Zellfreie Expressionssysteme sind leistungsstarke und kostengünstige Werkzeuge für den Hochdurchsatz-Synthese und Screening von wichtigen Proteinen. Hier beschreiben wir die Vorbereitung der zellfreien Protein Expressionssystems mit Vibrio Natriegens für die schnelle Proteinproduktion Plasmid-DNA, lineare DNA und mRNA-Vorlage verwenden.
Die marinen Bakteriums Vibrio Natriegens hat beträchtliche Aufmerksamkeit als aufstrebenden mikrobielle Gastgeber für die Biotechnologie aufgrund seiner schnellen Wachstumsrate sammelte. Ein allgemeines Protokoll wird für die Zubereitung von V. Natriegens Rohöl Zellextrakte mit gemeinsamen Laborgeräte beschrieben. Dieses hohe ertragreiche Protokoll wurde speziell für die Zugänglichkeit Benutzer optimiert und Kosten reduziert. Zellfreie Proteinsynthese (GFP) in kleinem Maßstab 10 μL Batch Reaktionen in entweder einem 96 oder 384-Well-Format vorgenommen werden und reproduzierbar ergibt Konzentrationen von > 260 μg/mL super Ordner GFP (SfGFP) innerhalb von 3 h insgesamt, groben Zelle zu extrahieren, Vorbereitung und GFP kann ein einzelner Benutzer in 1−2 volle Tage erreicht werden. Dieses Protokoll kann leicht in vorhandene Protein Synthese Pipelines, Fortschritte in der Bio-Produktion und synthetische Biologie Anwendungen zu erleichtern integriert werden.
Zellfreie Proteinsynthese ist eine vielseitige und kostengünstige Methode für die Ausprägung der wertvollen Proteine oder Peptide1,2,3,4. In der Vergangenheit wurde zellfreie Proteinsynthese mit Escherichia coli Expressionssysteme durchgeführt; Es wurde jedoch eine neue Schwankung im Umgang mit Alternativen, nicht-Modell Organismen mit neuartigen Eigenschaften als Fahrgestell für zellfreie Expression5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. Organismen mit einzigartigen Stoffwechselprofile sind Hauptkandidaten als Alternativen zu E. Coli zellfreien Systemen. Zum Beispiel Verdopplungszeit des marinen Bakteriums Vibrio Natriegens ist die am schnellsten wachsende aller bekannten Organismen mit einer beobachteten von weniger als 10 min13. Dies hat V. Natriegens große Aufmerksamkeit als eine aufstrebende mikrobielle Host für Forschung und Biotechnologie14,15,16,17,18sammelte. Angesichts der Tatsache, dass das schnelle Wachstum von V. Natriegens hat worden zu hohen Protein-Synthese und Stoffwechseleffizienz19,20,21, Nutzbarmachung der zellulären Maschinerie für zellfreie verbunden Synthese kann das Toolkit für schnelle Proteinproduktion und Hochdurchsatz-Screening deutlich erweitern.
Vor kurzem eine zellfreie V. Natriegens Expressionssystem wurde nachgewiesen, die in der Lage, super Ordner GFP (SfGFP) bei Konzentrationen von > 260 μg/mL in 3 h mit einer T7-Promotor-9ist. Das übergeordnete Ziel der Entwicklung dieser Methode war Benutzern eine sehr zugänglich, kostengünstige, reproduzierbare und ertragreiche zellfreien Protein Expressionssystems zur Verfügung zu stellen, die mit gemeinsamen Labor-Equipment in kürzester Zeit zubereitet werden können. Dieses Protokoll nutzt 1 L Kulturen in Fläschchen schütteln, Lyse der Zelle durch Puls-Beschallung und kleine Batch Reaktionen in einem 96 oder 384-Well-Format, Parallelisierung und screening-Durchsatz zu maximieren. Eine lange, anhaltende Protein-Expression wird als eine Energie Quelle8,22,23durch Supplementierung von 3-Phosphoglyceric-Säure (3-PGA) ermöglicht. Nach erfolgreichem Abschluss dieses Protokolls, ein Benutzer haben die Möglichkeit, einen gewünschten Proteins auszudrücken oder Satz von Proteinen in einem zellfreien Format mit V. Natriegens groben Zelle extrahieren.
Ausgehend von einem Glycerin-Lager, V. Natriegens Rohöl Zellextrakte bereiten wir aus Zellen geerntet eine Extinktion bei 600 nm (OD600) von 1,0. Eine 1 L-Kultur wird etwa 2−3 mL Extrakt, nachgeben, die für mehr als 800 zellfreie Reaktionen auf 25 % Rohöl Zelle Extrakt ausreicht. Proteine können mit Plasmid DNA, lineare DNA oder mRNA Vorlage ausgedrückt werden; lineare DNA-Vorlage-Abbau durch endogene Nukleasen bleibt jedoch einen großen Nachteil bei der Verwendung von Wildtyp V. Natriegens zellfreien System9. Ausgehend von V. Natriegens Kulturen, kann Protein nutzbar für downstream-Anwendungen von einem einzelnen Benutzer in 1−2 volle Tage erreicht werden.
Dieses Protokoll wurde für Wildtyp V. Natriegens und Bakterienwachstum Medien bestehend aus LB ergänzt mit V2 Salze (Table of Materials) optimiert. Andere Stämme von V. Natriegens können in ähnlicher Weise kultiviert werden, um grobe Zellextrakte für zellfreie Reaktionen zu erzeugen; Ihr Einsatz erfordert jedoch zusätzliche Optimierung dieses Protokolls. Darüber hinaus wurde dieses zellfreien Protein Ausdruck System optimiert, mit 3-Phosphoglyceric-Säure (3-PGA) als die primäre Energiequelle für die Regeneration. Andere Energiequellen Regeneration können verwendet werden; Optimierung von Reagenzien und Kalibrierung werden jedoch wahrscheinlich zu hoch ertragreiche Protein Ausdruck10,11erwerben.
Besondere Aufmerksamkeit auf einige wichtige Schritte in diesem Protokoll sorgt für maximale Extrakt Produktivität für ertragreiche zellfreien Protein-Produktion. Zunächst groben Zelle extrahieren muss bereit sein, von V. Natriegens Zellkulturen geerntet in eine Mitte-exponentielle Wachstumsphase; Proteinausbeute ist maximal, wenn Kulturen eines OD600 erreichen = 1,0 ± 0,2. Während zellfreien Protein-Produktion von Zellen in einem Bereich der optischen Dichte möglich ist, haben wir bereits festgestellt, dass Zellen in einem exponentiellen Wachstum deutlich mehr Protein9ergeben. Die beobachteten Effekte der optischen Dichte auf Rohöl Zellleistung Extrakt entsprechen denen anderer zellfreie Expressionssysteme Zellen gezüchtet in Batch-Kultur-Bedingungen-1abgeleitet. Da V. Natriegens rasant wächst, ist es wichtig zu optischen Dichte der Kulturen verfolgen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass V. Natriegens Kulturen reproduzierbar ein OD600 von 1,0 in 1−1.5 h unter Verwendung dieses Protokolls erreichen sollte; allerdings verblüfft individuelle Wachstumsbedingungen wie die Verwendung von versus nicht ratlos Flaschen, welche Affekte Belüftung oder Luft im Vergleich zu Wasser Inkubation, betrifft die Geschwindigkeit und Stabilität der Inkubationstemperatur Wachstumszeit verändern können. Darüber hinaus empfiehlt es im allgemeinen Kultur mindestens 250 mL V. Natriegens in einem 1 L ratlos Kolben um eine große Zelle Pellet bei der Ernte für einfache Handhabung und Übertragung zu gewährleisten. Dies verbessert den Erfolg der groben Zelle Extrakt Zubereitung sowie steigt das Gesamtvolumen der Auszug aus einem Pellet hergestellt. Bei der Verwendung von kleineren Maßstab Vorbereitung können Kulturbedingungen und Reagenzien entsprechend angepasst werden. Für die groß angelegte Gärung weitere sein Optimierung der Kulturbedingungen erforderlich. Schließlich um proteinreiche Ausbeute zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die Zelle Pellets sofort nach der Ernte oder innerhalb von 1−2 Tagen Lagerung bei-80 ° c verarbeitet werden
Die richtige lyse der Zelle Pellet durch Puls Ultraschallbehandlung ist entscheidend für den Erfolg der zellfreien Proteinexpression und ist oft der schwierigste Aspekt dieses Protokolls für neue Benutzer. Ein gut lysierten Pellet wird in der Regel einen signifikanten Teil der Flüssigextrakt hervorbringen, die frei von Fremdkörpern ist. Der Extrakt sollte leicht viskose aber kann leicht pipettiert werden, wenn Rohre Aliquotierung Einlagerung vor Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Abbildung 3 zeigt eine Darstellung eines gut lysierten Pellet (Abbildung 3A) im Vergleich zu einem schlecht lysierten Pellet (Abb. 3 b) nach der Post Lyse Zentrifugationsschritt. Ein wichtiger Indikator für vollständige Zelle Lysis ist eine grobe Zelle extrahieren Gesamtprotein Konzentration > 20 mg / mL eine Gesamt-Protein Assay (Schritt 2.13) bestimmt. Übermäßige Anwendung von Ultraschall oder übermäßige Erhitzung des groben Zelle Extraktes beschädigen die zelluläre Maschinerie, die ohne Durchführung einer zellfreien Reaktion nicht ermittelt werden kann. Daher ist es sehr vorteilhaft, Extrakt Effizienz mit einem Kontrollreaktion bevor widmet viel Zeit und Mühe auf nachgelagerten Protein Ausdruck Anwendungen testen. Zusätzliche Optimierung für verschiedene Beschallung Geräte erforderlich sind, wurden die beschriebenen Schritte zur Beschallung der Puls hoch reproduzierbare in unseren Händen.
Die Verwendung von linearen DNA-Vorlage abgeleitet von PCR-Amplifikation, Restriktionsenzym verdauen oder kommerzielle Gensynthese kann die Kapazität für hohen Durchsatz und schnelle Proteinproduktion in zellfreien Ausdruck Systeme24deutlich erhöhen. Während Protein-Produktion von PCR amplifizierten lineare Vorlage wurde nachgewiesen, die Ausbeute dieser Reaktionen sind etwa 13.5-fold niedriger im Vergleich zu Reaktionen mit Plasmid DNA Schablone äquimolaren Verhältnisse9. Dies ist in erster Linie aufgrund der Instabilität der linearen DNA-Vorlage dürfte abgebaut durch endogene Nukleasen in V. Natriegens groben Zelle extrahieren vorhanden. Während des Lambda-Phagen Protein GamS hat früher zum Schutz der lineare DNA Schablone24,25, ergab für unvereinbar mit V. Natriegens 9extrahiert. Darüber hinaus während Erhöhung der Konzentration von linearen DNA Schablone für einen höheren Eiweiß-Ertrag ermöglichen, werden seinen schnellen Abbau in groben Zelle Extrakt nach wie vor ein großes Problem.
Eine Lösung zur Überwindung der linearen DNA Schablone Verschlechterung möglicherweise zellfreie Reaktionen mit mRNA Vorlage generiert aus in-vitro-Transkription von linearen DNA zu ergänzen. Auf der anderen Seite die Verwendung von ein RNase-Inhibitor bietet erhebliche Schutz gegen mRNA-Transkript-Abbau und spürbare Protein Erträge erhalten Sie in den 10 μL zellfreie Reaktion Format (Abbildung 5AB). Klonen von linearen DNA in eine kreisförmige Vorlage durch TA Ligation, können TOPO Klonen, Golden Gate Montage oder Rekombination Methoden zur Vorlage Abbau zu umgehen. Dennoch werden weitere Ansätze zur Hemmung der Aktivität der Nuklease für effiziente Proteinexpression mit linearen DNA Schablone erforderlich sein.
Bisher wurden verschiedene Ansätze zur Vorbereitung von Rohöl Extrakt zellfreien Protein Ausdruck9,10,11,26vorgeschlagen. Bei der Entwicklung dieses Protokolls, haben wir versucht, maximale Zugänglichkeit Benutzer, reduzieren Gesamtkosten und zeitaufwändigen Schritte zu minimieren. Zum Beispiel ein hohen Protein-Ertrag erfolgt über einen einfachen Schritten Beschallung-Zentrifugation und erfordert keine Zelle Homogenisatoren, langwierige Dialyse Schritte oder Run-off Reaktion. Es ist einfach, in kurzer Zeit auszuführen und erfordert keine hohe Labor Kompetenz. So kann es helfen, zellfreie Ausdruck als Standard für die translationale Forschung und industrielle Prozess-Design zu erleichtern.
Dieses Protokoll erweitert das Toolkit für Untersuchung und den Nutzen von V. Natriegens, nicht-Modellorganismus mit einzigartigen biologischen Eigenschaften zur Verfügung. Höherer Eiweiß-Ertrag erzielt werden, durch den Einsatz von halb – oder voll-ständige zellfreie Reaktionen zu ermöglichen, Energierückgewinnung, Nachschub von Aminosäuren und die Beseitigung der Abfallprodukte3,5,27. Darüber hinaus könnte das Engineering von Wildtyp V. Natriegens , DNAse oder RNAse-defizienten Stämme produzieren, Entfernung von schädlichen und konkurrierenden Stoffwechselwege und Ausdruck der zusätzlichen tRNAs erheblich die Produktion von Proteinen in verbessern Dieses System28,29. Da wir die Biologie zugrunde liegenden seines schnellen Wachstums entwirren, kann Weiterentwicklung von V. Natriegens zellfreien Systemen Bioproduktion Fähigkeiten zu beschleunigen und ermöglichen robuste Ausdruck der therapeutischen Peptide, small Molecules und synthetische Materialien.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch das National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 und Abteilung von Energie-DE-FG02-02ER63445 finanziert. Die Autoren möchten Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam und Dr. Edgar Goluch Danke für hilfreiche Tipps zu konstruieren die Protokoll-Abschnitt des Manuskripts.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |