Summary
Pinselzellen sind seltene cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die in der naiven Maustrache gefunden werden. Aufgrund ihrer begrenzten Anzahl ist die Ex-vivo-Bewertung ihrer funktionellen Rolle bei der Atemwegsimmunität und dem Umbau eine Herausforderung. Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen durch Durchflusszytometrie.
Abstract
Trachealbürstenzellen sind cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die bereit sind, Signale aus dem Atemwegslumen an das Immunsystem und das Nervensystem zu übertragen. Sie sind Teil einer Familie von chemosensorischen Epithelzellen, die Tuffsteinzellen in der Darmschleimhaut, Bürstenzellen in der Luftröhre und einsame chemosensorische und mikrovillous Zellen in der Nasenschleimhaut enthalten. Chemosensorische Zellen in verschiedenen Epithelkompartimenten teilen sich wichtige intrazelluläre Marker und eine transkriptionelle Kernsignatur, weisen aber auch eine signifikante transkriptionelle Heterogenität auf, die wahrscheinlich die lokale Gewebeumgebung widerspiegelt. Die Isolierung von Trachealbürstenzellen aus einzelzelligen Suspensionen ist erforderlich, um die Funktion dieser seltenen Epithelzellen im Detail zu definieren, aber ihre Isolierung ist eine Herausforderung, möglicherweise aufgrund der engen Wechselwirkung zwischen Trachealbürstenzellen und Nervenenden oder aufgrund der luftwegspezifischen Zusammensetzung von engen und haftenden Kreuzungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von Bürstenzellen aus Maustrachealepithel. Das Verfahren basiert auf einer anfänglichen Trennung des Trachealepithels von der Submucosa, was eine spätere kürzere Inkubation des Epithelblatts mit Papain ermöglicht. Dieses Verfahren bietet eine schnelle und bequeme Lösung für die zytometrische Durchflusssortierung und funktionelle Analyse lebensfähiger Trachealbürstenzellen.
Introduction
Pinselzellen gehören zu einer Klasse von chemosensorischen Epithelzellen, die sich durch die Expression von bitteren Geschmacksrezeptoren und der Geschmacksrezeptor-Transduktionsmaschinerie in Geschmacksknospenzellen auszeichnen. Im Gegensatz zu Geschmacksknospenzellen sind chemosensorische Epithelzellen in epithelialen Oberflächen verstreut und werden als einsame chemosensorische Zellen (SCCs) und mikrovillous Zellen im Nasenepithel1,2, Bürstenzellen in der Luftröhre bezeichnet 3,4und Büschelzellen im Darm5,6. Epithelzellen, die bittere Geschmacksrezeptoren und die bitteren Geschmackstransduktionsmaschinen exdrücken, finden sich auch in der Harnröhre7,8 und der Gehörröhre9. Atemwegsbürstenzellen haben einzigartige Funktionen in neurogenen und immunen Atemwegsreaktionen. Sie sind Acetylcholin-produzierende Chemosensorienzellen, die bei Aktivierung mit Bitterverbindungen und bakteriellen Metaboliten wie quorum-sensing Substanzen10schützende Atemreflexe evozieren. Atemwegsbürstenzellen sind auch die dominante Atemwegsepithelquelle von IL-25, die aeroallergen-entlöste Typ-2-Entzündungen in den Atemwegen reguliert3.
Die Charakterisierung des vollständigen Transkriptoms der unteren Atemwegsbürstenzellen und ihre Reaktion auf Umweltreize wurde durch ihre geringe Anzahl im Trachealepithel und sehr begrenzte Zahlen über die großen Bronchien hinaus begrenzt10. Techniken zur Isolierung von chemosensorischen Zellen aus dem Darmepithel haben keine proportional hohen Zahlen aus der Luftröhre ergeben, möglicherweise aufgrund der intimen Kontakte von Trachealbürstenzellen mit Nervenenden10 oder anderen gewebespezifische Faktoren in der Atemschleimhaut wie die Zusammensetzung von Aufenthalten und engen Knotenproteinen. Jüngste Berichte über eine erfolgreiche Isolierung von Trachealbürstenzellen in höheren Zahlen für die einzellige RNA-Sequenzierungsanalyse verwendeten entweder eine 2 h Inkubation mit Papain oder eine 18 h Inkubation mit Pronase11,12. Da längere Inkubationen mit Verdauungsenzymen die Zelllebensfähigkeit verringern und das Transkriptionsprofil von Zellen aus verdauten Geweben verändern können13, könnte dies eine vergleichende Analyse mit anderen chemosensorischen Epithelpopulationen vortragen.
Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen zur RNA-Sequenzierung3. Die Behandlung der Luftröhre mit hochdosierter Dispase trennt das Epithel von der Submucosa. Die anschließende Verdauung des Epithelblatts mit Papain ermöglicht eine hervorragende Rückgewinnung dieser Strukturzelle.
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Protocol
Stellen Sie vor der Durchführung der folgenden Experimente sicher, dass alle Tierpflege- und -protokolle vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortiere" (8. Auflage, 2011) und die ARRIVE-Richtlinien. Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung im Brigham and Women es Hospital überprüft und genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien
- Bereiten Sie die Dispase-Verdauungslösung vor, bei der es sich um eine PBS-Lösung handelt, die 16 U/ml-Dispase und 20 g/ml DNase I enthält. Stellen Sie sicher, dass das Dispasepulver vollständig gelöst ist, bevor Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 37 °C aufwärmen.
- Fügen Sie 5% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) zu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, um eine Stopplösung zu finden.
- Vorbereiten Tyrode I Puffer: Fügen Sie 26 U/ml Papain (20 l/ml 48 U/mg Papain-Lösung) und 10 l/ml L-Cystein in den Puffer von HEPES-Tyrode ohne Kalzium.
- Vorbereiten Des Tyrode II-Puffers: 2 L/ml Leupeptin (5 mg/ml) mit Kalzium in den Puffer von HEPES-Tyrode geben.
- FACS-Puffer vorbereiten: Verwenden Sie Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calcium, Magnesium & Phenolrot, ergänzt mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und fügen Sie 2% FBS hinzu.
2. Zerlegung der Maus-Trachea
HINWEIS: Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind ChAT(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 Monate alt von beiden Geschlechtern. Minimieren Sie die Exposition des Gewebes, Licht zu lenken, um photobleaching von eGFP zu reduzieren.
- Euthanisieren Sie die Maus mit 100 mg/kg Pentobarbital Euthanasie-Lösung intraperitoneal oder mit Standardprotokollen von der IACUC genehmigt injiziert.
- Fixieren Sie die Maus auf einem chirurgischen Brett in der Supine-Position mit 21 G Nadeln mit verlängerten oberen und unteren Extremitäten. Sprühen Sie das Fell mit 70% EtOH, um den Bereich zu desinzipieren.
- Mit geraden Zangen, heben Sie die Haut und das Fell des Bauches und machen einen Schnitt in der Mitte mit sezierender Schere (gerade Schere, 3 cm). Mit der Schere, trennen Sie die Haut vom subkutanen Gewebe vom Bauch zur Mandibula. Während Sie das unterkutane Gewebe mit der Zange hochhalten, machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Mitte der Bauchwand.
- Öffnen Sie das Peritoneum mit einem V-förmigen Schnitt. Mit der Zange bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig zur Seite, lokalisieren Sie die Bauchaorta und Vena cava und machen Sie einen Schnitt mit der sezierenden Schere, um eine schnelle Exsanguination zu ermöglichen.
- Suchen Sie die Membran. Mit einer 18 G Nadel, machen Sie eine Öffnung im Zwerchfell direkt unter dem Brustbein, um die Lunge zu entschärfen. Trennen Sie das Zwerchfell vorsichtig vom Rippenkäfig mit einer scharfspitzen geraden Sezierenderschere, um entlang der Unterbasis der Rippen zu schneiden.
- Heben Sie mit der Zange das exponierte Ende des Brustbeins an und schneiden Sie das Brustbein längs von der Basis des Rippenkäfigs bis zum Hals. Machen Sie einen zentralen Zervixschnitt mit kurzer gerader Schere (2 cm) und trennen Sie die beiden Lappen der submandibulären Drüse.
- Entfernen Sie vorsichtig das umgebende Bindegewebe und den Thymus, der die Carina mit einem Paar feinfeiner, hochpräziser Zange überlagert.
- Sezieren Sie die Luftröhre zuerst frei, indem Sie das proximale Ende auf der Ebene der Epiglottis trennen und dann das distale Ende auf der Ebene der Bifurkation der Luftröhre sezieren.
- Suchen Sie die Epiglottis und schneiden Sie die Luftröhre längs von den Epiglottis zur Carina.
3. Tracheal epitheliale Verdauung
- Legen Sie die Luftröhre in ein 1,5 ml-Rohr mit 750 l vorgewärmter (auf 37 °C) Dispase-Verdauungslösung. Auf einem Shaker bei 200 Rpm für 40 min bei Raumtemperatur bebrüten. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Belichtung von direktem Licht zu reduzieren.
- Fügen Sie 750 l kaltes DMEM mit 5% FBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Auf Eis legen.
- Die Luftröhre auf eine Petrischale (100 mm x 15 mm) geben und unter ein Seziermikroskop stellen. Richten Sie die Luftröhre mit der epitheliale Seite nach oben. Die längs sezierte Luftröhre hat eine halbzylindrische Form, die von den Knorpelringen gepflegt wird. Das Epithel befindet sich auf der konkaven Oberfläche.
- Tether der Epiglottis Bereich der Luftröhre mit geraden Zangen auf die Petrischale und mit einem Einwegsskalpell der Größe 22, kratzen Sie das Epithel von der Luftröhre. Die Epithelschicht trennt sich als transluzentes Blatt.
- Das Epithel mit dem Skalpell zerkleinern. Übertragen Sie die Epithelschicht in ein 2 ml-Rohr.
- Spülen Sie die Petrischale mit 750 L Tyrode I Puffer und übertragen Sie in das 2 ml Rohr, das die Epithelschicht enthält.
- Inkubieren Sie die Trachealepithelschicht in Tyrode I 30 min bei 37 °C auf einem Shaker bei 200 Rpm puffern. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Belichtung von direktem Licht zu reduzieren.
- Fügen Sie 750 l kalten Tyrode II Puffer hinzu. Das verdaute Gewebe für 20-30 s kräftig vortexen. Das Homogenat mit einer Spritze, die an einer 18 G Nadel befestigt ist, 10 Mal trituieren. Wechseln Sie zu einer 21 G-Messnadel und trituieren Sie 10-20 Mal.
- Filtern Sie die Zellen durch ein 100-m-Sieb in ein 50 ml konisches Rohr. Fügen Sie 30:1 Vol/Vol des kalten FACS-Puffers hinzu.
- Drehen Sie bei 350 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet im kalten FACS-Puffer aussetzen und die Suspension auf ein 12 mm x 75 mm (5 ml) Polystyrolrohr übertragen. Drehen Sie bei 350 x g 10 min bei 4 °C wieder und entsorgen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Pellet in 100 L FACS-Puffer wieder aus.
- Fügen Sie 1 L Anti-Maus-CD16/32-Blockierungsantikörper hinzu, um unspezifische Bindungen zu blockieren und 15 min auf Eis zu brüten. Nicht waschen.
- Fügen Sie die folgenden Antikörper und die entsprechenden Isotyp-Steuerelemente hinzu: pazifischeblaue Anti-Maus-CD45 oder Ratte IgG2a, k (0,25 g/106 Zellen in 100 L Volumen) und Allophycocyanin (APC) Anti-Maus-EpCAM oder Ratte IgG2b, k (0,5 g/106 Zellen in 100 l Volumen) monoklonale Antikörper. 45 min auf Eis vor direktem Licht geschützt. 4,5 ml kalter FACS-Puffer hinzufügen, bei 350 x g mischen und drehen, 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den FACS-Puffer, und setzen Sie das Pellet in 300 L kalten FACS-Puffer wieder auf.
- Fügen Sie Propidiumiodid (PI) (5 g/ml) unmittelbar vor der zytometrischen Durchflusssortierung hinzu.
HINWEIS: Pinselzellen haben eine unregelmäßige Form mit mehreren Prozessen, die ihre Einhaltung von Filtern erhöhen könnten (Abbildung 3C). Wir verglichen 30 mm mit 70 mm und 100 mm Filter und stellten fest, dass größere Porenfilter für bessere Erträge sorgten. Darüber hinaus verbessert eine gründliche Triturierung der Zellsuspension nach der Papainverdauung die Ausbeute der Bürstenzelle signifikant. Wir empfehlen die Verwendung einer 18G-Nadel für die anfängliche Trituration, gefolgt von einer kleineren Bohrung (21 oder 23 G Nadel) zur feineren Trennung von Zellen.
4. Flow Cytometry Gating Strategie
- Identifizieren Sie Zellen aus Schutt durch vorwärts und seitlichen Streuwinkel. Schließen Sie die Doublets mit Vorwärtsstreuhöhe und -breite und seitenstreuungshöhe und -breite aus. Die Doublets wären die Zellen mit hohen Breitenwerten.
- Identifizieren Sie innerhalb der einzelnen Zellen die lebenden Zellen als die Population, die PI-negativ ist.
- Identifizieren Sie innerhalb der einzelnen Einzelzellen die CD45-Zellen mit niedrigen bis negativen Zellen basierend auf der Isotypkontrolle.
- Identifizieren Sie innerhalb der CD45-Low/Negativ-Zellen die EpCAM-positiven Zellen, die ebenfalls eGFP-positiv sind (im FITC-Kanal). Dies ist die Grundgesamtheit der Pinselzellen (Abbildung 2A).
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Representative Results
Dieses Verfahren wurde erfolgreich implementiert, um Trachealbürstenzellen für die RNA-Sequenzierung3zu isolieren. Nach Isolierung der Luftröhre und Verdauung des Gewebes mit einem 2-stufigen Protokoll (Abbildung 1) wurden Zellen gesammelt und mit fluoreszierend gekennzeichneten CD45 und EpCAM nach Ausschluss abgestorbener Zellen mit PI gefärbt. Nachdem wir Doublets basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuungsmerkmalen herausgezäunt hatten, definierten wir Bürstenzellen als niedrig/negativ für CD45, positiv für EpCAM und positiv für eGFP (Abbildung 2A). Pinselzellen stellten 0,16-0,42 % der CD45-Low/Neg-Zellen durch Durchflusszytometrie dar und machten 250-600 Zellen pro Luftröhre aus (Abbildung 2B). Wir verglichen diese Zählungen mit einer Schätzung der Anzahl der ChAT-eGFP-positiven Zellen in ganzen Tracheal-Mounts von ChAT (BAC)-eGFP-Mäusen auf der Grundlage unserer veröffentlichten umfangreichen immunhistologischen Auswertung von Trachealbürstenzellen 3 und hier dargestellt ( Abbildung 3). Unsere früheren Studien an Trachealbürstenzellen in Wild-, ChAT (BAC)-eGFP-Mäusen und Il25F25/F25-Mäusen legten nahe, dass cholinerge Bürstenzellen sich zu 90% mit DCLK1 + und IL25+ Zellen überlappen und für 600-1000 Bürstenzellen pro Luftröhre3. Bemerkenswert ist, dass diese Zahl niedriger ist als die Anzahl der cholinergen Pinselzellen, die von anderen Gruppen gemeldet werden10. Da die zahlsmittelsiologischen Zellzahlen durch Exposition gegenüber mikrobiellen Metaboliten und Protozoen5,14verändert werden, könnten diese Zahlen eine Variabilität der interinstitutionellen Mikrobiota widerspiegeln. Daher schlagen wir vor, die Anzahl der Pinselzellen durch Fluoreszenzmikroskopie abzuschätzen, um die erwartete Anzahl isolierter Pinselzellen durch zytometrische Durchflusssortierung zu messen.
Während der Erstellung unseres Protokolls haben wir mehrere zuvor veröffentlichte Methoden zur Isolierung von chemosensorischen Zellen versucht (Abbildung 4). Wenn wir Hackfleisch-Luftröhre mit 650 U/ml Kollagennase IV und 1,84 U/ml Dispase mit DNase I für 45 min ergänzt, eine Kombination häufig verwendet, um einzellige Suspensionen aus Lungenhomogenaten zu erhalten15, erreichten wir eine einzellige Suspension von Epithelzellen, aber wir haben nur wenige Pinselzellen zurückgewonnen (Abbildung 4A). Tuft-Zellen im Darm wurden erfolgreich mit 2,5 mM EDTA und 0,75 mM Dithiothreitol (DTT) mit DNase I für 20 min isoliert, um die Epithelzellen zu entfernen, gefolgt von der Verdauung der freigesetzten Epithelzellen mit 0,01 U/mL Dispase mit DNaseI für 10 min 6. In unseren Händen führte dieses Verfahren auch zu einer suboptimalen Trachealbürstenzellwiederherstellung (Abbildung 4B). Ein Protokoll zur erfolgreichen Isolierung von Trachealbürstenzellen für die RNA-Analyse wurde von Krasteva et al.10 beschrieben. Nach diesem Protokoll inkubierten wir gehackte Luftröhre mit 35 U/ml Papain in Tyrode Puffer für 45 min und erreichten keine gute Bürstenzellwiederherstellung (Abbildung 4C). Rock et al. beschrieben eine Methode der Verdauung von Trachealepithelium zur Basalzellisolierung mit zwei Schritten: Trennung des Epithels von der mesenchymalen Schicht mit hochdosiertem Dispase (16 U/ml) bei Raumtemperatur gefolgt von Inkubation des abgestreiften Epithels mit 0,1 % Trypsin und 1,6 mM EDTA für 30 min bei 37 °C16. Die folgenden Schritte führten zu einer besseren Wiederherstellung der Bürstenzellen, aber die pro Maus erreichten Zahlen reichten nicht aus, um tiefgehende Funktionsanalysen durchzuführen (Abbildung 4D). Um das Protokoll zu optimieren, haben wir beschlossen, die letzten beiden Ansätze zu kombinieren. Durch die Trennung des Trachealepithels mit hochdosiertem Dispase wollten wir einen besseren Zugang von Papain zu Trachealbürstenzellen ermöglichen. So führte die Verwendung von 16 U/ml Dispase bei Raumtemperatur auf ganzer Luftröhre zur Trennung des Epithels und anschließender Inkubation des Epithels mit 26 U/ml Papain im Tyrode-Puffer zur besten Bürstenzellrückgewinnung (Abbildung 4E).
Abbildung 1 : Schema der vorgeschlagenen Schritte zur Isolierung von Trachealbürstenzellen. Das Protokoll umfasst 2 Hauptschritte: Nach der Zerlegung wird die gesamte Luftröhre in einer hochdosierten Dispaselösung inkubiert, um das Epithel zu trennen; Es folgt die Verdauung des Epithelblatts mit Papain in Kalzium enthaltendem Tyrode-Puffer (Tyrode I) und Antikörperfärbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Repräsentative Durchflusszytometrieanalyse von Trachealbürstenzellen. (A). Schematische Darstellung der Flow Cytometrie-Gating-Strategie. Einzelne Zellen wurden basierend auf ihren vorwärts- und seitlichen Streueigenschaften abgezäut torden und lebende Zellen wurden auf der Grundlage des Ausschlusses von Propidium Iodid ausgewählt. CD45 Niedrig-/Negativzellen wurden auf der Grundlage der Isotypkontrolle ausgewählt und auf ihre Expression von EpCAM ausgewertet. EpCAM-positive Zellen wurden als Pinselzellen betrachtet, wenn sie eGFP fluoreszierend im FITC-Kanal exprimierten. (B). Anzahl der cholinergen Trachealbürstenzellen pro Maustrachea und Frequenz als Prozent aller CD45Low/- Zellen und als Prozent der CD45Low/-EpCAM+ Zellen dargestellt. Jeder Punkt stellt eine separate Maus dar. Die Daten stammen aus 3 separaten Experimenten mit je 2-3 Mäusen. (C). Fehlen von eGFP-positiven Bürstenzellen in einem Trachealepithel-Digest von einer Wild-Typ-Maus, die für CD45 und EpCAM gebeizt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Gesamte Halterung der Mausluftrache einer ChAT(BAC)-eGFP Maus. Die Luftröhre wurde längs geöffnet und mit Anti-GFP-Antikörpern gefärbt, um das grüne EGFP-Fluoreszenzsignal zu verbessern. (A) Ganze Trachealhalterung der ChAT(BAC)-eGFP-Maus, intensiv grüne fluoreszierende Zellen stellen Pinselzellen dar; Maßstabsstange 1 mm; (B) ganze Trachealhalterung einer Wild-Typ-Maus, die das Fehlen von Bürstenzellen demonstriert; Skalenstange = 1 mm; (C) Vergrößerung der Epithelschicht, die unregelmäßig geformte Bürstenzellen (grüne Zellen) sowie eine cholinerge Nervenendeime (Pfeil) zeigt; (D) ganze Trachealhalterung einer Luftröhre eines ChAT(BAC)-eGFP für GFP ohne Antikörperverstärkung des Fluoreszenzsignals abgebildet; (E) Querschnitt einer paraffineingebetteten Maustrache a ChAT(BAC)-eGFP Maus mit Anti-GFP (grün) oder Ziege IgG-Steuerung und DAPI (blau); Skalenbalken = 20 m (C-E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Vergleich verschiedener Trachealverdauungsprotokolle. (A) Die Luftröhre wurde gehackt und mit 650 U/ml Kollagenase IV und 1,84 U/ml Dispase ergänzt mit DNase I für 45 min. Dieses Experiment wurde 2 Mal wiederholt. (B) Die gesamte Luftröhre wurde mit 2,5 mM EDTA und 0,75 mM DTT mit DNase I für 20 min ergänzt inkubiert; die Epithelzellen wurden mit 0,01 U/ml Dispase und DNase I für 10 min entfernt und weiter verdaut. Dieses Experiment wurde 2 Mal wiederholt. (C) Die Luftröhre wurde mit 35 U/ml Papain in Tyrode I Puffer für 45 min gehackt und inkubiert; die verbleibende Papainaktivität wurde mit Leupeptin gehemmt. Dieses Experiment wurde einmal durchgeführt. (D) Die gesamte Luftröhre wurde mit hochdosiertem Dispase (16 U/ml) für 30 min inkubiert, um das Epithelblatt zu trennen, gefolgt von der Inkubation des Epithelblatts mit 0,1% Trypsin und 1,6 mM EDTA für 30 min. Dieses Experiment wurde 2 Mal wiederholt. (E). Die gesamte Luftröhre wurde 30 min lang mit hochdosiertem Dispase (16 U/ml) inkubiert, gefolgt von der Verdauung des Epithelblattes mit 26 U/ml Papain im Tyrode-Puffer für 30 min. Die Rest-Papain-Aktivität wurde mit Leupeptin und hoher Volumenverdünnung gehemmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir fanden heraus, dass eine Kombination von hochdosierter Dispase-Behandlung für 40 min gefolgt von einer kurzen Papain-Behandlung (30 min) ein optimales Protokoll für die Trachealverdauung und die Isolierung von Bürstenzellen bietet. Diese Kombination vermeidet eine umfangreiche Verdauung und erzeugt die höchste Ausbeute an Bürstenzellen im Vergleich zu alternativen Protokollen.
Während die Lungenverdauung zur Extraktion hämatopoetischer Zellen sich klassischerweise auf milde Verdauungsenzyme wie Kollagenase IV15stützt, erfordert die Isolierung von Epithelzellen komplexere Protokolle. Einzelzellsuspensionen von Epithelzellen sind aufgrund der engen und haftenden Verbindungen, die sie aneinander und die Kellermembran binden, und wegen der Gebrechlichkeit der Zellen selbst schwieriger zu erreichen. Die meisten Protokolle für die Epithelzellverdauung umfassen zwei Schritte - ein erster Schritt ist die Trennung des Epithels von der Kellermembran gefolgt von nachfolgenden Schritten, um die engen Knoten und Desmosomes zu stören, die die Epithelzellen aneinander haften. 16 , 17.
Mehrere Gruppen haben erfolgreich chemosensorische Büschelzellen aus dem Darm isoliert, indem sie verschiedene Modifikationen eines 2-stufigen Protokolls zur Isolierung von Epithelzellen verwendet haben: Der erste Schritt verwendet EDTA und DTT, um Epithelzellen aus der Submukose freizusetzen, gefolgt von Verdauung der Epithelblätter mit Dispase. Howitt et al. verwendeten eine Mischung aus 5 mM EDTA + 1 mM DTT gefolgt von der Verdauung mit 0,5 Einheiten/ml Dispase II und DNase14. Gerbe et al. verwendet hohe Konzentration 30 mM EDTA allein, um die Epithelfraktion zu trennen und anschließend mit Dispase ergänzt mit DNaseI18inkubiert. Von Moltke et al. verwendet 2,5 mM EDTA, 0,75 mM DTT und DNaseI gefolgt von Dispase Verdauung6. Wir fanden heraus, dass diese Techniken die Isolierung lebensfähiger Epithelzellen in der Luftröhre ermöglichen, aber der Prozentsatz der Trachealbürstenzellen extrem niedrig war (Abbildung 4B) und nicht mit unserer Erwartung einer Isolierung von 600-800 Bürstenzellen pro trachea basierend auf unserer histologischen Bewertung.
Trachealepitheliale Zellisolationsprotokolle wurden von mehreren Gruppen entwickelt, um Basalepithelzellen zu untersuchen. Die Hauptunterschiede zwischen diesen Protokollen und denen, die im Darm verwendet werden, sind in der Reihenfolge der Verdauungsenzyme. Der erste Schritt ist die Trennung des Trachealepithels durch Inkubation mit einer hohen Dispasekonzentration (16 U/ml) bei Raumtemperatur16. Dadurch kann sich das Epithel als einzelnes Blatt von der mesenchymalen Schicht19trennen. Die nachfolgende Verarbeitung des Trachealepithels verwendet eine Kombination von Trypsin und EDTA, einer der am häufigsten verwendeten enzymatischen Methoden der Zellablösung, um eine einzelzellige Suspension zu erreichen. Trypsin spaltet Peptide auf der C-terminalen Seite von Lysin- und Arginin-Aminosäurerückständen, während EDTA als Calciumchelator für Zellzell- und Zellmatrix-Wechselwirkungen20verwendet wird. Mit dieser Technik, Rock et al. haben erfolgreich bei der Wiederherstellung basalepitheliale Zellen für transkriptionelle Profilierung16. Ein ähnliches Protokoll wurde vor kurzem verwendet, um bittere Geschmacksrezeptor exzellen aus einem Tas2r143-CreERT2-gesteuerten eGFP-Reporter und aus B6 zu isolieren. Il25Flare25/Flare25 für RNA-Sequenzierungsstudien5,8. Nach unserer Erfahrung führte die Verdauung des Epithelblatts mit Trypsin und EDTA zu einer ausgezeichneten Epithelzellrückgewinnung, aber zu einer unzureichenden Anzahl cholinerger Trachealbürstenzellen für die funktionelle oder transkriptionelle Analyse, es sei denn, mehrere Mäuse wurden für jede Stichprobe (Abbildung 4C).
Papain ist eine potente endolytische Pflanze Cystein Protease aus Papaya Latex abgeleitet, und es ist bekannt, Peptidbindungen mit grundlegenden Aminosäuren, insbesondere Arginin, Lysin und Rückstände nach Phenylalanin21zu spalten. Tracheal Bürstenzellisolation mit Papain von ChAT(BAC)-eGFP Mäusen wurde zuerst von Krasteva et al10berichtet. Die Papain-Verdauung wurde vor kurzem auch verwendet, um Atemwegsepithelzellen für die einzellige RNA-Sequenzierung zu dissoziieren, bei der Pinsel-/Tuft-Zellen einen kleinen Bruchteil der Epithelzellen11umfassten. Papain ist auch das am häufigsten verwendete Enzym für die Verdauung von Hirngewebe zur Isolierung lebensfähiger Neuronen22. Dissoziation von Hirngewebe mit Papain für 30 min führt zu deutlich höheren Erträgen, neuronalen Überleben und Integrität im Vergleich zu Trypsin-Verdauung23. Da einige Bürstenzellen eng mit Nervenenden3,10verflochten sind, könnte die Verwendung von Papain für die erfolgreiche Spaltung von Bürstenzellknoten zu Neuronen entscheidend sein. Wir fanden jedoch heraus, dass eine 45 min Verdauung mit Papain in einer Konzentration von 35-40 U/ml die Epithelzelllebensfähigkeit drastisch reduzierte, was zu einer niedrigen Wiederherstellung der Pinselzellen führte (Abbildung 4D).
Wir verwendeten 3 Methoden, um die Papain-Toxizität zu reduzieren und unsere zellulären Erträge zu erhöhen. Erstens haben wir durch die Trennung des Epithelblatts mit Dispase die nachfolgende Inkubationszeit von Papain von 45 auf 30 min reduziert. Zweitens hemmten wir sofort die Papain-Aktivität mit Leupeptin, einem Inhibitor von Cystein-Proteasen24. Insbesondere ist Leupeptin bei 4 °C sehr instabil und sollte bei -20 °C aliquoted und gefroren werden. Drittens fanden wir heraus, dass die Verdünnung des enzymatisch verdauten Gewebes in einem großen Volumen an kaltem PBS auch dazu beiträgt, die Lebensfähigkeit der verdauten Zellen zu erhalten. Ein weiterer Schritt, der entscheidend für die Erhöhung der Zellausbeute ist, ist die rigorose Trituration10. Da längereWirbel auch die Lebensfähigkeit verringern konnten, ersetzten wir sie teilweise durch Trituration. Wir empfehlen trituration mit einer 18G-Nadel, um größere Zellklumpen zu dissoziieren, gefolgt von einer zusätzlichen Trituration mit einer 21 G Nadel. Schließlich stellten wir fest, dass eGFP hochgradig lichtempfindlich ist und der Schutz vor direkter Lichteinwirkung bei jedem Schritt hilfreich ist. Diese Modifikationen ermöglichten eine robuste Wiederherstellung lebensfähiger Trachealbürstenzellen (Abbildung 4E).
Die wichtigsten Einschränkungen des hier vorgeschlagenen Protokolls sind das 2-stufige Verfahren und die Verwendung von Papain, einer potenten Cysteinprotease. Einige Gruppen haben vor kurzem Liberase durch Dispase5 ersetzt, wenn chemosensorische Zellen isoliert werden. Darüber hinaus wurde die Liberase-Verdauung vor kurzem verwendet, um chemosensorische (Pinsel) Epithelzellen aus Nasenpolypen25,26zu isolieren. Wir haben die Liberase-Verdauung nicht direkt mit unserem zweistufigen Dispase/Papain-Verdauungsprotokoll verglichen. Papain ist eine potente Cystein-Protease, die den protease aktivierten Rezeptor PAR2 auf Epithelzellen27 aktivieren kann, was zur Aktivierung von Bürstenzellen selbst oder zur Erzeugung von Mediatoren durch andere Atemzellen führt, die wiederum die Bürstenzellen. Schließlich kann Papain die Rezeptorexpression durch die Spaltung von Oberflächenrezeptoren modulieren, was es schwierig macht, die Pinselzellrezeptorexpression durch Durchflusszytometrie zu validieren28,29.
Zusammenfassend bieten wir ein Protokoll zur Isolierung von trachealen cholinergen Bürstenzellen von ChAT-eGFP Reportermäusen, das eine robuste Wiederherstellung lebensfähiger Trachealbürstenzellen ermöglicht. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für die Isolierung und Transkriptionsanalyse von Pinselzellen durch RNA-Sequenzierung3verwendet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Adam Chicoine vom Brigham and Women es Human Immunology Center Flow Core für seine Hilfe bei der zytometrischen Sortierung durch Fluss. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) und K08 AI132723 (L.G.B) und von der American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), durch den AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), den Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), den Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.) und großzügige Spende der Familie Vinik (L.G.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
