Summary
זהו פרוטוקול עבור הכנת רקמה אופטימלית עבור גנומית, טראנסקריפט, וניתוחים פרוטאומית של עטלפים נתפס בטבע. הוא כולל פרוטוקולים עבור לכידת בת וניתוח, שימור רקמות, ותא culturing של רקמת בת.
Abstract
כמו טכנולוגיות ברצף התפוקה גבוהה מראש, שיטות סטנדרטיות לרכישת רקמות באיכות גבוהה ושימור לאפשר הארכה של שיטות אלה לאורגניזמים שאינם מודל. סדרה של פרוטוקולים כדי למטב את אוסף רקמות מעטלפים פותחה עבור סדרה של גישות בתפוקה גבוהה רצף. מתוארים כאן הם פרוטוקולים ללכידת עטלפים, הדמוגרפיה הרצויה לאסוף עבור כל עטלף, ואת שיטות אופטימיזציה כדי למזער את הלחץ על המחבט במהלך איסוף רקמות. מתואר במיוחד הם שיטות איסוף וטיפול ברקמות כדי להשיג (i) DNA עבור משקל מולקולרי גבוה ניתוחים גנומית, (ii) RNA עבור הרקמה ספציפיים הטרנססקריפט, ו (iii) חלבונים עבור ניתוח ברמה פרוטמית. לבסוף, גם מתואר הוא שיטה כדי למנוע דגימה קטלנית על ידי יצירת תרביות תאים הראשי קיימא מאטבי כנף. מוטיבציה מרכזית של שיטות אלה היא למקסם את כמות הנתונים המולקולריים הפוטנציאליים ומורפולוגיים עבור כל עטלף ולהציע דרכים אופטימליות כדי לשמר את הרקמות כך שהם שומרים על הערך שלהם כמו שיטות חדשות להתפתח בעתיד. סטנדרטיזציה זו הפכה חשובה במיוחד כמו יוזמות לרמת כרומוזום ברמה, שגיאה ללא שגיאות של מינים ברחבי העולם הופיעו, שבו מפלגות מדעיות מרובות מוביל את רצף של מיסים שונים קבוצות. הפרוטוקולים המפורטים להלן מגדירים את אוסף הרקמה האידיאלית שיטות שימור רקמה עבור Bat1K, קונסורציום כי הוא ברצף את הגנום של כל מיני עטלף.
Introduction
שיטות של רצף תפוקה גבוהה (HTS) מתקדמות במהירות ביעילות ומוקטנת בעלות, וכעת ניתן לשנות את הגישות למאות או לאלפי דגימות. תובנות המתקבלות על ידי יישום של טכנולוגיות אלה יש השפעות עצומות על פני דיסציפלינות מדעיות מרובות, מ ביודינין לאבולוציה ואקולוגיה1,2,3. עם זאת, יישומים רבים HTS להסתמך באופן ביקורתי על חומצות גרעין באיכות גבוהה ממקור חי. מגבלה זו עשויה להיות בעייתית יותר ויותר עם התפתחות רצף הדור השלישי על בסיס מולקולות לקרוא ארוך4. מסיבות אלה, יש צורך למקד את המאמצים על הקמת שיטות העבודה הטובות ביותר לאיסוף דגימות רקמה טרייה מאורגניזמים בר מחוץ למעבדה, אשר מגדיל את כלי השירות של החומר ומפחית את מספר האנשים שצריכים להיות נאסף.
Bat1K הוא קונסורציום בינלאומי של מדענים עם יוזמה מתמשכת לרצף את הגנום של כל מיני עטלף להרכבה ברמת כרומוזום5. העטלפים מייצגים 20% ממגוון היונקים ומצטיינים בעיבודים יוצאי דופן בעלי השלכות להבנת ההזדקנות, אקולוגיה של מחלות, ביולוגיה חושית וחילוף חומרים5,6. עטלפים רבים גם איימו או בסכנת הכחדה בשל ניצול האדם7 או מתדרדר במהירות בשל פתוגנים8,9, ואת רצף ברמת הגנום הוא בעל חשיבות רבה לשימור מינים אלה. למרות Bat1K כיום מטרתו לרצף את הגנום של כל מיני העטלף, את הסטנדרטיזציה של אוסף דגימות של רקמה לרצף גנומית באיכות גבוהה נשאר אתגר מפתח על פני הקהילה של ביולוגים אורגאימאל. בנוסף נתונים גנומית, הבנה פונקציונלית של מגוון של עיבודים בת דורש ניתוח ספציפי לרקמות הטרנס והחלבונים, לעתים קרובות דורשים פרוטוקולים אוסף נפרד. יתרה מזאת, כמו בכל הקבוצות המטקיות, בעוד שאוסף הרקמה האופטימלי והשימור חיוני להשגת הנתונים באיכות הגבוהה ביותר עבור ניתוח omics, התקשורת הטובה ביותר היא לעתים קרובות קשה בגלל טכנולוגיות משתנות במהירות ו צוותי מחקר מרובים עובדים באופן עצמאי.
הצורך לאמץ את השיטות הטובות ביותר עבור מחקר בת-omics דחוף במיוחד, בהתחשב בכך שמינים רבים של עטלפים הם נדירים או מאוימים. בניגוד ליונקים קטנים אחרים כגון מכרסמים ושיני, עטלפים הם ארוכים, המיוחס מנגנוני תיקון DNA יוצא דופן10 ו הרבייה איטית11, עם רוב המינים ללדת רק אחד או (במקרים מעטים) שני צעירים בשנה. מסיבות אלו, אוכלוסיית העטלף יכולה להיות איטית כדי להתאושש מהפרעה, ואיסוף אנשים רבים מן הטבע אינו מומלץ ולא ניתן לביצוע. במילים אחרות, על הפרוטוקולים להיות ממוטבים כדי לקבל את הכמות המרבית של נתונים עבור דגימה בודדת, ובכך לצמצם את הצורך לשכפל את מאמצי הדגימה שלא לצורך.
כאן, פרוטוקול זה מתמקד במיוחד על שיטות סטנדרטיות עבור אוסף ודגימה של רקמת בת עבור הרצף הגנומית וניתוח החלבונים הטרנססקריפט. העדיפות העליונה שלה היא להבטיח כי רקמות העטלף נאספים מבחינה אתית ובאחריות, החל בתהליך המתיר עבור האוסף, ייצוא של רקמות למזעור הלחץ לבעלי חיים, ותנאי אחסון ארוכי טווח. ניתוח משוכלל פותחו במטרה לקבל בעתיד את התועלת של חומרים שונים שנאספו. כתב יד זה מספק מדריך צעד-אחר-צעד לאיסוף עטלפים באופן אנושי שנועד למזער את ההשפעה על אוכלוסיות ולמקסם את הערך המדעי. בעוד המיקוד של פרוטוקול זה הוא במיוחד לשימוש בעטלפים, רבים מהשלבים רלוונטיים אחרים בעלי חוליות, בעיקר יונקים.
סקירה כללית של אוסף הרקמה
ההליך לאיסוף רקמות, כולל הטמפרטורה לאחסון ובחירת הסוכן, ייקבע על-ידי האופי של כל ניתוח במורד הזרם המתוכנן. עם זאת, מומלץ מאוד כי, כאשר הדבר אפשרי, הרקמה נאסף תחת מגוון של שיטות כדי למקסם את השירות העתידי שלה גם אם לא מתוכננת ניתוח מסוים. באופן כללי, רקמות נאסף ונשמר לניתוחים הבאים של חומצות גרעין (DNA ו-RNA), או חלבון. עבור כל אחד מהיישומים הללו, רקמות ניתן לשמור באופן אופטימלי על ידי הקפאת פלאש ישירות בחנקן נוזלי (LN2). עם זאת, טבילה מיידית ב LN2 לא תמיד אפשרי בתחום. כמו התקדמות הטכנולוגיה, משאבים כגון מבחנות מיוחדות כדי לאחסן DNA ו-RNA בטמפרטורות הסביבה הופכים לזמינים יותר. למרות שלא הצלחנו לממש את כל החומרים הללו בפרוטוקול זה, אנו מעודדים חוקרים אחרים לנתח באופן יחסי את הביצועים של חומרים חדשים ביחס למה שאנו מציגים כאן. אנו מספקים שיטות כדי לשמר את הרקמה האידיאלית עבור יישומים שונים במצבים שבהם LN2 לא ניתן לגשת, לדוגמה, כאשר LN2 התחבורה אינה אפשרית בשל גישה לאתר באמצעות מטוס קטן באמזונס. בנוסף, אנו מספקים שיטה לאיסוף רקמות שמהן ניתן לגדל ולהפיץ תאים חיים. להלן מתווה שיקולים מרכזיים לאיסוף חומר עבור כל אחד מהמטרות הללו וסקירה של שיטות הגבייה ניתנת בטבלה 1.
רקמת דנ א
עבור כל הרקמה שנאספה שנאספו, מדיית האחסון תקבע אם ניתן להשתמש בו עבור או משקל מולקולרי רגיל או גבוה (HMW) חילוץ DNA. HMW נדרש ברצף ארוך לקרוא וכרגע נדרש כדי ליצור הרכבות הגנום ברמת כרומוזום, או הגנום "רגיל" פלטינה. משקל מולקולרי נמוך (LMW) DNA ניתן לחלץ הבזק קפוא, AllProtect (מעתה המכונה "פתרון ייצוב רקמות"), או אפילו RNAlater (מעתה ואילך "RNA ייצוב פתרון")-דגימות שנשמרו (למרות פלאש קפוא דגימות להישאר אופטימלי ). ה-DNA מבודד על ידי שיטות מעבדה סטנדרטית (למשל, סיליקה ג'ל ממברנה ספין עמודות, פנול-כלורופורם), יכול עדיין להניב שברי דנ א של עד ~ 20 קילו (kb). לכן, בתנאי יש תשואה מספקת, צורה זו של ה-DNA מבודדים ניתן להשתמש עבור הוספת גודל הספרייה בודדת, שבו גודל ההכנסה הוא לעתים קרובות ~ 500 בסיס זוגות (bp), ומקריא רצף קצר של ~ 100 bp נוצרות12. ה-DNA הזה שימושי במיוחד לפרויקטים של "סידור מחדש" או למחקרים שבהם נתונים כרומוזומטיים באורך מלא אינם נדרשים. HMW DNA (10-150 kb) הוא מאתגר יותר יכול להיות רק מושגת באופן אמין באמצעות רקמה כי כבר פלאש מהיר קפוא ב LN2 בעקבות הקציר ומתוחזק במקסימום של-80 ° צ' עד החילוץ.
משקל מולקולרי נמוך או דנ א מפוצל הוא לעתים קרובות מספיק גישות ממוקדות, כולל הגברה גנטית דרך ה-PCR ולקרוא ברצף13. PCR מבוססי חקירות באמצעות ה-DNA lmw כי היעד רק אחד או כמה גנים היו אינפורמטיבי מאוד בהבנת הסתגלות ואת האבולוציה המולקולרית של בת ביולוגיה חושית6,14, פיזיולוגיה15, פילוגנטיקה 5,16, ושימור17,18. רצף ממוקד מוצלח לשחזר של משקל מולקולרי נמוך ו-DNA מפוצל הוכח גם עבור קבוצות בעלי חוליות רבות, כולל עטלפים19. שיטות אלה הן לעתים קרובות חסכונית ומינימלית פולשנית למחבט, כמו דגימות צואה ודגימת רקמה שאינה קטלנית באמצעות מטליות בוצ או אגרופים כנף הם גם דרכים נפוצות להשיג דנ א עבור משקל מולקולרי נמוך ניתוח20, . עשריםואחד
עם זאת, האיכות תלויה במידה רבה בסוג המדיה שבה מאוחסן המדגם22. לאחר השוואות שיטתית וכמותי של בדיקות ואגרופים ביופסיה, אגרופים כנף ביופסיה הוכחו להניב רמות גבוהות יותר של DNA ו היו פחות מלחיץ את המחבט במהלך אוסף22. השוואות אלה גם הראו כי התוצאות הטובות ביותר התקבלו כאשר פונץ ' כנף השתמר סיליקה אינדיקטור (כלומר, סוג של התייבשות עשוי חרוזי סיליקה ג'ל המשתנה צבע כאשר הלחות נצפתה) ולא באמצעי אחסון פופולריים אחרים כגון אתנול או DMSO22; למרות, אמצעי אחסון אחרים כולל פתרון ייצוב רקמות לא נבדקו. ניתן להשתמש באגרופים בכנף גם כדי לגדל תאים העשויים בתרבות, כמו בקצ'יק ואח '23 וכמתואר להלן (ראה סעיף 6). עבור שיטות אלה, הכנף או uropatagium צריך להיות מורחב בעדינות, ואת האגרוף ביופסיה נקי, בדרך כלל 3 מ"מ בקוטר, יש להשתמש כדי להשיג את המדגם. גישה זו מופיעה לגרום נזק לא מתמשך, עם צלקות ריפוי בתוך שבועות ברוב המקרים24.
ה-DNA HMW (10-150 kb) הוא מאתגר יותר וכרגע רק מושגת באופן אמין באמצעות רקמה כי כבר פלאש מהיר קפוא ב LN2 בעקבות הקציר ומתוחזק במקסימום של-80 ° צ' עד החילוץ. ה-DNA HMW (10-150 kb) הוא חיוני עבור רצפי דנ א ארוך לקרוא ולכן עבור הרכבת דה נובו הגנום. אכן, בעוד ערכות מסחריות ביותר ניתן להשתמש כדי לבודד את ה-DNA סטנדרטי HMW, מידות המולקולה שנוצר לעתים קרובות לא עומדים בדרישות של הדור השלישי ברצף טכנולוגיות [g., אלה השיקה על ידי חברות כגון פסיפיק ביומדעים (PacBio), אוקספורד Nanopore טכנולוגיות, ו-10x גנומיקה, או באמצעות שיטות הרכבה המוצעים על ידי ביונאנו גנומיקה או בהגנומיקה. ככזה, קיימת דרישה חדשה ל-DNA "אולטרה HMW" (> 150 kb). בעת קבלת ה-DNA ultra HMW מן העטלפים, דגימות טריות של הכבד, המוח, או השריר מתאימים כולם, אבל אלה חייבים להיות מיד פלאש קפוא ב LN2 ללא כל מאגר אחסון או כימיות. תיאור מלא של שלבים אלה הוא מעבר לטווח של הנייר הזה אבל הם זמינים במקומות אחרים25.
רקמת רנ א
רנ א היא מולקולה בודדת תקועים כי הוא פחות יציב מ-DNA. למרות שיש צורות רבות של RNA,-מנתח omics נוטים להתמקד mRNA (שליח RNA) ו RNAs קטן (למשל, microRNAs). לאחר תמלול, mRNA משולבים כדי ליצור תעתיק בוגר שאינו מכיל introns ומייצג את החלק קידוד של גנים/genomes. קידוד גנים חשבון עבור חלקיק זעיר של גודל הגנום (1%-2%), ביצוע מיקוד mRNA אמצעי יעיל להשגת נתוני רצף עבור גנים. MicroRNAs הם מחלקה של RNAs המסדירים את תהליך התרגום של mRNA לחלבונים, ולכן הם משתמשים ברגולציה חשובה. RNA התעתיקים יכול להיות ברצף בנפרד, או בדרך כלל לניתוחים שבדרך-omics26,27,28,29,30, כחלק מהמרה; כלומר, סך כל התעתיקים של RNA הנמצאים במדגם נתון.
רצף ניתן לבצע בעקבות מספר שיטות (כלומר, באמצעות קצר לקרוא RNA-seq או ארוך לקרוא בשלמותו isoform), המאפשר ניתוח של שניהם השפע RNA ו isoform השימוש. כמו כמות וגיוון של התעתיקים mRNA משתנה בין תאים ורקמות, רצפי RNA מאפשר ללמוד ולהשוות ביטוי גנים ורגולציה על פני דגימות. עניין ברצף RNAs קטן ורצף איזוטופס שלם גדל, כמו שיטות אלה נעשים יותר ויותר אינפורמטיבי ביולוגית. הכנת דגימות רקמות למחלקות שונות של RNA ניתן לבצע באותו אופן כפי שהוצג בכתב יד זה, עם רק שיטות החילוץ הבאות שונות31,32. לבסוף, מכיוון transcript להציע מערכת כיסוי גבוהה של הגנום קידוד חלבון, הנתונים התאספו עשוי להיות שימושי הרכבה הגנום וביאור, ביצוע אוסף של נתוני RNA-seq על פני מגוון של רקמות שונות מרכיב חשוב של . יוזמה Bat1K
בניגוד ל-DNA, ה-RNA הוא לא יציב כימית ממוקד גם על ידי אנזימים RNase, אשר הנוכחי אוביקוויטים ברקמות לlysates כאסטרטגיה הגנתית נגד RNA מבוססי וירוסים. מסיבות אלה, שבר RNA בתאים ורקמות מתחיל לבזות זמן קצר לאחר נקודת הדגימה ו/או המתת חסד. השמירה על RNA ולכן דורשת צעדים כדי למנוע את ההשפלה שלה. זה כרוך בדרך כלל שימור רקמות שנאספו טרי ב 4 ° c בסוכן ייצוב כגון RNA מייצב פתרון כדי להשבית את RNases באופן טבעי הנוכחי ברקמות, ואחריו הקפאה לאחסון ארוך טווח. כחלופה המועדפת, רקמות יכול להיות הבזק קפוא ב LN2; למרות כאמור לעיל, הובלת LN2 לתוך השדה ושמירה על רמות כדי למנוע את הרקמה הרקמות יכול להיות מאתגרת לוגיים.
רקמת חלבון
הרכב החלבון והשפע היחסי משתנים בין תאים ורקמות באופן דומה למה שנדון עבור RNA; עם זאת, חלבונים הם בממוצע יציבה יותר מאשר RNA. זיהוי חלבונים באמצעות פרוטאומניקס בדרך כלל מתאים לשבריר של, ולא את כל החלבונים ברצף, אבל זה יכול לספק מידע על הביטוי על פני רקמות ואפיון פתוגנים נוכח. כמו רצפי חלבונים רבים נשמרים על פני יונקים, העטלף דגימות עבור פרוטאומניקס יכול בקלות להיות מזוהם עם חלבונים אנושיים שימור, דרישת פרוטוקולים סטרילי (g., כפפות, מלקחיים) במהלך האיסוף. בעוד הקפאת הבזק ב LN2 היא הדרך הטובה ביותר למנוע השפלה של חלבונים, שימוש בקרח יבש, 20 ° c מקפיאים, ואפילו קרח מתאימים אם אין אמצעים אחרים. ככל שהטמפרטורות מגדילות, גם הסיכון להתמוטטות החלבון הדיפרנציאלי עולה. ייצוב סוכנים כגון פתרון ייצוב רקמות יעילים בשימור שבריר החלבון של רקמות בטמפרטורת החדר ומתאימים לשימור לטווח קצר (עד שבוע אחד) כאשר הקפאת פלאש אינו בר קיימא.
הפרופיל האנזימטי של רקמה נתונה משפיע ישירות על שימור החלבון שבו. רקמות עם פעילות אנזימטית נמוכה כגון שריר יכול לשמר פרופילי חלבונים אפילו בטמפרטורות גבוהות יותר במקפיא ביתי. לעומת זאת, רקמת הכבד היא תגובתי אנזימקטיבית, והחלבונים שלו יש הסתברות גבוהה יותר של משפיל במהלך ההכנה. מספר גדל והולך של פרוטוקולים להשגת פרופילים פרוטמית אנושיים מ-formalin קבוע-מוטבע-פרפין (FFPE) דגימות מציע כי התיקון פאראפורמלדהיד של רקמות מחזיקה הבטחה לשימור בעלות נמוכה חלבון כאשר הקפאת על איסוף אינו ריאלי33,34. למרות מאוד תלוי בזמן ובמצב השימור, חלבונים זוהו באמצעות אימונוהיסטוכימיה מ-formalin קבוע, האתנול שהשתמרו דגימות העטלף35. גישה זו אינה מדרגית כדי פרוטמית ברמה הדגימה אבל מדגיש את הפוטנציאל formalin-ברמת רקמות קבוע להניב פרופילי חלבון כאשר הקפאת פלאש אינו זמין וסוכני ייצוב אחרים יקרים מדי.
רקמה לתרבית תאים
רקמת הדגימה והקפאת הבזק מציעים כמות מוגבל של חומר לשימוש, וברגע שהחומר משמש, הוא אינו זמין עוד. לחילופין, תרביות תאים מספקות תאים חיים שניתן להשתמש בהם באופן מיידי או להישמר למחקרים עתידיים. תרבויות גם להקל על התרחבות של תאים כדי להגדיל את התשואה כאשר דגימות רקמות קטנות. היא שימושית במיוחד במקרים בהם אוסף רקמות מוגבל, כגון ניסויים עם מינים נדירים שבהם הדגימה הלא קטלנית היא חיונית ולכן יש השלכות רחבות לשימור. תיאר הוא פרוטוקול שבו תרבות התא אפשרית באמצעות דגימה שאינה קטלנית של רקמת ממברנה כנף, אבל culturing אפשרי עם מספר סוגי רקמות36,37. הפרוטוקול שסופק כאן בוחר עבור תאים חסיד. השילוב של רקמות המקור ומדיית הגדילה המשמשים את הפרוטוקול הזה מתאים לבחור ולצמוח, אך אם תרצה, ניתן להשתמש בפרוטוקולים חלופיים כדי לבחור עבור סוגי תאים אחרים. בהקשר של פרויקט Bat1K, הוא ניבא כי עבור מינים נדירים ומאוימים, דגימה שאינה קטלנית של ממברנות כנף והתרחבות של דגימות דרך culturing היא חיונית כדי ליצור את נפח ה-DNA הדרושים עבור טכנולוגיות מרובות המועסקים5 .
לכידת בת
כל האנשים המטפלים בעטלפים צריכים להיות מאומנים על ידי חוקר עטלף מוכשר וחוסנו נגד כלבת עם סדרה של זריקות טרום חשיפה. אם ננשך, סדרה נוספת של זריקות לאחר חשיפה עדיין הכרחי. שיטות סטנדרטיות ללכידת עטלפים כוללות רשתות ערפל (איור 1) ומלכודות נבל (איור 2). רשתות הערפל משמשות בדרך כלל ואידיאליות לאזורים בעלי פעילות נמוכה עד בינונית, שכן הם דורשים את הטיפול הטוב ביותר לצמצום מצוקת העטלף. עטלפים קטנים פגיעים במיוחד ועלולים למות מלחצים אם לא נטו במהירות. בדיקות נטו תכופות ממזער את פגיעת העטלף ואת התמותה, כמו גם נזק לרשת הערפל. פרט זה חשוב כי אוסף הרקמה הנכונה דורש את הרקמה להיות רענן, ותשומת לב לא נאותה לרשתות הערפל בעטלפים יכול להוביל לתמותה מיותרת או תמותה מוקדמת לפני החוקר יכול לעבד כראוי דגימות. בגלל שכמה עטלפים יכולים לנוח במלכודת נבל עם מצוקה מינימלית, גישה זו אידיאלית לאזורים עם פעילות במחבט גבוהה, כגון ליד מערה או מקום גדול. הנחיות מפורטות עבור לכידת המחבט הנכון עיבוד נתונים עבור אוסף של מידע מורפולוגיים ודמוגרפיים זמינים בשיטות המשלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת אבן ברוק (פרוטוקול #2013-2034).
1. המתת חסד
- מויסטן כדור צמר גפן עם הרדמה. או הרדמה אחרת זמינה
- מניחים את כדור הכותנה לתוך שקית פלסטיק מחדש, אטום לאיטום. התיק צריך להיות גדול מספיק כדי להחזיק שקית בשקית העטלף בד בנוחות.
- לאחר מספר דקות של מתן שקית לחלחל עם הרדמה, המקום שקית עטלף המכיל את המחבט לתוך שקית ניילון.
- המתינו מספר דקות עד להמתת העטלף. עטלפים ~ 20 g או פחות במשקל דורשים כ 5 – 10 דקות. עטלפים גדולים מזה עשוי לדרוש עד 20 דקות. שים לב כי משך הזמן עשוי גם תלוי בחדירות של שק העטלף. מומלץ להשתמש בחומר הבד הדק ביותר האפשרי כדי למקסם את הדיפוזיה של ההרדמה.
- בדוק אם יש נשימה וקצב לב כדי להבטיח שהעטלף מורכך לפני תחילת החיתוך.
2. הכנה לחיתוך
- השאר את כל המכשור נקי בין הניתוח, באמצעות הפרוטוקול הבא.
- רוחצים מכשירים עם סבון מים ומכלים. נגב אותם עם 10% אקונומיקה, הרחק מאזור הניתוח, כמו אקונומיקה יהיה לשבור את חומצות הגרעין.
- . לנגב עם 70% אתנול
- . לנגב עם הטיהור של הריאוס
- חזור על מקטע זה לאחר כל ניתוח.
3. הכנת הבקבוקונים לדגימות רקמה
-
עבור RNA:
- הכינו את כל הבקבוקונים לפני שמתחילים בניתוח כדי למנוע עיכובים.
- להניח בצד את מספר הבקבוקונים הדרושים עבור כל דגימה. סמן כל צינור עם סוג הרקמה שייאספו, כמו גם מידע הזיהוי הסטנדרטי של הדגימה. מלאו את הבקבוקונים 50% מלאים בתמיסה מייצבת RNA ומקררים באופן אידיאלי עד 4 ° c.
- לדאוג לא למלא את הבקבוקונים לחלוטין עם פתרון מייצב RNA, אחרת הצינור עלול להתפוצץ כאשר ממקמים אותו ב LN2. בעת נטילת דגימות רקמה, זכור כי גושים גדולים של רקמות לא יהיה מחלחל במלואו על ידי ה-RNA ייצוב פתרון. לכן, לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות יותר מאשר 0.5 ס"מ בממד אחד, ולשמור על יחס של לפחות 10:1 נפח עבור ה-RNA מייצב פתרון: רקמות.
- לפחות, לגזור רקמות צריך להיות ממוקם ב-RNA ייצוב פתרון, גם אם גישה LN2 או קר מחסני בלתי זמין.
-
לבדיקת דנ א:
הערה: התוכן ה-DNA הגרעיני הוא זהה עבור כמעט כל הרקמות; לכן, הדגימה יכולה להיות גמישה. עם זאת, יש לציין כי צפיפויות גבוהות יותר של המיטו, ברקמת השריר עלול להוביל לאובדן קריאות עבור הגנום הגרעיני38.- עבור משקל מולקולרי נמוך DNA, לקחת אחד או יותר משכפל של קרום כנף לאחסון ב סיליקה, ו/או שריר לאחסון בפתרון ייצוב של RNA או פתרון ייצוב רקמות.
- עבור DNA אולטרה HMW, הקפאת flash ב LN2 ללא כל מגיב אחסון, ואז להעביר לאחסון לטווח ארוך ב-80 ° c או קר. מתוך ניתוח הגולגולת, רקמת המוח הוא סוג הרקמה המתאימה ביותר עבור אחזור ultra HMW DNA39, ואילו מן הניתוח בתוך הגולגולת, הכבד או השריר מתאימים יותר40.
- לניתוח הגולגולת, השתמש 5 מבחנות mL (בניגוד תקן 2 mL מבחנות) של RNA מייצב פתרון עבור רקמות מסוימות. . כל הבקבוקונים צריכים להיות מקריוגני שמור את הבקבוקונים על הקרח. בזמן שאתה מבתר
4. מפני הגולגולת עבור RNA
- מיד לאחר המתת חסד, ערוף את ראשו של הדגימה עם זוג מספריים גדולים או חותכי עצמות (איור 3).
- להסיר את העיניים עם מלקחיים באמצעות כוח חזק מספיק כדי לנתק את עצב הראייה. מניחים את העיניים ב 2 מ"ל בקבוקון של RNA ייצוב פתרון.
- באמצעות כלי הבחירה שלך, העור הגולגולת מן השיער, fascia, ושרירי הגולגולת, כולל את העור על האף. שמור על עצמך לא לשבור את החלק הקדמי של האף.
- באמצעות מספריים, לעשות חיתוך משונן על החלק הגחוני (איור 3) של הגולגולת מתחיל בצוואר, מטפלת לא לפגוע במוח.
- באמצעות מלקחיים, למשוך בעדינות את שני הצדדים של הגולגולת עד שהוא סדוק פתוח המוח חשוף.
- על הקצה של הגולגולת, הקוצ'ליק צריך עכשיו להיות גלוי מהצד בכל צד של הראש. הם קטנים, עצמות כדוריות בצד שמאל וימין, רק rostral לצוואר האחורי של השרירים מעסים. באמצעות מלקחיים, בעדינות למשוך את שבלול ולשים אותם בבקבוקון 2 מ ל של RNA מייצב פתרון.
- בעדינות לגרד את המוח (אשר יהיה רך מאוד) עם מלקחיים. נורת הריח תהיה גלויה, יושבת בחלק הגחוני של הפנים של הגולגולת. נסה לשמור על הנורה. מחוברת לריח
- אם נורת הריח לא הוסר כבר, בעדינות לגרד את הרקמה, ואת צלחת cribriform יהיה לעין. זוהי עצם קריטית כדי לשמור על החוקרת בכיוון. זה יכול להיות מזוהה כאזור הקדמי ביותר של הגולגולת עם מספר foramen ואת הנקודה שבה שני חריצים שבו הנורה הריח נח.
- אם אפשרי, לשמור על צורת המוח שלם ומקום מיד על קרח יבש כדי לשמור על צורה או בקבוקון 5 מ ל של RNA מייצב פתרון. אם הוא ייעשה במוח, במקום 4% פאראפורמלדהיד, אם הוא זמין.
- הפוך שני חתכים לבין הלסת העליונה והתחתונה להצטרף, ולהסיר את הלסת התחתונה.
- לאחר הסרת הלסת התחתונה, להסיר את הגליל (הלסת העליונה) מהחלק הנותר של הגולגולת. ודא כי הלסת כוללת את לוחית הקריבריפורם.
- מניחים את האף ב-RNA ייצוב פתרון וחנות ב 4 ° c בלילה. מכיוון שזו רקמה צפופה, זה דורש זמן כדי לאפשר הפתרון מייצב RNA כדי לחלחל את הרקמה כולה.
- מניחים את בקבוקון האף ב LN2 בעקבות הטבילה לילה בפתרון מייצב RNA.
- מתוך הלסת התחתונה, חותכים את הלשון עם מספריים ומניחים בבקבוקון 2 מ ל של RNA למועד מאוחר יותר.
- הפרוטוקול הזה מאבד. את רוב הגולגולת שיניים, במיוחד אלה מן הלסת התחתונה, ניתן לשחזר ועשויים להיות שימושיים עבור אבחון מינים. רקמת עצם ניתן לאחסן בתמיסת מלח 1 x פוספט באגירה (PBS).
5. הניתוח הפוסטגולגולתי לרנ א
- השתמש אזמל לחדור דרך חלל הבטן, עושה חתך האורך עד הצלעות (איור 3). . זה מאבד את מסגרת השלד אם העצם היא להישמר, לנתח בזהירות מהעור בשריר ובחנות ב-1x PBS לאחר ניתוח רקמות רכות הושלמה.
- להסיר את העור כדי לחשוף את שריר החזה, לקחת לפחות שתי דגימות של שריר, אחד עבור RNA הפתרון ייצוב אחד להישאר קפוא עבור ה-DNA HMW, הצבת מיד במבחנה לשים לתוך LN2.
- חותכים את עצם החזה ומושכים את הצלעות כדי לאסוף דגימות מהריאות.
- לאסוף את הלב, אשר ניתן לקחת שלם אבל צריך להיות מנות בחצאים, אז RNA ייצוב פתרון מעמיק.
- . קחו דגימות מהכבד לקחת לפחות שני דגימות של הכבד, אחד להישאר קפוא עבור ה-DNA HMW, הצבת מיד במבחנה ריקה לשים לתוך LN2. הכבד הוא מאוד אנזימטי, וחשוב להפוך את הדגימות קטן מספיק עבור RNA מייצב פתרון כדי להשרות במלואו.
- צינור הכבד, אשר פונקציות לנקז את המרה מן הכבד, מחבר את הכבד ללבלב והמעי הדק. כלי זה ניתן לזיהוי בקלות על ידי בדיקת החלק הנחות/האחורי של הכבד לעקוב אחר כלי הקיבול באופן אחורי. הצינור הוא לעתים קרובות צבע ירקרק, כמו גם. בצע את צינור הכבד כדי למצוא את הלבלב ואת כיס המרה ולאסוף אלה בנפרד. מקום בבקבוקונים בהתאמה של הפתרון מייצב RNA.
- לאסוף את הקיבה, לידו, בבסיסו ולהופיע כגוון שונה של סגול, הוא הטחול כמו נוצה. הלבלב צריך גם להיות גלוי כאן כמבנה לבן (איור 3). מקום בבקבוקונים בהתאמה של הפתרון מייצב RNA.
- לאסוף דגימות קטנות של המעי הגס קטן וגדול. מקום בבקבוקונים בהתאמה של הפתרון מייצב RNA. ניתן גם לאתר את המעיים לעין. אם פרזיולוג נמצא בשטח, ניתן לבצע בדיקה לטפילים. אם זה נעשה במועד מאוחר יותר, את המעי כולו ניתן לקחת ב 5 מ ל בקבוקון קריוגני.
- קח את אחת הכליות ובצע את הצינורות שלהם אל שלפוחית השתן. מקום בבקבוקונים בהתאמה של הפתרון מייצב RNA.
- השתמש בכליה אחרים כמדריך למצוא את האשכים (אם זכר) או הרחם דרכו את השחלות (אם נקבה). לאסוף אחד או שניהם הגונדות, אם אפשר.
- שמרו דגימות של חלקים שונים של העור של הכנף בבקבוקונים נפרדים (שרירי לעומת חלק לא שרירי).
6. מקבץ ומכנה תרבות רקמה
- הכנת בינוני גדילה עבור התאים על ידי הפיכת מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 20% סרום בפרה העובר (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), ו 50 μg/mL ג'אמיאמצין. מדיית הצמיחה צריכה להיות טרייה בכל יום של הפרוטוקול.
- לאחר איסוף, אגרופים כנף ביופסיה חייב להיות ממוקם ישירות ב 1 מ ל של גידול קר בינוני בתוך היטב אטום 1.5 mL שפופרת צנטריפוגה. . עטוף את הצינור בפראפilm כדי לאטום
- לאחר מכן, יש להעביר את הצינורות בקופסת פוליסטירן עם אלמנטים מצוננים כדי לשמור דגימות ב -4 ° c. התחבורה צריכה להיות מואצת; למרות, תאים בריאים יכולים להיות עשויים מאגרופים כי אוחסנו בצורה זו עד 6 ימים, אך פחות מיטבי23.
- לאחר הועבר למתקן תרבות רקמות, הפרוטוקול הבא יכול לשמש כדי ליצור תרביות תאים. יש להשתמש בטכניקות סטרילי סטנדרטיות עבור שאר הפרוטוקול41.
7. יום 1 רקמה תרבות: דיסוציאציה של רקמה
- העבר את התוכן של הצינור (בינוני גדילה המכיל את הביופסיה רפידת הכנף) לתוך שפופרת צנטריפוגה a 15 מ"ל.
- הסר בזהירות את מדיום הגידול. לשטוף בעדינות את הביופסיה פעמיים פעמיים עם 500 μL של ה-PBS הסטרילי.
- הוסף 500 μL של הקולגנאז IV (1 מ"ג/mL) לשפופרת. זה יגרום לעיכול של הרקמה לתוך תאים בודדים.
- דגירה לילה (מקסימום 16 h) ב 37 מעלות צלזיוס ללא עצבנות.
8. יום 2 התרבות רקמה: ציפוי תאים
- הפוך מדיום צמיחה טריים ולחמם אותו מראש עד 37 ° c.
- הכן 6 היטב התרבות רקמה על ידי הוספת 2 מ ל של טרי, טרום מחומם בינונית צמיחה בכל הטוב של הצלחת לשמש (1 טוב לאגף 3 מ"מ ביופסיה). אחסן צלחת זו ב 37 ° צ' ו 5% החממה CO2 עד הצורך (שלב 8.7).
- הסר את השפופרת 15 mL המכילה את התאים מתוך החממה וכיבוי תגובת העיכול על ידי הוספת 1 מ ל של גידול טרי בינונית (טרום מחומם עד 37 ° c).
- להשעות את התאים על ידי בזהירות triturating הפתרון עם קצה P1000 tte להשיג השעיה תא יחיד.
- בעדינות לסובב את התאים בצנטריפוגה השולחן העליון עבור 3 דקות ב 300 x g.
הערה: חתיכות קטנות של רקמה עדיין יכול להיות גלוי או השעיה או מחובר לקיר של שפופרת 15 mL. עם זאת זה לא השפעת ההשעיה התא הכנה - התעלם מהסופרנטנט על-ידי הסרה עדינה של 80%-90% מהנוזל עם פיפטה P1000.
הערה: אם עדיין גלוי, אל תמחק את פיסת הרקמה, ובעדינות לבצע אותו בשלב הבא (8.7). - השהה מחדש את הגלולה ב-500 μl של בינוני מראש צמיחה מחומם, בעדינות קצוצות ההשעיה כדי להבטיח את הגלולה או שברי גדול של הגלולה הם כבר לא גלויים, כי תאים מושעים מספיק. המדיה עלולה להיראות מעורפלת עקב הימצאות תאים.
הערה: בשלב זה, ספירת תאים קיימא ניתן לבצע כדי להעריך את האיכות של ההשעיה תאים ותשואה של תאים נגזר קליפ כנף (ראה שלב 10.11 לפרטים נוספים). - מפיקת בעדינות את כל הנפח של התא מושעה לתוך באר אחת של 6 היטב צלחת.
הערה: בצע את הצעד לעיל מיד ולא לאפשר לתאים להתיישב לאחר שלב 8.7. השתמש בפיפטה כדי להפיץ בעדינות את ההשעיה של התא על פני השטח של הבאר באופן dropwise. אין להכניס את הפתרון כולו למרכז הבאר, משום שפעולה זו תגרום לתאים המקרקהים באמצע הבאר.
הערה: אם פיסת הרקמה עדיין גלויה, אל תעביר אותו לכלי התרבות היטב. - טלטל בעדינות את הצלחת מצד לצד ומגב ל-2x-3x כדי לסייע לתאים לפזר על משטח הבאר בשכבה אחת.
- בדוק את התאים מצופה מתחת למיקרוסקופ, כפי שהם צריכים להיות תאים בודדים המופיעים התגלגל וצף אבל צפוף מאוד.
- בזהירות למקם את הצלחת לתוך חממה מראש מוגדר ל 37 ° c ו 5% CO2.
- לאחר ~ 24 h, להתבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לקבוע את הבריאות של התרבות. התאים צריכים כעת להיות מחוברים למשטח הצלחת ומופיעים משוטחים (איור 4A). סוגי תאים שונים עשויים להיות גלויים בתרבות כאשר מסתכלים דרך המיקרוסקופ.
- סביר להניח שיהיו כמה תאים צפים שלא צורפו. . חלק מהתאים האלה מתים אם יש שיעור גבוה של תאים צפים גלוי בבאר, יש לרענן את המדיה. במקרה זה, מתיף בזהירות ~ 50% של המדיום מן הבאר ולהוסיף בעדינות 1 מ ל של המדיום צמיחה מחומם מראש לצד הבאר כדי לא להפריע את התאים.
- שמרו על התאים בחממה שנקבעה מראש ל-37 ° c ו-5% CO2. תאים צריך להיות נצפתה תחת המיקרוסקופ באופן קבוע (אבל לא יותר מפעם אחת ביום) כדי לקבוע את הצורך בכיבוד מדיה או פיצול.
הערה: כאשר התאים מצופים לאחרונה, הם לחלק במהירות ולכן יש לבדוק כל יום. לאחר זמן מה בתרבות, הצמיחה איטית, והם יכולים להיבדק כל 48 עד 72 h.
9. מרענן מדיה
-
בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ באופן סדיר כדי להתבונן הצמיחה שלהם איכות התרבות. נטר את צבע המדיה כמחוון לאיכותו. התאים צריכים להישאר באותו מדיה למשך שלושה ימים לכל היותר, או עד שיהיה צורך לעבור לפני הזמן, מה שיבוא ראשון.
- אם התאים גדלים במהירות ומתישים את התקשורת, זה יהיה גם גלוי לעין, כמו צבע המדיה יהפוך מאדום לצהוב.
- בכל פעם שצריך בזהירות ומתן בקפידה את ~ 50% של המדיום מן הבאר ולהוסיף בעדינות בערך אותו נפח של בינוני טרום הצמיחה המוקדמת לצד הבאר כדי לא להפריע את התאים.
- החזר את התאים ל-37 ° צ' ו-5% בחממה2 %.
10. הפסייאייג ' תאים
- התאים מתייחסים לתרבות קיימת ומפצל אותו לבארות חדשות. כאשר התאים הם ~ 80% confluent [קרי, כאשר הם תופסים ~ 80% מהמשטח של הבאר ורק ~ 20% מהפלסטיק עדיין גלוי כפערים (איור 4B)].
- מתיף בזהירות ומתעלם ~ 90% מאמצעי הצמיחה.
- לשטוף את התאים בעדינות רבה על ידי הוספת 1 מ ל של PBS סטרילי לקיר של הבאר כדי לא להפריע את התאים. מטלטל בעדינות את הצלחת הלוך ושוב ומצד 2 x – 3x. . ולהשליך את כל הערוץ מהצלחת
- חזור על שלב 10.3 כדי לשטוף את התאים שוב.
- הוסף בעדינות 250 μL של טריפסין-אדטה (סיגמא אולדריץ ', Cat #T4049) לבאר ולדגירה של 1.5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ודא שהפתרון של טריפסין-אדטה מכסה את כל המשטח של הבאר על ידי הנדנדה העדינה של הצלחת. - להרוות את התגובה על ידי הוספת 1 מ ל של מדיום טרי מראש צמיחה מחומם.
- פיפטה למעלה ולמטה ~ 5x כדי לשטוף את התאים מהמשטח של הצלחת ולהבטיח את התאים הם ההשעיה.
הערה: הפתרון צריך להיות מעונן עקב נוכחות של התאים. - מקום ההשעיה התא ב 15 מ ל שפופרת ספין למטה את התאים ב צנטריפוגה השולחן העליון עבור 3 דקות ב 300 x g.
- התעלם מהסופרנטנט על-ידי הסרה עדינה של 80%-90% מהנוזל עם פיפטה P1000.
- השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של הצמיחה הקדם מחומם מראש ובעדינות קצוצות ההשעיה. ודא כי הגלולה או שברי גדול של הגלולה אינם גלויים עוד, ותאים נמצאים בהשעיה תא אחד.
- ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי כפי שמתואר כאן, או באופן ידני על-ידי שימוש באמצעות הומוציטוטומטר כמתואר בפירוט בסרטון הייחוס42. מערבבים 10 Μal של התאים המושהים 1:1 עם הכחול של טריבין כדי לזהות תאים שאינם פעילים.
- דגירה של 1 דקות, ואת פיפטה 10 μL של הפתרון על שקופית ספירה. הכנס את שקופית הספירה לתוך מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים באמצעות ההגדרות המתאימות. התשואה צריכה להיות סביב 1 – 2 מיליון תאים מבאר יחיד ושוטפת של 6 היטב צלחת, למרות שזה עשוי להשתנות בהתאם לגודל של תאים ומינים. אם תאים אינם נמצאים בהשעיה של תא אחד, ספירת התאים לא תהיה מדויקת.
- תרביות תאים אלה בדרך כלל לסבול 1:2 מפוצל [i.e., אחד היטב שוטפת של תאים ניתן לפצל לשתי בארות חדשות (סה כ)]. כדי לעשות זאת, בעדינות קצוצות את התאים שוב, ואז לקחת את ההשעיה התא בשני חצאים (~ 730 μl כל אחד) ולמקם אותם לתוך כל אחת משתי בארות חדשות המכילות 750 μl של טרום הצמיחה בינונית באופנה dropwise.
הערה: אחרי 2-3 ימים הבארות צריכות להיות מוכנות ושוב להתפצל. בשלב זה, מומלץ לשמור על תאים מסוימים על-ידי פרוטוקול ההקפאה הניכרת (סעיף 11). מלאי נוסף של תאים יכול להיות קפוא במהלך קטעים נוספים רצוי.
הערה: לאחר ~ 6 מעברים, התאים נוטים להיכנס הזדקנות ולא להתחלק יותר. זהו סימן לכך שלא ניתן עוד לפצל או להרחיב את התאים כדי להגדיל את מספרי התאים. זהו גם אינדיקציה כי התאים לא יהיה בר קיימא לעוד הרבה זמן.
11. הקפאת תאים חיים קיימא
- הכינו מדיה מקפיאה על-ידי שילוב DMEM עם 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S, ו 50 μg/mL בג.
- הקפאת מבוצעת על-ידי נטילת תאים מסוימים לפי התהליך. הגלולה צריכה להיות מוכנה מ-80%-90% היטב של 6 הצלחות היטב (המייצגים ~ 1 – 2 מיליון תאים), לפי שלבים 8.1 – 8.9.
- להשעות מחדש את הגלולה ב 1.5 מ ל של הקפאה בינונית.
- מקום ~ 750 μL של השעיית תא בכל אחת משתי הקריוצלוחיות נפרדות.
- הניחו את הבקבוקונים במיכל הקפאה קריוגני, שתוצאתה הקפאת התאים באיטיות כדי לשמור על חיוניות התא. מניחים אותם באופן מיידי ב-80 ° c.
- לאחר 24 – 48 h, להעביר את הקריובקבוקונים של תאים LN2 לאחסון לטווח ארוך. מאוחסן בדרך זו, תאים ניתן להחיות ויהיה בר קיימא במשך שנים.
12. תאים קפואים התאגף
- להכין 6 צלחת היטב המכיל 2 מ ל של הצמיחה הקדם מחומם בינוני בכל טוב שישמשו (1 היטב לבקבוקון של תאים המופשרים). לשמור על הצלחת ב 37 ° צ' ו 5% החממה CO2 עד הצורך.
- קח בקבוקון אחד של תאים מ LN2 ומניחים אותו באמבט מים חמים (37 ° c) כדי להפשיר במהירות תאים. זה אמור לקחת 2 – 3 דקות.
הערה: אין להשאיר את הבקבוקונים התאגף במשך יותר מ 3 – 5 דקות, כמו DMSO במדיה הקפאה הוא רעיל את התאים ברגע הופסדר. - ברגע הפתרון במבחנה הוא הפרה, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי המגון לסדר את הפתרון ולמקם מיד את הפתרון כולו (~ 750 μL) אחד טוב של 6 צלחת הבאר (מוכן מראש בשלב 12.1).
- בעדינות לנדנד את הצלחת מצד לצד לאחור 2 – 3 פעמים כדי לעזור תאים לפזר על משטח הבאר בשכבה אחת.
- מניחים את התאים בחממה ב 37 ° צ' ו 5% בחממה2 % עבור 24 – 48 h.
- הצג והעבר את התאים כמתואר לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA
עבור משקל סטנדרטי מולקולרי נמוך (LMW) ניתוחים, ה-DNA הופק מתוך שלושה מינים neotropical עטלפים. דגימות רקמות נאספו בשדה מהרפובליקה הדומיניקנית וקוסטה ריקה, בעקבות הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה. בעקבות ניתוח, חתיכות קטנות (< 0.5 ס מ בחלק הדק ביותר) של רקמות מעורבות (המוח, הכבד והמעיים) הוצבו בפתרון מייצב RNA, הבזק קפוא, ולאחר מכן מאוחסן ב-80 ° c. העקירות בוצעו באמצעות פרוטוקולים החילוץ תקן DNA עם RNase טיפול43. הערכה של שלמות ה-DNA עם כלי אלקטרופורזה אוטומטית חשף את הפסגות לדוגמה הבאה של גודל קטעים: מינים 1 (שני עקירות נפרדים) הורכב 22 kb ו 20 kb; מינים 2 כללו 25 kb; ומינים 3 מורכב 24 kb (איור 5, שולחן 2).
ה-DNA שחולצו עבור רצף הדור השלישי נדרש להיות נאסף בריכוזים גבוהים ומקוטעת מינימלית. ה-DNA HMW שחולצו מרקמת המוח הקפואה הבזק מעטלף פרי העולם הישן (Eאלילים on helvum) שנאסף בגאנה הושג. ה-DNA של HMW הופק באמצעות פרוטוקול החילוץ ביונאנו לניתוח הבאים על פלטפורמת Irys. ה-DNA הזה היה 607,463 Mb אורך והיה לו N50 מולקולרית ממוצע של 194.5 Mb.
RNA
מחוון נפוץ של הצלחה עבור עקירת RNA הוא הערך מספר שלמות RNA (RIN). לעתים קרובות זה לא מומלץ על ידי מתקני רצף לבצע הכנה לספרייה RNA-seq או פרוטוקול רצף כאשר לעקירות יש ערך RIN פחות משמונה, כערכים מתחת לסף זה מתחילים להפגין חתימות גבוהות של השפלה44 ,45. איור 6 מציג את ערכי רין לעקירת RNA של סוגי רקמות שונים בעקבות פרוטוקול זה. הפקת רקמות שנאספו עם הפרוטוקולים הביא באיכות גבוהה RNA, ללא תלות בתחום דיגום השדה. כאשר LN2 לא היה זמין מיד אמזון, הרקמות הוצבו ב-RNA ייצוב פתרון ושמרו על 4 ° צ' במשך 1 שבוע עד הניח לתוך LN2. גם במקרים כאלה, ערכי RIN היו דומים לאלה שהונחו מיד ב-RNA ייצוב פתרון וישירות לתוך LN2. רנ א ייצוב פתרון הוא סוכן ייצוב חיוני.
תרבית רקמה
מיד לאחר הציפוי, התאים יהיה התגלגל וצף. עם זאת, בתוך 24 שעות, הפיברופיצוצים צריך לשטח ולהצמיד למשטח של הצלחת (איור 4A). בשלב זה, התאים צריכים להיות בערך 20%-30% זרימה כדי להבטיח הישרדות. ערך נמוך מזה עלול לגרום למותם של התרבות כולה. בתחילה, הם חייבים להיות בשפע מקום בין השני כדי לאפשר הרחבה, כמו התאים יהיה להפריד ולהרחיב בתרבות. הם צריכים להתפצל כאשר הם מגיעים 80%-90% המפגש (קרי, הם מכסים את > 80% של משטח הצלחת (איור 4B)]. בדרך זו, ניתן לשמור על התאים בתרבות עבור מספר מעברים (בדרך כלל > 6 מעברים) לפני שעברו הזדקנות. אם התאים נשמרים בתרבות מעבר לזמן זה או לא לפצל כאשר הם נעשים שוטפת, הם עשויים לשנות את המבנה ולהיות גדולים יותר ויותר (איור 4C). תאים עם מורפולוגיה זה יכול עדיין להתחלק, אבל זה בדרך כלל מעיד כי התאים הם או בקרוב להיכנס הזדקנות והוא לא יוכל עוד להישמר או התרחב בתרבות.
איור 1: מערכת נפוצה לרשתות ערפל כדי ללכוד עטלפים ביער. שמירה על יד אחת מכוסה תוך הימנעות עם היד הנגדית היא דרך להסיר בבטחה את המחבט תוך מזעור הלחץ. התמונה הזו צולמה. ע י ג'ון פלנדרס אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מלכודת נבל משמשת לעתים קרובות ללכידת מערות מחוץ למערות, לצריחים גדולים או לנוסעים. עטלפים יצטברו בכיס התחתון של המלכודת עם שזירה מינימלית והסרה קלה על ידי החוקר. התמונה הזו צולמה. על ידי סטיבן רוסיטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זרימת עבודה של ניתוח ודגימת רקמה להכנת רקמת RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מגוון תרבויות התאים הנגזרות מאגרופים כנף של לטשטש או. (א) 24-48 h לאחר ציפוי, תאים יהפכו להיות משוטחים ולצרף למשטח הצלחת. (ב) התאים מכסים 80%-90% ממשטח הצלחת ושומרים על המבנה המקורי. זה מייצג את השלב האופטימלי לפיצול. (ג) לאחר > 6 מעברים, התאים ישנו את המבנה שלהם כדי להיות גדולים יותר ויותר, והתאים ייכנסו הזדקנות. בכל התמונות, תאים בהירים ומוארים מייצגים תאים מתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות של עקירת dna משימור עבור ניתוחי dna סטנדרטיים ממינים שלושה עטלפים, ה-dna הופק פעמיים מן המינים 1. להקה גדולה בודדת מציינת פיצול מינימלי ושברי בגודל דומה של דנ א מכל הוצאה בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מספרי שלמות rna (RIN) של שעקירות rna מ -13 סוגי רקמות שונים ממינים מסוג עטלף טרופי שנדגמו בארבע יישובים שונים. עקירות אלה הוכנו בעקבות הפרוטוקול המתואר ולאחר מכן שימשו כדי להכין את HiSeq/Nex, הארת המאייר ספריות הטרנס. מו הוא האפיתל הריח העיקרי. VNO הוא האיבר הvomאפי. רקמות שנדגמו ממינים בהרי האנדים, קוסטה ריקה והרפובליקה הדומיניקנית הוצבו ישירות ב-LN2 לאחר שהשריה בתמיסה ייצוב של RNA ב -4 ° c בלילה. רקמות שנדגמו ממינים באמזונס הוצבו ב LN2 כ 1 שבוע לאחר הצבת RNA ייצוב פתרון ושמרו על 4 ° c ברציפות. N מייצג את מספר האנשים המיוצגים עבור כל הפקת רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| יישום | הבזק מוקפא (L2) | . לנאלטר | להגן על | מיכל בע | דיה |
| דנ א גבוה של MW |  |
 |
|
|
|
| דנ א של MW נמוכה | |
|
|
|
|
| RNA | |
|
|
|
|
| חלבון | |
|
|
|
|
| תרבית תאים | |
|
|
|
|
טבלה 1: סקירה של שיטות ויישומים לשימור. MW = משקל מולקולרי, FFPE = formalin-קבוע פרפין-רקמה מוטבעת. סימני הביקורת מציינים את שיטת השימור המועדפת עבור כל יישום מיועד. סימני X מציינים preservations שאין להשתמש בו.
| מזהה מין | מזהה דוגמה | ריכוז (ng/μL) | גודל לדוגמה מידת שיא (bp) |
| מינים 1 | 1.1 | 31.8 | 21,885 |
| 1.2 | 22.8 | 19,633 | |
| מינים 2 | 2 | 30.4 | 25,198 |
| מינים שלושה | 3 | 32 | 24,386 |
שולחן 2: תוצאות מייצגות עבור עקירת DNA על בסיס שיטות שימור בפרוטוקול זה. הערכים מקבילים לאלקטרופורזה בבארות של הג מאיור 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנדון בכתב יד זה מתאר את נוהלי הדיגום הטובים ביותר לניתוח מולקולרי בתפוקה גבוהה של עטלפים. כל מחקרים מצליחים-omics דורשים רקמה באיכות גבוהה, אבל רקמת העטלף, כמו גם אחרים שאינם מודל אורגניזמים, מתרחשת לעתים קרובות בתנאי שדה, כי לא ניתן להגדיר את אותם סטנדרטים כמו אלה של הגדרת מעבדה מבוקרת. הדגימה מתרחשת לעתים קרובות במיקומים מרוחקים, עם משאבים מינימליים, כולל גישה מוגבלת לחשמל ומקפיאים. זה קשה, ולעתים קרובות בלתי אפשרי, כדי להבטיח תנאי דגימה סטרילי לחלוטין. לפיכך, מתוארים הפרוטוקולים המזוהים כאלה המצליחים ביותר במגוון יישובי הדיגום ובתנאי שדה. על מנת לקבל שיטות דיגום סטנדרטיות ליוזמה הBat1K ולמאמצים ולפרויקטים נלווים, מוצעת העובדה כי ביולוגים מהביולוגים מנהלים את הפרוטוקולים הללו תוך תכנון משלחות שדות למידה המותרת.
הצעות פרוטוקול
בעוד שדחיסת החזה הייתה גישה משותפת להמתת החסד בעבר, היא הציעה לעולם לא להשתמש בדחיסת החזה כדי לאסוף העטלפים עבור ניתוחomics . אין זו עוד צורה מקובלת של המתת חסד בארצות הברית46, ושיטה זו עלולה להוביל להתדרדרות אנזימטית של מגוון של רקמות, לא משנה את מינים של ריבית47. אם בעלי חיים מורדמים, הוא הציע כי הרקמה של הניתוחים הן גנומית והן ניתוח הטרנססקריפט ייאספו. שניהם דורשים לאסוף רקמה טרייה כי יהיה אידיאלי להיות פלאש קפוא ב LN2, אבל זה יכול גם להיות מאוחסן במדיה שונים כדי להקל על DNA, RNA, או החילוץ חלבון. הוא הציע לעבוד במקביל עם שני אנשים בתוך הגולגולת הגולגולת ניתוח להפחתת השפלה של RNA ברקמות. אדם אחד צריך לנתח את הגולגולת. בזמן שהשני עובד על הגולגולת
המגבלות המרכזיות של ביצוע פרוטוקולי הניתוח כוללים את העובדים המעורבים בניתוח ובמרחב הזמינים לשימור רקמות (למשל, במיכל LN2). הכנת מבחנות מראש ומספר מספיק של אנשים כדי לסייע עם שפופרות תיוג ותיעוד מבחנות ורקמות שנאספו יתרום לחלק עיבוד לדוגמה. יצוין כי התיעוד הנכון של דגימות חיוני כדי להשיג את הצורך (ייצוא, ייבוא) תהליכים. פרוטוקול הניתוח הפוסט-גולגולתי, למשל, דורש יותר מ -20 מבחנות לכל חיה.
אם המרחב והזמן מוגבלים, הפרטים הבאים צריכים להיות בעדיפות גבוהה: 1) קביעת עדיפות עבור דגימה אחת עבור מינים, או לכל הפחות, דגימה אחת לכל סוג; קביעת סדרי עדיפויות עבור הדגימה זכר כדי לאפשר רצף של כרומוזום X ו-Y ומזעור ההסתברות לדיגום נקבה הרבייה; 2) עבור ה-DNA HMW: המוח, השריר, והכבד צריך להיות פלאש קפוא ללא כל מגיב; 3) עבור RNA: המוח, רקמות העיכול, הטחול ואברי החישה הם בעדיפות גבוהה. כל דגימת רקמה צריכה להיות מאוחסנת בפתרון מייצב RNA. יש לנקוט גם ברקמת שריר כבקרת ניתוח ביטויים של רקמה מיוחדת; 4) לכל הפחות, הרקמות יש לשמור קר; 5) הזמינות של LN2 עשויה להיות גם דאגה. LN2 טנקים צריך להיות ממולא במינימום כל שבועיים, אבל לעתים קרובות יותר באקלים חם יותר או אם הטנק פתוח לעתים קרובות. LN2 הוא לעתים קרובות זמין מסחרית בכל המדינות, כפי שהוא משמש לעתים קרובות בחקלאות ובריאות כדי להעביר דגימות. בדרך כלל שירותים אלה מסופקים על ידי חברות המוכרות גם גזים אחרים, כגון פחמן דו חמצני או חמצן. חנויות גלידה לפעמים מציעים אפשרות נוספת עבור קרח יבש או LN2 (או לפחות לספק המלצה לרכוש), והוא הציע לבקש העובדים המקומיים לקבלת סיוע זה; 6) איור 6 מתווה שעקירות הרקמה המוצלחת עבור כמה משלחות אוסף שבו התנאים היו מוגבלים.
עם יותר אנשים ומרחב יותר, רקמות יותר ניתן לאסוף בדרכים שונות. להלן פרוטוקולים נוספים שפורסמו במקום אחר כי החוקרים צריכים לשקול אם את הניסיון ואת החומרים הנכונים זמינים: 1) העטלף מטבולי, או את כל משפני המשקל הנמוך-מולקולרי של תאים ורקמות, יכול לספק תובנה על אריכות ימים של עטלף יוצא דופן או שינה ודרישות טיסה מטבולית. יש לאסוף דם מכלי דם נגיש בקלות, כגון ורידי הקרסול, לתוך מבחנה עם הפארין48, ודגימות צואה אמורות להיות קפואות ב LN249; 2) immunomics, או התגובה של בעל החיים כדי פתוגנים, ניתן לנתח על ידי נטילת הפמרים ו humeri והצבת אותם בפתרון התרבות רקמה מקרופאגים תרבות במורד50; 3) צואה עשוי להיות שימושי עבור שני סוגים של במורד הגרעין-חומצה מבוססת ניתוח מבוסס, כגון קביעת דיאטה51 ובודק את מיקרוביome בטן52,53,54. בשני המקרים, ריאגנטים כגון פתרון ייצוב רקמות להפחית את ההשפלה של משתנים נדירים נוכח צואה; 4) lipidomics, או repertoires פוספוליפיד של סוג של רקמה, יש כבר חושף בהבנת תסמונת האף הלבן הפתוגן פטרייתי55,56. הכנת רקמות הוא הציע לקפוא מיד לאחר הניתוח.
ארכיון רקמות עבור Bat1K
Bat1K שואפת לשמור על בנק רקמות של כל עטלף בודד המשמש להפקת genomes. כיום, אלה בנקים רקמה הנתונים הרלוונטיים הפרטים האקולוגיים שנאספו לכל אדם מתוחזקים במעבדות/אוספי המוזיאון של חברי Bat1K תורמים. ככל שהפרוייקט מתקדם, Bat1K לרכז ולתחזק אוספי רקמות ומאגרי מידע רלוונטיים באמצעות מאגרים המחוברים לרשת כגון רשת הביולוגית העולמית < http://www.ggbn.org/ggbn_portal/>.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים סנטרו de Ecología y Biodiversidad CEBIO, אריקה פעליזה, מילסקה סנצ'ז, חורחה קאררה, אדגר Rengifo Vásquez, הרולד Porocarrero Zarria, חורחה Ruíz Leveau, חיימה פצ'קו קסטילו, קרלוס Tello, פאני קרניות, ו פאני פראנדס מלו להכנת רקמות קולקציה בפרו אפשרית. כמו כן, אנו מודים לכל חברי גריפו ג'אגואה ויולנדה לאון על הכנת אוסף רקמות ברפובליקה הדומיניקנית, כמו גם לברnal רודריגז הרננדז, ברנל מאטאריטה, וכולם בתחנת המחקר הביולוגית לה סלבה בקוסטה ריקה, להכנת ניתן לדגימה. אנו מודים לה לאטטנקמפ & לוץ וייגרבה לקבלת גישה ואוסף דגימות של אגרופים מהאגף מתוך לטשטש את העטלפים ליצירת תרבות סלולרית. העטלפים מקורם במושבת הרבייה בביולוגיה המחלקה השנייה של אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן במינכן. אישור לשמור ולקיים את העטלפים הונפק על ידי המשרד הוטרינרית במחוז מינכן. LMD, SJR, KTJD, ו LMD מומן על ידי NSF-דאב 1442142. LMD מומן על ידי NSF-דאב 1838273. LRY מומן על ידי NSF-PRFB 1812035. SCV ו-PD מומן על ידי פרס קבוצת מחקר Max פלאנק, ו תוכנית המדע גבולות האדם (HFSP) מענק מחקר (RGP0058/2016). SJR, JHTP, ו KTJD מומן על ידי מועצת המחקר האירופי (ERC החל מענק 310482 [EVOGENO]) הוענק SJR, ECT מומן על ידי מלגת מועצת המחקר האירופי (ERC-2012-StG311000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3 mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| Collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
References
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen? Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , Museum of Texas Tech University. (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Schaumburg, IL. (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity? PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
