet i lineær DNA malen som trolig ved endogene nucleases i V. natriegens råolje celle ekstrakt. Mens lambda phage protein GamS har tidligere blitt brukt til å beskytte lineær DNA mal24,25, ble det funnet inkompatibel med V. natriegens ekstrakter9. I tillegg, mens øker konsentrasjonen av lineær DNA mal kan tillate en høyere protein avkastning, vil dens rask degradering av råolje celle ekstrakt fortsatt være et stort problem.
En løsning for å overvinne lineær DNA mal fornedrelse kan være å supplere celle-fri reaksjoner med mRNA mal fra i vitro transkripsjon av lineær DNA. På den annen side, bruk av en RNase hemmer gir betydelig beskyttelse mot mRNA transkripsjon fornedrelse og merkbar protein gir kan fås i 10 μL celle-fri reaksjon format (figur 5AB). Kloning av lineær DNA i et rundskriv mal gjennom TA hemorroider, kan TOPO kloning, Golden Gate montering eller andre rekombinasjon metoder brukes til å omgå mal degradering. Likevel vil videre tilnærminger for hemming av nuclease aktivitet være nødvendig for effektiv protein uttrykk bruker lineær DNA mal.
Hittil har foreslått flere ulike tilnærminger for utarbeidelse av rå ekstrakt for cellen uten protein uttrykk9,10,11,26. I utvikling av denne protokollen, søkt vi å maksimere bruker tilgjengelighet, redusere totalkostnadene og minimere tidkrevende trinnene. For eksempel en høy protein avkastning er oppnådd med en enkel prosess for sonication-sentrifugering, og krever ikke celle homogenizers, lange dialyse trinnene og avrenning reaksjon. Det er enkelt å utføre i en kort periode og krever ikke høy laboratorium kompetanse. Dermed kan det hjelpe lette celle-frie uttrykk som standard translasjonsforskning akademisk forskning og prosessindustri.
Denne protokollen utvider verktøysettet tilgjengelig for etterforskning og nytten av V. natriegens, en ikke-modellen organisme med unike biologiske egenskaper. Høyere protein avkastning kan oppnås ved å bruke semi – eller fullt-kontinuerlig celle-fri reaksjoner, å tillate energi gjenfødelse, forsyne aminosyrer og fjerning av avfallsprodukter3,5,27. Videre prosjektering av vill-type V. natriegens å produsere DNAse – eller RNAse-mangelfull stammer, fjerning av skadelige og konkurrerende metabolske veier, og uttrykk for flere tRNAs kan øke produksjonen av proteiner i Dette systemet28,29. Som vi løse biologi underliggende dens raske veksten, kan videreutvikling av V. natriegens celle-frie systemer akselerere bioproduction evner og aktivere robust uttrykk for terapeutisk peptider, små molekyler og syntetisk materialer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 og Institutt for energi-DE-FG02-02ER63445. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam og Dr. Edgar Goluch for nyttige råd på å konstruere den protokoll delen av dette manuskriptet.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |