Summary
Bu, vahşi doğada yakalanan yarasaların genomik, transkripsiyonik ve proteomik analizleri için en uygun doku hazırlığı için bir protokoldür. Bu yarasa yakalama ve diseksiyon, doku koruma ve yarasa dokusunun hücre culturing için protokoller içerir.
Abstract
Yüksek iş hacmi ne kadar çok yönlü sektirme teknolojileri ilerledikçe, yüksek kaliteli doku edinimi ve korunması için standartlaştırılmış yöntemler, bu yöntemlerin model olmayan organizmalara uzatılmasına olanak sağlar. Yarasalardan doku toplanmasını optimize etmek için bir dizi protokol, bir dizi yüksek iş elde li sıralama yaklaşımı için geliştirilmiştir. Burada özetlenen yarasaların yakalanması için protokoller, her yarasa için toplanacak istenen demografik ve doku toplama sırasında bir yarasa üzerinde stresi en aza indirmek için optimize yöntemleri vardır. Yüksek molekül ağırlıklı genomik analizler için (i) DNA, (ii) dokuya özgü transkripsiyonlar için RNA ve proteomik düzey analizleri için (iii) proteinler elde etmek için doku toplama ve tedavi yöntemleri özellikle özetlenmiştir. Son olarak, aynı zamanda kanat klipleri canlı birincil hücre kültürleri oluşturarak ölümcül örnekleme önlemek için bir yöntemdir. Bu yöntemlerin temel motivasyonu, her yarasa için potansiyel moleküler ve morfolojik veri miktarını en üst düzeye çıkarmak ve gelecekte yeni yöntemler geliştikçe değerlerini koruyabilmeleri için dokuları korumak için en uygun yolları önermektir. Bu standardizasyon, dünya çapında türlerin kromozom düzeyinde, hatasız genomlarını sıralama girişimleri ortaya çıktıkça özellikle önemli hale gelmiştir ve birçok bilimsel taraf farklı taksonomik dizilimi ne lerdir? Grup. Burada özetlenen protokoller Bat1K için ideal doku toplama ve doku koruma yöntemlerini tanımlar, yarasa her türün genomlarını sıralamak olan konsorsiyum.
Introduction
Yüksek verimli sıralama (HTS) yöntemleri hızla verimlilik gelişmiş ve maliyet azalmıştır, ve şimdi yüzlerce veya binlerce örnek bu yaklaşımları ölçeklendirmek mümkündür. Bu teknolojilerin uygulanması ile elde edilen anlayışlar, biyotıp evrim veekoloji1,2,3,birden fazla bilimsel disiplinler arasında büyük etkileri vardır. Ancak, birçok HTS uygulamaları kritik bir canlı kaynaktan yüksek kaliteli nükleik asitler güveniyor. Bu sınırlama, uzun okunanmoleküller4dayalı üçüncü nesil sıralama gelişimi ile giderek daha sorunlu hale gelmesi muhtemeldir. Bu nedenlerden dolayı, laboratuvar dışında yabani organizmalardan taze doku örnekleri nin toplanması için en iyi uygulamaların oluşturulmasına odaklanmak gerekir, bu da malzemenin yararını en üst düzeye çıkarır ve ihtiyaç duyulması gereken bireylerin sayısını azaltır. Toplanan.
Bat1K kromozom düzeyinde montaj5yarasa her türün genom dizilimi için devam eden bir girişim ile bilim adamları uluslararası bir konsorsiyum . Yarasalar memeli çeşitliliğinin% 20 temsil ve yaşlanma, hastalık ekolojisi, duyusal biyoloji ve metabolizma5,6anlamak için etkileri var olağanüstü adaptasyonları var. Birçok yarasa da tehdit veya insan sömürüsü nedeniyle tehlike altında7 veya hızla patojenler nedeniyle azalan8,9, ve genom düzeyinde sıralama bu türlerin korunması için büyük önem taşımaktadır. Bat1K şu anda tüm yarasa türlerinin genomlarını dizilemeyi amaçlasa da, yüksek kaliteli genomik sıralama için doku örneklerinin toplanmasının standartlaştırılması organizma biyologları topluluğu nda önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Genomik verilere ek olarak, yarasa adaptasyonlarının çeşitliliğinin işlevsel olarak anlaşılması dokuya özgü transkripsiyon ve protein analizleri gerektirir ve genellikle ayrı toplama protokolleri gerektirir. Ayrıca, tüm taksonomik gruplarda olduğu gibi, -omik analizler için en yüksek kalitede veri elde etmek için optimum doku toplama ve koruma şartiken, hızla değişen teknolojiler ve bağımsız olarak çalışan birden fazla araştırma ekibi.
Yarasa-omics araştırma için en iyi uygulamaları benimsemeihtiyacı, birçok yarasa türünün nadir veya tehdit altında olduğu göz önüne alındığında, özellikle acildir. Kemirgenler ve sivri fareler gibi diğer küçük memelilerin aksine, yarasalar uzun ömürlüdür, olağanüstü DNA onarım mekanizmaları10 ve yavaş üreme11atfedilebilir , çoğu tür sadece bir veya (birkaç durumda) yılda iki genç doğurma ile. Bu nedenlerden dolayı, yarasa popülasyonları rahatsızlıktan kurtarmak için yavaş olabilir, ve vahşi birçok kişi toplama ne tavsiye edilebilir ne de uygulanabilir. Başka bir deyişle, protokoller tek bir örnek için maksimum veri miktarını elde etmek için optimize edilmeli ve böylece örnekleme çabalarını gereksiz yere çoğaltma gereksinimini azaltmalıdır.
Burada, bu protokol özellikle genomik ve transkripsiyon dizilimi ve protein analizleri için yarasa dokusunun toplanması ve örnekleştirilmesi için standartlaştırılmış yöntemlere odaklanmaktadır. En önemli önceliği, yarasa dokularının toplanması, dokuların ihracatı, stresin hayvana en aza itilmesi ve uzun süreli depolama koşullarına kadar etik ve sorumlu bir şekilde toplanmasını sağlamaktır. Toplanan farklı malzemelerin kullanışlılığını gelecekte de ön plana etmek amacıyla ayrıntılı diseksiyonlar geliştirilmiştir. Bu el yazması, yarasaları popülasyonlar üzerindeki etkiyi en aza indirmek ve bilimsel değeri en üst düzeye çıkarmak amacıyla insancıl bir şekilde toplamak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokolün odak yarasalar kullanılmak üzere özel iken, adımların çoğu diğer omurgalı takson, özellikle memeliler ile ilgilidir.
Doku koleksiyonuna genel bakış
Depolama sıcaklığı ve koruyucu madde seçimi de dahil olmak üzere doku toplama prosedürü, planlanan herhangi bir downstream analizlerin niteliğine göre belirlenecektir. Ancak, mümkün olduğunda, belirli bir analiz planlanmamış olsa bile, doku gelecekteki yarar maksimize etmek için yöntemler bir dizi altında toplanır şiddetle tavsiye edilir. Genel olarak, doku toplanır ve nükleik asitler (DNA ve RNA) veya protein sonraki analizleri için korunur. Bu uygulamaların her biri için, doku en iyi sıvı azot (LN2) doğrudan flaş donma ile korunabilir. Ancak, LN2 hemen daldırma her zaman alanında mümkün değildir. Teknoloji ilerledikçe, DNA ve RNA'yı ortam sıcaklıklarında depolamak için özel şişeler gibi kaynaklar daha kolay kullanılabilir hale gelmektedir. Bu protokoldeki tüm bu materyalleri doğrulamamış olsak da, diğer araştırmacıları burada sunduklarına göre yeni malzemelerin performansını karşılaştırmalı olarak analiz etmeye teşvik ediyoruz. LN2'ye erişilemediği durumlarda, örneğin Amazon'daki küçük uçak üzerinden siteye erişim nedeniyle LN2 taşımacılığının mümkün olmadığı durumlarda, farklı uygulamalar için ideal olarak dokuları korumak için yöntemler salıyoruz. Buna ek olarak, canlı hücrelerin yetiştirilip yayıldığı dokuları toplamak için bir yöntem salıyoruz. Aşağıda, bu ilgili amaçlariçin malzeme toplamak için önemli hususlar ı özetliyoruz ve toplama yöntemlerine genel bir bakış Tablo 1'deverilmiştir.
