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Immunology and Infection

Isolement et évaluation quantitative des cellules de brosse de La souris trachée

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59496
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

Les cellules de brosse sont les cellules épithéliales chimiosensorielles cholinergiques rares trouvées dans la trachée naïve de souris. En raison de leur nombre limité, l'évaluation ex vivo de leur rôle fonctionnel dans l'immunité de voie aérienne et le remodelage est provocante. Nous décrivons une méthode pour l'isolement des cellules trachéales de brosse par cytométrie de flux.

Abstract

Les cellules trachéales de brosse sont des cellules épithéliales chimiosensorielles cholinergiques prêtes à transmettre des signaux du lumen de voie aérienne au système immunitaire et nerveux. Ils font partie d'une famille de cellules épithéliales chimiosensorielles qui comprennent des cellules tuft dans la muqueuse intestinale, des cellules de brosse dans la trachée, et des cellules chimiosensorielles et microvilleuses solitaires dans la muqueuse nasale. Les cellules chimiosensorielles dans différents compartiments épithélial partagent des marqueurs intracellulaires clés et une signature transcriptionnelle de noyau, mais montrent également l'hétérogénéité transcriptionnelle significative, reflétant probablement l'environnement local de tissu. L'isolement des cellules trachéales de brosse des suspensions simples de cellules est exigé pour définir la fonction de ces cellules épithéliales rares en détail, mais leur isolement est provocant, potentiellement dû à l'interaction étroite entre des cellules trachéales de brosse et des terminaisons nerveuses ou en raison de la composition spécifique aux voies aériennes des jonctions serrées et adhérentes. Ici, nous décrivons une procédure pour l'isolement des cellules de brosse de l'épithélium trachéal de souris. La méthode est basée sur une séparation initiale de l'épithélium trachéal de la submucosa, permettant une incubation plus courte ultérieure de la feuille épithéliale avec du papain. Cette procédure offre une solution rapide et pratique pour le tri cytométrique de flux et l'analyse fonctionnelle des cellules viables de brosse trachéale.

Introduction

Les cellules de brosse appartiennent à une classe de cellules épithéliales chimiosensorielles caractérisées par l'expression des récepteurs amers de goût et des machines de transduction de récepteur de goût trouvées dans les cellules de papetor de goût. Contrairement aux cellules des bourgeons gustatifs, les cellules épithéliales chimiosensorielles sont dispersées dans des surfaces épithéliales et sont appelées cellules chimiosensorielles solitaires (SCC) et cellules microvilleuses dans l'épithélium nasal1,2, cellules de brosse dans la trachée 3,4, et les cellules de touffe dans l'intestin5,6. Les cellules épithéliales exprimant les récepteurs amers de goût et les machines de transduction de goût amer se trouvent également dans l'urètre7,8 et le tube auditif9. Les cellules de brosse de voie aérienne ont des fonctions uniques dans les réponses neurogènes et immunisées de voie aérienne. Ce sont des cellules chimiosensorielles productrices d'acétylcholine qui évoquent des réflexes respiratoires protecteurs lors de l'activation avec des composés amers et des métabolites bactériens comme les substances de détection de quorum10. Les cellules de brosse de voie aérienne sont également la source épithéliale dominante de voie aérienne deLIL-25, qui règle l'inflammation de type 2 aéroallergen-obtenue dans les voies respiratoires 3.

La caractérisation de la transcriptome complète des cellules inférieures de brosse de voie aérienne et de leur réponse aux stimulus environnementaux a été limitée par leurs nombres bas dans l'épithélium trachéal et nombre très limité au-delà des grandes bronches10. Les techniques utilisées pour l'isolement des cellules chimiosensorielles de l'épithélium intestinal n'ont pas donné des nombres proportionnellement élevés de la trachée, peut-être en raison des contacts intimes des cellules trachéales de brosse avec des terminaisons nerveuses10 ou autre facteurs spécifiques aux tissus dans la muqueuse respiratoire, comme la composition des adhérents et des protéines de jonction serrées. Les rapports récents de l'isolement réussi des cellules trachéales de brosse dans des nombres plus élevés pour l'analyse de séquençage d'ARN simple de cellules ont employé une incubation de 2 h avec le papain ou une incubation de 18 h avec pronase11,12. Puisque de plus longues incubations avec des enzymes digestives peuvent diminuer la viabilité de cellules et modifier le profil transcriptionnel des cellules des tissus digérés13,ceci pourrait biaiser l'analyse comparative avec d'autres populations épithéliales chimiosensorielles.

Ici, nous rapportons une méthode pour l'isolementdes cellules trachéales de brosse pour le séquençage d'ARN 3. Le traitement de la trachée avec le dispase de haut-dose sépare l'épithélium du submucosa. La digestion ultérieure de la feuille épithéliale avec la papaine permet une excellente récupération de cette cellule structurelle.

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Protocol

Avant de mener les expériences suivantes, assurez-vous que tous les protocoles et utilisation des soins aux animaux sont approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (CCIO) et exécutés conformément au «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (8e Édition, 2011) et les directives ARRIVE. Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Brigham and Women's Hospital.

1. Préparation des réactifs

  1. Préparer la solution de digestion Dispase, qui est une solution PBS contenant 16 dispase U/mL et 20 'g/mL DNase I. Assurez-vous que la poudre de dispase est complètement dissoute avant de réchauffer la solution dans un bain d'eau à 37 oC.
  2. Ajoutez 5 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF) au milieu de l'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco pour faire une solution d'arrêt.
  3. Préparer tyrode I tampon: ajouter 26 U/mL papain (20 L/mL de 48 U/mg solution papain) et 10 L/mL L-cystéine à la mémoire tampon de HEPES-Tyrode sans calcium.
  4. Préparer le tampon Tyrode II : ajouter 2 leupeptins lll (5 mg/mL) au tampon de HEPES-Tyrode avec du calcium.
  5. Préparer le tampon FACS : utilisez la solution de sel équilibrée de Hanks (HBSS) sans calcium, magnésium et rouge phénol, complété par 2 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) et ajoutez 2 % de FBS.

2. Dissection de la trachée de souris

REMARQUE: Les souris utilisées dans ce protocole sont ChAT(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg (RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 mois d'âge des deux sexes. Réduire au minimum l'exposition du tissu à la lumière directe pour réduire le photoblanchiment de l'eGFP.

  1. Euthanasiede la souris avec une solution d'euthanasie pentobarbital de 100 mg/kg injectée par voie intrapéritone ou en utilisant des protocoles standard approuvés par l'IACUC.
  2. Fixez la souris sur une planche chirurgicale en position de supine avec des aiguilles de 21 G avec des extrémités supérieures et inférieures prolongées. Vaporiser la fourrure avec 70% EtOH pour assainir la zone.
  3. À l'aide de forceps droits, soulevez la peau et la fourrure de l'abdomen et faites une incision au centre avec des ciseaux disséquants (ciseaux droits, 3 cm). À l'aide des ciseaux, séparer la peau du tissu sous-cutané de l'abdomen à la mandibule. Tout en tenant le tissu sous-cutané avec les forceps, faire une petite incision avec les ciseaux au centre de la paroi abdominale.
  4. Ouvrez le péritoine avec une incision en forme de V. À l'aide des forceps, déplacez doucement l'intestin grêle sur le côté, localisez l'aorte abdominale et le cava de vena et faites une incision avec les ciseaux disséquants pour permettre une exsanguination rapide.
  5. Localiser le diaphragme. À l'aide d'une aiguille de 18 G, faire une ouverture dans le diaphragme juste en dessous du sternum pour dégonfler les poumons. Séparez soigneusement le diaphragme de la cage thoracique à l'aide de ciseaux de disséquement droit pointus pour couper le long de la base des côtes.
  6. À l'aide des forceps, soulever l'extrémité exposée du sternum et couper le sternum longitudinalement de la base de la cage thoracique au cou. Faire une incision cervicale centrale avec de courts ciseaux droits (2 cm) et séparer les deux lobes de la glande submandibulaire.
  7. Retirez soigneusement le tissu conjonctif environnant et le thymus qui recense la carina avec une paire de forceps de haute précision.
  8. Disséquer la trachée libre d'abord en séparant l'extrémité proximale au niveau de l'épiglotte, puis en disséquant l'extrémité distale au niveau de la bifurcation de la trachée.
  9. Localiser l'épiglotte et couper la trachée longitudinalement de l'épiglotte à la carina.

3. Digestion épithéliale trachéale

  1. Placer la trachée dans un tube de 1,5 ml contenant 750 l de solution de digestion de désapass pré-chauffée (à 37 oC). Incuber sur un shaker à 200 tr/min pendant 40 min à température ambiante. Couvrir le tube de papier d'aluminium pour réduire l'exposition à la lumière directe.
  2. Ajouter 750 L de DMEM froid avec 5% FBS pour arrêter la réaction. Placer sur la glace.
  3. Transférer la trachée dans un plat Petri (100 mm x 15 mm) et placer sous un microscope à disséquer. Orientez la trachée avec le côté épithélial vers le haut. La trachée disséquée longitudinale a une forme semi-cylindrique maintenue par les anneaux cartilagineux. L'épithélium se trouve à la surface concave.
  4. Attachez la zone d'épiglotte de la trachée avec des forceps droites au plat De Petri et à l'aide d'un scalpel jetable de taille 22, grattez l'épithélium de la trachée. La couche épithéliale se sépare sous forme de feuille translucide.
  5. Émincer l'épithélium avec le scalpel. Transférer la couche épithéliale dans un tube de 2 ml.
  6. Rincer le plat Petri avec 750 l de tampon Tyrode I et transférer dans le tube de 2 ml contenant la couche épithéliale.
  7. Incuber la couche épithéliale trachéale dans Tyrode I tampon pendant 30 min à 37 oC sur un shaker à 200 tr/min. Couvrir le tube de papier d'aluminium pour réduire l'exposition à la lumière directe.
  8. Ajouter 750 l de tampon tyrode II froid. Vortex le tissu digéré vigoureusement pendant 20-30 s. Triturate l'homogénéisme avec une seringue attachée à une aiguille de 18 G 10 fois.  Passez à une aiguille de jauge de 21 G et triturate 10-20 fois de plus.
  9. Filtrer les cellules à travers une passoire de 100 m dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 30:1 vol/vol de tampon FACS froid.
  10. Faire tourner à 350 x g pendant 10 min à 4 oC et jeter le supernatant. Resuspendre la pastille dans un tampon FACS froid et transférer la suspension dans un tube en polystyrène de 12 mm x 75 mm (5 ml). Faire tourner à nouveau à 350 x g pendant 10 min à 4 oC et jeter le supernatant.
  11. Suspendre à nouveau la pastille dans 100 l de tampon FACS.
  12. Ajouter 1 l d'anticorps anti-souris CD16/32 pour bloquer la liaison non spécifique et incuber pendant 15 min sur la glace. Ne pas laver.
  13. Ajoutez les anticorps suivants et les contrôles isotypes respectifs : bleu pacifique anti-souris CD45 ou rat IgG2a, k (0,25 g/106 cellules en volume de 100 l) et allophycocyanine (APC) anti-souris EpCAM ou rat IgG2b, k (0,5 g/106 cellules en volume de 100 l) anticorps monoclonaux. Incuber 45 min sur glace à l'abri de la lumière directe. Ajouter 4,5 ml de tampon FACS froid, mélanger et faire tourner à 350 x g pendant 10 min à 4 oC. Jetez le tampon FACS et suspendez à nouveau le granule dans 300 l de tampon FACS froid.
  14. Ajouter de l'iodure de propidium (PI) (5 g/mL) immédiatement avant le tri cytométrique d'écoulement.
    REMARQUE: Les cellules de broussailles ont une forme irrégulière avec plusieurs processus qui pourraient potentiellement augmenter leur adhérence aux filtres (Figure 3C). Nous avons comparé les filtres de 30 mm à 70 mm et de 100 mm et nous avons constaté que les filtres à pores plus grands assuraient de meilleurs rendements. En outre, la trituration complète de la suspension cellulaire après la digestion papane améliore considérablement les rendements des cellules de brosse. Nous recommandons d'utiliser une aiguille de 18G pour la trituration initiale suivie d'un alésage plus petit (21 ou 23 G d'aiguille) pour une dissociation plus fine des cellules.

4. Stratégie de gating de cytométrie de flux

  1. Identifiez les cellules des débris par l'angle de diffusion vers l'avant et le côté. Exclure les doublets à l'aide de la hauteur et de la largeur de la diffusion vers l'avant et de la hauteur et de la largeur de la diffusion latérale. Les doublets seraient les cellules qui ont des valeurs de largeur élevée.
  2. Dans les cellules individuelles, identifier les cellules vivantes comme la population qui est PI négatif.
  3. Dans les cellules individuelles vivantes, identifiez les cellules CD45 faibles à négatives en fonction du contrôle de l'isotype.
  4. Dans les cellules basses/négatives CD45, identifiez les cellules positives EpCAM qui sont également eGFP positives (dans le canal FITC). Il s'agit de la population de cellules de broussailles (Figure 2A).

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Representative Results

Cette procédure a été mise en œuvre avecsuccès pour isoler les cellules trachéales de brosse pour le séquençage d'ARN 3. Après l'isolement de la trachée et la digestion du tissu avec un protocole en deux étapes (figure1), les cellules ont été rassemblées et tachées avec le CD45 fluorescent et l'EpCAM après exclusion des cellules mortes avec PI. Après avoir sorti les doublets en fonction des caractéristiques de diffusion vers l'avant et latérales, nous avons défini les cellules de brosse comme étant faibles/négatives pour le CD45, positives pour EpCAM et positives pour l'eGFP (Figure 2A). Les cellules de brosse représentaient 0,16-0,42 % des cellules CD45faibles/nég par cytométrie de flux et représentaient 250 à 600 cellules par trachée (figure 2B). Nous avons comparé ces comptes à une estimation du nombre de cellules positives ChAT-eGFP dans des montures trachéales entières de souris ChAT(BAC)-eGFP basées sur notre évaluation immunohistologique étendue publiée des cellules trachéales3 et illustrées ici ( Figure 3). Nos études précédentes sur les cellules trachéales de brosse dans le type sauvage, les souris ChAT(BAC)-eGFP et les souris Il25F25/F25 ont suggéré que les cellules de brosse cholinergique s'chevauchent à 90% avec les cellules et le compte de DCLK1et il25 pour 600-1000 cellules de brosse par trachée3. Notamment, ce nombre est inférieur au nombre de cellules de brosse cholinergique rapportées par d'autres groupes10. Comme les nombres de cellules chimiosensorielles sont modifiés par l'exposition aux métabolites microbiens et au protozoaires5,14, ces nombres pourraient refléter une variabilité dans le microbiote interinstitutionnel. Par conséquent, nous suggérons d'estimer le nombre de cellules de brosse par microscopie de fluorescence pour évaluer le nombre prévu de cellules de brosse isolées par le tri cytométrique d'écoulement.

Tout en établissant notre protocole, nous avons essayé plusieurs méthodes précédemment publiées d'isolement des cellules chimiosensorielles (Figure 4). Lorsque nous avons incubé la trachée hachée avec 650 U/mL collagène IV et 1,84 U/mL dispase complété par DNase I pendant 45 min, une combinaison fréquemment utilisée pour obtenir des suspensions à cellule unique des homogénéités pulmonaires15, nous avons atteint une suspension à cellule unique de cellules épithéliales, mais nous n'avons récupéré que peu de cellules de brosse (figure4A). Les cellules de tuft dans l'intestin ont été avec succès isolées utilisant 2.5 mM EDTA et 0.75 mM Dithiothreitol (DTT) avec DNase I pendant 20 min pour déloger les cellules épithéliales suivies de la digestion des cellules épithéliales libérées avec 0.01 Dispase d'U/mL avec DNaseI pendant 10 min 6. Dans nos mains, l'utilisation de cette procédure a également conduit à la récupération sous-optimale des cellules trachéales de brosse (figure4B). Krasteva et coll.10ont décrit un protocole pour l'isolement réussi des cellules trachéales de brosse pour l'analyse d'ARN. Suivant ce protocole, nous avons incubé la trachée hachée avec 35 U/mL papain dans le tampon de Tyrode pendant 45 min et n'avons pas réalisé la récupération bonne de cellules de brosse (figure 4C). Rock et coll. ont décrit une méthode de digestion de l'épithélium trachéal pour l'isolement des cellules basales en deux étapes : séparation de l'épithélium de la couche mésenchymale avec dispase à forte dose (16 U/mL) à température ambiante suivie de l'incubation de l'épithélium dépouillé avec 0,1 % de trypsine et 1,6 mM EDTA pendant 30 min à 37 oC16. À la suite de ces étapes, on a permis de mieux récupérer les cellules de broussailles, mais les chiffres obtenus par souris étaient insuffisants pour des analyses fonctionnelles approfondies (figure4D). Pour optimiser le protocole, nous avons décidé de combiner les deux dernières approches. En séparant l'épithélium trachéal avec le dispase de dose élevée, nous avons visé pour permettre un meilleur accès de la papaïne aux cellules trachéales de brosse. Ainsi, l'utilisation de 16 U/mL de dispase à température ambiante sur la trachée entière pour séparer l'épithélium et l'incubation subséquente de l'épithélium avec 26 U/mL de papaïne dans le tampon Tyrode a conduit à la meilleure récupération des cellules de broussailles (Figure 4E).

Figure 1
Figure 1 : Schéma des étapes proposées pour l'isolement des cellules trachéales de brosse. Le protocole comprend 2 étapes principales : après la dissection, la trachée entière est incubée dans une solution de dispase à haute dose pour séparer l'épithélium ; ceci est suivi par la digestion de la feuille épithéliale avec le papain dans le calcium contenant le tampon de Tyrode (Tyrode I) et la coloration d'anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Analyse cytométrie de flux représentatif des cellules trachéales debrosse. (A. Représentation schématique de la stratégie de gating de cytométrie de flux. Les cellules simples ont été fermées en fonction de leurs caractéristiques de diffusion vers l'avant et latérales et les cellules vivantes ont été choisies en fonction de l'exclusion de Propidium Iodide. Les cellules basses/négatives de CD45 ont été choisies basées sur le contrôle d'isotype et évaluées pour leur expression de l'EpCAM. Les cellules positives d'EpCAM ont été considérées des cellules de brosse si elles ont exprimé le fluorescent d'eGFP dans le canal de FITC. (B. Nombre de cellules trachéales cholinergiques par trachée de souris et fréquence présentée comme pourcentage de toutes les cellules CD45faibles/- et comme un pour cent de CD45faible /-EpCAM- cellules. Chaque point représente une souris séparée. Les données proviennent de 3 expériences distinctes avec 2-3 souris chacune. (C). Absence de cellules de brosse positive eGFP dans un digest épithélial trachéal d'une souris sauvage de type tachée pour CD45 et EpCAM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Monture entière de trachée de souris d'une souris ChAT(BAC)-eGFP. La trachée a été ouverte longitudinalement et souillée avec l'anticorps anti-GFP pour augmenter le signal vert de fluorescence d'eGFP. (A) Monture trachéale entière de souris ChAT(BAC)-eGFP, les cellules fluorescentes intensément vertes représentent les cellules de brosse; barre d'échelle 1 mm; (B) monture trachéale entière d'une souris sauvage de type démontrant l'absence de cellules de brosse ; Barre d'échelle de 1 mm; (C) grossissement de la couche épithéliale démontrant des cellules de brosse de forme irrégulière (cellules vertes) ainsi qu'une terminaison de nerf cholinergique (flèche); (D) monture trachéale entière d'une trachée d'un ChAT(BAC)-eGFP image pour GFP sans anticorps-amélioration du signal de fluorescence; (E) section transversale d'une trachée de souris intégrée à la paraffine d'une souris ChAT(BAC)-eGFP souris tachée d'anti-GFP (vert) ou de chèvre IgG contrôle et DAPI (bleu); Barres d'échelle de 20 m (C-E). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Comparaison de différents protocoles de digestion trachéale. (A) La trachée a été hachée et incubée avec 650 U/mL de collagène IV et 1,84 U/mL dispase complété par DNase I pendant 45 min. Cette expérience a été répétée 2 fois. (B) La trachée entière a été incubée avec 2,5 mM EDTA et 0,75 mM DTT complété par DNase I pendant 20 min; les cellules épithéliales ont été délogées et digérées plus loin avec la dispase de 0.01 U/mL et le DNase I pendant 10 min. Cette expérience a été répétée 2 fois. (C) La trachée a été hachée et incubée avec 35 U/mL de papain en Tyrode I tampon pendant 45 min; L'activité résiduelle de papain a été empêchée avec leupeptin. Cette expérience a été réalisée une fois. (D) La trachée entière a été incubée avec une dispase à haute dose (16 U/mL) pendant 30 min pour séparer la feuille épithéliale, suivie de l'incubation de la feuille épithéliale avec 0,1% de trypsine et 1,6 mM EDTA pour 30 min. Cette expérience a été répétée 2 fois. (E). La trachée entière a été incubée avec une dispase à haute dose (16 U/mL) pendant 30 min suivie de la digestion de la feuille épithéliale avec 26 u/mL de papain dans le tampon Tyrode pendant 30 min. L'activité résiduelle de papain a été empêchée avec leleupeptin et la dilution de volume élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous avons constaté qu'une combinaison du traitement de dispase de haut-dose pendant 40 min suivi d'un traitement court de papain (30 min) fournit un protocole optimal pour la digestion trachéale et l'isolement de cellules de brosse. Cette combinaison évite la digestion étendue et produit le rendement le plus élevé des cellules de brosse, comparéaux aux protocoles alternatifs.

Tandis que la digestion de poumon pour extraire les cellules hématopoïétiques a classiquement compté sur les enzymes digestives douces comme la collagène IV15,l'isolement des cellules épithéliales exige des protocoles plus complexes. Les suspensions à cellule unique des cellules épithéliales sont plus difficiles à réaliser en raison des jonctions serrées et adhérentes les liant les unes aux autres et à la membrane du sous-sol et en raison de la fragilité des cellules elles-mêmes. La plupart des protocoles pour la digestion épithéliale de cellules impliquent deux étapes - une première étape est la séparation de l'épithélium de la membrane de sous-sol suivie par des étapes suivantes pour perturber les jonctions serrées et les desmosomes qui adhèrent les cellules épithéliales les uns aux autres 16 Annonces , 17.

Plusieurs groupes ont réussi à isoler les cellules chimiosensorielles de l'intestin à l'aide de différentes modifications d'un protocole en deux étapes pour l'isolement des cellules épithéliales : la première étape utilise EDTA et DTT pour libérer les cellules épithéliales du submucosa suivies par digestion des feuilles épithéliales avec le dispase. Howitt et coll. ont utilisé un mélange de 5 mM EDTA et 1 mM DTT suivi d'une digestion avec 0,5 unités/mL Dispase II et DNase14. Gerbe etcoll. utilisé à haute concentration 30 mM EDTA seul pour séparer la fraction épithéliale et ensuite incubé avec dispase complété par DNaseI18. Von Moltke et coll. ont utilisé 2,5 mM EDTA, 0,75 mM DTT et DNaseI suivis d'une digestion dispase6. Nous avons constaté que ces techniques permettent l'isolement des cellules épithéliales viables dans la trachée, mais le pourcentage de cellules trachéales de brosse était extrêmement bas (figure 4B) et non compatible avec notre attente d'isolement de 600-800 cellules de brosse par trachée basée sur notre évaluation d'histologie.

Des protocoles épithélial d'isolement de cellules trachéales ont été développés par plusieurs groupes pour étudier les cellules épithéliales basales. Les principales différences entre ces protocoles et ceux utilisés dans l'intestin sont dans la séquence des enzymes digestives. La première étape est la séparation de l'épithélium trachéal par l'incubation avec une forte concentration de dispase (16 U/mL) à température ambiante16. Cela permet à l'épithélium de se séparer sous une seule feuille de la couche mésenchymale19. Le traitement ultérieur de l'épithélium trachéal utilise une combinaison de trypsine et d'EDTA, l'une des méthodes enzymatiques les plus fréquemment utilisées de détachement cellulaire, pour obtenir une suspension cellulaire unique. La trypsine fend les peptides du côté C-terminal des résidus d'acide aminé de lysine et d'arginine, tandis que l'EDTA est utilisé comme chélateur de calcium pour les interactions cellules-cellules et cellules-matrice20. En utilisant cette technique, Rock et coll. ont réussi à récupérer les cellules épithéliales basales pour le profilage transcriptionnel16. Un protocole semblable a été récemment employé pour isoler le récepteur amer de goût exprimant des cellules d'un journaliste d'eGFP conduit de Tas2r143-CreERT2 et de B6. Il25Flare25/Flare25 pour les études de séquençage de l'ARN5,8. Dans notre expérience, la digestion de la feuille épithéliale avec la trypsine et l'EDTA a mené à la récupération excellente épithéliale de cellules mais au nombre insuffisant de cellules trachéales cholinergiques pour l'analyse fonctionnelle ou transcriptionnelle à moins que plusieurs souris aient été mises en commun pour chaque (figure4C).

Papain est une protéase endolytique puissante de cystéine de plante dérivée du latex de papaye, et elle est connue pour cliver des liaisons peptidiques impliquant des acides aminés de base, particulièrement l'arginine, la lysine et les résidus suivant la phénylalanine21. L'isolement des cellules de brosse trachéale utilisant le papain des souris chAT(BAC)-eGFP a été rapporté la première fois par Krasteva et autres10. La digestion de papain a été également récemment employée pour dissocier des cellules épithéliales de voie aérienne pour le séquençage simple d'ARN de cellules où les cellules de brosse/toft ont comporté une petite fraction des cellules épithéliales11. Papain est également l'enzyme la plus couramment utilisée pour la digestion des tissus cérébraux pour l'isolement des neurones viables22. La dissociation du tissu cérébral avec le papain pendant 30 min a comme conséquence des rendements nettement plus élevés, la survie neuronale et l'intégrité comparées à la digestion de trypsin23. Puisque quelques cellules de brosse sont étroitement entrelacées avec des terminaisons nerveuses3,10,l'utilisation du papain pourrait être critique pour le clivage réussi des jonctions de cellules de brosse aux neurones. Cependant, nous avons constaté qu'une digestion de 45 min avec le papain à une concentration de 35-40 U/mL a considérablement réduit la viabilité épithéliale de cellules, menant à la récupération basse de cellules de brosse (figure 4D).

Nous avons utilisé 3 méthodes pour réduire la toxicité de la papaïne et augmenter nos rendements cellulaires. Tout d'abord, en séparant la feuille épithéliale de dispase, nous avons réduit le temps d'incubation subséquent de papaïne de 45 à 30 min. Deuxièmement, nous avons immédiatement inhibé l'activité de papain avec leupeptin, un inhibiteur des protéases de cystéine24. Notamment, la leupeptine est très instable à 4 oC et doit être aliquoted et congelé à -20 oC. Troisièmement, nous avons constaté que la dilution du tissu enzymatiquement digéré dans un grand volume de PBS froid aide également à préserver la viabilité des cellules digérées. Une autre étape qui est essentielle à l'augmentation des rendements cellulaires est la trituration rigoureuse10. Puisque le vortexing prolongé pourrait également diminuer la viabilité, nous l'avons partiellement substitué avec la trituration. Nous recommandons la trituration avec une aiguille de 18G pour dissocier de plus grands amas cellulaires suivis d'une trituration supplémentaire avec une aiguille de 21 G. Enfin, nous avons constaté que l'eGFP est très sensible à la lumière et la protection contre l'exposition directe à la lumière à n'importe quelle étape est utile. Ces modifications ont permis une récupération robuste des cellules viables de brosse trachéale (Figure 4E).

Les principales limites du protocole proposé ici sont la procédure en deux étapes et l'utilisation de la papaïne, une protéase cystéine puissante. Certains groupes ont récemment substitué la liberase à la dispase5 lors de l'isolage des cellules chimiosensorielles. En outre, la digestion de liberase a été récemment employée pour isoler les cellules épithéliales chimiosensorielles (brosse) des polypes nasaux25,26. Nous n'avons pas directement comparé la digestion de liberase à notre protocole de digestion de dispase/papain en deux étapes. Papain est une protéase cystéine puissante qui peut activer le récepteur activé de protéase PAR2 sur les cellules épithéliales27 menant à l'activation des cellules de brosse elles-mêmes ou à la génération des médiateurs par d'autres cellules respiratoires qui pourraient à leur tour activer le cellules de brosse. Enfin, la papaïne peut moduler l'expression des récepteurs à travers le clivage des récepteurs de surface, ce qui rend difficile de valider l'expression des récepteurs cellulaires de brosse par cytométrie de flux28,29.

En résumé, nous fournissons un protocole d'isolement des cellules cholinergiques trachéales de brosse de ChAT-eGFP de reporter souris qui permet le rétablissement robuste des cellules viables de brosse trachéale. Ce protocole a été utilisé avec succès pour l'isolement et l'analyse transcriptionnelle des cellules de brosse par le séquençage d'ARN3.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions Adam Chicoine au Brigham and Women's Human Immunology Center Flow Core pour son aide au tri cytométrique du débit. Ce travail a été soutenu par National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), et K08 AI132723 (L.G.B), et par l'American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), par le Prix de perfectionnement des facultés de la Fondation AAAAI (L.G.B.), par le Prix Steven et Judy Kaye des jeunes innovateurs (N.A.B.), par le Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.), et par un don généreux de la famille Vinik (L.G.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) Abcam cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8) Biolegend cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control Biolegend cat#400511
DAPI Biolegend cat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies/Molecular Probes cat#A-11055
Normal Goat IgG R&D Systems cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) Biolegend cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control Biolegend cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase Gibco cat# 17105041 
DNase I Sigma  cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter Boston BioProducts cat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) Boston BioProducts cat# BSS-355
L-Cysteine Sigma cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt Sigma cat# L2023
Papain from papaya latex Sigma cat# P3125
Propidium iodide  Sigma cat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) The Jackson Laboratory 7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope Zeiss
LSRFortessa BD 647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubes Thomas Scientific 1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style Falcon 14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style Falcon 352098
Feather Disposable Scalpel no.12 Fisher Scientific NC9999403
Petri dish, 100 mm x 15 mm Style Falcon 351029
Sterile cell strainer, 100 μm Fisherbrand cat#22363549

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References

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Immunologie et infection numéro 148 cellules trachéales cellules épithéliales cholinergiques cellules chimiosensorielles solitaires cellules de détection du goût amer récepteurs du goût amer cellules touffes
Isolement et évaluation quantitative des cellules de brosse de La souris trachée
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Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).

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