Ячейки свободного выражения системы являются мощными и экономически эффективных инструментов для высок объём синтез и проверка важных белков. Здесь мы описываем подготовку системы выражение протеина, клетки бесплатно, с помощью Vibrio natriegens для быстрого белок производства с использованием плазмида ДНК, линейной ДНК и мРНК шаблон.
Морских бактерией Vibrio natriegens получил большое внимание как возникающих микробной хост для биотехнологии из-за ее быстрые темпы роста. Это общий протокол описан для подготовки V. natriegens сырой клеточных экстрактов с использованием общего лабораторного оборудования. Этот высокий уступая протокол был специально оптимизирован для доступа пользователя и снижение стоимости. Синтез белков, клеток бесплатно (СЛТ) может осуществляться в малых масштабах 10 мкл пакетного реакции в формате 96 – или 384-Ну и можно воспроизвести дает концентрации > 260 мкг/мл супер папки GFP (sfGFP) в течение 3 ч. в целом, сырой сотовый экстракт подготовка и СЛТ может быть достигнуто в 1−2 суток одним пользователем. Этот протокол может быть легко интегрированы в существующие трубопроводы синтез белков для облегчения достижения в био производство и синтетической биологии приложений.
Синтез белков, клеток бесплатная является универсальным и экономичным методом для выражения ценные белки и пептиды1,2,3,4. Исторически синтез белков, клеток бесплатно была выполнена с помощью кишечной палочки выражение систем; Однако был недавний всплеск в использовании альтернативных, -модель организмов с Роман свойствами в качестве шасси для свободных клеток выражение5,6,,78,9 , 10 , 11 , 12. организмы с уникальными метаболические профили являются первоочередными кандидатами альтернативных систем свободных клеток кишечной палочки . Например морской бактерией Vibrio natriegens является самым быстрорастущим всех известных организмов с наблюдаемыми удвоение время менее чем 10 минут13. Это получил V. natriegens значительное внимание как возникающих микробной хост для исследований и биотехнологии14,,1516,17,18. Учитывая, что быстрый прирост V. natriegens были связаны с высоким уровнем синтеза белка и метаболические эффективность19,20,21, использование ее клеточными для клеток бесплатно синтез может значительно расширить инструментарий для быстрой белок производства и высокопроизводительного скрининга.
Недавно, клетки бесплатно V. natriegens выражение системы была продемонстрирована, который способен производить супер папку GFP (sfGFP) в концентрациях > 260 мкг/мл в 3 h с T7 промоутер9. Общая цель разработки этого метода было предоставить пользователям весьма доступными, экономически эффективным, воспроизводимые и высокоурожайных свободных клеток белка выражение системы, которая может быть подготовлен с использованием общих лабораторное оборудование в короткий промежуток времени. Этот протокол использует 1 Л культур в колбах, трясти, лизис клеток, пульс sonication и мелкие партии реакции в формате 96 – или 384-Ну чтобы максимизировать распараллеливания и скрининг пропускную способность. Длинные, устойчивый белков стало возможным благодаря добавок 3-phosphoglyceric кислоты (3-PGA)22,8,источник энергии23. После успешного завершения этот протокол, пользователь будет иметь возможность выразить желаемого белка или извлечь набор белков в формате свободной ячейки с использованием V. natriegens сырой клеток.
Начиная от глицерина запас, V. natriegens сырой клеточных экстрактов готовятся из клеток, собирают в оптической плотности на 600 Нм (600OD) 1.0. 1 Л культура даст около 2−3 мл экстракт, который является достаточным для более чем 800 свободной ячейки реакций на 25% сырой сотовый экстракт. Белки могут быть выражены с помощью плазмида ДНК, линейной ДНК или шаблон мРНК; Однако линейная ДНК шаблон деградации эндогенного nucleases остается основным недостатком при использовании системы дикого типа V. natriegens сотовый бесплатно9. Начиная от V. natriegens культур, белка для нисходящие приложения может быть достиган одного пользователя в 1−2 суток.
Этот протокол был оптимизирован для одичал тип V. natriegens и бактериальных питательных сред, состоящая из LB дополнена V2 солей (Таблица материалов). Другие штаммы V. natriegens можно аналогичным образом культивировали для создания сырой клеточных экстрактов для свободных клеток реакций; Однако их использование требует дополнительной оптимизации этого протокола. Кроме того эта система выражения протеина, клетки бесплатно была оптимизирована с помощью 3-phosphoglyceric кислоты (3-PGA) как источника первичной энергии регенерации. Могут использоваться другие источники энергии регенерации; Однако оптимизация реагентов и калибровки, вероятно, будет необходимо получить высокие урожайность белка выражение10,11.
Особое внимание на несколько важных шагов в этот протокол обеспечит максимальное извлечение производительности для высокоурожайных свободной ячейки производства белка. Во-первых экстракт сырой ячейки должны быть готовы от V. natriegens клеточных культур собирают в середине экспоненциальной фазе роста; белка урожай максимальна, когда культур достигают ОД600 = 1,0 ± 0,2. Хотя производство клеток бесплатно белка возможен из клеток, собирают в диапазон оптических плотностей, мы ранее нашли что клетки собирают в состоянии экспоненциального роста урожайности значительно больше белков9. Наблюдаемые эффекты оптической плотности на сырой сотовый экстракт производительности согласуются с данным для других систем ячейки свободного выражения, полученные из клеток, выращенных в партии культуры условия1. Потому что V. natriegens растет быстрыми темпами, важно внимательно следить за культур оптических плотностей. В целом ожидается, что V. natriegens культур можно воспроизвести должен достичь ОД600 1.0 в пределах 1−1.5 h, используя этот протокол; Однако индивидуального роста условий, таких как использование озадаченного против-озадаченного колбы, который затрагивает аэрации, или воздуха и воды инкубации, которая влияет на скорость и стабильность температуры инкубации, может изменить время роста. Кроме того обычно рекомендуется культуры по крайней мере 250 мл против natriegens в 1 Л озадачен колбу для обеспечения крупноклеточный лепешки на урожай для легкой обработки и передачи. Это значительно повышает успех экстракт подготовка сырой клетки, а также увеличивает общий объем экстракт получают из гранул. При использовании меньших масштабах подготовки, условий культуры и реагенты могут быть скорректированы соответствующим. Для крупномасштабных ферментации дальнейшей оптимизации условий культуры могут потребоваться. Наконец чтобы обеспечить доходность высоким содержанием белка, важно, что гранулы клетки обрабатываются сразу же после сбора урожая, или в течение 1−2 дней хранения при температуре-80 ° C.
Надлежащего lysis клетки Пелле, пульс sonication имеет решающее значение для успешной экспрессии белков, клеток бесплатно и часто является самым трудным аспектом этого протокола для новых пользователей. Как правило хорошо лизированных Пелле даст значительный объем жидкого экстракта, который свободен от мусора. Выписка должна быть слегка вязкая, но может быть легко накапаны, когда aliquoting в хранилище трубы до вспышки, замораживание в жидком азоте. На рисунке 3 изображена представление хорошо лизированных Пелле (Рисунок 3А) по сравнению с плохо лизированных Пелле (рис. 3B) после центрифугирования шаг лизис пост. Основным показанием лизис полного клеток является ячейку сырой экстракт общего белка концентрацию > 20 мг / мл определяется общий белок пробирного (шаг 2.13). Чрезмерная sonication или чрезмерного нагрева сырой сотовый экстракт повредит клеточными, который не может быть определено без выполнения реакции клетки бесплатно. Таким образом это очень полезно для тестирования экстракта эффективность управления реакцией прежде чем посвятить значительное время и усилия вниз по течению белка выражение приложений. В то время как дополнительные оптимизации могут быть необходимы для различных sonication оборудования, пульс sonication шаги, описанные были весьма воспроизводимые в наших руках.
Использование линейного шаблона дна, производный от амплификации PCR, дайджест энзима ограничения или синтеза коммерческую генов может значительно увеличить потенциал для производства высокой пропускной способностью и быстрым белка в ячейки свободного выражения систем24. Несмотря на то, что было продемонстрировано производство белка от PCR усиливается линейный шаблон, доходность этих реакций являются примерно 13.5-fold ниже по сравнению с реакции, с помощью плазмида ДНК шаблон в эквимолярных соотношениях9. Это главным образом обусловлено нестабильностью линейной ДНК шаблон, который является вероятно деградировали эндогенного nucleases присутствует в V. natriegens экстракт сырой клеток. Хотя фага лямбда белка GamS ранее использовалась для защиты линейной ДНК шаблон24,25было обнаружено, несовместимыми с V. natriegens извлекает9. Кроме того в то время как увеличение концентрации линейной ДНК шаблон может позволить более высокую урожайность белка, его быстрой деградации в сырой сотовый экстракт по-прежнему будет серьезной проблемой.
Решение для преодоления линейный шаблон деградации ДНК может быть дополнить реакций клетки бесплатный шаблон мРНК, образующиеся в vitro транскрипция линейной ДНК. С другой стороны использование битор РНКазы обеспечивает существенную защиту от деградации мРНК Стенограмма и заметных белка урожай может быть получен в формате бесплатно сотовый реакция 10 мкл (Рисунок 5AB). Клонирование линейной ДНК в круговой шаблон через TA перевязки, клонирование TOPO, Золотые ворота Ассамблеи или другие методы рекомбинации может использоваться для обхода шаблон деградации. Тем не менее дальнейшее подходы для ингибирование активности нуклеиназы будет необходимо для эффективного белков с помощью линейной ДНК шаблона.
На сегодняшний день, были предложены несколько различных подходов для подготовки сырой экстракт для свободных клеток белка выражение9,10,11,26. В разработке этого протокола, мы стремились максимизировать доступность пользователей, снизить общую стоимость и сведения к минимуму времени шаги. К примеру высоким содержанием белка урожая достигается с помощью простой двухэтапный процесс sonication центрифугирования и не требует клеток гомогенизаторы, длительные диализа шаги или реакция стока. Это просто выполнить в течение короткого времени и не требует высокого уровня знаний лаборатории. Таким образом это может помочь облегчить ячейки свободного выражения в качестве стандарта для трансляционного академических исследований и проектирования промышленных процессов.
Этот протокол расширяет инструментарий для расследования и полезности V. natriegens, организм-модель с уникальными биологическими свойствами. Высокую урожайность белка может быть достигнуто путем использования полу – или полностью непрерывной свободной ячейки реакций, для регенерации энергии, снабжении аминокислоты, и удаление отходов3,5,27. Кроме того инженерные одичал тип V. natriegens производить DNAse – или РНКазы недостаточным штаммов, устранение пагубных и конкурирующие метаболических и выражение дополнительных tRNAs может значительно повысить производство белков в Эта система28,29. Как мы разгадать биологии, лежащие в основе его быстрый рост, дальнейшее развитие систем V. natriegens свободных клеток может ускорить биопродукции возможности и позволить надежное выражение терапевтического пептидов, малые молекулы и синтетические материалы.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась национального института Генеральной медицинских наук 1U01GM110714-01 и Департамента энергетики де-FG02-02ER63445. Авторы хотели бы поблагодарить д-р Ричард Kohman, д-р Дженни там и д-р Эдгар Goluch за полезные советы по строительству в разделе протокол этой рукописи.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |