Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Изоляция и количественная оценка клеток кисти от мыши Tracheas

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59496
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

Клетки кисти являются редкими холинергическими химиосенсорными эпителиальными клетками, встречаемыми в наивной трахееемышиной. Из-за их ограниченного числа, ex vivo оценки их функциональной роли в иммунитете дыхательных путей и ремоделирования является сложной задачей. Мы описываем метод изоляции клеток трахеальной кисти цитометрией потока.

Abstract

Клетки трахеальной кисти являются холинергическими химиосенсорными эпителиальными клетками, готовыми передавать сигналы из просвета дыхательных путей в иммунную и нервную системы. Они являются частью семейства химиосенсорных эпителиальных клеток, которые включают пучки клеток в слизистой оболочке кишечника, клетки кисти в трахеее, а также одиночные химиосенсорные и микровильные клетки в слизистой оболочке носа. Химиосенсорные клетки в различных эпителиальных отсеках имеют ключевые внутриклеточные маркеры и основную транскрипционную подпись, но также демонстрируют значительную транскрипционную неоднородность, вероятно отражающую местную тканевую среду. Изоляция клеток трахеальной кисти от одноклеточных суспензий требуется для детального определения функции этих редких эпителиальных клеток, но их изоляция является сложной задачей, потенциально из-за тесного взаимодействия между клетками трахеальной кисти и нервными окончаниями или из-за состава плотных и адополителей дыхательных путей. Здесь мы описываем процедуру изоляции клеток кисти от эпителия трахеи мыши. Метод основан на первоначальном отделении трахеального эпителия от субмукозы, что позволяет последующую более короткую инкубацию эпителиального листа папаном. Эта процедура предлагает быстрое и удобное решение для цитометрической сортировки потока и функционального анализа жизнеспособных клеток трахеальной кисти.

Introduction

Клетки кисти принадлежат к классу химиосенсорных эпителиальных клеток, характеризующихся выражением рецепторов горького вкуса и трансдукционного механизма вкусовых рецепторов, найденных в клетках вкусовых рецепторов. В отличие от вкусовых рецепторов, химиосенсорные эпителиальные клетки разбросаны по эпителиальным поверхностям и называются одиночными химиосенсорными клетками (SCCs) и микровилусовыми клетками в носовом эпителии1,2, клетками кисти в трахее 3,4, и пучка клеток в кишечнике5,6. Эпителиальные клетки, выражающие рецепторы горького вкуса и механизмы с переводом горького вкуса, также находятся в мочеиспускательном канале 7,8 и слуховой трубке9. Клетки кисти дыхательных путей имеют уникальные функции в нейрогенных и иммунных дыхательных путей реакции. Они ацетилхолина производства химиосенсорных клеток, которые вызывают защитные дыхательные рефлексы при активации с горькими соединениями и бактериальных метаболитов, как кворум зондирующих веществ10. Клетки кисти дыхательных путей также являются доминирующим эпителиальным источником IL-25, который регулируетвоспаление аэроаллергена 2 типа в дыхательных путях 3.

Характеристика полного транскриптома нижних клеток кисти дыхательных путей и их реакция на экологические раздражители была ограничена их низким числом в эпителии трахеи и очень ограниченное число за пределами больших бронхов10. Методы, используемые для изоляции химиосенсорных клеток от кишечного эпителия, не дали пропорционально высоких чисел от трахеи, возможно, из-за интимных контактов клеток трахеальной кисти с нервными окончаниями10 или других ткани конкретных факторов в дыхательной слизистой оболочки, таких как состав приверженцев и плотные белки соединения. Последние сообщения об успешной изоляции клеток трахеальной кисти в более высоких числах для одноклеточного анализа секвенирования РНК использовали либо 2 ч инкубации с папаин или 18 ч инкубации с pronase11,12. Поскольку более длительные инкубации с пищеварительными ферментами могут снизить жизнеспособность клеток и изменить транскрипционный профиль клеток из переваренных тканей13,это может предвзято сравнительный анализ с другими химиосенсорными эпителиальными популяциями.

Здесь мы сообщаем метод для изоляции клеток трахеи кисти для секвенирования РНК3. Лечение трахеи с высокодозной дезасе отделяет эпителий от субмукозы. Последующее переваривание эпителиального листа с папаином позволяет отлично восстановить эту структурную клетку.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Перед проведением следующих экспериментов убедитесь, что все виды использования и протоколы по уходу за животными будут одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) и выполнены в соответствии с «Руководством Национального исследовательского совета по уходу и использованию Лабораторные животные" (8-е издание, 2011) и руководящие принципы ARRIVE. Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Бригамской и женской больнице.

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка Dispase пищеварения решение, которое является раствором PBS, содержащим 16 U/mL dispase и 20 мкг/мл DNase I. Убедитесь, что порошок диспазы полностью растворяется перед разогревом раствора в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
  2. Добавьте 5% теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), чтобы сделать остановочный раствор.
  3. Подготовка Tyrode I буфер: добавить 26 U/mL папаин (20 л/мл 48 U/mg папаин раствор) и 10 Л / мЛ L-цистеин в буфер HEPES-Tyrode без кальция.
  4. Приготовьте буфер Tyrode II: добавьте 2 леупептина (5 мг/мл) в буфер HEPES-Tyrode с кальцием.
  5. Подготовка FACS буфер: использовать Хэнкса сбалансированное решение соли (HBSS) без кальция, магния и фенола красный, дополненный 2 ММ этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) и добавить 2% FBS.

2. Рассечение мыши Трачея

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, используемые в этом протоколе, являются ChAT(BAC)-eGFP (B6. CG-Tg (RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 месяцев в возрасте обоих полов. Свести к минимуму воздействие ткани на прямой свет, чтобы уменьшить фотоотбеление eGFP.

  1. Эвтанизировать мышь с 100 мг/кг пентобарбитальной эвтаназии раствор вводят интраперитоневую или с помощью стандартных протоколов, утвержденных IACUC.
  2. Зафиксните мышь на хирургической доске в положении лежа с 21 G иглами с расширенными верхними и нижними конечностями. Спрей меха с 70% EtOH для дезинфекции области.
  3. Используя прямые щипцы, поднимите кожу и мех живота и сделайте разрез в центре с рассекающими ножницами (прямые ножницы, 3 см). Используя ножницы, отделите кожу от подкожной ткани от живота к мандибуле. Удерживая подкожную ткань с помощью щипцы, сделайте небольшой разрез ножницами в центре брюшной стенки.
  4. Откройте перитонеум V-образным разрезом. Используя щипцы, аккуратно переместить тонкой кишки в сторону, найти брюшной аорты и полы вены и сделать разрез с рассекающими ножницами, чтобы обеспечить быстрое exsanguination.
  5. Найдите диафрагму. Используя 18 G иглы, сделать отверстие в диафрагме чуть ниже грудины, чтобы сдуть легкие. Тщательно отделить диафрагму от грудной клетки с помощью острых остроконечных прямых вскрытия ножницами, чтобы разрезать вдоль основания ребер.
  6. Используя щипточки, поднимите открытый конец грудины и вырезать грудину продольно от основания грудной клетки к шее. Сделайте центральный разрез шейки матки короткими прямыми ножницами (2 см) и разделите две доли подчелюстной железы.
  7. Тщательно удалите окружающие соединительной ткани и тимуса над кариной с парой тонкой точки высокой точности щипцов.
  8. Вскрыть трахею бесплатно сначала путем разделения проксимального конца на уровне epiglottis, а затем путем вскрытия дистального конца на уровне бифуркации трахеи.
  9. Найдите эпиглоттис и вырежьте трахею продольно от эпиглоттиса до карины.

3. Трахеальная эпителиальная пищеварение

  1. Поместите трахею в трубку 1,5 мл, содержащую 750 л предварительно разогретого (до 37 градусов по Цельсию) растворить раствор пищеварения. Инкубировать на шейкере при 200 об/мин в течение 40 мин при комнатной температуре. Обложка трубки с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить воздействие прямого света.
  2. Добавьте 750 л холодных DMEM с 5% FBS, чтобы остановить реакцию. Место на льду.
  3. Перенесите трахею в чашку Петри (100 мм х 15 мм) и поместите под рассекающий микроскоп. Ориентируйте трахею с эпителиальной стороной вверх. Продольно расчлененные трахеи имеет полуцилиндрическую форму, поддерживаемую хрящевыми кольцами. Эпителий находится на вогнутой поверхности.
  4. Прикрепляйте область эпиглоттиса трахеи прямыми щипками к чашке Петри и используя размер 22 одноразового скальпеля, соскребите эпителий от трахеи. Эпителиальный слой отделяется как полупрозрачный лист.
  5. Фарш эпителия скальпелем. Перенесите эпителиальный слой в трубку 2 мл.
  6. Промыть чашку Петри с 750 л буфера Tyrode I и перенесите в трубку 2 мл, содержащую эпителиальный слой.
  7. Инкубировать трахеальный эпителиальный слой в буфере Tyrode I в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию на шейкере при 200 об/мин. Обложка трубки с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить воздействие прямого света.
  8. Добавьте 750 л холодного буфера Tyrode II. Вихрь переваренной ткани энергично в течение 20-30 с. Тритурировать гоменат с шприцем, прикрепленным к 18 G иглы 10 раз.  Переключитесь на иглу 21 G и на тритуре еще 10-20 раз.
  9. Фильтр клетки через 100 мкм ситечко в 50 мл конической трубки. Добавьте 30:1 vol/vol холодного буфера FACS.
  10. Спин на 350 х г в течение 10 минут при 4 градусах по Цельсию и отбросить супернатант. Отрежь гранулы в холодном буфере FACS и перенесите подвеску на полистиролную трубку 12 мм x 75 мм (5 мл). Спин снова на 350 х г в течение 10 минут при 4 кв и отбросить супернатант.
  11. Повторно приостановить гранулы в 100 л буфера FACS.
  12. Добавьте 1 зл анти-мыш CD16/32 блокирующих антител, чтобы блокировать неспецифические связывания и инкубировать в течение 15 минут на льду. Не мыть.
  13. Добавьте следующие антитела и соответствующие элементы управления изотипом: тихоокеанский синий анти-мышонок CD45 или крыса IgG2a, k (0,25 мкг/106 ячеек в объеме 100 л) и аллофикоцианин (APC) анти-мышь EpCAM или крыса IgG2b, k (0,5 мкг/106 клеток в объеме 100 л) моноклональные антитела. Инкубировать в течение 45 минут на льду защищены от прямого света. Добавьте 4,5 мл холодного буфера FACS, перемешайте и закрутите при 350 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от буфера FACS и повторно приостановите гранулы в 300 л холодного буфера FACS.
  14. Добавить пропидий йодид (PI) (5 мкг/мл) непосредственно перед потоком цитометрической сортировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки кисти имеют неправильную форму с несколькими процессами, которые потенциально могут увеличить их присоединение к фильтрам(рисунок 3C). Мы сравнили 30 мм с 70 мм и 100 мм фильтры и обнаружили, что большие поры фильтры обеспечивают лучшие урожаи. Кроме того, тщательное трикуляции клеточной подвески после переваривания папанов значительно улучшает урожайность клеток кисти. Мы рекомендуем использовать 18G иглу для первоначальной тритурации с последующим меньшим отверстием (21 или 23 G иглы) для тонкой диссоциации клеток.

4. Поток Цитометрия Gating Стратегия

  1. Определите клетки из мусора по углу переднего и бокового рассеяния. Исключите дублеты, используя высоту и ширину переднего рассеяния, а высоту и ширину бокового рассеяния. Дублеты будут ячейками с высокими значениями ширины.
  2. В одиночных клетках, определить живые клетки, как популяция, которая ЯВЛЯЕТСЯ Pi отрицательным.
  3. В живых одиночных ячеек, определить CD45 от низкого до отрицательного клеток на основе контроля изоттипа.
  4. В CD45 низких/отрицательных ячеек, определить EpCAM положительные клетки, которые также eGFP положительные (в канале FITC). Это популяция клеток кисти(рисунок 2A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эта процедура была успешно реализована для изоляции клеток трахеальнойкисти для секвенирования РНК 3. После изоляции трахеи и пищеварения тканей с 2-ступенчатым протоколом(рисунок1), клетки были собраны и окрашены флуоресцентно помечены CD45 и EpCAM после исключения мертвых клеток с PI. После gating из дублетов на основе вперед и стороны рассеяния характеристики, мы определили клетки кисти как низкий / отрицательный для CD45, положительный для EpCAM и положительный для eGFP (Рисунок 2A). Клетки кисти, представленные 0,16-0,42% от клеток cd45с низким/нег по цитометрии потока и составили 250-600 клеток на трахею (рисунок2B). Мы сравнили эти подсчеты с оценкой количества tAT-eGFP положительных клеток в целых трахеальных креплений от ChAT(BAC)-eGFP мышей на основе нашей опубликованной обширной иммуногистологической оценки клеток трахеальной кисти3 и проиллюстрированы здесь ( Рисунок 3). Наши предыдущие исследования клеток трахеальной кисти в диком типе, ChAT(BAC)-eGFP мышей и Il25F25/F25 мышей предположил, что холинергические клетки кисти на 90% перекрываются с DCLK1 и IL25 - клетки и счета для 600-1000 клеток кисти на трахею3. Примечательно, что это число ниже, чем количество холинергических клеток кисти сообщили другие группы10. Поскольку числа хемосенсорных клеток изменяются воздействием микробных метаболитов и простейшей5,14, эти цифры могут отражать изменчивость в межинституциональной микробиоты. Поэтому мы предлагаем оценить количество клеток кисти с помощью флуоресценции, чтобы оценить ожидаемое количество изолированных клеток кисти с помощью цитометрической сортировки потока.

При создании нашего протокола, мы попытались несколько ранее опубликованных методов изоляции химиосенсорных клеток(рисунок 4). Когда мы инкубировали фарш трахеи с 650 U/mL коллагеназы IV и 1,84 U/mL dispase дополнен dNase I в течение 45 минут, комбинация часто используется для получения одноклеточных суспензий из легких гомогенатов15, мы достигли одноклеточной подвески эпителиальных клеток, но мы восстановили только несколько клеток кисти(Рисунок 4A). Клетки туфа в кишечнике были успешно изолированы с помощью 2,5 мм EDTA и 0,75 мМ дитиотрийтол (DTT) с DNase I в течение 20 минут, чтобы выбить эпителиальные клетки с последующим перевариванием выпущенных эпителиальных клеток с 0,01 U/mL dispase с DNaseI за 10 минут 6. В наших руках, используя эту процедуру также привело к неоптимальным восстановления клетки трахеальной кисти(рисунок 4B). Протокол для успешной изоляции клеток трахеальной кисти для анализа РНК был описан Крастева и др.10. Следуя этому протоколу, мы инкубировали фарш трахеи с 35 U/mL папаин в буфере Tyrode в течение 45 минут и не достигли хорошего восстановления клеток кисти(рисунок 4C). Рок и др. описали метод переваривания трахеального эпителия для базальной клеточной изоляции двумя шагами: отделение эпителия от мезенхимального слоя с высокой дозой диспаза (16 U/mL) при комнатной температуре с последующим инкубированием раздели эпителия с 0,1 % трипсин и 1,6 мМ EDTA в течение 30 мин при 37 КК16. После этих шагов привело к лучшему восстановлению клеток кисти, но числа, достигнутые на мышь были недостаточными для глубины функциональных анализов(Рисунок 4D). Для оптимизации протокола мы решили объединить два последних подхода. Отделяя трахеевой эпителий с высокой дозой диспази, мы стремились обеспечить лучший доступ папаина к клеткам трахеальной кисти. Таким образом, использование 16 U/mL диспазы при комнатной температуре на всю трахею, чтобы отделить эпителий и последующее инкубацию эпителия с 26 U/mL папаин в буфере Tyrode привело к лучшему восстановлению клеток кисти(Рисунок 4E).

Figure 1
Рисунок 1 : Схема предлагаемых шагов для изоляции клеток трахеальной кисти. Протокол включает в себя два основных шага: после вскрытия, вся трахея инкубируется в высокодозном растворе диспазы для разделения эпителия; за этим следует переваривание эпителиального листа с папаином в кальции, содержащей буфер Тироде (Tyrode I) и окрашивание антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представительный анализ цитометрии потока клеток трахеальной кисти. (A). Схематическое представление стратегии цитометрии потока gating. Одиночные клетки были закрыты на основе их вперед и боковой рассеивание характеристики и живые клетки были выбраны на основе исключения Propidium Iodide. CD45 низкие/отрицательные клетки были выбраны на основе контроля изотипов и оценены для их выражения EpCAM. EpCAM положительные клетки считались клетки кисти, если они выразили eGFP флуоресцентные в канале FITC. (B) Количество клеток холинергической трахеи кисти на трахею мыши и частота представлены в процентах от всех CD45 низких/-клеток и в процентах от CD45низких/-EpCAM- клеток. Каждая точка представляет собой отдельную мышь. Данные взяты из 3 отдельных экспериментов с 2-3 мышами каждый. (C). Отсутствие eGFP положительные клетки кисти в трахееи эпителиального дайджеста из диких мыши типа окрашенных для CD45 и EpCAM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Целое крепление трахеи мыши ChAT(BAC)-eGFP мыши. Трахея была открыта продольно и окрашены анти-GFP антитела для повышения eGFP зеленый сигнал флуоресценции. (A) Целое трахеи горе ChAT(BAC)-eGFP мыши, интенсивно зеленые флуоресцентные клетки представляют клетки кисти; шкала бар 1 мм; (B) целое трахеи горе дикий тип мыши, демонстрирующие отсутствие клеток кисти; Шкала бар No 1 мм; (C) увеличение эпителиального слоя, демонстрирующего клетки нерегулярной формы (зеленые клетки), а также холинергическое окончание нерва (стрелка); (D) целое трахеи горе трахеи ChAT(BAC)-eGFP изображения для GFP без антитела-повышение сигнала флуоресценции; (E) поперечное сечение парафина-встроенных трахеи мыши ChAT(BAC)-eGFP мыши окрашенных анти-GFP (зеленый) или коза IgG управления и DAPI (синий); Шкала баров 20 мкм (C-E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Сравнение различных протоколов пищеварения трахеи. (A) Трахея была измельчена и инкубирована с 650 U/mL коллагенеза IV и 1,84 U/mL dispase дополненd DNase I в течение 45 мин. Этот эксперимент повторялся 2 раза. (B) Вся трахея была инкубирована с 2,5 мм EDTA и 0,75 мМ DTT дополнен dNase I в течение 20 мин; эпителиальные клетки были выбиты и далее перевариваются с 0,01 U/mL dispase и DNase I в течение 10 минут. Этот эксперимент повторялся 2 раза. (C) Трахея была измельчена и инкубирована с 35 U/mL папаина в Tyrode I буфера в течение 45 минут; остаточная папаинная активность подавлялась леупептином. Этот эксперимент был выполнен один раз. (D) Вся трахея была инкубирована с высокой дозой dispase (16 U/mL) в течение 30 минут, чтобы отделить эпителиальный лист, а затем инкубации эпителиального листа с 0,1% трипсина и 1,6 мМ EDTA в течение 30 минут. Этот эксперимент повторялся 2 раза. (E). Вся трахея была инкубирована с высокой дозой dispase (16 U/mL) в течение 30 минут с последующим перевариванием эпителиального листа с 26 U/mL папаин в буфере Tyrode в течение 30 минут. Остаточная папаинная активность подавлялась леупептином и большим объемом разбавления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы обнаружили, что сочетание высокодозного лечения диспазы в течение 40 минут с последующим коротким лечением папаина (30 мин) обеспечивает оптимальный протокол для пищеварения трахеи и изоляции клеток кисти. Эта комбинация позволяет избежать обширного пищеварения и производит наивысший урожай клеток кисти, по сравнению с альтернативными протоколами.

В то время как пищеварение легких для извлечения гематопогетических клеток классически полагалось на мягкие пищеварительные ферменты, такие как коллагенеза IV15,изоляция эпителиальных клеток требует более сложных протоколов. Одноклеточные суспензии эпителиальных клеток труднее достичь из-за плотных и приверженных узлов связывая их друг с другом и мембраны подвала и из-за слабости самих клеток. Большинство протоколов для эпителиального пищеварения клеток включают два шага - первым шагом является отделение эпителия от мембраны подвала с последующими последующими шагами, чтобы нарушить тесные соединения и десмосомы, которые придерживаются эпителиальных клеток друг к другу 16 Год , 17.

Несколько групп успешно выделили клетки химиосенсорного пучка из кишечника, используя различные модификации 2-ступенчатого протокола для изоляции эпителиальных клеток: первый шаг использует EDTA и DTT для высвобождения эпителиальных клеток из субмукозы, за которыми следует переваривание эпителиальных листов с диспазой. Howitt et al. использовали смесь 5 мМ EDTA и 1 мМ DTT с последующим пищеварением с 0,5 единицами/мл Dispase II и DNase14. Гербе и др. используется высокая концентрация 30 мМ EDTA только для разделения эпителиальной фракции, а затем инкубируется с dispase дополнен dNaseI18. Фон Moltke et al. использовали 2,5 мМ EDTA, 0,75 мМ DTT и DNaseI, а затем dispase пищеварения6. Мы обнаружили, что эти методы позволяют изоляции жизнеспособных эпителиальных клеток в трахее, но процент клеток трахеи кисти была крайне низкой(Рисунок 4B) и не согласуется с нашим ожиданием изоляции 600-800 клеток кисти на трахея на основе нашей гистологии оценки.

Протоколы изоляции эпителиальных клеток трахеи были разработаны несколькими группами для изучения базальных эпителиальных клеток. Основные различия между этими протоколами и те, которые используются в кишечнике в последовательности пищеварительных ферментов. Первым шагом является разделение трахеального эпителия через инкубацию с высокой концентрацией диспазы (16 U/mL) при комнатной температуре16. Это позволяет эпителии отделить как один лист от мезенхимального слоя19. Последующая обработка трахеального эпителия использует сочетание трипсина и ЭДТА, одного из наиболее часто используемых ферментативных методов отслоения клеток, для достижения одноклеточной суспензии. Трипсин расщепляет пептиды на C-терминальной стороне остатков аминокислот и аминокислот аргинина, в то время как ЭДТА используется в качестве хелатора кальция для клеточных и клеточных матричных взаимодействий20. Используя этот метод, Рок и др. были успешными в восстановлении базальных эпителиальных клеток для транскрипционного профилирования16. Аналогичный протокол был недавно использован для изоляции рецептора горького вкуса, выражающего клетки от Tas2r143-CreERT2 приводом eGFP репортера и от B6. Il25Flare25/Flare25 для исследований секвенированияРНК 5,8. По нашему опыту, переваривание эпителиального листа с трипсином и ЭДТА привело к отличному восстановлению эпителиальных клеток, но недостаточное количество клеток холинергической трахеи для функционального или транскрипционного анализа, если не сколько несколько мышей были объединены для каждого образец(рисунок 4C).

Папаин является мощным эндолитического растения цистеина протеазы, полученные из латекса папайи, и, как известно, расщеплять пептидные связи с участием основных аминокислот, особенно аргинин, лизин и остатки после фенилаланина21. Галеальная кисти изоляции клеток с использованием папаин из ChAT(BAC)-eGFP мышей был впервые сообщил Krasteva и др. Папаин пищеварения был также недавно используется для диссоциации эпителиальных клеток дыхательных путей для одноклеточного секвенирования РНК, где кисть / пуч клетки состояли из небольшой доли эпителиальных клеток11. Папаин также является наиболее часто используемым ферментом для пищеварения тканей мозга для изоляции жизнеспособных нейронов22. Диссоциация тканей мозга с папаином в течение 30 минут приводит к заметно более высоким урожаям, выживаемости нейронов и целостности по сравнению с варизором трипсина23. Поскольку некоторые клетки кисти плотнопереплетаются с нервными окончаниями 3,10, использование папаина может иметь решающее значение для успешного расщепления клеток кисти клеток соединений с нейронами. Тем не менее, мы обнаружили, что 45 мин пищеварения с папаином в концентрации 35-40 U/mL резко снижение жизнеспособности эпителиальной клетки, что приводит к низкой рекуперации клеток кисти (Рисунок 4D).

