Summary
Fırça hücreleri naif fare trakea bulunan nadir kolinerjik kemoduyusal epitelyal hücrelerdir. Sınırlı sayılar nedeniyle, havayolu bağışıklık ve remodeling fonksiyonel rolünün ex vivo değerlendirilmesi zordur. Trakeal fırça hücrelerinin Akış sitometrisi ile yalıtımına yönelik bir yöntem tarif ediyoruz.
Abstract
Trakeal fırça hücreleri, hava yolu lümeninden bağışıklık ve sinir sistemlerine sinyal iletimi için uygulanan kolinerjik kemoduyusal epitelyal hücrelerdir. Onlar bağırsak mukozasında tutam hücreleri, trakea fırça hücreleri ve burun mukozasında soliter kemoduyusal ve mikrovillöz hücreler içeren kemoduyusal epitelyal hücreler ailesinin bir parçasıdır. Farklı epitelyal bölmeler içindeki kemoduyusal hücreler anahtar hücre içi işaretçileri ve çekirdek transkripsiyonel imzayı paylaşır, aynı zamanda önemli transkripsiyonel heterojenliği de gösterir, muhtemelen yerel doku ortamını yansıtırlar. Tek hücreli süspansiyonların trakeal fırça hücrelerinin yalıtımı ayrıntılı olarak bu nadir epitelyal hücrelerin fonksiyonunu tanımlamak için gereklidir, ama onların yalıtım zorlu, potansiyel trakeal fırça hücreleri ve sinir uçları arasındaki yakın etkileşimi nedeniyle veya sıkı ve yapışır kavşak hava yolu özgü bileşimi nedeniyle. Burada, fare trakeal epitelyumdan fırça hücrelerinin yalıtımına yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. Yöntem, submukoza gelen trakeal epitel ilk ayrımı dayanmaktadır, papain ile epitelyal levha bir sonraki kısa kuluçarı için izin. Bu prosedür, akış cytometrik sıralama ve uygulanabilir trakeal fırça hücrelerinin fonksiyonel analizi için hızlı ve kullanışlı bir çözüm sunar.
Introduction
Fırça hücreleri, acı tat reseptörlerinin ifadesi ve tat tomurcuğu hücrelerinde bulunan tat reseptörü dönüştürücü makinelerinin karakterize olduğu kemoduyusal epitelyal hücreler sınıfına aittir. Tat tomurcuk hücrelerinin aksine, kemoduyu epitelyal hücreler epitelyal yüzeylerde dağılmış ve burun epiteli hücreler (SCCS) ve microvillous hücreleri olarak adlandırılır1,2, trakea fırça hücreleri 3,4, ve tüft hücreler bağırsak5,6. Acı tat reseptörleri ve acı tat dönüştürücü makine ifade epitelyal hücreler de üretra7,8 ve işitsel tüp9bulunur. Hava yolu fırça hücreleri nörojenik ve bağışıklık havayolu yanıtlarında benzersiz işlevlere sahiptir. Onlar asetilkolin üreten kemoduyusal hücreler, acı bileşikler ve çekirdek algılama maddeleri gibi bakteriyel metabolitler ile aktivasyon üzerine koruyucu solunum refleksleri uyandıran10. Havayolu fırça hücreleri de Il-25 baskın hava yolu epitelyal kaynağıdır, hangi hava yolları3aeroallerjen-elicited tip 2 inflamasyon düzenler.
Alt hava yolu fırça hücrelerinin tam transkriptom karakterizasyonu ve çevresel uyaranlara yanıt onların düşük sayılar trakeal epitelyum ve büyük bronşi10ötesinde çok sınırlı sayıda ile sınırlıdır. Bağırsak epitelinin kemoduyusal hücrelerin izolasyonunda kullanılan teknikler, trakea 'dan orantılı olarak yüksek sayılar vermedi, muhtemelen sinir uçları ile trakeal fırça hücrelerinin samimi temasları nedeniyle10 veya diğer yapışkanslar ve sıkı kavşak proteinlerinin bileşimi gibi solunum mukozasında dokuya özgü faktörler. Tek hücreli RNA sıralama analizi için daha yüksek sayılarda trakeal fırça hücrelerinin başarılı bir şekilde yalıtılmasının son raporları, papain ile 2 h inkübasyon ya da pronase11,12ile 18 h inkübasyon kullanılmıştır. Sindirim enzimleri ile uzun kuluzlar hücre canlılığı azaltabilir ve sindirilmiş dokulardan hücrelerin transkripsiyonel profilini değiştirmek beri13, bu diğer chemosensory epitelyal nüfusu ile önyargı karşılaştırmalı analiz olabilir.
Burada, RNA sıralaması3için trakeal fırça hücrelerinin yalıtımına yönelik bir yöntem bildiriyoruz. Yüksek doz dispaz ile trakea tedavisi submukoza epitel ayırır. Papain ile epitelyal sac sonraki sindirim Bu yapısal hücrenin mükemmel iyileşme sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki denemeleri yapmadan önce, tüm hayvan bakım kullanımı ve protokollerinin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (IAUC) tarafından onaylanması ve Ulusal Araştırma Konseyi 'nin "bakım ve Kullanım Kılavuzu "ile uyumlu olarak gerçekleştirildiğinden emin olun. Lab Animals " (8 . sürüm, 2011) ve gelmesi yönergeleri. Aşağıda açıklanan tüm prosedürler Brigham ve kadın Hastanesi 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından incelenip onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
- 16 U/mL dispaz ve 20 μg/mL DNase ı içeren bir PBS çözeltisi olan Dispase sindirim çözümünü hazırlayın. 37 °C ' de bir su banyosundan solüsyonu ısınmadan önce dispaz tozunun tamamen çözünmesini sağlayın.
- Bir durdurma çözüm yapmak için Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) için% 5 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
- Tyrode ı tamponunu hazırlayın: 26 U/mL papain (20 μL/mL 48 U/mg papain çözeltisi) ve 10 μL/mL L-sistein ile HEPES-Tyrode ' n e s tamponunu kalsiyum olmadan ekleyin.
- Tyrode II tamponunu hazırlayın: 2 μL/mL leupeptin (5 mg/mL) ile HEPES-Tyrode ' l e m tamponunu kalsiyum ile ekleyin.
- FACS buffer hazırlayın: Hanks ' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) kalsiyum olmadan kullanın, magnezyum & fenol kırmızı, 2 mM Etilen ile tamamlayıcı diaminetetraasetic asit (EDTA) ve ekleyin 2% FBS.
2. fare trakea diseksiyon
Not: Bu protokolde kullanılan fareler sohbet(BAC)-EGFP (B6. CG-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 ay yaş her iki cinsiyeler. EGFP fotobleaching azaltmak için doğrudan ışık doku pozlama minimize.
- 100 mg/kg pentobarbital ötenazi çözeltisi intraperitoneal enjekte veya ıasuc tarafından onaylanan standart protokolleri kullanarak fareyi ötenize.
- Genişletilmiş üst ve alt ekstremite ile 21 G iğneler ile fitil pozisyonunda bir cerrahi tahta üzerinde fareyi düzeltin. Alanı sterilize etmek için% 70 EtOH ile kürk sprey.
- Düz forseps kullanarak, karın cilt ve kürk kaldırın ve Diseksiyon makas (düz makas, 3 cm) ile merkezinde bir kesi yapmak. Makası kullanarak, cildin subkutan dokusundan mandibula için karından ayırın. Subkutan dokusu forseps ile tutarak, karın duvarının merkezinde makas ile küçük bir kesi yapın.
- Peritonumu V şeklinde bir kesi ile açın. Forseps kullanarak, yavaşça kenara ince bağırsak hareket, abdominal aort ve Vena Cava bulmak ve hızlı Exsanguination için izin Diseksiyon makas ile bir kesi yapmak.
- Diyaframı bulun. 18 G iğne kullanarak, akciğerleri saptırmak için sternum hemen altında diyaframda bir açılış yapın. Kaburgaların tabanı boyunca kesim yapmak için keskin sivri düz kesimli makas kullanarak diyaframı dikkatli bir şekilde kaburga kafesinden ayırın.
- Forseps kullanarak, sternum maruz sonu kaldırın ve boynunda kaburga kafesi tabanına boyuna sternum kesti. Kısa düz makas (2 cm) ile merkezi bir servikal kesi yapın ve submandibular bezin iki lobları ayırın.
- Dikkatle çevreleyen bağ dokusu ve ince nokta yüksek hassasiyetli forseps bir çift ile Carina üzerinde timus çıkarın.
- İlk olarak epiglot seviyesinde proksimal ucunu ayırarak ve sonra distal ucunu trakea bifurkasyonu seviyesinde keserek trakea 'yı serbest bırakmak.
- Epiglot 'i bulun ve epiglot 'ten Carina 'ya kadar uzunlamasına trakea 'ya kesin.
3. trakeal epitelyal sindirim
- Trakea 'yi 750 μL ön ısıtılmış (37 °C) dispaz sindirim solüsyonu içeren 1,5 mL 'Lik bir tüpe yerleştirin. Oda sıcaklığında 40 dakika için 200 rpm de bir shaker üzerinde inkübe. Doğrudan ışığa maruz kalma azaltmak için alüminyum folyo ile tüp kapak.
- Reaksiyon durdurmak için% 5 FBS ile soğuk DMEM 750 μL ekleyin. Buzun üzerine yerleştirin.
- Trakea 'ya bir petri tabağı (100 mm x 15 mm) aktarın ve Diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Epitel tarafı yukarı bakacak şekilde trakea yönlendirmek. Uzunlamasına disseke trakea, kıkırdak halkalar tarafından tutulan yarı silindirik bir şekle sahiptir. Epitelyum konkav yüzeyinde.
- Epiglot alan trakea düz forseps ile Petri tabak ve bir boyutu 22 tek kullanımlık neşter kullanarak, trakea dan epitelyum kazımak. Epitelyal tabaka yarı saydam bir sac olarak ayrılır.
- Epitel, neşter ile Mince. Epitelyal tabakası 2 mL tüpüne aktarın.
- Petri tabağı ile durulayın 750 μL Tyrode ı tampon ve Transfer 2 mL tüp içeren epitelyal tabaka.
- Tyrode ı tamponunda trakeal epitel tabakasını 37 °C ' de 200 rpm 'de bir shaker üzerinde 30 dakika boyunca inküd. Doğrudan ışığa maruz kalma azaltmak için alüminyum folyo ile tüp kapak.
- 750 μL soğuk Tyrode II tampon ekleyin. 20-30 için şiddetle sindirilmiş doku Vortex s. 18 G iğne 10 kez bağlı bir şırınga ile Homojenat Triturate. 21 G Gauge iğne ve triturate 10-20 daha fazla kez geçin.
- 100 μm süzgeciyle hücreleri 50 mL konik tüpüne filtreleyin. Soğuk FACS tampon 30:1 vol/Vol ekleyin.
- 4 °C ' de 10 dakika için 350 x g 'de spin ve supernatant atın. Soğuk FACS tampon içinde Pelet resuspend ve 12 mm x 75 mm (5 mL) polistiren tüp süspansiyon transfer. 4 °C ' de 10 dakika için 350 x g 'de tekrar Döndür ve supernatant atın.
- 100 μL FACS arabelleğinde Pelet yeniden askıya alın.
- Özel olmayan bağlayıcılığı engellemek için 1 μL Anti-fare CD16/32 engelleme antikor ekleyin ve buzda 15 dakika boyunca inküye yapın. Yıkanmayın.
- Aşağıdaki antikorları ve ilgili izotype denetimlerini ekleyin: Pasifik mavisi Anti-fare CD45 veya sıçan IgG2a, k (0,25 μg/106 hücreler 100 μL hacimde) ve allofikosiyanin (APC) fare karşıtı EpCAM veya sıçan IgG2b, k (0,5 μg/106 hücreler, 100 μL hacminde) monoklonal antikorlar. Doğrudan ışıkta korunan buz üzerinde 45 dk için inküye yapın. 350 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika soğuk FACS tampon, mix ve spin 4,5 ml ekleyin. FACS arabelleği atın ve 300 μL soğuk FACS tampon içinde Pelet yeniden askıya.
- Akış cytometrik sıralamadan hemen önce propidium iyodür (PI) (5 μg/ml) ekleyin.
Not: Fırça hücrelerinin, filtrelere uyumu artırabilir (Şekil 3C) çeşitli süreçlerle düzensiz bir şekli vardır. 30 mm ile 70 mm ve 100 mm filtrelere kıyasla daha büyük gözenek filtreleri daha iyi verim sağladı. Buna ek olarak, papain sindirimi sonrasında hücre süspansiyonunun kapsamlı triturasyonu fırça hücresi verimleri önemli ölçüde geliştirir. Hücrelerin daha ince bir şekilde dağılması için daha küçük bir delik (21 veya 23 G iğne) tarafından izlenen ilk triturasyon için 18G iğne kullanmanızı öneririz.
4. akış cytometry gating stratejisi
- İleri ve yan dağılım açısı ile enkaz hücreleri tanımlayın. İleri dağılım yüksekliği ve genişliği ve yan dağılım yüksekliği ve genişliğini kullanarak ceketleri hariç. Ceketleri yüksek genişlik değerlerine sahip hücreler olacaktır.
- Tek hücreler içinde, canlı hücreleri PI negatif olan nüfus olarak tanımlayın.
- Canlı tek hücreler içinde CD45 düşük negatif hücrelere izotype denetimine göre tanımlayın.
- CD45 düşük/negatif hücreler içinde de eGFP pozitif olan EpCAM pozitif hücreleri tanımlayın (FITC kanalında). Bu fırça hücrelerinin nüfusu (Şekil 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yordam, RNA sıralama3için trakeal fırça hücrelerini yalıtmak için başarıyla uygulandı. 2 adımlı protokol (Şekil 1) ile doku trakea ve sindirim yalıtım sonra, hücreler toplanan ve PI ile ölü hücrelerin dışlama sonra floresan etiketli CD45 ve EpCAM ile lekelenmiş. İleri ve yan dağılım özelliklerine dayanarak ceketleri dışarı gating sonra, biz CD45 için düşük/negatif olarak fırça hücreleri tanımlanan, EpCAM için pozitif ve EGFP için pozitif (Şekil 2A). Fırça hücreleri temsil ~ 0.16-0.42% CD45düşük/neg hücreleri akış sitometri tarafından ve için muhasebesi 250-600 trakea başına hücreler (Şekil 2B). Biz sohbet(BAC)tüm trakeal bağlar içinde sohbet-EGFP pozitif hücrelerin sayısı bir tahmin bu sayıları karşılaştırıldı-EGFP fareler trakeal fırça hücreleri3 bizim yayınlanan geniş immünhistolojik değerlendirme dayalı ve burada resimli ( Şekil 3). Vahşi tip trakeal fırça hücrelerinin önceki çalışmalar, sohbet(BAC)-EGFP fareler ve Il25F25/F25 fareler kolinerjik fırça HÜCRELERIN% 90 DCLK1+ ve Il25+ hücreler ve hesap ile örtüşen olduğunu önerdi 600-1000 için trakhea başına fırça hücreleri3. Özellikle, bu sayı diğer gruplar tarafından bildirilen kolinerjik fırça hücrelerinin sayısından daha düşüktür10. Chemosensory hücre numaraları mikrobiyal metabolitleri ve protozoa5,14maruz tarafından değiştirilmiş gibi, bu sayılar interkurumsal microbiota bir değişkenlik yansıtabilir. Bu nedenle, akış cytometrik sıralama ile izole fırça hücrelerinin beklenen sayısını ölçmek için floresan mikroskopisi tarafından fırça hücrelerinin sayısını tahmin öneririz.
Protokollerimizi oluştururken, daha önce yayınlanmış birkaç kemoduyusal hücre yalıtımı yöntemi denenir (Şekil 4). Biz 650 u/ml kolajenaz IV ile kıyılmış trakea ve 1,84 u/ml dispase ile DNase ı için 45 dk, sıklıkla akciğer homojenatlar tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için kullanılan bir kombinasyon ile takviye inküserli15, biz tek bir hücre süspansiyon elde epitelyal hücreler, ancak sadece birkaç fırça hücreleri (Şekil 4A) kurtarıldı. Bağırsak içinde Tuft hücreleri başarıyla 2,5 mM EDTA ve 0,75 mM dithiothreitol (DTT) ile DNase ı 20 dk ile yayımlanan epitelyal hücrelerin sindirim tarafından izlenen epitel hücreleri ortadan kaldırmak için kullanılarak izole edilmiştir 0,01 U/mL dispase ile 10 dakika için DNaseI 6. bizim elimizde, bu prosedürü kullanarak da suboptimal trakeal fırça hücre kurtarma yol açtı (Şekil 4B). RNA analizi için trakeal fırça hücrelerinin başarılı izolasyonu için bir protokol Krasteva ve ark.10tarafından tanımlanmıştır. Bu protokol sonrasında, 45 dk için Tyrode tampon içinde 35 U/mL papain ile kıyılmış trakea inkük ve iyi bir fırça hücresi kurtarma (Şekil 4C) elde etmedi. Kaya ve ark. iki adım ile bazal hücre yalıtım için trakeal epitel sindirim bir yöntem açıklanmıştır: yüksek doz dispaz ile mezenkimal tabakadan epitelin ayrılması (16 U/mL) Oda sıcaklığında, sonra çıkartılmış epitelin kuluçka 37 °C16' da 30 dakika boyunca% 0,1 tripsin ve 1,6 mm EDTA ile. Bu adımların ardından fırça hücrelerinin daha iyi kurtarılması sağlandı, ancak fare başına elde edilen sayılar derinlemesine fonksiyonel analizler için yetersiz (Şekil 4D). Protokolü optimize etmek için son iki yaklaşımı birleştirmeye karar verdik. Yüksek doz dispaz ile trakeal epitel ayırarak, biz trakeal fırça hücreleri papain daha iyi erişim için izin hedefliyoruz. Böylece, 16 U/mL kullanarak tüm trakea üzerinde oda sıcaklığında dispase epitel ayırmak ve epitel sonraki inkübasyon ile 26 U/mL Tyrode tampon içinde papain en iyi fırça hücresi kurtarma yol açtı (Şekil 4E).
Şekil 1 : Trakeal fırça hücrelerinin yalıtımına yönelik önerilen adımların şeması. Protokol 2 ana adım içerir: diseksiyon sonrası, tüm trakea epitel ayırmak için yüksek doz dispaz çözeltisi içinde inkübe; Bu Tyrode tampon içeren kalsiyum papain ile epitelyal levha sindirimi takip edilir (Tyrode ı) ve antikor boyama. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Trakeal fırça hücrelerinin temsilci akış sitometri Analizi. (A). akış sitometri gating stratejisinin şematik gösterimi. Tek hücreler, ileri ve yan dağılım özelliklerine bağlı olarak Gated ve canlı hücreler Propidium Iodide dışlama dayalı seçildi. CD45 düşük/negatif hücreler izotip kontrolüne dayalı olarak seçildi ve EpCAM 'in ifadesi için değerlendirildi. EpCAM pozitif hücreler FITC kanalında eGFP floresan ifade ederse fırça hücreleri olarak kabul edildi. (B). fare trakea ve frekans başına kolinerjik trakeal fırça hücrelerinin sayısı tüm CD45düşük/ hücreler yüzde olarak ve CD45düşük/-EpCAM+ hücrelerin yüzdesi olarak sundu. Her nokta ayrı bir fareyi temsil eder. Veriler her biri 2-3 fareler ile 3 ayrı deneylerden. (C). CD45 ve EpCAM için lekelenmiş bir vahşi tip fare bir trakeal epitelyal Özetle EGFP pozitif fırça hücrelerinin yokluğunda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Bir sohbet(BAC)fare trakea tüm Mount-EGFP fare. Trakea, eGFP yeşil floresan sinyalini arttırmak için uzunlamasına açıldı ve anti-GFP antikor ile lekelenmiş. (A) tüm trakeal Mount sohbet(BAC)-EGFP fare, yoğun yeşil floresan hücreler fırça hücrelerini temsil; ölçek çubuğu 1 mm; (B) fırça hücrelerinin yokluğunda gösteren vahşi bir tür fare tüm trakeal montaj; Ölçek çubuğu = 1 mm; (C) düzensiz şekilli fırça hücrelerini (yeşil hücreler) kolinerjik sinir sonu (ok) olarak kuyular olarak gösteren epitelyal tabakanın büyütme; (D) bir sohbet(BAC)bir trakea tüm trakeal Mount-EGFP floresan sinyalinin antikor-geliştirme olmadan Gfp için görüntülenmiş; (E) bir sohbet(BAC)bir parafin-gömülü fare trakea Cross-bölüm-EGFP fare Anti-GFP (yeşil) veya keçi ıGG kontrol ve DAPI (mavi) ile lekelenmiş; Ölçek çubukları = 20 μm (C-E). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Farklı trakeal sindirim protokollerinin karşılaştırılması. (A) trakea, 650 u/ml kolajenaz IV ve 1,84 u/ml dispase ile DNase ı için 45 dk ile tamamlayıcı olarak kıyılmış ve inkübe edildi. Bu deney 2 kez tekrarlanmıştı. (B) tüm trakea 2,5 mm EDTA ve 0,75 mm DTT ile% 20 dk DNase ı ile inkübe edildi; epitelyal hücreler yerinden edildi ve 0,01 U/mL dispaz ve DNase ı ile 10 dakika daha fazla sindirilmiş. Bu deney 2 kez tekrarlanmıştı. (C) trakea, 45 dakika boyunca tyrode ı tamponunda 35 U/ml papain ile kıyılmış ve inkübe edildi; kalan papain aktivitesi leupeptin ile engellenir. Bu deney bir kez yapıldı. (D) tüm trakea, epitel levha ayırmak için 30 dakika için yüksek doz dispaz (16 U/ml) ile inkübe edildi,% 0,1 tripsin ve 1,6 mm EDTA ile epitel levha kuluçkası takip 30 dakika. Bu deney 2 kez tekrarlanmıştı. (E). tüm trakea 30 dk Için tyrode tampon Içinde 26 u/ml papain ile epitelyal levha sindirimi takip etmek için yüksek doz dispaz (16 u/ml) ile inkübe edildi. Kalan papain aktivitesi leupeptin ve yüksek hacimli seyreltme ile engellenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz 40 dakika için yüksek doz dispaz tedavisi bir arada kısa papain tedavisi (30 dk) takip, trakeal sindirim ve fırça hücre yalıtımı için optimum bir protokol sağlar bulundu. Bu kombinasyon hem geniş sindirim önler ve fırça hücrelerinin en yüksek verim üretir, alternatif protokollere kıyasla.
Hematopoetik hücreler ayıklamak için akciğer sindirimi klasik kolajenaz IV15gibi hafif sindirim enzimleri üzerinde dayanırken, epitelyal hücrelerin yalıtım daha karmaşık protokoller gerektirir. Epitelyal hücrelerin tek hücreli süspansiyonları birbirlerine ve Bodrum membranı birbirine bağlayan sıkı ve yapışkan kavşak nedeniyle ulaşmak daha zordur ve hücrelerin kendilerini zaaf nedeniyle. Epitelyal hücre sindirimi için çoğu protokol iki adım içerir-ilk adım, epitel hücreleri birbirlerine yapışır sıkı kavşakları ve desmosomes rahatsız etmek için sonraki adımları takiben Bodrum membrandan epitelin ayrılması 16 , 17 yaşında.
Çeşitli gruplar, epitelyal hücrelerin yalıtımına yönelik 2 adımlı bir protokolün farklı modifikasyonları kullanılarak bağırsaktan kemoduyusal tutam hücrelerini başarıyla yalıtır: ilk adım, ardından submukozanın epitelyal hücrelerini serbest bırakmak için EDTA ve DTT kullanır dispase ile epitelyal levhalar sindirim. Howitt ve al. 5 mM EDTA + 1 mM DTT karışımı kullanılan 0,5 units/mL Dispase II ve DNase14ile sindirimi izledi. Gerbe ve Al. yüksek konsantrasyon kullanılan 30 mM EDTA tek başına epitelyal fraksiyonu ayırmak ve daha sonra Dnaseı18ile tamamlayıcı dispaz ile inkübe. Von Moltke ve ark. kullanılmış 2,5 mM EDTA, 0,75 mM DTT ve DNaseI sonra dispase sindirim6. Bu tekniklerin trakea 'da uygun epitelyal hücrelerin yalıtımına izin vermektedir, ancak trakeal fırça hücrelerinin yüzdesi son derece düşüktür (Şekil 4B) ve 600-800 fırça hücrelerinin yalıtım beklentisi ile tutarlı değil Histoloji değerlendirmesine dayalı trakea.
Trakeal epitelyal hücre yalıtım protokolleri bazal epitelyal hücreleri incelemek için çeşitli gruplar tarafından geliştirilmiştir. Bu protokoller ve bağırsak içinde istihdam olanlar arasındaki önemli farklar sindirim enzimleri dizisidir. İlk adım, yüksek konsantrasyon dispaz (16 U/mL) Oda sıcaklığında16ile kuluçla trakeal epitel ayrılması olduğunu. Bu epitel mezenkimal katman19tek bir levha olarak ayırmak için izin verir. Trakeal epitel sonraki işleme tripsin ve EDTA bir kombinasyonu kullanır, hücre dekolmanı en sık kullanılan enzimatik yöntemlerden biri, tek bir hücre süspansiyon elde etmek için. Trypsin, lizin ve arginin amino asit kalıntıları C-Terminal tarafında peptidler Cleaves, ancak EDTA hücre hücresi ve hücre matris etkileşimleri için bir kalsiyum şelatör olarak kullanılır20. Bu tekniği kullanarak, rock vd. transkripsiyonel profil oluşturma için bazal epitelyal hücreler kurtarma başarılı olmuştur16. Benzer bir protokol son zamanlarda bir Tas2r143-CreERT2 Driven EGFP muhabiri ve B6 gelen hücreleri ifade acı tat reseptörü izole etmek için kullanıldı. RNA sıralama çalışmaları için Il25Flare25/Flare25 5,8. Deneyimimizde, tripsin ve EDTA ile epitelyal levha sindirimi mükemmel epitelyal hücre geri kazanımı ancak fonksiyonel veya transkripsiyonel analiz için kolinerjik trakeal fırça hücrelerinin yetersiz sayıda yol açtı her biri için birden fazla fare havuza edildi sürece örnek (Şekil 4C).
Papain Papaya Latex türetilen güçlü bir endolitik bitki sistein proteaz olduğunu, ve temel amino asitler içeren peptid bağları ayırmak için bilinmektedir, özellikle arginin, lizin ve artıkları Fenilalanin aşağıdaki21. Sohbette(BAC)papain kullanarak trakeal fırça hücresi yalıtımı-EGFP fareler Ilk Krasteva ve el10tarafından bildirilmiştir. Papain sindirimi de son zamanlarda tek hücreli RNA sıralamaları için hava yolu epitelyal hücreleri ayırmak için kullanılan nerede fırça/Tuft hücrelerin epitelyal hücrelerin küçük bir kısmını oluşur11. Papain aynı zamanda, uygun nöronların22izolasyonu için beyin dokusunun sindirilmesi için en sık kullanılan enzimdir. Beyin dokusunun papain ile dağılmasının 30 dakika boyunca belirgin daha yüksek verim, nöronal hayatta kalma ve bütünlük tripsin sindirim karşılaştırıldığında23. Bazı fırça hücreleri sıkıca sinir uçları ile iç içe olduğundan3,10, papain kullanımı nöronlar için fırça hücresi kavşak başarılı bölünme için kritik olabilir. Bununla birlikte, 35-40 U/mL konsantrasyonunda papain ile 45 min sindirmenin, epitelyal hücre artabilirliğini önemli ölçüde azaltmasını, düşük fırça hücresi geri kazanımı (Şekil 4D) olduğunu bulduk.
Papain toksisitesi azaltmak ve hücresel verimleri artırmak için 3 yöntem kullandık. İlk olarak, epitelyal levha dispase ile ayırarak, biz 45 ila 30 dakika papain sonraki kuluçdak süresini azalttı. Ikinci olarak, hemen leupeptin ile papain etkinliğini inhibe, sistein proteazlar bir inhibitörü24. Özellikle, leupeptin 4 °C ' de son derece dengesizdir ve-20 °C ' de yer işaretli ve donmuş olmalıdır. Üçüncü olarak, biz soğuk PBS büyük bir hacimli enzimsel sindirilmiş doku seyreltme de sindirilmiş hücrelerin canlılıkla korunmasına yardımcı olduğunu bulduk. Hücre verimleri artırmak için kritik bir başka adım titiz toz10. Uzun süreli vortiberlik de viability azaltabilir beri, biz kısmen trituration ile yerine. Biz 21 g iğne ile ek toz takip daha büyük hücresel kümeleri ayırmak için bir 18G iğne ile toz öneririz. Son olarak, biz eGFP son derece hafif duyarlı ve herhangi bir adımda doğrudan ışık pozlama koruma yararlı olduğunu bulduk. Bu değişiklikler, geçerli trakeal fırça hücrelerinin sağlam bir şekilde kurtarılması için izin verilir (Şekil 4E).
Burada önerilen protokolün büyük sınırlamaları, 2 adımlı prosedür ve papain kullanımı, güçlü bir sistein proteaz. Bazı gruplar, chemoduyusal hücreleri yalıtırken5 dispase için liberase yakın zamanda yerine vardır. Dahası, liberaz sindirimi son zamanlarda burun poliplerin kemoduyusal (fırça) epitelyal hücreleri yalıtmak için kullanıldı25,26. Biz doğrudan iki adımlı dispase/papain sindirim protokolüne liberaz sindirimi karşılaştırılmadı. Papain epitel hücreleri üzerinde proteaz aktif reseptör PAR2 etkinleştirebilir güçlü bir sistein proteaz olduğunu27 fırça hücrelerinin kendilerini aktivasyonuna yol açan veya diğer solunum hücreleri tarafından mediatörlerin nesil etkinleştirmek olabilir fırça hücreleri. Son olarak, papain akış sitometri28,29tarafından fırça hücresi reseptör ifadesi doğrulamak için zor hale yüzey reseptörlerinin yaraması ile reseptör ifadesi modüle olabilir.
Özetle, canlı trakeal fırça hücrelerinin sağlam bir şekilde kurtarılmasını sağlayan ChAT-eGFP muhabiri farelerden trakeal kolinerjik fırça hücrelerinin izolasyonunda bir protokol sağlıyoruz. Bu protokol, fırça hücrelerinin yalıtım ve transkripsiyon analizi için RNA sıralı3ile başarıyla kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz Brigham ve kadın ınsan Immünoloji merkezi Flow Core akış cytometrik sıralama ile onun yardımı için adam Chicoine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık bağışları R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B) ve K08 AI132723 (L. G. B) ve Amerikan alerji, astım ve Immünoloji (AAAAI)/Amerikan Akciğer alerjisi tarafından destekleniyordu Solunum hastalığı Ödülü (N.A.B.), AAAAI Vakfı fakülte geliştirme Ödülü (L.G.B.) tarafından, Steven ve Judy Kaye genç yenilikçiler Ödülü (N.A.B.) tarafından, JoYcElYn C. Austen Fonu kadın hekim bilim adamları kariyer gelişimi için (L.G.B.), ve bir vinik ailesi (L.G.B.) tarafından cömert bağış.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