DNA için doku
Toplanan tüm toplanan dokular için, depolama ortamı standart veya yüksek molekül ağırlıklı (HMW) DNA çıkarma için kullanılabilir olup olmadığını belirleyecektir. HMW uzun okuma sıralama için gereklidir ve şu anda kromozom düzeyinde genom derlemeleri oluşturmak için gerekli, ya da bir "platin standart" genom. Düşük molekül ağırlığı (LMW) DNA flaş dondurulmuş elde edilebilir, AllProtect (bundan böyle "doku dengeleme çözümü" olarak anılacaktır), hatta RNAlater (bundan böyle "RNA stabilizasyon çözümü")-korunmuş numuneler (flaş dondurulmuş numuneler optimal kalsa da ). Standart laboratuvar yöntemleriyle izole edilen DNA (örn. silika jel membran spin kolonları, fenol-kloroform), yine de ~20 kilobaza (kb) kadar DNA parçaları verebilir. Bu nedenle, yeterli verim olması koşuluyla, bu izole DNA formu tek bir kesici uç boyutu kitaplığı hazırlığı için kullanılabilir, hangi insert boyutu genellikle ~ 500 baz çiftleri (bp) ve ~ 100 bp kısa sıra okuma12oluşturulur . Bu DNA özellikle tam uzunlukta kromozomel verilerin gerekli olmadığı "sıralama" projeleri veya çalışmaları için yararlıdır. HMW DNA (10-150 kb) daha zorludur ve sadece hasat tan sonra LN2'de hızla yanıp sönen ve ekstraksiyona kadar en fazla -80 °C'de tutulan doku kullanılarak güvenilir bir şekilde elde edilebilir.
Düşük molekül ağırlığı veya parçalanmış DNA genellikle PCR ve kısa okunur sıralama13ile gen amplifikasyonu da dahil olmak üzere hedefli yaklaşımlar için yeterlidir. SADECE bir veya birkaç genhedef LMW DNA kullanarak PCR tabanlı araştırmalar adaptasyon ve yarasa duyusal biyoloji6molekülerevrimi anlamak son derece bilgilendirici olmuştur ,14, fizyoloji15, filogenetik 5,16, ve koruma17,18. Düşük molekül ağırlığı ve parçalanmış DNA'nın başarılı hedefli sekans ları yeniden ele geçirilirken, yarasalar19dahil olmak üzere çok sayıda omurgalı grubu da gösterilmiştir. Bu yöntemler genellikle düşük molekül ağırlığı analizleri için DNA elde etmek için yaygın yollar olduğu gibi, dışkı örnekleri ve bukkal swabs veya kanat biyopsisi yumruklar yoluyla öldürücü olmayan doku örnekleme, yarasa için maliyet-etkin ve minimal invaziv20, 21. yıl.
Ancak, kalite büyük ölçüde örneğin22depolandığı ortam türüne bağlıdır. Bukkal swabs ve biyopsi yumruklarının sistematik ve kantitatif karşılaştırmalar sonra, kanat biyopsi salgı yumruklar DNA sürekli daha yüksek seviyelerde verim gösterilmiştir ve toplama sırasında yarasa için daha az stresli22. Bu karşılaştırmalar aynı zamanda kanat yumruğu nun gösterge silikasında korunduğunda en iyi sonuçların elde edildiğini de gösterdi (örneğin, nem gözlendiğinde renk değiştiren silika jel boncuklardan yapılmış bir desiccant türü) etanol veya DMSO22; ancak doku stabilizasyon solüsyonu dahil diğer depolama ortamları incelenmemekle birlikte. Kanat yumrukları da kültür fibroblast hücreleri büyümek için kullanılabilir, Kacprzyk ve ark23 gibi ve aşağıda açıklandığı gibi (bölüm 6 bakınız). Bu yöntemler için, kanat veya üropatagium hafifçe uzatılmalı ve temiz bir biyopsi yumruğu, genellikle çapı 3 mm, örnek elde etmek için kullanılmalıdır. Bu yaklaşım kalıcı bir hasara neden gibi görünüyor, çoğu durumda hafta içinde iyileşiyor yaralarile 24.
HMW DNA (10-150 kb) daha zorludur ve şu anda sadece hasat tan sonra LN2'de hızla yanıp sönen ve ekstraksiyona kadar en fazla -80 °C'de tutulan doku kullanılarak güvenilir bir şekilde elde edilir. HMW DNA (10-150 kb) uzun okunan DNA dizilimi ve dolayısıyla de novo genom montajı için çok önemlidir. Gerçekten de, çoğu ticari kitleri bazı standart HMW DNA izole etmek için kullanılabilir iken, ortaya çıkan molekül boyutları genellikle üçüncü nesil sıralama teknolojilerinin gereksinimlerini karşılamak değil [örneğin, Bu Pasifik Biosciences (PacBio) gibi şirketler tarafından başlatılan, Oxford Nanopore Teknolojileri, ve 10x Genomik, ya da Biyonano Genomik veya Dovetail Genomics tarafından sunulan montaj yöntemleri ile]. Bu nedenle, "ultra HMW" DNA (>150 kb) için yeni bir talep vardır. Yarasalardan ultra HMW DNA elde ederken, karaciğer, beyin veya kas taze örnekleri tüm uygundur, ancak bu hemen herhangi bir depolama tampon veya kriyoprotektif olmadan LN2 dondurulmuş flaş olmalıdır. Bu adımların tam bir açıklaması bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak başka bir yerde25mevcuttur.
RNA için doku
RNA, DNA'dan daha az kararlı olan tek iplikçikli bir moleküldür. RNA'nın birçok şekli olmasına rağmen, -omik analizler mRNA (haberci RNA) ve küçük RNA'lara (örneğin mikroRNA'lar) odaklanma eğilimindedir. Transkripsiyondan sonra, mRNA intron içermeyen ve genlerin/genomların kodlama kısmını temsil eden olgun bir transkript oluşturmak üzere birleştirilmiştir. Kodlama genleri genom boyutunun küçük bir kısmını (%1-2) oluşturuyor ve bu da mRNA'nın hedefalınmasını genler için dizi verilerini elde etmek için uygun maliyetli bir araç haline getiriyor. MikroRNA'lar, mRNA'nın proteinlere çevrilme sürecini düzenleyen bir RNA sınıfıdır ve bu nedenle önemli düzenleyici efektörlerdir. RNA transkriptleri tek tek sıralanabilir, ya da daha yaygın olarak -omics analizleri için26,27,28,29,30, bir transkriptom un bir parçası olarak; diğer bir deyişle, belirli bir örnekte bulunan tüm RNA transkriptlerinin toplamıdır.
Sıralama çeşitli yöntemler (yani, kısa okunan RNA-seq veya uzun okunan tüm izoform Seq yoluyla) aşağıdaki yapılabilir, hem RNA bolluğu ve izoform kullanımı analizi sağlayan. mRNA transkriptlerinin miktarı ve çeşitliliği hücreler ve dokular arasında değiştiğinden, RNA dizilemesi gen ekspresyonunu ve regülasyonunun örnekler arasında incelenmesini ve karşılaştırılmasını mümkün kılabilir. Bu yöntemler giderek biyolojik olarak bilgilendirici hale geldikçe, küçük RNA'ların ve bütün isoform sıralamanın sıralanmasına olan ilgi artmaktadır. RNA farklı sınıflarda sıralamak için doku örneklerihazırlanması bu el yazması sunulan aynı şekilde yapılabilir, sadece sonraki çıkarma yöntemleri31,32farklı . Son olarak, transkripsiyonlar protein kodlayan genomun yüksek kapsama alanı alt kümesini sunduğundan, biraraya getirilen veri seti genom montajı ve ek açıklamalarında yararlı olabilir, bu da farklı dokular arasında RNA-seq verilerinin toplanmasını Bat1K girişimi.
DNA'nın aksine, RNA kimyasal olarak kararsızdır ve rna bazlı virüslere karşı savunma stratejisi olarak doku lysates'inde her yerde bulunan RNase enzimleri tarafından da hedef alınır. Bu nedenlerden dolayı, hücre ve dokularda RNA fraksiyonu örnekleme ve/veya ötenazi noktasından kısa bir süre sonra bozulmaya başlar. Bu nedenle RNA'nın korunması, bozulmasını önlemek için adımlar gerektirir. Bu genellikle 4 °C'de taze toplanan dokunun, dokularda doğal olarak bulunan RNa'ları inaktive etmek için RNA stabilizasyon çözeltisi gibi bir stabilizatör ajanda korunmasını ve ardından uzun süreli depolama için dondurulmayı içerir. Tercih edilen bir alternatif olarak, doku LN2 dondurulmuş flaş olabilir; yukarıda belirtildiği gibi, ln2'nin sahaya taşınması ve doku ların erimesini önlemek için seviyelerinin korunması lojistik açıdan zor layıcı olabilir.
Protein için doku
Protein bileşimi ve göreceli bolluk rna için tartışılan benzer bir şekilde hücre ve dokular arasında değişir; ancak proteinler rna'dan ortalama olarak daha kararlıdır. Proteomik kullanılarak protein tanımlaması tipik olarak protein dizisinin bir kısmıyla eşleşir, tam olarak değil, ancak dokular arasında ifade hakkında bilgi sağlayabilir ve mevcut patojenleri karakterize edebilir. Birçok protein dizisi memeliler arasında korunduğundan, proteomik yarasa örnekleri toplama sırasında steril protokoller (örneğin eldivenler, forsepsler) gerektiren korunmuş insan proteinleriyle kolayca kontamine edilebilir. LN2'de parlama dondurma, proteinlerin bozulmasını önlemenin en iyi yolu olsa da, kuru buz, -20 °C'lik dondurucular ve hatta buz başka bir yol yoksa uygundur. Sıcaklıklar arttıkça diferansiyel protein arızası riski de artar. Doku stabilizasyon çözümü gibi stabilizasyon ajanları oda sıcaklığında dokuların protein fraksiyonunun korunmasında etkilidir ve flaş donma uygun olmadığında kısa süreli koruma için uygundur (bir haftaya kadar).
Belirli bir dokunun enzimatik profili doğrudan orada proteinin korunmasını etkiler. Kas gibi düşük enzimatik aktiviteye sahip dokular, ev dondurucuda yüksek sıcaklıklarda bile protein profillerini koruyabilir. Buna karşılık, karaciğer dokusu enzimatik reaktif, ve proteinleri hazırlık sırasında aşağılayıcı yüksek olasılıklar var. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) örneklerinden insan proteomik profilleri elde etmek için protokollerin giderek artan sayıda dokuların paraformaldehit sabitleme toplama üzerine donma düşük maliyetli protein korunması için söz tutar düşündürmektedir uygulanabilir33,34. Koruma süresine ve durumuna son derece bağlı olmasına rağmen, proteinler formalin-sabit, etanol le korunmuş yarasa örneklerinden immünohistokimya ile tespit edilmiştir35. Bu yaklaşım proteomik düzeyde örnekleme için ölçeklenebilir değildir, ancak flash-donma kullanılamadığında ve diğer stabilizasyon ajanları çok pahalı olduğunda formalin sabit yarasa dokularının protein profilleri verme potansiyelini vurgular.
Hücre kültürü için doku
Örnekleme dokusu ve parlama dondurma kullanılacak sonlu miktarda malzeme sunar ve malzeme kullanıldıktan sonra artık kullanılamaz. Alternatif olarak, hücre kültürleri hemen kullanılabilir veya gelecekteki çalışmalar için korunmuş canlı hücreler sağlar. Kültürler de doku örnekleri küçük olduğunda verimi artırmak için hücrelerin genişlemesini kolaylaştırmak. Özellikle doku toplamanın sınırlı olduğu durumlarda yararlıdır, örneğin öldürücü olmayan örneklemenin gerekli olduğu ve bu nedenle koruma için geniş etkileri olan nadir türlerle yapılan deneyler gibi. Açıklanan hangi hücre kültürü kanat membran dokusunun öldürücü olmayan örnekleme yoluyla mümkün olduğu bir protokol, ancak birden fazla doku tipleri ile culturing mümkündür36,37. Burada sağlanan protokol yapışık hücreler için seçer. Kullanılan kaynak doku ve büyüme ortamının birleşimi bu protokolü fibroblastları seçmek ve büyütmek için uygun hale getirir, ancak istenirse diğer hücre tipleri için alternatif protokoller kullanılabilir. Bat1K projesi kapsamında, nadir ve tehdit altındaki türler için kanat zarlarının öldürücü olmayan örneklemesi ve numunelerin kültürlenme yoluyla genişlemesinin, kullanılan çoklu teknolojiler için gerekli DNA hacmini oluşturmak için gerekli olduğu tahmin edilmektedir5 .
Yarasa yakalama
Yarasaları kullanan tüm insanlar yarasa yetkin bir araştırmacı tarafından eğitilmeli ve bir dizi ön maruziyet enjeksiyonu ile kuduz aşısı yapılmalıdır. Isırılırsa, bir dizi daha maruz kalma sonrası enjeksiyonları hala gereklidir. Yarasaları yakalamak için standart yöntemler sis ağları(Şekil 1) ve arp tuzakları(Şekil 2)içerir. Sis ağları en yaygın olarak kullanılan ve düşük ve orta aktivite ile alanlar için ideal, onlar yarasa sıkıntıen en aza indirmek için en çok bakım gerektiren gibi. Küçük yarasalar özellikle savunmasızdır ve hızlı bir şekilde eğiliminde değilse stresten ölebilir. Sık yapılan net denetimler yarasa yaralanmasını ve mortalitenin yanı sıra sis ağına zarar verebilir. Uygun doku toplama doku taze olmasını gerektirir, çünkü bu ayrıntı önemlidir, ve yarasalar sis ağları nauygun dikkat araştırmacı düzgün örnekleri işlemeden önce gereksiz mortalite veya erken mortaliteye yol açabilir. Birkaç yarasa en az sıkıntı ile bir arp tuzağında dinlenebilir çünkü, bu yaklaşım yüksek yarasa aktivitesi olan alanlar için idealdir, bir mağara veya büyük tünek yakın gibi. Morfolojik ve demografik bilgilerin toplanması için uygun yarasa yakalama ve veri işleme için ayrıntılı talimatlar ek yöntemler mevcuttur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol #2013-2034).
1. Ötenazi
- Bir isoflurane anestezi veya başka bir mevcut anestezik ile bir pamuk topu nemlendirin.
- Bir resealable, hava geçirmez plastik torba içine pamuk topu yerleştirin. Çanta rahat bir bez yarasa çantası bir çanta tutmak için yeterince büyük olmalıdır.
- Poşetin anestezi ile nüfuz etmesine birkaç dakika kaldıktan sonra, yarasaiçeren bir yarasa torbasını plastik torbaya yerleştirin.
- Yarasa ötenazi yapılana kadar birkaç dakika bekleyin. Yarasalar ~ 20 g veya daha az ağırlık yaklaşık 5-10 dakika. Yarasalar bu kadar 20 dakika kadar gerektirebilir daha büyük gerektirir. Anestezinin yayılmasını en üst düzeye çıkarmak için mümkün olan en ince bez malzemenin kullanılması tavsiye edilir.
- Diseksiyon başlamadan önce yarasa ötenazi olduğundan emin olmak için nefes ve kalp atışı kontrol edin.
2. Diseksiyon Hazırlığı
- Aşağıdaki protokolü kullanarak tüm enstrümantasyonları diseksiyonlar arasında temiz tutun.
- Aletleri su ve bulaşık sabunu ile yıkayın. Çamaşır suyu nükleik asitleri parçalayacak gibi, diseksiyon alanından uzak, % 10 çamaşır suyu ile silin.
- %70 etanol ile silin.
- RNAse dekontaminasyon reaktifi ile silin.
- Her diseksiyondan sonra bu bölümü tekrarlayın.
3. Doku Örnekleri için Şişelerin Hazırlanması
-
RNA için:
- Gecikmeleri önlemek için herhangi bir diseksiyon başlamadan önce tüm şişeleri hazırlayın.
- Her numune için gerekli şişe sayısını bir kenara koyun. Her tüpü, toplanacak doku tipive standart numune tanımlama bilgilerini etiketle. Şişeleri %50 dolu RNA stabilizatör çözeltisi doldurun ve ideal olarak 4 °C'ye kadar soğutun.
- Şişeleri RNA stabilizatör çözeltisi ile tamamen doldurmamaya dikkat edin, aksi takdirde tüp LN2'ye yerleştirirken patlayabilir. Doku örnekleri alırken, büyük doku topaklarının RNA stabilizatör çözeltisi tarafından tam olarak nüfuz edilmeyeceğini unutmayın. Bu nedenle, bir boyutta 0,5 cm'den büyük olmayan küçük parçalar halinde dokuyu kesin ve RNA stabilizasyon çözeltisi: doku için en az 10:1 hacimlik bir oranı koruyun.
- En azından, diseksiyonlu dokuların RNA stabilizatör çözeltisine yerleştirilmesi gerekir, LN2'ye erişim veya mevcut olmayan soğuk hava depolarına erişim olsa bile.
-
DNA için:
NOT: Nükleer DNA içeriği hemen hemen tüm dokular için aynıdır; bu nedenle, örnekleme esnek olabilir. Ancak, kas dokusunda mitokondri yüksek yoğunlukları nükleer genom için okuma kaybına yol açabilir unutulmamalıdır38.- Düşük molekül ağırlıklı DNA için, silika depolamak için kanat zarının bir veya daha fazla kopyasını alın ve/veya Kaslar RNA stabilizasyon çözeltisinde veya doku stabilizasyon çözeltisinde depolayın.
- Ultra HMW DNA için, herhangi bir depolama reaktifi olmadan LN2'de parlama-donma, ardından -80 °C veya daha soğuk uzun süreli depolamaya aktarın. Kranial diseksiyonu itibaren, beyin dokusu ultra HMW DNA almak için en uygun dokutipi39, postkraniyal diseksiyonlar ise, karaciğer veya kas daha uygundur40.
- Kranial diseksiyon için bazı dokular için RNA stabilizatör çözeltisinin 5 mL şişesini (standart 2 mL şişelerin aksine) kullanın. Tüm şişeler kriyojenik olmalı. Parçalara ayırırken şişeleri buzda tutun.
4. RNA için Kranial Diseksiyon
- Ötenaziden hemen sonra, numunenin kafasını büyük bir makas veya kemik kesicilerle ayırın(Şekil 3).
- Optik sinir ayırmak için yeterince güçlü kuvvet kullanarak forceps ile gözleri çıkarın. Gözleri 2 mL RNA stabilizatör çözeltisi içine yerleştirin.
- Seçtiğiniz aracı kullanarak, saç, fasya ve burun deri de dahil olmak üzere kafatası kasları, kafatası cilt. Burnun ön ucunu kırmamaya dikkat edin.
- Makas kullanarak, boyunbaşlayan kafatasıventral kısmı(Şekil 3)bir sagittal kesim yapmak, beyne zarar vermemeye özen.
- Forseps kullanarak, kafatasının her iki tarafını da hafifçe çatlayana ve beyin açığa çıkana kadar geri çekin.
- Kafatasının kaudal ucunda, kokleae şimdi yanal başın her iki tarafında görünür olmalıdır. Onlar sol ve sağ tarafında küçük, küresel kemikler, sadece boyun ve masseter kasları postertral vardır. Forseps kullanarak kokleae'yi yavaşça çekin ve 2 mL'lik bir RNA stabilizasyon çözeltisi içine koyun.
- Yavaşça forceps ile beyin (çok yumuşak olacak) kazıyın. Koku ampul görünür hale gelecektir, kafatasıiç ventral kısmında oturan. Koku ampulü bağlı tutmaya çalışın.
- Koku ampul zaten kaldırılmış değilse, yavaşça doku kazıyın, ve kribriform plaka belirgin hale gelecektir. Bu araştırmacı odaklı tutmak için kritik bir kemiktir. Birden fazla foramen ile kafatasının en ön bölge olarak tanımlanabilir ve koku ampul dinlenir hangi noktada iki oluklar.
- Mümkünse, beyin şeklini sağlam tutun ve şekli korumak için hemen kuru buzun üzerine yerleştirin veya 5 mL'lik RNA stabilizasyon çözeltisi içinde. Eğer immünohistokimya beyin üzerinde yapılacaksa, varsa %4 paraformaldehit yerleştirin.
- Üst ve alt çenenin birleştiği yerde iki kesi yapın ve çeneyi çıkarın.
- Mandibula çıkarıldıktan sonra, kafatasının kalan kısmından rostrum (üst çene) çıkarın. Çenenin kribriform plakayı içerdiğinden emin olun.
- Burnu RNA stabilizatör çözeltiye yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Bu yoğun bir doku olduğu için, RNA stabilize çözeltisi tüm doku nüfuz izin vermek için zaman gerektirir.
- Burun şişesini RNA stabilizatör çözeltisinde bir gece bekletmekten sonra LN2'ye yerleştirin.
- Alt mandibula itibaren, makas ile dil kesti ve daha sonra rna bir 2 mL şişe yerleştirin.
- Bu protokol kafatasının çoğunu kaybediyor. Dişler, özellikle mandibula dan, kurtarılabilir ve tür tanı için yararlı olabilir. Kemik dokusu 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde saklanabilir.
5. RNA için Postkraniyal Diseksiyon
- Karın boşluğunu delmek için neşter kullanın, kaburgalara kadar uzunlamasına bir kesi(Şekil 3). Bu iskelet çerçevesini kaybeder. Kemik korunacaksa, dikkatli bir şekilde kas deriden kesip yumuşak doku diseksiyonu tamamlandıktan sonra 1x PBS saklayın.
- Pektoral kas ortaya çıkarmak için cilt şerit, kas en az iki örnek almak, RNA stabilizasyon çözeltisi için bir ve HMW DNA için dondurulmuş kalmak için bir, LN2 koymak için bir şişe hemen yerleştirerek.
- Göğüs kafesini kesin ve akciğerden örnekler toplamak için kaburgaları çekin.
- Tüm alınabilir ama yarıya kesilmelidir kalp toplamak, böylece RNA stabilize çözeltisi iyice ıslatır.
- Karaciğerden örnek al. En az iki karaciğer örneği alın, biri HMW DNA'sı için donmuş olarak kalacak, hemen boş bir şişeye koyup LN2'ye koyun. Karaciğer çok enzimatik, ve örnekleri yeterince küçük RNA stabilize çözeltisi için tam olarak emmek için yapmak önemlidir.
- Karaciğerden safra boşaltmak için işlevleri hepatik kanal, pankreas ve ince bağırsak karaciğer bağlanır. Bu damar kolayca karaciğer inferior / posterior kısmını probing ve posterior bir şekilde damar izleme ile tanımlanabilir. Kanal genellikle yeşilimsi bir renk, de. Pankreas ve safra kesesi bulmak ve ayrı ayrı toplamak için hepatik kanalı izleyin. RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin.
- Mide toplamak ve, yanında, tabanında ve mor farklı bir gölge olarak görünen, tüy gibi dalak olduğunu. Pankreas da burada beyaz bir yapı olarak görülmelidir (Şekil 3). RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin.
- Küçük ve kalın bağırsak küçük örnekleri toplamak. RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin. Bağırsaklar da endoparazit taraması olabilir. Eğer bir parazitolog sahadaysa, parazitler için bir muayene yapılabilir. Bu daha sonra yapılacakise, tüm bağırsak 5 mL kriyojenik şişe alınabilir.
- Böbreklerden birini al ve kanallarını mesaneye kadar takip et. RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin.
- Testisler (eğer erkek) veya rahim ve yumurtalıklar (eğer kadın) aracılığıyla bulmak için bir rehber olarak diğer böbrek kullanın. Mümkünse bir veya her iki gonad toplayın.
- Ayrı şişelerde kanat cildinin çeşitli bölgelerinden örnekleri tutun (kas vs kas olmayan parçası).
6. Doku Kültürü Toplama ve Hazırlama
- %20 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin/streptomisin (P/S) ve 50 μg/ mL gentamisin içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM) oluşturarak hücreler için büyüme ortamı hazırlayın. Büyüme medya aliquots protokolün her gün taze yapılmalıdır.
- Toplama yapıldıktan sonra, kanat biyopsisi yumrukları doğrudan iyi kapatılmış 1,5 mL santrifüj tüp içinde 1 mL soğuk büyüme ortamına yerleştirilmelidir. Mühürlemek için tüpü parafilm'e sarın.
- Tüpler daha sonra numuneleri 4 °C'de tutmak için soğutma elemanlarına sahip polistiren bir kutuiçinde taşınmalıdır. Ulaşım hızlandırılmalıdır; rağmen, sağlıklı hücreler kadar bu şekilde depolanmış olan yumruklar yapılabilir 6 gün ama daha az optimal23.
- Doku kültürü tesisine nakledildikten sonra, aşağıdaki protokol hücre kültürleri oluşturmak için kullanılabilir. Standart steril teknikler protokolün geri kalanı için kullanılmalıdır41.
7. Gün 1 Doku Kültürü: Doku İzni
- Tüpün içeriğini (kanat zarı biyopsisi içeren büyüme ortamı) 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın.
- Büyüme ortamını dikkatlice çıkarın. Biyopsiyi 500 μL steril PBS ile iki kez hafifçe yıkayın.
- Tüpe 500 μL kollajenaz IV (1 mg/ mL) ekleyin. Bu tek tek hücrelere doku sindirimine neden olacaktır.
- Ajitasyon olmadan 37 °C'de bir gecede (maksimum 16 saat) kuluçkaya yatın.
8. Gün 2 Doku Kültürü: Kaplama Hücreleri
- Taze büyüme ortamı nı ve 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
- Kullanılacak plakanın her kuyunun her kuyusu için 2 mL taze, önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek 6 kuyulu doku kültür plakası hazırlayın (3 mm kanat biyopsisi başına 1 kuyu). Bu plakayı 37 °C ve %5 CO2 kuluçka makinesinde gerektiğinde (adım 8.7) saklayın.
- Hücreleri içeren 15 mL'lik tüpü kuvözden çıkarın ve 1 mL taze büyüme ortamı ekleyerek sindirim reaksiyonuna son verir (önceden 37 °C'ye ısıtılmış).
- Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için p1000 pipet ucu ile çözeltiyi dikkatlice triturating ederek hücreleri yeniden askıya alın.
- Yavaşça 300 x g3 dakika için bir tablo üst santrifüj hücreleri aşağı spin .
NOT: Küçük doku parçaları süspansiyonda veya 15 mL borunun duvarına bağlı olarak görülebilir. Ancak bu hücre süspansiyon uyrama hazırlık etkilemez - P1000 pipetli sıvının %80-90'ını hafifçe çıkararak süpernatant'ı atın.
NOT: Hala görünürse, doku parçasını atmayın ve bir sonraki adımda hafifçe triturate (8.7). - Önceden ısıtılmış büyüme ortamının 500°L'sinde peleti yeniden askıya alın, peletin veya büyük parçalarının artık görünmediğinden ve hücrelerin yeterince askıya alınmasını sağlamak için süspansiyonu hafifçe triturate. Hücrelerin varlığı nedeniyle medya bulutlu görünebilir.
NOT: Bu aşamada, hücre süspansiyonunun kalitesini ve kanat klibinden elde edilen hücrelerin verimini değerlendirmek için uygulanabilir bir hücre sayısı yapılabilir (daha fazla ayrıntı için 10.11. adıma bakınız). - Yavaşça 6 kuyu plaka tek bir kuyuiçine hücre süspansiyon tüm hacmi pipet.
NOT: Yukarıdaki adımı hemen gerçekleştirin ve hücrelerin 8.7 adımdan sonra yerleşmesine izin vermeyin. Hücre süspansiyonuna yavaşça kuyunun yüzeyine damla gibi dağıtmak için bir pipet kullanın. Bu, kuyunun ortasında ki hücrelerin kümelenmesine neden olacağından, tüm çözeltiyi kuyunun ortasına sokmayın.
NOT: Doku parçası hala görülebiliyorsa, onu kültür kabına iyi aktarmayın. - Hücrelerin kuyu yüzeyinde tek bir katmanda dağiyete yol alabilmek için plakayı yanyana ve önden arkaya 2x-3x'ten yavaşça sallayın.
- Mikroskop altında kaplanmış hücreleri kontrol edin, onlar toplanmış ve yüzen ama çok yoğun görünen tek hücreler olmalıdır gibi.
- Plakayı 37 °C ve %5 CO2'yeayarlanmış bir kuluçka makinesine dikkatlice yerleştirin.
- ~ 24 saat sonra, kültürün sağlığını belirlemek için mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Hücreler artık plaka yüzeyine iliştirilmeli ve düzleştirilmiş görünmelidir(Şekil 4A). Mikroskoptan bakıldığında kültürde farklı hücre tipleri görülebilir.
- Büyük olasılıkla bağlı olmayan bazı yüzen hücreler olacaktır. Bu hücrelerin bir kısmı ölü. Kuyuda yüksek oranda yüzen hücreler görünüyorsa, ortam yenilenmelidir. Bu durumda, dikkatlice iyi den orta ~ % 50 aspire ve yavaşça hücreleri rahatsız etmemek için kuyunun yan tarafında önceden ısıtılmış büyüme ortamı 1 mL ekleyin.
- Hücreleri 37 °C ve %5 CO2olarak önceden ayarlanmış bir kuluçka makinesinde saklar. Hücreler düzenli olarak mikroskop altında gözlemlenmelidir (ama günde bir kereden fazla değil) medya ferahlığı veya bölme ihtiyacını belirlemek için.
NOT: Hücreler yeni kaplandığında, hızlı bir şekilde bölünür ve bu nedenle her gün kontrol edilmelidir. Kültürde bir süre sonra, büyüme yavaşlayacak ve her 48-72 saat kontrol edilebilir.
9. Ferahlatıcı Medya
-
Büyümelerini ve kültür kalitelerini gözlemlemek için mikroskop altındaki hücreleri düzenli olarak kontrol edin. Ortamın rengini kalitesinin bir göstergesi olarak izleyin. Hücreler en fazla 3 gün boyunca aynı ortamda kalmalı veya hangisi önce gelirse, geçiş gerekli olana kadar.
- Hücreler hızla büyüyor ve ortam yorucu ise, bu da göz için görünür olacak, medya rengi kırmızıdan sarıya dönecek gibi.
- Gerektiğinde kuyudan ortamın ~%50'sini dikkatlice aspire edin ve hücreleri rahatsız etmemek için kuyunun kenarına yaklaşık aynı hacimde ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin.
- Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 kuluçka makinesine geri döndürün.
10. Passaging Hücreleri
- Passaging hücreleri varolan bir kültürü alıp yeni kuyulara bölmeyi ifade eder. Geçiş, hücreler ~%80'lik bir konfluent olduğunda [yani kuyu yüzeyinin ~%80'ini işgal ettiklerinde ve plastiğin sadece ~%20'si hala boşluk olarak görülebildiğinde) gerçekleşmelidir(Şekil 4B)].
- Dikkatle aspire ve büyüme ortamının ~ 90% atın.
- Hücreleri rahatsız etmemek için kuyunun duvarına 1 mL steril PBS ekleyerek hücreleri çok nazikçe yıkayın. Yavaşça plaka ileri geri ve yan yana 2x-3x kaya. Dikkatlice aspire ve plaka tüm PBS atın.
- Hücreleri tekrar yıkamak için adım 10.3'u tekrarlayın.
- Yavaşça 250 μL tripsin-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) kuyuya ekleyin ve oda sıcaklığında 1,5 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Trypsin-EDTA çözeltisinin plakayı hafifçe sallayarak kuyunun tüm yüzeyini kapladığından emin olun. - 1 mL taze önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek reaksiyonu söndürün.
- Pipet yukarı ve aşağı ~ 5x plaka yüzeyinden hücreleri yıkamak ve hücrelerin süspansiyon olduğundan emin olmak için.
NOT: Çözelti hücrelerin varlığı nedeniyle bulutlu olmalıdır. - Hücre süspansiyonuna 15 mL'lik bir tüp yerleştirin ve hücreleri 3 000 x g'da3 dakika boyunca masa üstü bir santrifüjde döndürün.
- P1000 pipetli sıvının %80-90'ını hafifçe çıkararak süpernatant'ı atın.
- Önceden ısıtılmış büyüme ortamının 1 mL'lik peletini yeniden askıya alın ve süspansiyonu hafifçe triturate. Peletveya peletin büyük parçalarının artık görünmediğinden ve hücrelerin tek hücreli süspansiyonda olduğundan emin olun.
- Burada açıklandığı gibi otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak, ya da el ile referans video42ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir hemositometre kullanarak . Uygun hücreleri tespit etmek için 1:1'deki askıdaki hücrelerden 10 μL aliquot'u Trypan mavisi ile karıştırın.
- 1 dk ve pipet 10 μL çözelti için sayım slayt üzerine kuluçka. Uygun ayarları kullanarak hücreleri saymak için sayım slaytını otomatik bir hücre sayacına ekleyin. Verim 6 kuyu plakası bir confluent tek kuyudan yaklaşık 1-2 milyon hücre olmalıdır, bu hücre ve türlerin büyüklüğüne bağlı olarak değişebilir rağmen. Hücreler tek bir hücre süspansiyonunda değilse, hücre sayısı doğru olmayacaktır.
- Bu hücre kültürleri genellikle 1:2 bölünmüş tolere edecek [yani, hücrelerin bir confluent kuyu iki yeni kuyu (toplam) ayrılabilir. Bunu yapmak için, hücreleri tekrar hafifçe triturate, sonra iki yarıya hücre süspansiyon almak (~ 730 μL her) ve damla moda önceden ısıtılmış büyüme ortamı 750 μL içeren iki yeni kuyuların her içine yerleştirin.
NOT: 2-3 gün sonra kuyular aksamalı ve tekrar bölünmeye hazır olmalıdır. Bu noktada, bir hücre kuyusunda uygun donma protokolü (bölüm 11) tarafından korunması önerilir. Hücrelerin daha fazla stokları arzu olarak daha fazla geçişler sırasında dondurulmuş olabilir.
NOT: ~6 pasajdan sonra, hücreler senescence girmek eğilimindedir ve artık bölmek. Bu, hücrelerin artık bölünemeyeceğiniveya hücre sayılarını artırmak için genişletilemedileemeyeceğinin bir göstergesidir. Bu aynı zamanda hücrelerin çok daha uzun süre canlı olmayacağının bir göstergesidir.
11. Donma Canlı Canlı Hücreleri
- DMEM'i %20 FBS, %10 DMSO, %1 P/S ve 50 μg/ mL gentamisin ile birleştirerek dondurucu ortam hazırlayın.
- Donma, geçiş işlemine göre peletlenmiş hücreler alınarak gerçekleştirilir. Pelet, 8.1-8.9 adıma göre 6 kuyuplakasının (~1-2 milyon hücreyi temsil eden) %80-90'lık bir kuyudan hazırlanmalıdır.
- Peleti 1,5 mL dondurucu ortamda yeniden askıya alın.
- İki ayrı cryovial'ın her birine ~750 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.
- Bir kriyojenik donma kabına şişeleri yerleştirin, hangi hücrelerin hücre canlılığını korumak için yavaş yavaş donma ile sonuçlanır. Hemen -80 °C'ye yerleştirin.
- 24-48 saat sonra, uzun süreli depolama için ln2 hücrelerin cryovials aktarın. Bu şekilde depolanan, hücreler canlandı olabilir ve yıllarca yaşayabilir olacaktır.
12. Dondurulmuş Hücreleri Eritme
- Kullanılacak her kuyuda 2 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı içeren 6 kuyuluk bir plaka hazırlayın (erimekte olan hücrelerin şişe başına 1 kuyusu). Plakayı 37 °C ve %5 CO2 kuluçka makinesinde ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
- LN2'den bir şişe hücre alın ve hücreleri hızla eritmek için ılık su banyosuna (37 °C) yerleştirin. Bu 2-3 dakika sürer.
NOT: Dondurucu ortamdaki DMSO çözüldükten sonra hücreler için toksik olduğundan şişeleri 3-5 dakikadan daha uzun süre eritmekten bırakmayın. - Şişedeki çözelti çözülür çözülmez, çözeltiyi homojenize etmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipet ler yerleştirin ve hemen tüm çözeltiyi (~750 μL) 6 kuyulu bir plakanın bir kuyuya yerleştirin (adım 12.1'de önceden hazırlanmış).
- Hücrelerin kuyu yüzeyine tek bir katmanda dağalanın yardımcı olmak için plakayı yavaşça bir taraftan diğer yana ve önden arkaya 2-3 kez sallayın.
- Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 kuluçka makinesinde 24-48 saat boyunca kuvöze yerleştirin.
- Yukarıda açıklandığı gibi hücreleri izleyin ve iletin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dna
Standart düşük molekül ağırlığı (LMW) analizleri için DNA üç neotropikal yarasa türünden çıkarıldı. Bu yazıda açıklanan protokoller izleyerek Dominik Cumhuriyeti ve Kosta Rika'dan bölgede doku örnekleri toplanmıştır. Diseksiyonun ardından, rna stabilizasyon çözeltisine (beyin, karaciğer ve bağırsak) küçük parçalar (en ince kısımda 0,5 cm) yerleştirildi, flaş donduruldu ve -80 °C'de depolandı. Ekstraksiyonlar RNase tedavisi43ile standart DNA ekstraksiyon protokolleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. DNA bütünlüğünün otomatik elektroforez aracı ile değerlendirilmesi, parça boyutlarındaki aşağıdaki temsili örnek tepe noktalarını ortaya koymuştur: tür 1 (iki ayrı ekstraksiyon) 22 kb ve 20 kb'den oluşuyordu; tür 2 25 kb; ve türler 3 24 kb 'den oluşuyordu (Şekil 5, Tablo 2).
Üçüncü nesil sıralama için çıkarılan DNA'nın yüksek konsantrasyonlarda toplanması ve en az parçalanmış şekilde toplanması gerekir. Gana'da toplanan eski dünya meyve yarasasından(Eidolon helvum)flaş dondurulmuş beyin dokusundan elde edilen HMW DNA'sı elde edildi. HMW DNA Irys platformu nda sonraki analiz için Bionano çıkarma protokolü kullanılarak çıkarıldı. Bu DNA 607.463 Mb uzunluğundaydı ve ortalama 194.5 Mb moleküler N50'ye sahipti.
Rna
RNA ekstraksiyonları için ortak bir başarı göstergesi RNA bütünlük numarası (RIN) değeridir. Bu eşiğin altındaki değerler bozulmaya karşı yüksek imzalar göstermeye başladığından, çıkarmaların rin değeri sekizden az olduğunda rna-seq kitaplığı hazırlama veya sıralama protokolü nün sıralanması genellikle önermez44 ,45. Şekil 6 bu protokolü izleyerek çeşitli doku tiplerinin RNA ekstraksiyonları için RIN değerlerini göstermektedir. Protokollerle toplanan dokunun çıkarılması, alan örnekleme alanından bağımsız yüksek kaliteli RNA ile sonuçlanmıştır. LN2 Amazon'da hemen kullanılamıyorsa, dokular RNA stabilizatör çözeltisine yerleştirildi ve LN2'ye yerleştirilene kadar 1 hafta boyunca 4 °C'de tutuldu. Bu gibi durumlarda bile RIN değerleri, RNA stabilizatör çözeltisine hemen yerleştirilen ve doğrudan LN2'ye yerleştirilen değerlerle karşılaştırılabilir. RNA stabilizasyon çözeltisi önemli bir stabilizatördür.
Doku kültürü
Kaplamadan hemen sonra, hücreler toplanır ve yüzer. Ancak, 24 saat içinde, fibroblastlar düzleştirmek ve plaka yüzeyine eklemek gerekir (Şekil 4A). Bu noktada, hücrelerin sağkalım sağlamak için kabaca% 20-30 birleştiğinde olmalıdır. Bundan daha düşük bir değer tüm kültürün ölümüne neden olabilir. Başlangıçta, hücreler kültürde bölünüp genişleyeceği için genişlemeye izin vermek için birbirleri arasında geniş bir alana sahip olmaları gerekir. %80-90 birleştiğinde bölünmelidirler [yani plaka yüzeyinin %gt;80'ini kaplarlar(Şekil 4B)]. Bu şekilde, hücreler bir dizi pasaj (genellikle >6 pasajlar) için kültür içinde senescence geçirmeden önce muhafaza edilebilir. Hücreler bu sürenin ötesinde kültürde korunursa veya konfluent olduklarında bölünmezlerse, morfolojiyi değiştirebilirler ve daha büyük ve daha uzun olabilirler(Şekil 4C). Bu morfolojiye sahip hücreler hala bölünebilir, ancak bu genellikle hücrelerin senescence girdiğini veya yakında gireceğini ve artık kültürde korunup genişletilemeyeceğini gösterir.
Şekil 1: Ormandaki yarasaları yakalamak için sis ağları için ortak bir kurulum. Karşı el ile ayrıştırMa sırasında bir el kapalı tutmak güvenli bir şekilde stresi en aza indirirken yarasa kaldırmak için bir yoldur. Bu fotoğraf Jon Flanders tarafından çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir arp tuzağı genellikle mağaralar, büyük tünek veya fly-aways dışında yakalamak için kullanılır. Yarasalar en az dolaşıklık ve araştırmacı tarafından kolay kaldırma ile tuzak alt kese birikir. Bu fotoğraf Stephen Rossiter tarafından çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNA doku hazırlığı için diseksiyonlar ve doku örneklemelerinin iş akışı.
Şekil 4: Filolostomus'unkanat deliklerinden türetilen yarasa hücresi kültürleri renk siz. (A) kaplamadan sonra 24-48 h, hücreler düzleşecek ve plaka yüzeyine bağlanır. (B) Hücreler plaka yüzeyinin %80-90'ını kaplar ve orijinal morfolojiyi korurlar. Bu, bölme için en uygun aşamayı temsil eder. (C) >6 pasajdan sonra hücreler morfolojilerini değiştirerek daha büyük ve daha uzun olurlar ve hücreler senescence girer. Tüm resimlerde, parlak, toplanmış hücreler ölü hücreleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Üç yarasa türünden standart DNA analizleri için dna çıkarmalarının temsili sonuçları, DNA Species 1'den iki kez çıkarıldı. Tek bir büyük bant, her bir çıkarmadan en az parçalanma ve benzer büyüklükteDNA parçalarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Dört farklı bölgede örnekalınan neotropikal yarasa türlerinden 13 farklı doku türünden RNA tümselsi (RIN) rna çıkarma ları. Bu ekstraksiyonlar açıklanan protokolden sonra hazırlandı ve daha sonra HiSeq/NextSeq Illumina transkripsiyon kütüphanelerinin hazırlanmasında kullanıldı. MOE ana koku epitelolduğunu. VNO vomeronasal organdır. Andes, Kosta Rika ve Dominik Cumhuriyeti'ndeki türlerden alınan dokular, bir gecede 4 °C'de RNA stabilizasyon çözeltisinde ıslatıldıktan sonra doğrudan LN2'ye yerleştirildi. Amazon'daki türlerden alınan dokular, RNA stabilizasyon çözeltisine yerleştirildikten yaklaşık 1 hafta sonra LN2'ye yerleştirildi ve sürekli olarak 4 °C'de tutuldu. N, her doku ekstraksiyonu için temsil edilen bireylerin sayısını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Uygulama | Flash dondurulmuş (L2) | RNAlater | AllProtect | FFPE | Medya |
| Yüksek MW DNA |  |
 |
|
|
|
| Düşük MW DNA | |
|
|
|
|
| Rna | |
|
|
|
|
| Protein | |
|
|
|
|
| Hücre Kültürü | |
|
|
|
|
Tablo 1: Koruma yöntemlerine ve uygulamalarına genel bakış. MW = molekül ağırlığı, FFPE = formalin-sabit parafin gömülü doku. Onay işaretleri, her bir amaçlanan uygulama için tercih edilen koruma yöntemini gösterir. X-işaretleri kullanılmaması gereken korumaları gösterir.
| Tür Kimliği | Örnek Kimlik | Konsantrasyon (ng/μL) | Örnek parça tepe boyutu (bp) |
| Türler 1 | 1.1 | 31.8 | 21,885 |
| 1.2 | 22.8 | 19,633 | |
| Türler 2 | 2 | 30.4 | 25,198 |
| Türler 3 | 3 | 32 | 24,386 |
Tablo 2: Bu protokoldeki koruma yöntemlerine dayalı DNA çıkarmasonuçları. Değerler Şekil 5'tekijel elektroforez kuyularına karşılık gelmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazmasında tartışılan protokol yarasaların çeşitli yüksek işlemmoleküler analizleri için en iyi örnekleme uygulamalarını açıklayınız. Tüm başarılı -omics çalışmaları yüksek kaliteli doku gerektirir, ancak örnekleme yarasa dokusu, yanı sıra diğer model olmayan organizmalar, genellikle kontrollü bir laboratuvar ayarı ile aynı standartlara ayarlanamayan alan koşullarında oluşur. Örnekleme genellikle elektrik ve donduruculara sınırlı erişim de dahil olmak üzere en az kaynaklarla uzak konumlarda gerçekleşir. Tamamen steril örnekleme koşulları sağlamak zordur ve çoğu zaman imkansızdır. Bu nedenle, ana hatlarıyla çeşitli örnekleme yerlerinde ve alan koşullarında en başarılı olarak tanımlanan protokoller sıralanır. Bat1K girişimi ve ilgili çaba ve projeler için standart örnekleme yöntemlerine sahip olmak için yarasa biyologlarının bu protokolleri takip ederken, saha keşiflerini izin verilen ölçüde planlamaları önerilmektedir.
Protokol önerileri
Torasik kompresyon geçmişte ötanazi için yaygın bir yaklaşım iken,omik analizler için yarasa toplamak için torasik kompresyon kullanmak asla önerilmektedir. Artık Amerika Birleşik Devletleri46ötanazi kabul edilebilir bir formudur , ve bu yöntem ilgi türleri ne olursa olsun dokuların bir dizi enzimatik bozulmaya yol açabilir47. Eğer bir hayvan ötenazi yapılacaksa, hem genomik hem de transkripsiyonanalizleri için doku toplanması önerilmektedir. Her ikisi de ideal LN2 dondurulmuş flaş olacak taze doku hasat gerektirir, ama aynı zamanda DNA, RNA veya protein çıkarma kolaylaştırmak için farklı ortamda saklanabilir. Dokularda RNA bozulmasını azaltmak için kranial ve postkraniyal diseksiyonlar iki kişi ile paralel olarak çalışma önerilmektedir. Bir kişi kafatasını parçalamalı, diğeri ise kafatası sonrası üzerinde çalışmalı.
Diseksiyon protokollerinin yürütülmesinin en önemli sınırlamaları arasında diseksiyonda yer alan personel ve doku ların korunması için kullanılabilir alan (örneğin, LN2 tankında). Şişelerin önceden hazırlanması ve tüplerin etiketlenmesi ve toplanan şişe ve dokuların belgelenmesinde yardımcı olacak yeterli sayıda insan, düzgün numune işlemeye katkıda bulunacaktır. Gerekli (ihracat, ithalat) süreçlerinin elde edilmesi için numunelerin doğru belgelenmesinin gerekli olduğu unutulmamalıdır. Örneğin postkraniyal diseksiyon protokolü hayvan başına 20'den fazla şişe talep eder.
Uzay ve zaman sınırlıysa, aşağıdakiler önceliklendirilmelidir: 1) türler için bir örnek için önceliklendirme, ya da en azından cins başına bir örnek; Bir erkek numunenin hem X hem de Y kromozomunun dizilemesine izin vermek ve üreme dişiörnekleme olasılığını en aza itebilmeleri için önceliklendirme; 2) HMW DNA için: beyin, kas, ve karaciğer herhangi bir reaktif olmadan dondurulmuş flaş olmalıdır; 3) RNA için: beyin, sindirim dokuları, dalak, ve duyu organları yüksek önceliklidir. Her doku örneği RNA stabilizatör çözeltisinde saklanmalıdır. Kas dokusu da özel doku ekspresyon analizleri için bir kontrol olarak alınmalıdır; 4) en az, dokular soğuk tutulmalıdır; 5) LN2 durumu da endişe verici olabilir. LN2 tankları en az iki haftada bir doldurulmalıdır ancak daha sık sıcak iklimlerde veya tank sık sık açılıyorsa. LN2 genellikle tüm ülkelerde ticari olarak mevcuttur, çünkü numuneleri taşımak için tarım ve sağlık hizmetlerinde sıkça kullanılmaktadır. Genellikle bu hizmetler aynı zamanda karbondioksit veya oksijen gibi diğer gazlar, satmak şirketler tarafından sağlanmaktadır. Dondurma dükkanları bazen kuru buz veya LN2 için başka bir seçenek sunuyoruz (ya da en azından satın almak için bir öneri sağlamak), ve bu konuda yerel personel sormak için önerilmektedir; 6) Şekil 6, koşulların sınırlı olduğu bazı toplama seferleri için başarılı doku ekstraksiyonlarını özetler.
Daha fazla insan ve daha fazla alan ile, daha fazla doku farklı şekillerde toplanabilir. Aşağıda, araştırmacıların uygun deneyim ve malzemelerin mevcut olup olmadığını göz önünde bulundurmaları gereken başka yerde yayınlanan ek protokoller şunlardır: 1) yarasa metabolomu veya hücre ve dokuların tüm boşaltılmış düşük molekül ağırlıklı metabolitleri olağanüstü yarasa uzun ömürlü veya kış uykusu ve metabolik uçuş talepleri içine içgörü. Kan kolayca ulaşılabilen bir kan damarından toplanmalıdır, ayak bileği damarları gibi, heparin ile bir şişe içine48, ve dışkı örnekleri LN2 dondurulmuş olmalıdır49; 2) immünomik, ya da patojenler için hayvanın tepkisi, femurlar ve humeri alarak analiz edilebilir ve kültür makrofajlar downstream50doku kültürü çözüm yerleştirerek ; 3) dışkı diyet51 belirlenmesi ve bağırsak mikrobiyomu52,53,54probing gibi downstream nükleik asit tabanlı analizler, iki tip için yararlı olabilir. Her iki durumda da, doku stabilizasyon çözeltisi gibi reaktifler dışkıda bulunan nadir varyantların bozulmasını azaltır; 4) lipidomik, ya da bir doku tipinin fosfolipid repertoires, beyaz burun sendromu mantar patojeni anlamada ortaya olmuştur55,56. Doku hazırlanması nın diseksiyondan hemen sonra dondurulması önerilmektedir.
Bat1K için doku arşivleri
Bat1K, genomları oluşturmak için kullanılan her yarasanın doku bankasını korumayı amaçlamaktadır. Şu anda, bu doku bankaları ve kişi başına toplanan ilgili henotibik ve ekolojik veriler Bat1K katkıda bulunan üyelerin laboratuvar/müze koleksiyonlarında muhafaza edilmektedir. Proje ilerledikçe Bat1K, Küresel Genom Biyolojik Çeşitlilik Ağı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo ve Fanny Fernndeáz Melo'ya doku yapımı için teşekkür ederiz. Peru'da toplama mümkün. Ayrıca Dominik Cumhuriyeti'nde doku toplama mümkün hale getirmek için Grupo Jaragua ve Yolanda León tüm üyelerine teşekkür yanı sıra Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, ve Kosta Rika La Selva Biyolojik Araştırma İstasyonu'nda herkes, yapmak için örnekleme mümkündür. Biz erişim ve hücre kültürü üretimi için Phyllostomus derenk yarasalar kanat yumruklar örnek toplama için Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe teşekkür ederiz. Phyllostomus renk değişikliği yarasalar Münih Ludwig-Maximilians-Üniversitesi Bölümü Biyoloji II bir üreme koloni kökenli. Yarasaların bakım ve üremesi için Münih bölge veterinerlik ofisi tarafından onay verildi. LMD, SJR, KTJD ve LRY NSF-DEB 1442142 tarafından finanse edilmiştir. LMD NSF-DEB 1838273 tarafından finanse edilmiştir. LRY NSF-PRFB 1812035 tarafından finanse edilmiştir. SCV ve PH, Max Planck Araştırma Grubu Ödülü ve Human Frontiers Science Program (HFSP) Araştırma hibesi (RGP0058/2016) tarafından finanse edilmiştir. SJR, JHTP ve KTJD, SJR'a verilen Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Başlangıç hibesi 310482 [EVOGENO]) tarafından finanse edilmiş, EKT Avrupa Araştırma Konseyi hibesi (ERC-2012-StG311000) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3 mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| Collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
References
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen? Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , Museum of Texas Tech University. (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Schaumburg, IL. (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity? PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