Мы использовали 3 метода для уменьшения токсичности папаина и повышения урожайности клеток. Во-первых, разделив эпителиальный лист с диспазой, мы сократили последующее время инкубации папаина с 45 до 30 мин. Во-вторых, мы сразу же ингибировали папан активность с лейпептином, ингибиторциона протеаз цистеина24. Примечательно, что лейпептина очень нестабильна при 4 градусах Цельсия и должна быть алицитирована и заморожена при -20 градусов по Цельсию. В-третьих, мы обнаружили, что разбавление ферментативно переваренной ткани в большом объеме холодного PBS также помогает сохранить жизнеспособность переваренных клеток. Еще один шаг, который имеет решающее значение для увеличения урожайности клеток является строгое тритурации10. Поскольку длительное вихревое может также снизить жизнеспособность, мы частично заменили его трикуляцией. Мы рекомендуем тритурацию с помощью иглы 18G, чтобы разъединить большие клеточные комки с последующей дополнительной тритурации с иглой 21 G. Наконец, мы обнаружили, что eGFP является высокочувствительным светом и защита от прямого воздействия света на любом этапе полезно. Эти изменения позволили надежно восстановить жизнеспособные клетки трахеальной кисти(Рисунок 4E).

Основными ограничениями протокола, предлагаемого здесь, являются 2-ступенчатая процедура и использование папаина, мощного протеазы цистеина. Некоторые группы недавно заменили liberase для dispase5 при изоляции химиосенсорных клеток. Кроме того, переваривание liberase недавно был использован для изоляции химиосенсорных (щетка) эпителиальных клеток из полипов носа25,26. Мы напрямую не сравнивали пищеварение liberase с нашим двухступенчатым протоколом дезаза/папапана пищеварения. Папаин является мощным цистеина протеазы, которые могут активировать протеазы активированный рецептор PAR2 на эпителиальных клетках27 приводит к активации клеток кисти себя или к поколению посредников другими респираторными клетками, которые могли бы в свою очередь активировать клетки кисти. Наконец, папаин может модулировать экспрессию рецепторов через расщепление поверхностных рецепторов, что затрудняет проверку экспрессии рецепторов клеток кисти цитометрией28,29.

Таким образом, мы предоставляем протокол изоляции трахеальных холинергических клеток кисти от мышей-репортеров ChAT-eGFP, что позволяет обеспечить надежное восстановление жизнеспособных клеток трахеальной кисти. Этот протокол успешно используется для изоляции и транскрипционного анализа клетоккисти с помощью секвенирования РНК 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Адама Чикиоэ (Adam Chicoine) из Бригама и женского центра иммунологии Flow Core за помощь в сортировке цитометрической сортировки потока. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Гранты R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) и K08 AI132723 (L.G.B), а также Американской академией аллергии, астмы и иммунологии (AAAAI)/ Премия по респираторным заболеваниям (N.A.B.), лауреатом премии Фонда ААААИ (L.G.B.), премией молодых новаторов Стивена и Джуди Кайе (N.A.B.), Фондом Джойслин К. Остин для развития карьеры женщин-медиков (L.G.B.), а также премией щедрое пожертвование семьи Виник (L.G.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) Abcam cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8) Biolegend cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control Biolegend cat#400511
DAPI Biolegend cat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies/Molecular Probes cat#A-11055
Normal Goat IgG R&D Systems cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) Biolegend cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control Biolegend cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase Gibco cat# 17105041 
DNase I Sigma  cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter Boston BioProducts cat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) Boston BioProducts cat# BSS-355
L-Cysteine Sigma cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt Sigma cat# L2023
Papain from papaya latex Sigma cat# P3125
Propidium iodide  Sigma cat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) The Jackson Laboratory 7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope Zeiss
LSRFortessa BD 647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubes Thomas Scientific 1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style Falcon 14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style Falcon 352098
Feather Disposable Scalpel no.12 Fisher Scientific NC9999403
Petri dish, 100 mm x 15 mm Style Falcon 351029
Sterile cell strainer, 100 μm Fisherbrand cat#22363549

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
  2. Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
  3. Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
  4. Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
  5. Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
  6. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
  7. Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
  8. Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
  9. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
  10. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
  11. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  12. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  13. Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
  14. Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
  15. Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
  16. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  17. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
  18. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
  19. Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
  20. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  21. Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
  22. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  23. Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
  24. Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
  25. Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
  26. Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
  27. Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
  28. Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
  29. Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 148 клетки трахеальной кисти холинергические эпителиальные клетки одиночные химиосенсорные клетки горькие клетки чувствания вкуса рецепторы горького вкуса клетки туфта
Изоляция и количественная оценка клеток кисти от мыши Tracheas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ualiyeva, S., Yoshimoto, E.,… More

Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter