Summary
Pensel celler er sjeldne kolinerge chemosensory epitelceller funnet i naiv mus luftrøret. På grunn av sine begrensede tall, er ex vivo evaluering av deres funksjonelle rolle i luftveiene immunitet og remodeling utfordrende. Vi beskriver en metode for isolering av tracheal pensel celler ved flyt flowcytometri.
Abstract
Tracheal pensel celler er kolinerge chemosensory epitelceller klar til å overføre signaler fra luftveiene lumen til immun-og nervesystemet. De er en del av en familie av chemosensory epitelceller som inkluderer tuft celler i tarmslimhinnen, pensel celler i luftrøret, og ensom chemosensory og microvillous celler i neseslimhinnen. Chemosensory celler i forskjellige epitel rom dele nøkkel intracellulære markører og en kjerne transcriptional signatur, men også vise betydelige transcriptional heterogenitet, sannsynligvis reflektert i det lokale vevet miljøet. Isolering av tracheal pensel celler fra enkelt celle suspensjoner er nødvendig for å definere funksjonen til disse sjeldne epitelceller i detalj, men deres isolasjon er utfordrende, potensielt på grunn av tett samspill mellom tracheal pensel celler og nerve avslutninger eller på grunn av luftveis spesifikk sammensetning av stramme og adherens knutepunkter. Her beskriver vi en prosedyre for isolering av pensel celler fra mus tracheal epitel. Metoden er basert på en innledende separasjon av tracheal epitel fra submukosa, noe som åpner for en etterfølgende kortere inkubasjons av epitel arket med Papain. Denne prosedyren tilbyr en rask og praktisk løsning for flyt analytiske sortering og funksjonell analyse av levedyktige tracheal pensel celler.
Introduction
Brush celler tilhører en klasse av chemosensory epitelceller karakterisert ved uttrykk for bitter smak reseptorer og smaken reseptoren Transduction maskiner som finnes i smak knopp celler. I motsetning til smak knopp celler, er chemosensory epitelceller spredt i epitel overflater og er referert til som enslig chemosensory celler (SCCs) og microvillous celler i nese epitel1,2, pensel celler i luftrøret 3,4, og tuft celler i tarmen5,6. Epitelceller uttrykker bitter smak reseptorer og bitter smak Transduction maskiner er også funnet i urinrøret7,8 og hørbar tube9. Luftveis pensel celler har unike funksjoner i neurogenic og immun luftveis responser. De er acetylkolin-produserende chemosensory celler som fremkalle beskyttende åndedretts reflekser ved aktivering med bitre forbindelser og bakterielle metabolitter som quorum-sensing stoffer10. Luftveis pensel celler er også den dominerende luftveisepitel kilden til IL-25, som regulerer aeroallergen-elicited type 2 betennelse i luftveiene3.
Karakterisering av full transcriptome av nedre luftveis pensel celler og deres reaksjon på miljømessige stimuli er begrenset av deres lave tall i tracheal epitel og svært begrenset tall utover den store bronkiene10. Teknikker som brukes for isolering av chemosensory celler fra tarm epitel har ikke gitt proporsjonalt høye tall fra luftrøret, muligens på grunn av intime kontakter av tracheal pensel celler med nerve avslutninger10 eller andre vev-spesifikke faktorer i luftveiene mucosa som sammensetningen av adherens og tette veikryss proteiner. Nylige rapporter om vellykket isolering av tracheal pensel celler i høyere tall for enkelt celle RNA sekvensering analyse ansatt enten en 2 h inkubasjons med Papain eller en 18 h inkubasjons med pronase11,12. Siden lengre incubations med fordøyelsesenzymer kan redusere celle levedyktighet og endre transcriptional profil av celler fra fordøyd vev13, dette kan bias sammenlignende analyse med andre chemosensory epitel populasjoner.
Her rapporterer vi en metode for isolering av tracheal pensel celler for RNA sekvensering3. Behandling av luftrøret med høy dose dispase skiller epitel fra submukosa. Senere fordøyelse av epitel arket med Papain gir utmerket utvinning av denne strukturelle cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før du gjennomfører følgende eksperimenter, må du sørge for at alle dyr pleie bruk og protokoller er godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) og utført i samsvar med National Research Council ' s "guide for omsorg og bruk av Forsøksdyr " (8th Edition, 2011) og kommer retningslinjene. Alle prosedyrene som er beskrevet nedenfor, er gjennomgått og godkjent av den institusjonelle dyre omsorgen og bruks komitéen ved Brigham and Women ' s Hospital.
1. utarbeidelse av reagenser
- Forbered Dispase fordøyelse løsning, som er en PBS-løsning som inneholder 16 U/mL Dispase og 20 μg/mL DNase i. Sørg for at Dispase pulveret er fullstendig oppløst før oppvarmingen av oppløsningen i et vannbad ved 37 ° c.
- Tilsett 5% varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS) til Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) for å gjøre en stopp løsning.
- Klargjør Tyrode I buffer: tilsett 26 U/mL Papain (20 μL/mL av 48 U/mg Papain oppløsning) og 10 μL/mL L-cystein til HEPES-Tyrode buffer uten kalsium.
- Klargjør Tyrode II-buffer: Tilsett 2 μL/mL leupeptin (5 mg/mL) til HEPES-Tyrode buffer med kalsium.
- Klargjør FACS-buffer: Bruk Hanks ' balanserte salt løsning (HBSS) uten kalsium, magnesium & fenol rød, supplert med 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og tilsett 2% FBS.
2. Disseksjon av mus luftrør
Merk: Mus som brukes i denne protokollen er ChAT(BAC)-EGFP (B6. CG-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 måneders alder av begge kjønn. Minimer eksponeringen av vevet for å direkte lys for å redusere photobleaching av eGFP.
- Euthanize musen med 100 mg/kg pentobarbital dødshjelp løsning injisert intraperitonealt eller ved hjelp av standardprotokoller godkjent av IACUC.
- Fest musen på et kirurgisk bord i liggende posisjon med 21 G nåler med forlenget øvre og Nedre ekstremiteter. Spray pelsen med 70% EtOH å rense området.
- Ved hjelp av rett tang, løft huden og pelsen av magen og gjøre et snitt i sentrum med dissekere saks (rett saks, 3 cm). Bruk saksen til å skille huden fra under Huds vevet fra buken til mandibula. Mens du holder subkutan vev opp med tang, lage et lite snitt med saks i midten av bukveggen.
- Åpne peritoneum med et V-formet snitt. Bruke tang, forsiktig flytte tynntarmen til siden, finne abdominal aorta og vena cava og gjøre et snitt med dissekere saks for å muliggjøre rask exsanguination.
- Finn membranen. Ved hjelp av en 18 G nål, lage en åpning i membranen like under brystbenet for å tømme lungene. Forsiktig skille membranen fra rib bur ved hjelp av skarp-spiss rett dissekere saks for å kutte langs bunnen av ribbeina.
- Ved hjelp av tang, løft den eksponerte enden av brystbenet og skjær brystbenet lengderetningen fra bunnen av rib bur til halsen. Lag en sentral cervical snitt med korte rette saks (2 cm) og skille de to fliker av submandibular kjertel.
- Forsiktig fjerne omkringliggende bindevev og thymus overliggende de Carina med et par fine punkt høy presisjon tang.
- Analysere luftrøret fri først ved å skille den proksimale enden på nivået av epiglottis og deretter ved dissekere den flate enden på nivået av bifurkasjonen av luftrøret.
- Finn epiglottis og skjær luftrøret lengderetningen fra epiglottis til Carina.
3. tracheal epitel fordøyelse
- Plasser luftrøret i et 1,5 mL rør inneholdende 750 μL av forvarmet (til 37 ° c) dispase fordøyelse løsning. Ruge på en shaker ved 200 RPM for 40 min ved romtemperatur. Dekk røret med aluminiumsfolie for å redusere eksponeringen for direkte lys.
- Tilsett 750 μL av kald DMEM med 5% FBS for å stanse reaksjonen. Plasser på isen.
- Overfør luftrøret til en Petri parabol (100 mm x 15 mm) og plasser under et dissekere mikroskop. Orientere luftrøret med epitel siden vendt opp. Den lengderetningen dissekert luftrøret har en semi-sylindrisk form vedlikeholdes av cartilaginous ringene. Epitel er på den konkave overflaten.
- Feste epiglottis område av luftrøret med rett tang til Petri fatet og bruker en størrelse 22 en gangs skalpell, skrape epitel av luftrøret. Epitel laget skiller som et gjennomskinnelig ark.
- Hakke epitel med skalpell. Overfør epitel laget til et 2 mL rør.
- Skyll Petri fatet med 750 μL av Tyrode I buffer og Overfør til 2 mL rør som inneholder epitel laget.
- Ruge det tracheal epitel laget i Tyrode i buffer i 30 min ved 37 ° c på en shaker ved 200 rpm. Dekk røret med aluminiumsfolie for å redusere eksponeringen for direkte lys.
- Tilsett 750 μL av kald Tyrode II-buffer. Vortex det fordøyd vevet kraftig for 20-30 s. Triturate homogenate med en sprøyte festet til en 18 G nål 10 ganger. Bytt til en 21 G måle nål og triturate 10-20 flere ganger.
- Filtrer cellene gjennom en 100 μm sil til et 50 mL konisk rør. Legg 30:1 Vol/Vol av kaldt FACS buffer.
- Snurr på 350 x g i 10 min ved 4 ° c og kast supernatanten. Resuspend pellet i kaldt FACS buffer og overføre suspensjonen til en 12 mm x 75 mm (5 mL) polystyren tube. Spinn igjen ved 350 x g i 10 min ved 4 ° c og kast supernatanten.
- Re-suspendere pellet i 100 μL av FACS buffer.
- Tilsett 1 μL av anti-mus CD16/32 blokkerende antistoff for å blokkere ikke-spesifikk binding og ruge i 15 minutter på is. Må ikke vaskes.
- Legg til følgende antistoffer og de respektive isotype kontrollene: Pacific blå anti-mus CD45 eller rotte IgG2a, k (0,25 μg/106 celler i 100 μL volum) og ALLOFYKOCYANIN (APC) anti-mus EpCAM eller rotte IgG2b, k (0,5 μg/106 celler i 100 μL volum) monoklonale antistoffer. Ruge for 45 min på isen beskyttet mot direkte lys. Tilsett 4,5 mL kaldt FACS buffer, bland og snurr ved 350 x g i 10 min ved 4 ° c. Kast FACS buffer og re-suspendere pellet i 300 av kaldt FACS buffer.
- Legg til propidium iodide (PI) (5 μg/mL) umiddelbart før flyt analytiske sortering.
Merk: Pensel celler har en uregelmessig form med flere prosesser som potensielt kan øke deres tilslutning til filtre (Figur 3C). Vi sammenlignet 30 mm til 70 mm og 100 mm filtre og fant at større pore filtre sikret bedre avkastning. I tillegg, grundig trituration av celle suspensjonen etter Papain fordøyelsen forbedrer betydelig pensel celle gir. Vi anbefaler å bruke en 18G nål for innledende trituration etterfulgt av en mindre bore (21 eller 23 G nål) for finere dissosiasjon av celler.
4. Flow flowcytometri gating strategi
- Identifiser celler fra rusk ved forover og side scatter vinkel. Utelat doublets ved hjelp av sprednings høyde og-bredde og sidehøyde og-bredde i fremover. Doublets vil være celler med høy bredde verdier.
- I enkeltcellene identifiserer du de aktive cellene som er PI-negative.
- Innenfor levende enkeltceller, identifisere CD45 lav til negative celler basert på isotype kontroll.
- Innenfor CD45 lave/negative celler, identifisere EpCAM positive celler som også er eGFP positive (i FITC kanal). Dette er populasjonen av pensel celler (figur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne prosedyren er implementert for å isolere tracheal pensel celler for RNA-sekvensering3. Etter isolering av luftrøret og fordøyelsen av vevet med en 2-trinns protokoll (figur 1), ble celler samlet og farget med fluorescensmerkete-merket CD45 og EpCAM etter utelukkelse av døde celler med PI. Etter gating ut doublets basert på fremover og side scatter egenskaper, definerte vi pensel celler som lav/negativ for CD45, positiv for EpCAM og positiv for eGFP (figur 2A). Pensel celler representerte ~ 0.16-0.42% av CD45lav/neg -celler ved flyt flowcytometri og utgjorde 250-600 celler per luftrør (figur 2B). Vi sammenlignet disse teller til et anslag over antall ChAT-eGFP positive celler i hele tracheal mounts fra ChAT(BAC)-eGFP mus basert på vår publisert omfattende immunohistological evaluering av tracheal pensel celler3 og illustrert her ( Figur 3). Våre tidligere studier av tracheal pensel celler i vill type, ChAT(BAC)-eGFP mus og Il25F25/F25 mus foreslo at kolinerge pensel celler er 90% overlappende med DCLK1+ og Il25+ celler og konto for 600-1000 pensel celler per luftrør3. Spesielt er dette tallet lavere enn antall kolinerge pensel celler rapportert av andre grupper10. Ettersom chemosensory celle tall endres ved eksponering for mikrobielle metabolitter og protozoer5,14, kan disse tallene gjenspeile en variasjon i interinstitutional bakterieflora. Derfor foreslår vi at du beregner antall pensel celler ved å fluorescens mikroskopi for å måle det forventede antallet isolerte pensel celler ved å strømme analytiske sortering.
Mens etablere vår protokoll, forsøkte vi flere tidligere publiserte metoder for isolering av chemosensory celler (Figur 4). Når vi inkubert hakket luftrør med 650 U/mL kollagenase IV og 1,84 U/mL dispase supplert med DNase I for 45 min, en kombinasjon som ofte brukes for å få en enkelt celle suspensjoner fra lunge homogenater15, oppnådde vi en enkelt celle suspensjon av epitelceller, men vi utvinnes bare noen få pensel celler (Figur 4A). Tuft celler i tarmen har blitt isolert ved hjelp 2,5 mM EDTA og 0,75 mM Dithiotreitol (DTT) med DNase I 20 min å løsne epitelceller etterfulgt av fordøyelsen av de frigitte epitelceller med 0,01 U/mL dispase med DNaseI i 10 min 6. i våre hender, ved hjelp av denne prosedyren også ført til suboptimal tracheal pensel celle utvinning (Figur 4B). En protokoll for vellykket isolering av tracheal pensel celler for RNA-analyse ble beskrevet av Krasteva et al.10. Etter denne protokollen, inkubert vi hakket luftrør med 35 U/mL Papain i Tyrode buffer for 45 min og ikke oppnå god pensel celle utvinning (Figur 4C). Rock et al. beskrev en metode for fordøyelsen av tracheal epitel for basalcelle isolasjon med to trinn: separasjon av epitel fra mesenchymal lag med høy dose dispase (16 U/mL) ved romtemperatur etterfulgt av inkubasjons av strippet epitel med 0,1% Trypsin og 1,6 mM EDTA for 30 min ved 37 ° c16. Etter disse trinnene førte til en bedre utvinning av pensel celler, men tallene oppnådd per mus var utilstrekkelig for i dybden funksjonelle analyser (Figur 4D). For å optimalisere protokollen, bestemte vi oss for å kombinere de to siste tilnærmingene. Ved å separere tracheal epitel med høy dose dispase, har vi som mål å gi bedre tilgang til Papain å tracheal pensel celler. Således, ved hjelp av 16 U/mL av dispase ved romtemperatur på hele luftrøret for å skille epitel og påfølgende inkubasjons av epitel med 26 U/mL Papain i Tyrode buffer førte til den beste børsten celle utvinning (Figur 4E).
Figur 1 : Skjema over foreslåtte trinn for isolering av tracheal pensel celler. Protokollen inneholder to viktige trinn: etter disseksjon, er hele luftrøret inkubert i en høy dose dispase løsning for å skille epitel; Dette etterfølges av fordøyelsen av epitel arket med Papain i kalsium inneholdende Tyrode buffer (Tyrode I) og antistoff farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representative Flow flowcytometri analyse av tracheal pensel celler. (A). skjematisk representasjon av strømnings flowcytometri gating strategi. Enkeltceller var gated basert på deres fremover og side scatter egenskaper og levende celler ble valgt basert på utelukkelse av Propidium iodide. CD45 lav/negative celler ble valgt basert på isotype kontroll og evalueres for deres uttrykk for EpCAM. EpCAM positive celler ble betraktet som pensel celler hvis de uttrykte eGFP fluorescerende i FITC kanalen. (B). antall kolinerge tracheal pensel celler per mus luftrør og frekvens presentert som prosent av alle CD45lav/- celler og som en prosent av CD45lav/-EpCAM+ celler. Hver prikk representerer en egen mus. Data er fra 3 separate eksperimenter med 2-3 mus hver. (C). fravær av eGFP positive pensel celler i en tracheal epitel fordøye fra en vill type mus BEISET for CD45 og EpCAM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Hele montere av musen luftrøret av en ChAT(BAC)-eGFP mus. Luftrøret ble åpnet lengderetningen og beiset med anti-GFP antistoff å forsterke eGFP grønne fluorescens signal. (A) hele tracheal Mount av ChAT(BAC)-eGFP mus, intenst grønne fluorescerende celler representerer pensel celler; skala bar 1 mm; (B) hele tracheal Mount av en vill type mus demonstrere fravær av pensel celler; Skala bar = 1 mm; (C) forstørrelse av epitel laget demonstrere uregelmessig formede pensel celler (grønne celler) som brønner som en kolinerge nerve ending (pil); (D) hele tracheal montere av et luftrør av en ChAT(BAC)-eGFP avbildet for GFP uten antistoff-forbedring av fluorescens signalet; (E) tverrsnitt av en parafin-embedded mus luftrøret av en ChAT(BAC)-eGFP mus BEISET med anti-GFP (grønn) eller GEIT IgG kontroll og DAPI (blå); Vektstenger = 20 μm (C-E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Sammenligning av ulike tracheal fordøyelsen protokoller. (A) luftrøret var hakket og inkubert med 650 u/ml kollagenase IV og 1,84 U/ml dispase supplert med DNase i for 45 min. Dette eksperimentet ble gjentatt 2 ganger. (B) hele luftrøret ble inkubert med 2,5 mm EDTA og 0,75 mm DTT supplert med DNase jeg i 20 min; epitelceller ble forskyves og videre fordøyd med 0,01 U/mL dispase og DNase jeg i 10 min. Dette eksperimentet ble gjentatt 2 ganger. (C) luftrøret var hakket og inkubert med 35 U/ml av Papain I Tyrode jeg buffer for 45 min; gjenværende Papain aktivitet ble hemmet av leupeptin. Dette eksperimentet ble utført én gang. (D) hele luftrøret ble inkubert med høy dose dispase (16 U/ml) i 30 min for å skille epitel arket, etterfulgt av inkubasjons av epitel arket med 0,1% trypsin og 1,6 mm EDTA i 30 min. Dette eksperimentet ble gjentatt 2 ganger. (E). hele luftrøret ble inkubert med høy dose dispase (16 U/ml) i 30 min etterfulgt av fordøyelsen av epitel arket med 26 U/ml Papain i Tyrode buffer i 30 min. Den resterende Papain aktiviteten ble hemmet med leupeptin og høy volum fortynning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi fant at en kombinasjon av høy dose dispase behandling for 40 min etterfulgt av en kort Papain behandling (30 min) gir en optimal protokoll for tracheal fordøyelsen og pensel celle isolasjon. Denne kombinasjonen unngår omfattende fordøyelsen og gir den høyeste avkastningen av pensel celler, sammenlignet med alternative protokoller.
Mens lunge fordøyelsen å trekke blodkreft celler har klassisk lettelse på milde fordøyelsesenzymer som kollagenase IV15, isolasjon av epitelceller krever mer komplekse protokoller. Enkelt celle suspensjoner av epitelceller er vanskeligere å oppnå på grunn av den stramme og adherens veikryss bindende dem til hverandre og kjelleren membran og på grunn av skrøpelighet av cellene selv. De fleste protokollene for epitel celle fordøyelsen innebære to trinn-et første skritt er separasjon av epitel fra kjelleren membranen etterfulgt av påfølgende skritt for å forstyrre de stramme veikryss og desmosomes som overholder epitelceller til hverandre 16 flere , 17av dem.
Flere grupper har lykkes isolert chemosensory tuft celler fra tarmen ved hjelp av ulike modifikasjoner av en 2-trinns protokoll for isolering av epitelceller: det første trinnet bruker EDTA og DTT å løslate epitelceller fra submukosa etterfulgt av fordøyelsen av epitel ark med dispase. Howitt et al. brukte en blanding av 5 mM EDTA + 1 mM DTT etterfulgt av fordøyelsen med 0,5 enheter/mL Dispase II og DNase14. Gerbe et al. brukt høy konsentrasjon 30 mM EDTA alene å skille epitel fraksjon og senere inkubert med dispase supplert med DNaseI18. Von Moltke et al. brukt 2,5 mM EDTA, 0,75 mM DTT og DNaseI etterfulgt av dispase fordøyelse6. Vi fant at disse teknikkene tillater isolering av levedyktige epitelceller i luftrøret, men prosent av tracheal pensel celler var ekstremt lav (Figur 4B) og ikke i samsvar med vår forventning om isolering av 600-800 pensel celler per luftrøret basert på vår histologi evaluering.
Tracheal epitel celle isolasjons protokoller har blitt utviklet av flere grupper for å studere basal epitelceller. De store forskjellene mellom disse protokollene og de som er ansatt i tarmen er i sekvensen av fordøyelsesenzymer. Det første trinnet er separasjon av tracheal epitel gjennom inkubasjons med en høy konsentrasjon av dispase (16 U/mL) ved romtemperatur16. Dette gjør at epitel å skille som et enkelt ark fra mesenchymal lag19. Påfølgende behandling av tracheal epitel bruker en kombinasjon av Trypsin og EDTA, en av de mest brukte enzymatisk metoder for celle avløsning, for å oppnå en enkelt celle suspensjon. Trypsin kløyver peptider på C-terminal side av lysin og arginin aminosyrer rester, mens EDTA brukes som en kalsium chelator for celle-celle og celle-matrise interaksjoner20. Ved hjelp av denne teknikken, rock et al. har vært vellykket i utvinne basal epitelceller for transcriptional profilering16. En lignende protokoll ble nylig brukt til å isolere bitter smak reseptor uttrykke celler fra en Tas2r143-CreERT2 drevet eGFP reporter og B6. Il25Flare25/Flare25 for RNA sekvensering studier5,8. I vår erfaring, fordøyelse av epitel ark med Trypsin og EDTA førte til utmerket epitel celle utvinning, men utilstrekkelig antall kolinerge tracheal pensel celler for funksjonell eller transcriptional analyse med mindre flere mus ble gruppert for hver prøven (Figur 4C).
Papain er en potent endolytic plante cystein protease avledet fra Papaya latex, og det er kjent for å holde peptid obligasjoner som involverer grunnleggende aminosyrer, spesielt arginine, lysin og rester etter fenylalanin21. Tracheal pensel celle isolasjon ved hjelp av Papain fra ChAT(BAC)-eGFP mus ble først rapportert av Krasteva et al10. Papain fordøyelsen ble også nylig brukt til å distansere luftveisepitel celler for enkelt celle RNA sekvensering der pensel/tuft celler omfattet en liten brøkdel av epitelceller11. Papain er også den mest brukte enzymet for fordøyelsen av hjernevevet for isolering av levedyktige neurons22. Dissosiasjon av hjernevevet med Papain i 30 min resulterer i markant høyere avkastning, neuronal overlevelse og integritet sammenlignet med Trypsin fordøyelse23. Siden noen pensel celler er tett sammenvevd med nerve avslutninger3,10, bruk av Papain kan være avgjørende for den vellykkede kløften av pensel celle veikryss til neurons. Vi fant imidlertid at en 45 min fordøyelse med Papain ved en konsentrasjon på 35-40 U/mL dramatisk redusert epitel celle levedyktighet, fører til lav pensel celle utvinning (Figur 4D).
Vi brukte 3 metoder for å redusere Papain toksisitet og øke vår mobilnettet gir. Først ved å skille epitel arket med dispase, reduserte vi den påfølgende inkubasjonstiden av Papain fra 45 til 30 min. For det andre har vi umiddelbart hemmet den Papain aktiviteten med leupeptin, en hemmer av cystein proteaser24. Spesielt er leupeptin svært ustabil ved 4 ° c og bør være aliquoted og frosset ved-20 ° c. Tredje, fant vi at fortynning av enzymatisk fordøyd vev i et stort volum av kulde PBS bidrar også til å bevare levedyktigheten til fordøyd celler. Et annet skritt som er avgjørende for å øke celle rentene er strenge trituration10. Siden forlenget virvlingen kan også redusere levedyktighet, vi delvis erstattet den med trituration. Vi anbefaler trituration med en 18G nål for å distansere større cellulære klumper etterfulgt av ekstra trituration med en 21 G nål. Til slutt, vi grunnlegge det eGFP er høylig lyset følsom og sikringen fra direkte lyset avsøring for alle steg er hjelpsom. Disse endringene er tillatt for robust gjenvinning av levedyktige tracheal pensel celler (Figur 4E).
De store begrensningene i protokollen foreslått her er 2-trinns prosedyre og bruk av Papain, en potent cystein protease. Noen grupper har nylig erstattet liberase for dispase5 når isolere chemosensory celler. Videre ble liberase fordøyelse nylig brukt til å isolere chemosensory (pensel) epitelceller fra nasal polypper25,26. Vi har ikke direkte sammenlignet liberase fordøyelsen til våre to-trinns dispase/Papain fordøyelsen protokollen. Papain er en potent cystein protease som kan aktivere protease aktivert reseptor PAR2 på epitelceller27 fører til aktivering av pensel celler selv eller til generering av meglere av andre respiratoriske celler som kan i sin tur aktivere pensel celler. Endelig kan Papain modulere reseptor uttrykk gjennom kløften av overflaten reseptorer gjør det vanskelig å validere pensel celle reseptor uttrykk ved flyt flowcytometri28,29.
Oppsummert gir vi en protokoll for isolering av tracheal kolinerge pensel celler fra ChAT-eGFP reporter mus som gjør det mulig for robust utvinning av levedyktige tracheal pensel celler. Denne protokollen har blitt brukt for isolasjon og transcriptional analyse av pensel celler ved RNA sekvensering3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Adam Chicoine ved Brigham og Women ' s Human immunologi Center Flow Core for hans hjelp med flyt analytiske sortering. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), og K08 AI132723 (L. G. B), og ved American Academy av allergi, astma, og immunologi (AAAAI)/American lunge allergisk Åndedretts sykdom Award (N.A.B.), av AAAAI Foundation fakultet Development Award (L.G.B.), av Steven og Judy Kaye Young innovatører Award (N.A.B.), av Joycelyn C. Austen Fund for karriereutvikling av kvinner lege forskere (L.G.B.), og av en sjenerøs donasjon av Vinik familien (L.G.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
