Cellfria uttryck system är kraftfulla och kostnadseffektiva verktyg för hög genomströmning syntes och screening av viktiga proteiner. Här beskriver vi beredning av cellfria protein uttryck systemet med Vibrio natriegens för snabba proteinproduktion med hjälp av plasmid DNA, linjära DNA och mRNA mall.
Marina bakterien Vibrio natriegens har rönt stor uppmärksamhet som en framväxande mikrobiell värd för bioteknik på grund av sin snabba tillväxt. Ett allmänt protokoll beskrivs för beredning av V. natriegens rå cell extrakt med hjälp av gemensamma laboratorieutrustning. Hög avkastning protokollet har varit särskilt optimerad för användaren tillgänglighet och minskade kostnader. Cellfria proteinsyntesen (CFPS) kan utföras i liten skala 10 μL batch reaktioner i antingen en 96 – eller 384-bra format och reproducibly ger halter av > 260 μg/mL super mapp GFP (sfGFP) i 3 h. övergripande, rå cell extrahera förberedelse och CFPS kan uppnås i 1−2 hela dagar av en enskild användare. Detta protokoll kan enkelt integreras i befintliga proteinsyntes rörledningarna att underlätta framsteg i bio-produktion och syntetisk biologi tillämpningar.
Cellfria proteinsyntesen är en mångsidig och kostnadseffektiv metod för uttrycket av värdefulla proteiner eller peptider1,2,3,4. Historiskt, har cellfria proteinsyntesen utförts med Escherichia coli uttryck system; Det har dock varit en senaste tidens uppgång i med alternativa, icke-modell organismer med nya egenskaper som chassi för cellfria uttryck5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unika metaboliska profiler är främsta kandidaterna som alternativ till E. coli cell-fria system. Till exempel fördubbling Marina bakterien Vibrio natriegens är den snabbast växande alla kända organismer med en observerade tid på mindre än 10 min13. Detta har rönt V. natriegens stor uppmärksamhet som en framväxande mikrobiell värd för forskning och bioteknik14,15,16,17,18. Tanke på att den snabba tillväxten av V. natriegens har kopplats till höga priser av proteinsyntes och metabolisk effektivitet19,20,21, utnyttja dess cellulära maskineriet för cellfria syntes kan avsevärt utvidga toolkit för snabb proteinproduktion och high-throughput screening.
Nyligen, en cell-fri V. natriegens uttryck systemet har påvisats som är kapabel att producera super mapp GFP (sfGFP) vid koncentrationer > 260 μg/ml i 3 h med en T7 Promotorn9. Det övergripande syftet att utveckla denna metod var att ge användarna en mycket tillgänglig, kostnadseffektiva, reproducerbar och högavkastande cellfria protein uttryck systemet som kan framställas med hjälp av gemensamma labbutrustning i en kort tid. Detta protokoll använder tredjeparts 1 L kulturer i skaka kolvarna, cellys genom puls ultraljudsbehandling och småskaliga batch reaktioner i en 96 – eller 384-bra format för att maximera parallelization och screening genomströmning. En lång, ihållande proteinuttryck görs möjligt genom tillskott av 3-phosphoglyceric syra (3-PGA) som en energi källa8,22,23. Efter framgångsrikt avslutat detta protokoll, en användare kommer att ha kapacitet att uttrycka en önskad protein eller uppsättning proteiner i en cell-fria format med V. natriegens rå cell extrahera.
Start från en glycerol lager, V. natriegens rå cell extrakt är beredd från celler skördas på en optisk densitet på 600 nm (OD600) 1.0. En 1 L kultur kommer att ge cirka 2−3 mL extrakt, som är tillräcklig för mer än 800 cellfria reaktioner på 25% rå cell extrakt. Proteiner kan uttryckas med hjälp av plasmid DNA, linjära DNA eller mRNA mallen. linjära DNA mall nedbrytning av endogena nukleaser förblir dock en stor nackdel när du använder vildtyp V. natriegens cell-fria system9. Start från V. natriegens kulturer, kan protein användbar för nedströms tillämpningar uppnås genom en enskild användare i 1−2 heldagar.
Detta protokoll har optimerats för vildtyp V. natriegens och bakterietillväxt media består av LB kompletteras med V2 salter (Tabell för material). Andra stammar av V. natriegens kan vara likaså odlas för att generera rå cell extrakt för cellfria reaktioner; deras användning kräver dock ytterligare optimering av detta protokoll. Dessutom har detta cellfria protein uttryck system optimerats med 3-phosphoglyceric syra (3-PGA) som den primära energikällan för regenerering. Andra energikällor för regenerering kan användas; optimering av reagenser och kalibrering kommer dock sannolikt att behöva få hög avkastning protein uttryck10,11.
Särskild uppmärksamhet till flera kritiska steg i detta protokoll garanterar maximal extrakt produktivitet för högavkastande cellfria proteinproduktion. Först, rå cell extrakt måste beredas från V. natriegens cellkulturer skördas i en mitten-exponentiell fas av tillväxt. protein avkastning är svårast när kulturer når en OD600 = 1,0 ± 0,2. Även cellfria proteinproduktion är möjligt från celler skördas vid en rad optiska densiteter, har vi tidigare funnit att celler skördas i tillståndet exponentiell tillväxt ger betydligt mer protein9. De observerade effekterna av optisk densitet på råolja cell extrakt prestanda överensstämmer med de som rapporterats för andra cellfria uttryck system härrör från celler odlas i batch kultur villkor1. Eftersom V. natriegens växer i snabb takt, är det viktigt att noga övervaka kulturers optiska densiteter. I allmänhet, förväntas det att V. natriegens kulturer reproducibly bör nå en OD600 1.0 inom 1−1.5 h använder detta protokoll. dock snopen enskilda tillväxt villkor såsom användning av kontra icke-förbryllad kolvar, som påverkar luftning, eller luft kontra vatten ruvningen, som påverkar den hastighet och stabilitet av inkubering temperatur, ändra tillväxt tid. Dessutom är det generellt rekommenderas att kultur minst 250 mL av V. natriegens i en 1 L förbryllad kolv att säkerställa en stor cellpelleten vid skörd för lätt manipulation och överföring. Detta förbättrar avsevärt framgången av rå cell extrahera förberedelse samt ökar den totala volymen av extrakt produceras från en pellet. När du använder mindre skala förberedelse, kan odlingsbetingelser och reagenser justeras på lämpligt sätt. För storskaliga jäsning, kan ytterligare optimering av odlingsbetingelser behövas. Slutligen, för att säkerställa hög proteinhalt avkastning, är det kritiskt att cell pellets behandlas omedelbart efter skörd, eller inom 1−2 dagar lagra vid-80 ° C.
Ordentlig Lys av cellpelleten av puls ultraljudsbehandling är avgörande för framgången av cellfria proteinuttryck och är ofta den svåraste aspekten av detta protokoll för nya användare. Vanligtvis, en väl lyserat pellet kommer att ge en betydande mängd flytande extrakt som är fri från skräp. Extraktet bör vara något trögflytande men kan vara enkelt pipetteras när alikvotering inlagrats rör innan blixten fryser i flytande kväve. Figur 3 illustrerar en representation av en väl lyserat pellet (figur 3A) i jämförelse med en dåligt lyserat pellet (figur 3B) efter det inlägget lysis centrifugeringssteget. En viktig indikation på komplett cellys är en rå cell extrahera totalprotein koncentration > 20 mg / mL som med en totalt protein analysmetod (steg 2.13). Överdriven ultraljudsbehandling eller överdriven uppvärmning av rå cell extraktet skadar det cellulära maskineriet, som inte kan bestämmas utan att utföra en cellfria reaktion. Därför är det mycket fördelaktigt att testa extrakt effektivitet med en kontroll reaktion innan ägna betydande tid och ansträngning till nedströms protein uttryck applikationer. Medan ytterligare optimering kan behövas för olika ultraljudsbehandling utrustning, har puls ultraljudsbehandling stegen som beskrivs varit mycket reproducerbara i våra händer.
Användning av linjära DNA-mall som härrör från PCR-amplifiering, restriktionsenzym sammanfattad eller kommersiella gen syntes kan avsevärt öka kapaciteten för produktion av högt dataflöde och snabba proteiner i cellen-fria uttryck system24. Medan proteinproduktion från PCR-förstärkta linjär mall har påvisats, är avkastningen av dessa reaktioner cirka 13.5-fold lägre jämfört med reaktioner med hjälp av plasmid DNA mall på equimolar nyckeltal9. Detta beror främst på instabiliteten i den linjära DNA-mallen som sannolikt försämras av endogena nukleaser närvarande i V. natriegens rå cell extrakt. Samtidigt lambda phage protein GamS har använts tidigare att skydda linjära DNA mall24,25, konstaterades vara oförenliga med V. natriegens extrakt9. Dessutom, medan öka koncentrationen av linjära DNA-mall kan möjliggöra en högre protein avkastning, kan dess snabb nedbrytning i rå cell extrakt fortfarande ett stort problem.
En lösning till att övervinna linjära DNA mall nedbrytning kan vara att komplettera cellfria reaktioner med mRNA mallen genereras från in vitro-transkription av linjära DNA. Däremot, användningen av en RNase inhibitor erbjuder betydande skydd mot mRNA avskrift nedbrytningen och märkbar protein avkastning kan erhållas i formatet 10 μL cellfria reaktion (figur 5AB). Kloning av linjära DNA i ett cirkulär mall genom TA ligatur, kan TOPO kloning, Golden Gate församlingen eller andra rekombination metoder användas till att kringgå mall nedbrytning. Dock ytterligare blir strategier för hämning av nuclease aktivitet nödvändigt för effektiv proteinuttryck med linjära DNA-mall.
Hittills har har flera olika metoder föreslagits för beredning av råa extrakt för cellfria protein uttryck9,10,11,26. Vid utvecklingen av detta protokoll har försökt vi maximera användaren tillgänglighet, minska totalkostnaden och minimera tidskrävande steg. Exempelvis en proteinrik avkastning uppnås med hjälp av en enkel tvåstegsprocess ultraljudsbehandling-centrifugering, och kräver inte cell Homogenisatorer, långa dialys steg eller avrinning reaktion. Det är enkelt att köra i en kort tidsperiod och kräver inte hög laboratorium kompetens. Således kan det hjälpa underlätta cellfria uttryck som en standard för translationell akademisk forskning och industriell processdesign.
Detta protokoll expanderar toolkit tillgänglig för utredning och nyttan av V. natriegens, en icke-modell organism med unika biologiska egenskaper. Högre protein avkastning kan uppnås genom att anställa semi – eller fullt-kontinuerlig cellfria reaktioner, att möjliggöra energi regenerering, skärande av aminosyror, och avlägsnande av slaggprodukter3,5,27. Dessutom konstruktion av vildtyp V. natriegens att producera DNAS – eller RNAse-brist stammar, borttagning av skadliga och konkurrerande metaboliska vägar och uttryck för ytterligare tRNAs kan kraftigt öka produktionen av proteiner i Detta system28,29. Som vi riva upp biologin bakom sin snabba tillväxt, kan vidareutveckling av V. natriegens cellfria system påskynda bioproduktion funktioner och aktivera robust uttryck för terapeutiska peptider, små molekyler och syntetiska material.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 och Institutionen för energi DE-FG02-02ER63445. Författarna vill tacka Dr Richard Kohman, Dr. Jenny Tam och Dr. Edgar Goluch för goda råd om att bygga avsnittet protokollet av detta manuskript.
15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
Dewar Flask – 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
DL-Dithiothreitol solution – 1 M | Sigma | 42816 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip | Qsonica | 4422 | |
RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM | NEB | N0450L | |
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |