Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

العزلوالتقييم الكمي لخلايا الفرشاة من القصبة الهوائية للفأر

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59496
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

خلايا الفرشاة هي خلايا ظهارية حساسة كيميائية نادرة موجودة في القصبة الهوائية للفأر السذاجة. نظرا لأعدادهم المحدودة، وتقييم من الجسم الحي من دورهم الوظيفي في حصانة مجرى الهواء وإعادة عرض تحديا. نحن نصف طريقة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية عن طريق قياس التدفق.

Abstract

خلايا فرشاة القصبة الهوائية هي خلايا الظهارية الحسية الكيميائية الكولينية تستعد لنقل الإشارات من تجويف مجرى الهواء إلى الجهاز المناعي والعصبي. وهي جزء من عائلة من الخلايا الظهارية الحسية الكيميائية التي تشمل خلايا خصلة في الغشاء المخاطي المعوي، وخلايا الفرشاة في القصبة الهوائية، والخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية والخلايا الدقيقة في الغشاء المخاطي للأنفية. تشترك الخلايا الحسية الكيميائية في المقصورات الظهارية المختلفة في علامات رئيسية داخل الخلايا وتوقيع النسخ الأساسي، ولكنها تظهر أيضًا تباينًا نسخيًا كبيرًا، مما يعكس على الأرجح بيئة الأنسجة المحلية. مطلوب عزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية من تعليق خلية واحدة لتحديد وظيفة هذه الخلايا الظهارية النادرة بالتفصيل، ولكن عزلتها صعبة، وربما يرجع ذلك إلى التفاعل الوثيق بين خلايا فرشاة القصبة الهوائية والنهايات العصبية أو بسبب تكوين مجرى الهواء محددة من تقاطعات ضيقة وadherens. هنا، ونحن نصف إجراء لعزل خلايا الفرشاة من ظهارة القصبة الهوائية الماوس. ويستند الأسلوب على فصل أولي من ظهارة القصبة الهوائية من الغشاء المخاطي تحت المخاطية، مما يسمح لحضانة أقصر لاحقة من ورقة الظهارية مع الباباين. يوفر هذا الإجراء حلاً سريعاً ومريحاً لفرز التدفق السيتومتري والتحليل الوظيفي لخلايا فرشاة القصبة الهوائية القابلة للحياة.

Introduction

خلايا الفرشاة تنتمي إلى فئة من الخلايا الظهارية الكيميائية الحسية التي تتميز بالتعبير عن مستقبلات الذوق المر وطعم مستقبلات آلات تحويل وجدت في خلايا برعم الذوق. على عكس خلايا برعم الذوق، تنتشر الخلايا الظهارية الحسية الكيميائية في الأسطح الظهارية ويشار إليها باسم الخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية (SCCs) والخلايا الدقيقة في ظهارة الأنف1،2، خلايا الفرشاة في القصبة الهوائية 3،4، وخلايا خصلة في الأمعاء5،6. كما توجد الخلايا الظهارية التي تعبر عن مستقبلات الطعم المر وآلات تحويل الطعم المر في مجرى البول7و8 والأنبوب السمعي9. خلايا فرشاة مجرى الهواء لها وظائف فريدة من نوعها في استجابات مجرى الهواء العصبي والمناعي. فهي الخلايا الحسية الكيميائية المنتجة لأستيل التي تثير ردود الفعل التنفسية الواقية عند التنشيط مع المركبات المريرة والأيض البكتيرية مثل المواد استشعار النصاب10. خلايا فرشاة مجرى الهواء هي أيضا المصدر الظهاري الرئيسي للمجرى الهوائي IL-25، الذيينظم التهاب النوع 2 من نوع 2 في المسالك الهوائية 3.

تم تحديد توصيف النسخ الكامل لخلايا فرشاة مجرى الهواء السفلي واستجابتها للمحفزات البيئية بانخفاض أعدادها في ظهارة القصبة الهوائية وأعداد محدودة جدا ً تتجاوز الشعب الهوائية الكبيرة10. التقنيات المستخدمة لعزل الخلايا الحسية الكيميائية من ظهارة الأمعاء لم تسفر عن أعداد عالية نسبيا من القصبة الهوائية، وربما بسبب الاتصالات الحميمة من خلايا فرشاة القصبة الهوائية مع النهايات العصبية10 أو غيرها العوامل الخاصة بالأنسجة في الغشاء المخاطي للجهاز التنفسي مثل تكوين الالتصاق والبروتينات تقاطع ضيق. التقارير الأخيرة عن العزلة الناجحة لخلايا فرشاة القصبة الهوائية بأعداد أعلى لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة تستخدم إما حضانة 2 ح مع الباباين أو حضانة 18 ح مع pronase11,12. منذ أطول الحضانة مع الإنزيمات الهضمية يمكن أن تقلل من قدرة الخلية على البقاء وتغيير الملف الشخصي النسخي للخلايا من الأنسجة المهضومة13، وهذا يمكن أن التحيز التحليل المقارن مع غيرها من السكان الظهارية الحسية الكيميائية.

هنا، ونحن الإبلاغ عن طريقة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية لتسلسل RNA3. علاج القصبة الهوائية مع ديسباس جرعة عالية يفصل ظهارة من تحت المخاطية. الهضم اللاحق للورقة الظهارية مع الباباين يسمح لاسترداد ممتاز من هذه الخلية الهيكلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

قبل إجراء التجارب التالية، تأكد من أن جميع استخدام الرعاية الحيوانية والبروتوكولات تتم الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) وتنفيذها وفقا ً لدليل "مجلس البحوث الوطني لرعاية واستخدام الحيوانات". مختبر الحيوانات" (الطبعة8، 2011) والمبادئ التوجيهية وصول. وقد استعرضت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى بريغام ومستشفى النساء جميع الإجراءات المبينة أدناه ووافقت عليها.

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد حل الهضم ديسباسي، وهو حل PBS تحتوي على 16 U / مل ديسباسي و 20 ميكروغرام / مل DNase I. تأكد من أن يتم حل مسحوق ديسباسي تماما قبل تسخين الحل في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
  2. أضف 5% مصل البقر الجنيني المعطلة حرارياً (FBS) إلى Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) لجعل حل التوقف.
  3. إعداد Tyrode I العازلة: إضافة 26 U / مل بابين (20 درجة مئوية / مل من 48 U / ملغ حل البابين) و 10 ميكرول / مل L-سيستين إلى العازلة HEPES-Tyrode دون الكالسيوم.
  4. إعداد Tyrode الثاني العازلة: إضافة 2 ميكرولتر / مل ليوبيبين (5 ملغ / مل) إلى العازلة HEPES-Tyrode مع الكالسيوم.
  5. إعداد FACS العازلة: استخدام حل الملح المتوازن هانكس (HBSS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر، وتستكمل مع 2 M حمض الإيثيلين ديامينتيتراسيتيك (EDTA) وإضافة 2٪ FBS.

2. تشريح القصبة الهوائية الماوس

ملاحظة: الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول هي ChAT(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg (RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J)، 3-6 أشهر من العمر لكلا الجنسين. تقليل تعرض الأنسجة للضوء المباشر للحد من ابيضاض الضوء من eGFP.

  1. قتل الفأر مع 100 ملغ / كغ البنتوباربيتال القتل الرحيم الحل حقن داخل الصفاق أو باستخدام البروتوكولات القياسية التي وافقت عليها IACUC.
  2. إصلاح الماوس على لوحة جراحية في موقف supine مع الإبر G 21 مع الأطراف العليا والسفلى الموسعة. رش الفراء مع EtOH 70٪ لتطهير المنطقة.
  3. باستخدام ملقط مستقيم، ورفع الجلد والفراء من البطن وجعل شق في المركز مع مقص تشريح (مقص مستقيم، 3 سم). باستخدام المقص، فصل الجلد من الأنسجة تحت الجلد من البطن إلى المنديبولا. أثناء حمل الأنسجة تحت الجلد مع الملقط، قم بعمل شق صغير مع المقص في وسط جدار البطن.
  4. افتح البابرق بشق على شكل حرف V. باستخدام الملقط، نقل بلطف الأمعاء الدقيقة إلى الجانب، وتحديد موقع الشريان الأبهر البطني والوريد كافا وإجراء شق مع مقص تشريح للسماح للexsanguination السريع.
  5. حدد موقع الحجاب الحاجز. باستخدام إبرة 18 G، وجعل فتحة في الحجاب الحاجز أسفل القص مباشرة لتحلل الرئتين. فصل الحجاب الحاجز بعناية من القفص الصدري باستخدام حاد وأشار مقص تشريح مستقيم لقطع على طول قاعدة الأضلاع.
  6. باستخدام الملقط، رفع الطرف المكشوف من القص وقطع القص طوليا من قاعدة القفص الصدري إلى الرقبة. قم بعمل شق عنق الرحم المركزي مع مقص مستقيم قصير (2 سم) وفصل فصوص الغدة تحت الفك السفلي.
  7. قم بإزالة النسيج الضام المحيط والغدة الصعترية المحيطة بعناية فوق الكارينا مع زوج من الملقط عالي الدقة.
  8. تشريح القصبة الهوائية الحرة أولا عن طريق فصل نهاية القريبة على مستوى epiglottis ومن ثم عن طريق تشريح نهاية القاصي على مستوى الانقسام من القصبة الهوائية.
  9. تحديد موقع epiglottis وقطع القصبة الهوائية طوليا من epiglottis إلى كارينا.

3. القصبة الهوائية الهضم الظهاري

  1. ضع القصبة الهوائية في أنبوب 1.5 مل يحتوي على 750 ميكرولتر من محلول الهضم المُدفأ مسبقاً (إلى 37 درجة مئوية). احتضان على شاكر في 200 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء المباشر.
  2. إضافة 750 درجة مئوية من DMEM الباردة مع FBS 5٪ لوقف رد الفعل. ضعها على الجليد.
  3. نقل القصبة الهوائية إلى طبق بيتري (100 مم × 15 مم) ووضعها تحت المجهر تشريح. توجيه القصبة الهوائية مع الجانب الظهاري ة تواجه. الرغامى تشريح طوليا له شكل شبه أسطواني الحفاظ عليها من قبل الحلقات الغضروفية. الظهارة على سطح مقعر.
  4. ربط منطقة epiglottis من القصبة الهوائية مع ملقط مستقيم إلى طبق بيتري واستخدام حجم 22 مشرط المتاح، كشط ظهارة قبالة القصبة الهوائية. وتفصل الطبقة الظهارية كورقة شفافة.
  5. يُفرم الظهارة مع المشرط. نقل الطبقة الظهارية إلى أنبوب 2 مل.
  6. شطف طبق بيتري مع 750 درجة مئوية من Tyrode I العازلة ونقل إلى أنبوب 2 مل التي تحتوي على طبقة الظهارية.
  7. احتضان الطبقة الظهارية القصبة الهوائية في Tyrode I العازلة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية على شاكر في 200 دورة في الدقيقة. تغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء المباشر.
  8. إضافة 750 درجة مئوية من المخزن المؤقت Tyrode الثاني الباردة. دوامة الأنسجة المهضومة بقوة لمدة 20-30 s. Triturate التجانس مع حقنة تعلق على إبرة 18 G 10 مرات.  التبديل إلى إبرة قياس 21 G وtriturate 10-20 مرات أخرى.
  9. تصفية الخلايا من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 30:1 المجلد/المجلد من المخزن المؤقت FACS الباردة.
  10. تدور في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وتجاهل supernatant. إعادة تعليق بيليه في العازلة FACS الباردة ونقل التعليق إلى أنبوب البوليسترين 12 مم × 75 ملم (5 مل). تدور مرة أخرى في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وتجاهل supernatant.
  11. إعادة تعليق بيليه في 100 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS.
  12. إضافة 1 μL من CD16/32 المضادة للماوس حجب لمنع غير محددة ملزمة وحضانة لمدة 15 دقيقة على الجليد. لا تغسل.
  13. إضافة الأجسام المضادة التالية وعناصر التحكم ذات النمط isotype ذات الصلة: الأزرق المحيط الهادئ المضادة للماوس CD45 أو الفئران IgG2a، ك (0.25 ميكروغرام /106 خلايا في حجم 100 ميكرولتر) وallophycocyanin (APC) المضادة للماوس EpCAM أو الفئران IgG2b، ك (0.5 ميكروغرام / 106 خلايا في حجم 100 ميكرولتر) الأجسام المضادة أحادية النسيلة. حضانة لمدة 45 دقيقة على الجليد محمية من الضوء المباشر. إضافة 4.5 مل من المخزن المؤقت FACS الباردة، مزيج وتدور في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت FACS وإعادة تعليق بيليه في 300 μL من المخزن المؤقت FACS الباردة.
  14. إضافة يوديد بروبيديوم (PI) (5 ميكروغرام / مل) مباشرة قبل فرز التدفق السيتومتري.
    ملاحظة: خلايا الفرشاة لها شكل غير منتظم مع العديد من العمليات التي يمكن أن تزيد من التزامها بالمرشحات (الشكل3C). قارنا 30 مم إلى 70 مم و 100 مم مرشحات ووجدت أن مرشحات المسام أكبر ضمان عوائد أفضل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التشعب الشامل لتعليق الخلية بعد هضم البابين يحسن بشكل كبير من غلة خلية الفرشاة. نوصي باستخدام إبرة 18G لثلاثية الأولية تليها تتحمل أصغر (21 أو 23 G إبرة) لانفصال أدق من الخلايا.

4. تدفق قياس السيتومتري ة استراتيجية التجمع

  1. تحديد الخلايا من الحطام من زاوية التشتت الأمامي والجانبي. استبعاد doublets باستخدام ارتفاع مبعثر إلى الأمام والعرض والجانب مبعثر الارتفاع والعرض. تكون doublets الخلايا التي تحتوي على قيم عالية العرض.
  2. داخل الخلايا المفردة، حدد الخلايا الحية كمجموعة سالبة PI.
  3. داخل الخلايا المفردة المباشرة، حدد الخلايا CD45 المنخفضة إلى السالبة استناداً إلى عنصر تحكم isotype.
  4. داخل الخلايا CD45 منخفضة/سالبة، تحديد الخلايا الإيجابية EpCAM التي هي أيضا eGFP إيجابية (في قناة FITC). هذا هو عدد خلايا الفرشاة (الشكل2A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية لتسلسل RNA3. بعد عزل القصبة الهوائية وهضم الأنسجة مع بروتوكولمن خطوتين (الشكل 1)، تم جمع الخلايا وملطخة CD45 وEpCAM المسمى بفلورسنت بعد استبعاد الخلايا الميتة مع PI. بعد gating خارج doublets على أساس خصائص مبعثر إلى الأمام والجانب، حددنا خلايا الفرشاة بأنها منخفضة / سلبية لCD45، إيجابية لEpCAM وإيجابية لeGFP (الشكل2A). تمثل خلايا الفرشاة ~ 0.16-0.42٪ من خلايا CD45منخفضة / نيغ عن طريق قياس التدفق وتستأثر بـ 250-600 خلية لكل القصبة الهوائية (الشكل2B). قارنا هذه التهم إلى تقدير لعدد الخلايا الإيجابية ChAT-eGFP في يتصاعد القصبة الهوائية الكاملة من ChAT(BAC)-eGFP الفئران استنادا ً إلى تقييمنا المناعي الواسع المنشور لخلايا فرشاة القصبة الهوائية3 والموضحهنا ( الشكل3). دراساتنا السابقة من خلايا فرشاة القصبة الهوائية في النوع البري، ChAT(BAC)-eGFP الفئران وIl25F25/F25 الفئران اقترح أن خلايا فرشاة الكوليني هي 90٪ متداخلة مع DCLK1+ و IL25+ الخلايا والحساب ل600-1000 خلايا فرشاةلكل القصبة الهوائية 3. وتجدر الإشارة إلى أن هذا العدد أقل من عدد خلايا الفرشاة الكولينية التي أبلغت عنها مجموعات أخرى10. كما يتم تغيير أرقام الخلايا الحسية الكيميائية عن طريق التعرض للأيض الميكروبية وبروتوزوا5،14، قد تعكس هذه الأرقام تقلب في الكائنات المجهرية بين المؤسسات. لذلك، نقترح تقدير عدد خلايا الفرشاة عن طريق الفحص المجهري الفلوري لقياس العدد المتوقع من خلايا الفرشاة المعزولة عن طريق فرز التدفق السيمتري.

أثناء إنشاء بروتوكولنا، حاولنا عدة طرق نشرت سابقا لعزل الخلايا الحسية الكيميائية (الشكل 4). عندما احتضننا القصبة الهوائية المفرومة مع 650 U / mL كولاجيناز الرابع و 1.84 U / mL dispase تستكمل مع DNase I لمدة 45 دقيقة، وهو مزيج يستخدم في كثير من الأحيان للحصول على تعليق خلية واحدة من التجانس الرئة15،حققنا تعليق خلية واحدة من الخلايا الظهارية، ولكن نا تعافى فقط عدد قليل من خلايا الفرشاة (الشكل4A). تم عزل خلايا خصلة في الأمعاء بنجاح باستخدام 2.5 mEDTA و 0.75 mM Dithiothreitol (DTT) مع DNase I لمدة 20 دقيقة لطرد الخلايا الظهارية تليها هضم الخلايا الظهارية المفرج عنها مع 0.01 U / mL dispase مع DNaseI لمدة 10 دقيقة 6.في أيدينا، واستخدام هذا الإجراء أدى أيضا إلى استعادة خلية فرشاة القصبة الهوائية دون المستوى الأمثل (الشكل4B). وصف Krasteva et al.10 بروتوكولًا للعزل الناجح لخلايا فرشاة القصبة الهوائية لتحليل الحمض النووي الريبي . بعد هذا البروتوكول، ونحن احتضان القصبة الهوائية المفروم مع 35 U / مل الباباين في العازلة Tyrode لمدة 45 دقيقة ولم تحقق جيدة استعادة خلية فرشاة (الشكل4C). وصف Rock et al. طريقة هضم ظهارة القصبة الهوائية لعزل الخلايا القاعدية مع خطوتين: فصل الظهارة عن الطبقة المتوسطة مع جرعة عالية dispase (16 U/mL) في درجة حرارة الغرفة تليها حضانة الظهارة جردت مع 0.1٪ تريبسين و 1.6 مليون بتوقيت جنوم EDTA لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية16. بعد هذه الخطوات أدى إلى استعادة أفضل لخلايا الفرشاة، ولكن الأرقام التي تحققت لكل ماوس لم تكن كافية للتحليلات الوظيفية المتعمقة (الشكل4D). ولتحسين البروتوكول، قررنا الجمع بين النهجين الأخيرين. من خلال فصل ظهارة القصبة الهوائية مع ديسباس جرعة عالية، كنا نهدف إلى السماح بوصول أفضل من البابين إلى خلايا فرشاة القصبة الهوائية. وهكذا، باستخدام 16 U/mL من ديسباسي في درجة حرارة الغرفة على القصبة الهوائية بأكملها لفصل الظهارة وحضانة لاحقة من ظهارة مع 26 U / مل بابين في العازلة Tyrode أدى إلى أفضل استعادة خلية فرشاة (الشكل4E).

Figure 1
الشكل 1 مخطط الخطوات المقترحة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية. ويتضمن البروتوكول خطوتين رئيسيتين: بعد تشريح، يتم احتضان القصبة الهوائية بأكملها في محلول ديسباس جرعة عالية لفصل الظهارة. ويلي ذلك هضم ورقة الظهارية مع الباباين في الكالسيوم التي تحتوي على Tyrode العازلة (Tyrode الأول) وتلطيخ الأجسام المضادة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تحليل قياس التدفق التمثيلي لخلايا فرشاة القصبة الهوائية. (A). التمثيل التخطيطي للتدفق cytometry استراتيجية gating. تم بوابات الخلايا المفردة على أساس خصائصها المبعثرة إلى الأمام والجانب وتم اختيار الخلايا الحية على أساس استبعاد يوديد بروبيديوم. تم اختيار الخلايا المنخفضة/السالبة CD45 استناداً إلى عنصر تحكم isotype وتقييمها للتعبير عن EpCAM. اعتبرت [إبكم] خلايا إيجابيّة فرشاة خلايا إن هم عبّروا عن [إغفب] فلورسنت في ال [فيتك] قناة. (ب). عدد خلايا فرشاة القصبة الهوائية الكولينية لكل القصبة الهوائية للماوس والتردد المقدم ة كنسبة مئوية من جميع خلايا CD45منخفضة/- وبنسبة مئوية من CD45منخفضة /-EpCAM+ الخلايا. تمثل كل نقطة ماوس منفصل. البيانات هي من 3 تجارب منفصلة مع 2-3 الفئران لكل منهما. (C). عدم وجود خلايا فرشاة إيجابية eGFP في هضم ظهارية القصبة الهوائية من فأرة من النوع البري ملطخة CD45 و EpCAM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 جبل كامل من القصبة الهوائية الماوس من ChAT(BAC)-eGFP الماوس. تم فتح القصبة الهوائية طوليا وملطخة بالأجسام المضادة للGFP لتعزيز إشارة الفلورة الخضراء eGFP. (أ) جبل القصبة الهوائية كله من ChAT(BAC)-eGFP الماوس، والخلايا الفلورية الخضراء بشكل مكثف تمثل خلايا الفرشاة. شريط مقياس 1 ملم؛ (B) جبل القصبة الهوائية كله من فأر ة من النوع البري مما يدل على عدم وجود خلايا الفرشاة. شريط مقياس = 1 ملم؛ (C) تكبير الطبقة الظهارية مما يدل على خلايا الفرشاة على شكل غير منتظم (الخلايا الخضراء) فضلا عن الآبار كنهاية العصب الكوليني (السهم)؛ (D) جبل القصبة الهوائية كله من القصبة الهوائية من ChAT(BAC)-eGFP يصور لGFP دون تعزيز الأجسام المضادة للإشارة الفلورية؛ (E) مقطع عرضي من القصبة الهوائية الماوس جزءا لا يتجزأ من البارافين من ChAT(BAC)-eGFP الماوس ملطخة المضادة لGFP (الأخضر) أو الماعز IgG السيطرة وDAPI (الأزرق)؛ قضبان المقياس = 20 ميكرومتر (C-E). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 مقارنة بروتوكولات هضم القصبة الهوائية المختلفة. (أ) تم فرمة القصبة الهوائية واحتضانها مع 650 U/mL كولاجيناز الرابع و 1.84 U /mL dispase تستكمل مع DNase I لمدة 45 دقيقة. وقد تكررت هذه التجربة مرتين. (ب) تم احتضان القصبة الهوائية بأكملها مع 2.5 mM EDTA و 0.75 mM DTT تستكمل مع DNase I لمدة 20 دقيقة؛ تم خلع الخلايا الظهارية وهضمها أكثر مع 0.01 U / mL dispase وDNase الأول لمدة 10 دقيقة. وقد تكررت هذه التجربة مرتين. (ج) تم فرم القصبة الهوائية واحتضانها مع 35 U/mL من الباباين في Tyrode I العازلة لمدة 45 دقيقة؛ تم تثبيط نشاط البابين المتبقية مع ليوبيبيتين. وقد أجريت هذه التجربة مرة واحدة. (D) تم احتضان القصبة الهوائية بأكملها مع جرعة عالية dispase (16 U / mL) لمدة 30 دقيقة لفصل ورقة الظهارية، تليها حضانة ورقة الظهارية مع 0.1٪ تريبسين و 1.6 mM EDTA لمدة 30 دقيقة. وقد تكررت هذه التجربة مرتين. (E). تم احتضان القصبة الهوائية بأكملها مع جرعة عالية dispase (16 U / mL) لمدة 30 دقيقة تليها الهضم من ورقة الظهارية مع 26 U / mL بابين في العازلة Tyrode لمدة 30 دقيقة. تم تثبيط نشاط البابين المتبقية مع ليوبيبين والتخفيف من حجم كبير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وجدنا أن مزيج من العلاج بجرعة عالية ديسباس لمدة 40 دقيقة تليها علاج البابين قصيرة (30 دقيقة) يوفر بروتوكول الأمثل لهضم القصبة الهوائية وعزل خلايا الفرشاة. هذا المزيج على حد سواء يتجنب الهضم واسعة النطاق وتنتج أعلى عائد من خلايا الفرشاة، مقارنة مع بروتوكولات بديلة.

في حين أن هضم الرئة لاستخراج الخلايا المكونة للدم قد اعتمد بشكل كلاسيكي على الإنزيمات الهضمية خفيفة مثل collagenase IV15، فإن عزل الخلايا الظهارية يتطلب بروتوكولات أكثر تعقيدا. تعليق خلية واحدة من الخلايا الظهارية هي أكثر صعوبة لتحقيق بسبب تقاطعات ضيقة وadherens ربطها ببعضها البعض وغشاء الطابق السفلي وبسبب ضعف الخلايا نفسها. معظم بروتوكولات هضم الخلايا الظهارية تنطوي على خطوتين - الخطوة الأولى هي فصل الظهارة من غشاء الطابق السفلي تليها خطوات لاحقة لزعزعة التقاطعات الضيقة وdesmosomes التي تلتزم الخلايا الظهارية لبعضها البعض 16 سنة , 17.

نجحت عدة مجموعات في عزل خلايا خصلة الحسيالكيميائي من الأمعاء باستخدام تعديلات مختلفة لبروتوكول من خطوتين لعزل الخلايا الظهارية: تستخدم الخطوة الأولى EDTA وDTT لإطلاق الخلايا الظهارية من الغشاء المخاطي الفرعي متبوعاً بـ submucosa متبوعاً هضم الأوراق الظهارية مع dispase. Howitt وآخرون استخدام خليط من 5 MM EDTA + 1 mM DTT تليها الهضم مع 0.5 وحدة / مل ديسباسي الثاني وDNase14. جيربي وآخرون. تستخدم تركيز عال 30 mM EDTA وحدها لفصل الكسر الظهاري واحتضنت في وقت لاحق مع dispase تستكمل مع DNaseI18. فون Moltke وآخرون تستخدم 2.5 mEdTA, 0.75 mM DTT وDNaseI تليها الهضم dispase6. وجدنا أن هذه التقنيات تسمح لعزل الخلايا الظهارية القابلة للحياة في القصبة الهوائية ولكن نسبة خلايا فرشاة القصبة الهوائية كانت منخفضة للغاية (الشكل4B)ولا تتفق مع توقعاتنا لعزل 600-800 خلايا فرشاة لكل القصبة الهوائية على أساس تقييم الأنسجة لدينا.

وقد وضعت عدة مجموعات بروتوكولات عزل الخلايا الظهارية للرغامى لدراسة الخلايا الظهارية القاعدية. الاختلافات الرئيسية بين هذه البروتوكولات وتلك المستخدمة في الأمعاء هي في تسلسل الإنزيمات الهضمية. الخطوة الأولى هي فصل ظهارة القصبة الهوائية من خلال الحضانة مع تركيز عال من ديسباس (16 U / مل) في درجة حرارة الغرفة16. وهذا يسمح للظهارة لفصل كورقة واحدة من طبقة mesenchymal19. المعالجة اللاحقة للظهارة القصبة الهوائية يستخدم مزيج من التربسين وEDTA، واحدة من الطرق الأنزيمية الأكثر استخداما من انفصال الخلية، لتحقيق تعليق خلية واحدة. تريبسين يشق الببتيدات على الجانب C-المحطة الطرفية من بقايا الأحماض الأمينية اليسين والأرجينين، في حين يستخدم EDTA كمشلات الكالسيوم لتفاعلات الخلية ومصفوفة الخلية20. باستخدام هذه التقنية، وقد نجحت روك وآخرون في استعادة الخلايا الظهارية القاعدية لتوصيف النسخ16. وقد استخدم بروتوكول مماثل مؤخرا لعزل مستقبلات طعم المر التعبير عن الخلايا من Tas2r143-CreERT2 مدفوعة eGFP مراسل ومن B6. Il25Flare25/Flare25 لدراسات تسلسل الحمض النووي الريبي5,8. في تجربتنا، أدى هضم الورقة الظهارية مع التربسين وEDTA إلى انتعاش الخلايا الظهارية ممتازة ولكن أعداد غير كافية من خلايا فرشاة القصبة الهوائية الكولينية لتحليل وظيفي أو النسخ يُجمع ما لم يتم تجميع فئران متعددة لكل منها عينة(الشكل 4C).

الباباين هو نبات الانحلال النيدي قوية السيستين البروتياز المستمدة من اللاتكس البابايا, ومن المعروف أن السندات الببتيد المحتسبة التي تنطوي على الأحماض الأمينية الأساسية, لا سيما ارجينين, يسين وبقايا بعد فينيل ألانين21. عزل خلية فرشاة القصبة الهوائية باستخدام الباباين من ChAT(BAC)- تم الإبلاغ عن الفئران eGFP لأول مرة من قبل Krasteva وآخرون10. كما تم استخدام هضم الباباين مؤخرا لتفكك الخلايا الظهارية مجرى الهواء لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة حيث كانت خلايا الفرشاة / خصلة تتألف من جزء صغير من الخلايا الظهارية11. الباباين هو أيضا الإنزيم الأكثر شيوعا لهضم أنسجة الدماغ لعزل الخلايا العصبية القابلة للحياة22. تفكك أنسجة الدماغ مع الباباين لمدة 30 دقيقة النتائج في عوائد أعلى بشكل ملحوظ، والبقاء على قيد الحياة العصبية والسلامة مقارنة مع هضم التربسين23. منذ بعض خلايا الفرشاة متشابكة بإحكام مع النهايات العصبية3،10، قد يكون استخدام البابين حاسما للانشقاق الناجح لتقاطعات خلايا الفرشاة إلى الخلايا العصبية. ومع ذلك، وجدنا أن الهضم 45 دقيقة مع الباباين في تركيز 35-40 U / مل خفضت بشكل كبير من صلاحية الخلايا الظهارية، مما يؤدي إلى انخفاض استعادة خلية فرشاة (الشكل4D).

استخدمنا 3 طرق للحد من سمية الباباين وزيادة غلتنا الخلوية. أولا، عن طريق فصل ورقة الظهارية مع dispase، خفضنا وقت الحضانة اللاحقة من الباباين من 45 إلى 30 دقيقة. ثانيا، نحن على الفور منعت نشاط البابين مع ليوبيبيتين، وهو مثبط للبروتياز السيستين24. وتجدر الإشارة إلى أن الليوبيبين غير مستقر إلى حد كبير عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، وينبغي أن يُقتبس ويُجمَّد عند -20 درجة مئوية. ثالثا، وجدنا أن تخفيف الأنسجة المهضومة الأنزيمية في حجم كبير من PBS الباردة يساعد أيضا على الحفاظ على صلاحية الخلايا المهضومة. خطوة أخرى حاسمة لزيادة غلة الخلية هي التتطر الصارم10. منذ دوامة طويلة يمكن أن تقلل أيضا من القدرة على البقاء، ونحن استبدال جزئيا مع trituration. نوصي بالثلاثية مع إبرة 18G لتفكك كتل خلوية أكبر تليها ثلاثية إضافية مع إبرة 21 G. وأخيرا، وجدنا أن eGFP حساسة للغاية خفيفة والحماية من التعرض المباشر للضوء في أي خطوة مفيدة. وسمحت هذه التعديلات باستعادة خلايا فرشاة القصبة الهوائية القابلة للحياة (الشكل4هاء).

القيود الرئيسية للبروتوكول المقترح هنا هي إجراء خطوتين واستخدام الباباين، البروتياز السيستين قوية. وقد حلت بعض المجموعات مؤخرا محل liberase للdispase5 عند عزل الخلايا الحسية الكيميائية. وعلاوة على ذلك، تم استخدام الهضم liberase مؤخرا لعزل الخلايا الظهارية الكيميائية الحسية (فرشاة) من الاورام الحميدة الأنفية25،26. نحن لم نقارن مباشرة الهضم liberase لدينا من خطوتين dispase / بابان بروتوكول الهضم. الباباين هو البروتياز السيستين قوية التي يمكن تنشيط مستقبلات البروتياز تنشيط PAR2 على الخلايا الظهارية27 مما يؤدي إلى تنشيط خلايا الفرشاة أنفسهم أو إلى توليد الوسطاء من قبل الخلايا التنفسية الأخرى التي يمكن أن تنشط بدورها فرشاة الخلايا. وأخيرا، يمكن أن باباين تحوير التعبير مستقبلات من خلال انشقاق مستقبلات السطح مما يجعل من الصعب التحقق من صحة التعبير مستقبلات خلية فرشاة عن طريق تدفق قياس الخلايا28،29.

وباختصار، نحن نقدم بروتوكول عزل خلايا فرشاة الكولين القصبي من الفئران مراسل ChAT-eGFP التي تسمح لاستعادة قوية من خلايا فرشاة القصبة الهوائية قابلة للحياة. وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لعزل وتحليل النسخ من خلايا الفرشاة عن طريق تسلسل RNA3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر آدم تشيكوين في بريغام ومركز المناعة البشرية للمرأة تدفق الأساسية لمساعدته في فرز التدفق الخلوي. وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B)، وK08 AI132723 (L.G.B)، والأكاديمية الأمريكية للحساسية والربو والمناعة (AAAAI)/ حساسية الرئة الأمريكية جائزة أمراض الجهاز التنفسي ،من قبل مؤسسة AAAAI جائزة تطوير أعضاء هيئة التدريس (L.G.B.)، من قبل ستيفن وجودي كاي جائزة المبتكرين الشباب (N.A.B.)، من قبل صندوق جويسلين C. أوستن للتطوير الوظيفي للعلماء الطبيبات (L.G.B.)، و تبرع سخي من قبل عائلة فيك (L.G.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) Abcam cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8) Biolegend cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control Biolegend cat#400511
DAPI Biolegend cat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies/Molecular Probes cat#A-11055
Normal Goat IgG R&D Systems cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) Biolegend cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control Biolegend cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase Gibco cat# 17105041 
DNase I Sigma  cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter Boston BioProducts cat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) Boston BioProducts cat# BSS-355
L-Cysteine Sigma cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt Sigma cat# L2023
Papain from papaya latex Sigma cat# P3125
Propidium iodide  Sigma cat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) The Jackson Laboratory 7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope Zeiss
LSRFortessa BD 647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubes Thomas Scientific 1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style Falcon 14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style Falcon 352098
Feather Disposable Scalpel no.12 Fisher Scientific NC9999403
Petri dish, 100 mm x 15 mm Style Falcon 351029
Sterile cell strainer, 100 μm Fisherbrand cat#22363549

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
  2. Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
  3. Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
  4. Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
  5. Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
  6. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
  7. Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
  8. Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
  9. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
  10. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
  11. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  12. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  13. Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
  14. Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
  15. Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
  16. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  17. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
  18. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
  19. Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
  20. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  21. Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
  22. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  23. Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
  24. Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
  25. Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
  26. Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
  27. Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
  28. Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
  29. Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).

Tags

علم المناعة والعدوى العدد 148 خلايا فرشاة القصبة الهوائية الخلايا الظهارية الكولينية الخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية خلايا استشعار الطعم المر مستقبلات الذوق المر خلايا خصلة
العزلوالتقييم الكمي لخلايا الفرشاة من القصبة الهوائية للفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ualiyeva, S., Yoshimoto, E.,… More

Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter