無細胞発現系は、ハイスループット合成と重要なタンパク質のスクリーニングのための強力かつコスト効率の高いツールです。ここで、mRNA のテンプレート、線形 DNA プラスミド DNA を使用して急速な蛋白質の生産のビブリオ natriegensを用いた無細胞タンパク質発現系の作製について述べる。
海洋細菌ビブリオ natriegensは、バイオ テクノロジーの急速な成長率のための新たな微生物ホストとして注目を集めています。一般的なプロトコルは、一般的な検査機器を使用して粗セルnatriegens (動)抽出物の準備のため説明します。この高降伏プロトコルが具体的にされているユーザのアクセシビリティのために最適化された、コストを削減します。無細胞タンパク質合成 (当たり) 96 または 384 ウェル フォーマット小規模 10 μ L バッチ反応で行うことが再現性をもって 3 h 内 > 260 μ g/mL スーパー フォルダー GFP (sfGFP) の濃度を全体的に利回り、原油細胞抽出準備と当たり単一のユーザーによって 1−2 日間で実現できます。この議定書は、生物生産と合成生物学の応用の進歩を促進するための既存の蛋白質合成パイプラインに簡単に統合できます。
無細胞タンパク質合成は、貴重なタンパク質またはペプチド1,2,3,4の式の汎用性とコスト効果の高い方法です。大腸菌発現システムを用いた無細胞タンパク質合成が実行された歴史的に、しかし、ずっとある最近のサージ無細胞5,6,7,8,9のシャーシとして新規プロパティで代替、非モデル生物を使っての,10,11,12.大腸菌無細胞システムに代わるものとして総理候補をユニークな代謝プロファイルを持つ生物。たとえば、海洋細菌のビブリオ natriegensはすべて知られている生物観察の急成長は、10 分13未満の時間を倍増します。これは研究とバイオ テクノロジー14,15,16,17,18新たな微生物ホストとしてnatriegens (動)注目を集めています。Natriegens 対の急速な成長率がタンパク質合成と代謝効率19,20,21, 無料のセルのための細胞機械装置を活用率が高いにリンクされて合成には、急速な蛋白質の生産と高速スクリーニングのためのツールキットが拡大します。
最近、無細胞発現系natriegens 対は T7 プロモーター93 h > 260 μ g/mL の濃度でスーパー フォルダー GFP (sfGFP) を作り出すことができるである実証されています。このメソッドの開発の全体的な目的は、短時間で一般的な実験装置を用いて調製できる高アクセス、コスト効率の高い、再現、および収無細胞タンパク質発現システムをユーザーに提供するためでした。このプロトコルは、シェイク フラスコ 1l 文化、パルス超音波処理と並列化とスループットをスクリーニングを最大限に 96 または 384 ウェル フォーマットで小規模なバッチ反応セル換散を利用しています。長い、持続的なタンパク質発現可能です 3-ホスホ グリセリン酸 (3-PGA) の補給によってエネルギー ソース8,22,23として。このプロトコルを正常に完了するには、ユーザーは目的の蛋白質を表現する機能を持っているまたはnatriegens 対粗セルを用いたセルなしの形式で蛋白質のセットを抽出します。
グリセロール ストックから始まって、 natriegens 対原油細胞抽出液は 600 の光学濃度で採取した細胞から調製した 1.0 nm (外径600)。1 L 文化原油細胞エキス 25% 以上 800 無細胞反応にとっては十分なエキスの約 2−3 mL が得られます。プラスミド DNA、線形 DNA や mRNA テンプレートを使用して蛋白質を表現できます。しかし、内因性核酸による線形 DNA テンプレート劣化携帯無料natriegens 対野生型システム9を使用する場合大きな欠点のままです。文化natriegens の v.から始まって、タンパク質の下流のアプリケーションの使用可能な可能である単一のユーザー 1−2 日以内。
このプロトコルは、 natriegens 対野生型と V2 塩 (資材表) を添加した lb 膜から成る細菌の成長媒体のために最適化されています。Natriegens v.の他の系統は、無細胞反応; 原油細胞抽出液を生成する同様に培養することができます。ただし、その使用には、このプロトコルのさらなる最適化が必要です。さらに、この無細胞タンパク質発現システムは、一次エネルギー再生ソースとして 3-ホスホ グリセリン酸 (3-PGA) を使用して最適化されています。その他再生エネルギーを使用可能性があります。ただし、高収量タンパク質式10,11を入手しなければに試薬および校正の最適化でしょう。
このプロトコルのいくつかの重要なステップに固有の注意は高収量の最大抽出生産性を確保する無細胞タンパク質の生産。まず、成長の半ば指数段階で収穫された細胞培養natriegens 対からの原油の細胞抽出液を準備しなければなりません文化外径600に達するとき、蛋白質収量が最大 1.0 ± 0.2 を =。光学密度の範囲で採取した細胞から無細胞タンパク質生産が可能ですが、我々 は以前セル成長の急激な状態で収穫がかなり多くタンパク質9をもたらすことを発見しました。原油細胞抽出パフォーマンスの光学密度の観測効果、バッチ培養条件1で育った細胞から派生した他の無細胞システムの報告と一致。Natriegens V.急速な率で増加するので、文化の光学密度を密接に監視する重要です。一般に、それはnatriegens 対文化がこのプロトコルを使用して 1−1.5 h 以内 1.0 の外径600を再現性をもって到達することが期待します。ただし、個々 の成長条件の使用などはどの影響曝気や空気水孵化率と孵化の温度の安定性に影響を与えると成長時間を変更可能性があります非困惑のフラスコと困惑。さらに、 natriegens 対1 L 困惑してフラスコで簡単操作や転送のための収穫で大細胞ペレットを確保するための少なくとも 250 mL を培養することを一般的にお勧めします。ペレット由来抽出物の総容積の増加と同様、原油セル抽出準備の成功が大幅に向上します。小さい規模の準備機能を使用するとき培養条件および試薬適切に調整できます。さらに大規模な発酵、培養条件の最適化が必要になります。最後に、高蛋白質収量を確保するため、収穫後すぐにまたは-80 ° C で保存する 1−2 日以内に細胞ペレットを処理する重要なです。
パルス超音波照射によって細胞ペレットの適切な換散は無細胞タンパク質発現の成功に不可欠です、このプロトコルの新しいユーザーのための最も困難な側面は、しばしば。通常、分離よくペレットの残骸がない液体抽出物の膨大な量になります。抽出物は少し粘性が液体窒素で凍結する前に管のストレージに早かったとき簡単に戻されることができます。図 3は、ポスト溶解遠心分離のステップ後不十分な分離ペレット (図 3 b) と比較しても分離ペレット (図 3 a) の表現を示しています。完全セル換散の主要な徴候は原油細胞抽出総蛋白濃度 > 20 mg/mL 総蛋白質の試金 (ステップ 2.13) によって決定されます。過剰超音波または原油の細胞抽出液の過剰加熱無細胞反応を行わず確定できない細胞機械装置が破損します。したがって、下流蛋白質式アプリケーションに膨大な時間と労力を捧げる前にコントロール反応の抽出効率をテストするのには非常に有益です。その他の最適化は、別の超音波処理装置に必要なかもしれませんが、パルス超音波処理の手順は、私たちの手で再現性の高いされています。
PCR 増幅、制限の酵素のダイジェスト、または商業遺伝子合成から派生した線形 DNA のテンプレートの使用は大幅無細胞システム24で高スループットと急速な蛋白質の生産のための容量を増やすことができます。PCR 増幅された線形テンプレートからの蛋白質の生産を示されている、これらの反応の収率が約 13.5-fold 下に比べてプラスミドを用いた反応モル比9時の DNA のテンプレート。これは主に内因性核酸natriegens 対の原油の細胞抽出液の存在によって低下はほとんど線形 DNA のテンプレートの不安定性。ラムダファージ · タンパク質 GamS は線形 DNA テンプレート24,25を保護するために既に使用されている、時natriegens 対に対応する9を抽出それが見つかりました。さらに、線形 DNA テンプレートの濃度を増加させるタンパク質の収量が可能ことがあります、原油の細胞抽出液の高速パフォーマンスが低下は大きな問題とされます。
線形 DNA の生体外のトランスクリプションから生成された mRNA のテンプレートで無料の細胞反応を補足する線形 DNA テンプレートの劣化を克服するための解決策があります。その一方で、RNase 阻害剤の使用は、mRNA 転写分解に対して重要な保護を提供しています、10 μ L 反応の無細胞形式 (図 5 a, B) でかなりのタンパク質の収量を得ることができます。TA 結紮を円形のテンプレートへの線形 DNA のクローニング、テンプレートの劣化を回避するために TOPO のクローニング、ゴールデン ゲートのアセンブリ、または他の結合方法を使用可能性があります。さらにそれにもかかわらず、アプローチのヌクレアーゼ活性を阻害すると、線形 DNA のテンプレートを使用して効率的なタンパク質発現の必要があります。
日には、無細胞タンパク質発現9,10、11,26の粗野なエキスの準備のためいくつかの異なる方法が提案されています。このプロトコルを開発する上では、ユーザのアクセシビリティを最大限、全体的なコストの削減、時間のかかる手順を最小限にましょう。たとえば、高蛋白質収量は単純な 2 段階の超音波処理遠心分離プロセスを使用して実現され、セルのホモジナイザー、長い透析の手順や流出反応は必要ありません。簡単に時間の短い期間で実行、実験室の専門知識の高レベルを必要としません。したがって、並進の学術研究や産業プロセスの設計のための標準として無細胞発現を促進することに役立ちます。
このプロトコルは、調査およびnatriegens 対、ユニークな生物学的特性を非モデル生物のユーティリティに使用できるツールキットを拡張します。エネルギー回生システムのように、半または完全に-連続無細胞の反応を用いた高蛋白質収量を実現できますアミノ酸および廃棄物3,5,27の除去の間。さらに、野生型natriegens V. DNAse、RNAse 欠損株を生成するためのエンジニア リング、劇物と競合する代謝経路の除去および追加 Trna の表現が大幅に強化の蛋白質の生産このシステム28,29急速な成長の基礎となる生物学的解明、 natriegens 対無細胞システムの更なる発展が生物生産機能を加速、治療的なペプチド、低分子、合成の堅牢な式を有効にします。材料。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、一般医学国立研究所 1U01GM110714-01 とエネルギー ・ デ ・ FG02 02ER63445 部門によって賄われていた。著者は、この原稿のプロトコル セクションの構築に関する有益な助言を博士リチャード Kohman、タム ジェニーと博士エドガー Goluch を感謝したいです。
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |