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Biology

Colección de tejidos de murciélagos para análisis de émica y cultivo celular primario

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59505
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 4, 5, *3,6, *2,7
1Department of Geology & Geophysics, Yale University, 2Department of Ecology & Evolution, Stony Brook University, 3Neurogenetics of Vocal Communication, Max Planck Institute for Psycholinguistics, 4School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London, 5School of Biology & Environmental Science, University College Dublin, 6Donders Institute for Brain, Cognition and Behavior, 7Consortium for Inter-Disciplinary Environmental Research, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

Este es un protocolo para la preparación óptima del tejido para análisis genómicos, transcriptómicos y proteómicos de murciélagos atrapados en la naturaleza. Incluye protocolos para la captura y disección de murciélagos, la preservación de tejidos y el cultivo celular del tejido murciélago.

Abstract

A medida que avanzan las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los métodos estandarizados para la adquisición y preservación de tejidos de alta calidad permiten la extensión de estos métodos a organismos no modelo. Se ha desarrollado una serie de protocolos para optimizar la recolección de tejidos de murciélagos para una serie de enfoques de secuenciación de alto rendimiento. Aquí se describen los protocolos para la captura de murciélagos, los datos demográficos deseados que se recogerán para cada murciélago y los métodos optimizados para minimizar el estrés en un murciélago durante la recolección de tejido. Específicamente se describen los métodos para recolectar y tratar tejido para obtener (i) ADN para análisis genómicos de alto peso molecular, (ii) ARN para transcriptomas específicos del tejido y (iii) proteínas para análisis de nivel proteómico. Por último, también se describe un método para evitar el muestreo letal mediante la creación de cultivos celulares primarios viables a partir de clips de alas. Una motivación central de estos métodos es maximizar la cantidad de datos moleculares y morfológicos potenciales para cada murciélago y sugerir formas óptimas de preservar los tejidos para que conserven su valor a medida que se desarrollen nuevos métodos en el futuro. Esta normalización se ha vuelto particularmente importante a medida que han surgido iniciativas para secuenciar genomas de especies a nivel de cromosomas y libres de errores en todo el mundo, en los que múltiples partes científicas están encabezando la secuenciación de diferentes taxonómicos Grupos. Los protocolos descritos aquí definen los métodos ideales de recolección de tejidos y preservación de tejidos para Bat1K, el consorcio que está secuenciando los genomas de cada especie de murciélago.

Introduction

Los métodos de secuenciación de alto rendimiento (HTS) han avanzado rápidamente en eficiencia y han disminuido en costos, y ahora es posible escalar estos enfoques a cientos o miles de muestras. Las perspectivas obtenidas por la aplicación de estas tecnologías tienen enormes impactos en múltiples disciplinas científicas, desde la biomedicina hasta la evolución y la ecología1,2,3. Sin embargo, muchas aplicaciones de HTS dependen críticamente de los ácidos nucleicos de alta calidad de una fuente viva. Es probable que esta limitación se vuelva cada vez más problemática con el desarrollo de la secuenciación de tercera generación basada en moléculas de lectura larga4. Por estas razones, es necesario centrar los esfuerzos en establecer las mejores prácticas para la recolección de muestras de tejido fresco de organismos silvestres fuera del laboratorio, lo que maximiza la utilidad del material y reduce el número de individuos que necesitan ser Recogidos.

Bat1K es un consorcio internacional de científicos con una iniciativa continua para secuenciar el genoma de cada especie de murciélago en el conjunto a nivel cromosómico5. Los murciélagos representan el 20% de la diversidad de mamíferos y tienen adaptaciones excepcionales que tienen implicaciones para entender el envejecimiento, la ecología de enfermedades, la biología sensorial y el metabolismo5,6. Muchos murciélagos también están amenazados o en peligro debido a la explotación humana7 o están disminuyendo rápidamente debido a patógenos8,9,y la secuenciación a nivel del genoma es de gran importancia para la conservación de estas especies. Aunque Bat1K actualmente tiene como objetivo secuenciar los genomas de todas las especies de murciélagos, la estandarización de la recolección de muestras de tejido para la secuenciación genómica de alta calidad sigue siendo un desafío clave en toda la comunidad de biólogos del organismo. Además de los datos genómicos, la comprensión funcional de la diversidad de adaptaciones de murciélagos requiere transcriptoma de tejidos específicos y análisis de proteínas, a menudo que requieren protocolos de recolección separados. Además, al igual que con todos los grupos taxonómicos, si bien la recolección y conservación óptima de tejidos es esencial para obtener los datos de la más alta calidad para los análisis de la omics, la comunicación de las mejores prácticas a menudo es difícil debido a los cambios rápidos en las tecnologías y múltiples equipos de investigación trabajando de forma independiente.

La necesidad de adoptar las mejores prácticas para la investigación de murciélagos-omics es especialmente urgente, dado que muchas especies de murciélagos son raras o amenazadas. A diferencia de otros pequeños mamíferos como roedores y musarañas, los murciélagos son de larga duración, atribuibles a mecanismos excepcionales de reparación del ADN10 y la reproducción lenta11,con la mayoría de las especies dando a luz a sólo una o (en algunos casos) dos crías al año. Por estas razones, las poblaciones de murciélagos pueden ser lentas para recuperarse de las perturbaciones, y recoger a muchos individuos de la naturaleza no es aconsejable ni factible. En otras palabras, los protocolos deben optimizarse para obtener la máxima cantidad de datos para una sola muestra, lo que reduce la necesidad de replicar innecesariamente los esfuerzos de muestreo.

Aquí, este protocolo se centra específicamente en métodos estandarizados para la recolección y muestreo de tejido murciélago para la secuenciación genómica y transcriptomica y análisis de proteínas. Su principal prioridad es garantizar que los tejidos del murciélago se recojan de forma ética y responsable, desde el proceso de permiso para la recolección, la exportación de tejidos hasta la minimización del estrés al animal y las condiciones de almacenamiento a largo plazo. Se han desarrollado disecciones elaboradas con el objetivo de probar el futuro la utilidad de los diferentes materiales recogidos. Este manuscrito proporciona una guía paso a paso para recoger murciélagos de una manera humana que está destinada a minimizar el impacto en las poblaciones y maximizar el valor científico. Si bien el enfoque de este protocolo es específicamente para su uso en murciélagos, muchos de los pasos son relevantes para otros taxones vertebrados, especialmente los mamíferos.

Resumen de la colección de tejidos
El procedimiento para la recolección de tejidos, incluida la temperatura de almacenamiento y la elección del agente conservante, se determinará por la naturaleza de los análisis posteriores previstos. Sin embargo, se recomienda encarecidamente que, cuando sea posible, el tejido se recoja bajo una serie de métodos para maximizar su utilidad futura, incluso si no se planea ningún análisis específico. En general, el tejido se recoge y conserva para análisis posteriores de ácidos nucleicos (ADN y ARN) o proteínas. Para cada una de estas aplicaciones, el tejido se puede conservar de forma óptima mediante la congelación directa del flash en nitrógeno líquido (LN2). Sin embargo, la inmersión inmediata en LN2 no siempre es posible en el campo. A medida que avanza la tecnología, recursos como viales especializados para almacenar ADN y ARN a temperaturaambiente son cada vez más fácilmente disponibles. Aunque no hemos validado todos estos materiales en este protocolo, animamos a otros investigadores a analizar comparativamente el rendimiento de los nuevos materiales en relación con lo que presentamos aquí. Proporcionamos métodos para preservar idealmente el tejido para diferentes aplicaciones en situaciones en las que no se puede acceder a LN2, por ejemplo, cuando el transporte LN2 no es posible debido al acceso al sitio a través de un pequeño plano en el Amazonas. Además, proporcionamos un método para la recolección de tejido del que se pueden cultivar y propagar células vivas. A continuación describimos las consideraciones clave para la recopilación de material para cada uno de estos propósitos respectivos y se ofrece una visión general de los métodos de recogida en el Cuadro 1.

Tejido para ADN
Para todo el tejido cosechado recogido, el medio de almacenamiento determinará si se puede utilizar para la extracción de ADN estándar o de alto peso molecular (HMW). HMW es necesario para la secuenciación de lectura larga y actualmente se requiere para generar conjuntos de genomas de nivel cromosómico, o un genoma "estándar de platino". El ADN de bajo peso molecular (LMW) se puede extraer de muestras congeladas por flash, AllProtect (en adelante denominada "solución estabilizadora de tejidos"), o incluso muestras conservadas por RNAlater (en adelante "solución estabilizadora de ARN") (aunque las muestras congeladas con flash siguen siendo óptimas ). El ADN aislado por métodos de laboratorio estándar (p. ej., columnas de espín de membrana de gel de sílice, fenol-cloroformo), todavía puede producir fragmentos de ADN de hasta 20 kilobases (kb). Por lo tanto, siempre que haya suficiente rendimiento, esta forma de ADN aislado se puede utilizar para la preparación de la biblioteca de tamaño de plaquita única, en la que el tamaño de la plaquita es a menudo de 500 pares de base (bp), ysegeneran lecturas de secuencia corta de 100 bp. Este ADN es particularmente útil para proyectos de "resecuenciación" o estudios en los que no se requieren datos cromosómicos de longitud completa. El ADN HMW (10-150 kb) es más difícil y sólo se puede obtener de forma fiable utilizando tejido que ha sido rápidamente congelado en LN2 después de la cosecha y mantenido a un máximo de -80 oC hasta la extracción.

El bajo peso molecular o el ADN fragmentado a menudo es suficiente para enfoques específicos, incluida la amplificación de genes a través de PCR y la secuenciación de lectura corta13. Las investigaciones basadas en PCR utilizando ADN LMW que se dirigen sólo a uno o unos pocos genes han sido muy informativas en la comprensión de la adaptación y la evolución molecular de la biología sensorial demurciélagos 6,14, fisiología15, filogenética 5,16, y conservación17,18. También se ha demostrado una recaptura exitosa de secuencias dirigidas de bajo peso molecular y ADN fragmentado para numerosos grupos de vertebrados, incluidos los murciélagos19. Estos métodos son a menudo rentables y mínimamente invasivos para el murciélago, ya que las muestras fecales y el muestreo de tejido no letal a través de hisopos bucales o punzones de biopsia de ala también son formas comunes de obtener ADN para análisis de bajo peso molecular20, 21.

Sin embargo, la calidad depende en gran medida del tipo de soporte en el que se almacena la muestra22. Después de comparaciones sistemáticas y cuantitativas de hisopos bucales y punzantes de biopsia, se ha demostrado que los punzones de biopsia de alas producen consistentemente niveles más altos de ADN y fueron menos estresantes para el murciélago durante la recolección22. Estas comparaciones también mostraron que los mejores resultados se obtuvieron cuando el punzón del ala se conservó en sílice indicadora (es decir, un tipo de desecante hecho de cuentas de gel de sílice que cambia de color cuando se observa humedad) en lugar de en otros medios de almacenamiento populares como etanol o DMSO22; sin embargo, no se examinaron otros medios de almacenamiento, incluida la solución de estabilización de tejidos. Los punzones de las alas también se pueden utilizar para cultivar células fibroblastas en cultivo, como en Kacprzyk et al.23 y como se describe a continuación (ver sección 6). Para estos métodos, el ala o el uropatagium deben extenderse suavemente, y se debe utilizar un punzón de biopsia limpio, típicamente de 3 mm de diámetro, para obtener la muestra. Este enfoque parece no causar daño duradero, con cicatrices curando en cuestión de semanas en la mayoría de los casos24.

El ADN HMW (10-150 kb) es más difícil y actualmente sólo se obtiene de forma fiable utilizando tejido que ha sido rápidamente congelado en LN2 después de la cosecha y mantenido a un máximo de -80 oC hasta la extracción. El ADN HMW (10-150 kb) es crucial para la secuenciación de ADN de lectura prolongada y, por lo tanto, para el ensamblaje del genoma de novo. De hecho, si bien la mayoría de los kits comerciales se pueden utilizar para aislar algunos ADN HMW estándar, los tamaños de molécularesultantes a menudo no cumplen con los requisitos de las tecnologías de secuenciación de tercera generación [por ejemplo, las lanzadas por empresas como Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, y 10x Genomics, o a través de métodos de montaje ofrecidos por Bionano Genomics o Dovetail Genomics]. Como tal, existe una nueva demanda de ADN "ultra HMW" (>150 kb). Al obtener ADN ultra HMW de murciélagos, muestras frescas de hígado, cerebro o músculo son todas adecuadas, pero estas deben ser congeladas inmediatamente en LN2 sin ningún búfer de almacenamiento o crioprotector. Una descripción completa de estos pasos está fuera del alcance de este documento, pero están disponibles en otros lugares25.

Tejido para ARN
El ARN es una molécula de una sola cadena que es menos estable que el ADN. Aunque hay muchas formas de ARN, los análisis -omics tienden a centrarse en el ARNm (ARN mensajero) y los ARN pequeños (por ejemplo, microARN). Después de la transcripción, el ARNm se empalma para formar una transcripción madura que no contiene intrones y representa la porción codificante de genes/genomas. Los genes de codificación representan una pequeña fracción del tamaño del genoma (1%-2%), lo que hace que el ARNm objetivo sea un medio rentable para obtener datos de secuencia para los genes. Los MicroRNAs son una clase de ARN que regulan el proceso de traducción del ARNm en proteínas y, por lo tanto, son importantes efectores reguladores. Las transcripciones de ARN se pueden secuenciar individualmente, o más comúnmente para los análisis -omics26,27,28,29,30, como parte de un transcriptoma; es decir, el total de todas las transcripciones de ARN presentes en una muestra dada.

La secuenciación se puede realizar siguiendo varios métodos (es decir, a través de ARN-seq de lectura corta o isoforma entera de lectura larga Seq), permitiendo el análisis tanto de la abundancia de ARN como del uso isoform. A medida que la cantidad y diversidad de transcripciones de ARNm varía entre células y tejidos, la secuenciación del ARN permite estudiar y comparar la expresión génica y la regulación entre muestras. El interés en secuenciar pequeños ARN y secuenciación isoforme entera está creciendo, ya que estos métodos son cada vez más informativos biológicamente. La preparación de muestras de tejido para secuenciar diferentes clases de ARN se puede realizar de la misma manera que se presenta en este manuscrito, con sólo los métodos de extracción posteriores diferentes31,32. Por último, debido a que los transcriptomas ofrecen un subconjunto de alta cobertura del genoma de codificación de proteínas, el conjunto de datos ensamblado puede ser útil en el ensamblaje y anotación del genoma, haciendo que la recopilación de datos de ARN-seq a través de una gama de diferentes tejidos sea un componente importante de la Iniciativa Bat1K.

A diferencia del ADN, el ARN es químicamente inestable y también está dirigido por las enzimas RNase, que están presentes omnipresentes en los tejidos que se colocan como una estrategia defensiva contra los virus basados en ARN. Por estas razones, la fracción de ARN en células y tejidos comienza a degradarse poco después del punto de muestreo y/o eutanasia. Por lo tanto, la preservación del ARN requiere medidas para evitar su degradación. Por lo general, esto implica preservar el tejido recién recolectado a 4 oC en un agente estabilizador, como la solución estabilizadora del ARN, para inactivar las RNases presentes naturalmente en los tejidos, seguido de congelación para un almacenamiento a largo plazo. Como alternativa preferida, el tejido puede ser congelado en LN2; aunque como se señaló anteriormente, transportar LN2 al campo y mantener niveles para evitar que el tejido se deshaga puede ser logísticamente difícil.

Tejido para proteínas
La composición proteica y la abundancia relativa varían entre las células y los tejidos de una manera similar a lo que se discutió para el ARN; sin embargo, las proteínas son en promedio más estables que el ARN. La identificación de proteínas utilizando proteómica típicamente coincide con una fracción de, y no toda, la secuencia de proteínas, pero puede proporcionar información sobre la expresión a través de los tejidos y caracterizar los patógenos presentes. Como muchas secuencias de proteínas se conservan en todos los mamíferos, las muestras de murciélagos para la proteómica pueden contaminarse fácilmente con proteínas humanas conservadas, lo que requiere protocolos estériles (por ejemplo, guantes, fórceps) durante la recolección. Mientras que la congelación del flash en LN2 es la mejor manera de prevenir la degradación de las proteínas, el uso de hielo seco, congeladores de -20 oC, e incluso el hielo son adecuados si no hay otros medios. A medida que aumentan las temperaturas, también aumenta el riesgo de descomposición diferencial de proteínas. Los agentes estabilizadores, como la solución de estabilización de tejidos, son eficaces para preservar la fracción proteica de los tejidos a temperatura ambiente y son adecuados para la conservación a corto plazo (hasta una semana) cuando la congelación del flash no es viable.

El perfil enzimático de un tejido dado influye directamente en la preservación de la proteína en él. Los tejidos con baja actividad enzimática como el músculo pueden preservar los perfiles de proteínas incluso a temperaturas más altas en un congelador doméstico. Por el contrario, el tejido hepático es enzimáticamente reactivo, y sus proteínas tienen mayores probabilidades de degradarse durante la preparación. El creciente número de protocolos para obtener perfiles proteómicos humanos a partir de muestras de parafina incrustada en formalina (FFPE) sugiere que la fijación de tejidos paraformaldehídes promete la preservación de proteínas de bajo costo cuando la congelación al recolectarse no es factible33,34. Aunque dependen en gran medida del tiempo y la condición de conservación, las proteínas se han identificado a través de la inmunohistoquímica de muestras de murciélagos fijas en formalina y conservadas con etanol35. Este enfoque no es escalable para el muestreo de nivel proteómico, pero destaca la posibilidad de que los tejidos de murciélago fijados en formalina produzcan perfiles de proteínas cuando la congelación de flash no está disponible y otros agentes estabilizadores son demasiado costosos.

Tejido para el cultivo celular
El tejido de muestreo y la congelación de flash ofrecen una cantidad finita de material a utilizar, y una vez que se utiliza el material, ya no está disponible. Alternativamente, los cultivos celulares proporcionan células vivas que se pueden utilizar o conservar inmediatamente para futuros estudios. Los cultivos también facilitan la expansión de las células para aumentar el rendimiento cuando las muestras de tejido son pequeñas. Es particularmente útil en casos donde la recolección de tejidos es limitada, como experimentos con especies raras en los que el muestreo no letal es esencial y, por lo tanto, tiene amplias implicaciones para la conservación. Descrito es un protocolo en el que el cultivo celular es posible a través de muestreo no letal de tejido de membrana de las alas, pero el cultivo es posible con múltiples tipos de tejido36,37. El protocolo proporcionado aquí selecciona para las células adherentes. La combinación de tejido fuente y medios de crecimiento utilizados hace que este protocolo sea adecuado para seleccionar y crecer fibroblastos, pero si se desea, se pueden utilizar protocolos alternativos para seleccionar otros tipos de células. En el contexto del proyecto Bat1K, se prevé que para las especies raras y amenazadas, el muestreo no letal de las membranas de las alas y la expansión de las muestras a través del cultivo es esencial para generar el volumen de ADN necesario para las múltiples tecnologías empleadas5 .

Captura de murciélagos
Todas las personas que manipulan murciélagos deben ser entrenadas por un investigador competente para murciélagos y vacunadas contra la rabia con una serie de inyecciones previas a la exposición. Si se muerde, todavía es necesaria otra serie de inyecciones post-exposición. Los métodos estándar para capturar murciélagos incluyen redes de niebla (Figura 1) y trampas de arpa (Figura 2). Las redes de niebla se utilizan con mayor frecuencia e ideales para áreas con actividad baja a moderada, ya que requieren el mayor cuidado para minimizar la angustia de los murciélagos. Los murciélagos pequeños son particularmente vulnerables y pueden morir por estrés si no se atenden a hacerlo rápidamente. Las inspecciones netas frecuentes minimizan las lesiones y mortalidad de los murciélagos, así como los daños en la red de niebla. Este detalle es importante porque la recolección adecuada de tejido requiere que el tejido esté fresco, y la atención inadecuada a las redes de niebla en los murciélagos puede conducir a una mortalidad innecesaria o mortalidad prematura antes de que el investigador pueda procesar correctamente las muestras. Debido a que varios murciélagos pueden descansar en una trampa de arpa con una angustia mínima, este enfoque es ideal para áreas con alta actividad de murciélagos, como cerca de una cueva o gran dormidero. Las instrucciones detalladas para la captura adecuada de murciélagos y el procesamiento de datos para la recopilación de información morfológica y demográfica están disponibles en los métodos suplementarios.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Stony Brook (protocolo #2013-2034).

1. Eutanasia

  1. Humedezca una bola de algodón con un anestésico isoflurano u otro anestésico disponible.
  2. Coloque la bola de algodón en una bolsa de plástico hermética y resellable. La bolsa debe ser lo suficientemente grande como para sujetar una bolsa en una bolsa de murciélago de tela cómodamente.
  3. Después de varios minutos de permitir que la bolsa se permee con anestésico, coloque una bolsa de murciélago que contenga el murciélago en la bolsa de plástico.
  4. Espere varios minutos hasta que el murciélago sea eutanasiado. Los murciélagos de 20 g o menos de peso requieren aproximadamente 5-10 min. Los murciélagos más grandes que esto pueden requerir hasta 20 min. Tenga en cuenta que el tiempo también podría depender de la permeabilidad de la bolsa de murciélago. Se recomienda utilizar el material de tela más delgado posible para maximizar la difusión del anestésico.
  5. Compruebe si hay aliento y latidos del corazón para asegurarse de que el murciélago ha sido eutanasiado antes de que comience la disección.

2. Preparación de la disección

  1. Mantenga toda la instrumentación limpia entre disecciones, utilizando el siguiente protocolo.
  2. Lave los instrumentos con agua y jabón para platos. Límpielos con un 10% de lejía, lejos de la zona de disección, ya que la lejía descompondrá los ácidos nucleicos.
  3. Limpie con 70% de etanol.
  4. Limpie con el reactivo de descontaminación de ARN.
  5. Repita esta sección después de cada disección.

3. Preparación de los viales para muestras de tejido

  1. Para ARN:
    1. Prepare todos los viales antes de iniciar cualquier disección para evitar retrasos.
    2. Deje a un lado el número de viales necesarios para cada espécimen. Etiquete cada tubo con el tipo de tejido que se recogerá, así como la información estándar de identificación de la muestra. Llene los viales un 50% llenos de solución estabilizadora de ARN e idealmente enfríe a 4 oC.
    3. Tenga cuidado de no llenar los viales completamente con solución estabilizadora de ARN, de lo contrario el tubo puede explotar al colocarlo en LN2. Al tomar muestras de tejido, recuerde que grandes bultos de tejido no serán completamente impregnados por la solución estabilizadora de ARN. Por lo tanto, cortar el tejido en trozos más pequeños de no más de 0,5 cm en una dimensión, y mantener una relación de al menos 10:1 volumen para la solución estabilizadora de ARN:tejido.
    4. Como mínimo, los tejidos diseccionados deben colocarse en la solución estabilizadora del ARN, incluso si el acceso a LN2 o almacenamientos en frío no están disponibles.
  2. Para ADN:
    NOTA:     El contenido de ADN nuclear es el mismo para casi todos los tejidos; por lo tanto, el muestreo puede ser flexible. Sin embargo, cabe señalar que mayores densidades de mitocondrias en el tejido muscular pueden conducir a una pérdida de lecturas para el genoma nuclear38.
    1. Para ADN de bajo peso molecular, tome una o más réplicas de la membrana del ala para su almacenamiento en sílice y/o músculo para su almacenamiento en la solución de estabilización de ARN o solución de estabilización tisular.
    2. Para ADN ultra HMW, congelación flash en LN2 sin ningún reactivo de almacenamiento, luego transfiera a almacenamiento a largo plazo a -80 oC o más frío. A partir de la disección craneal, el tejido cerebral es el tipo de tejido más adecuado para recuperar ADN ultra HMW39,mientras que a partir de disecciones postcraneales, hígado o músculo son más adecuados40.
    3. Para la disección craneal, utilice viales de 5 ml (a diferencia de los viales estándar de 2 ml) de solución estabilizadora de ARN para algunos tejidos. Todos los viales deben ser criogénicos. Mantenga los viales sobre hielo mientras se disecte.

4. Disecciones craneales para ARN

  1. Inmediatamente después de la eutanasia, decapitar el espécimen con un gran par de tijeras o cortadores de huesos (Figura 3).
  2. Retire los ojos con fórceps usando fuerza lo suficientemente fuerte como para separar el nervio óptico. Coloque los ojos en un vial de 2 ml de solución estabilizadora de ARN.
  3. Usando la herramienta de elección, despelleja el cráneo del cabello, la fascia y los músculos del cráneo, incluida la piel de la nariz. Tenga cuidado de no romper la parte delantera de la nariz.
  4. Usando tijeras, hacer un corte sagital en la parte ventral(Figura 3) del cráneo comenzando en el cuello, teniendo cuidado de no dañar el cerebro.
  5. Usando fórceps, tire suavemente hacia atrás de ambos lados del cráneo hasta que se haya agrietado y el cerebro esté expuesto.
  6. En el extremo caudal del cráneo, las cocleares ahora deben ser visibles lateralmente a cada lado de la cabeza. Son huesos pequeños y esféricos en el lado izquierdo y derecho, simplemente rostral al cuello y posterior a los músculos de la masseter. Con fórceps, tire suavemente de la cócleara y colóquelas en un vial de 2 ml de solución estabilizadora de ARN.
  7. Raspar suavemente el cerebro (que será muy suave) con fórceps. La bombilla olfativa se hará visible, sentada en la parte ventral del interior del cráneo. Trate de mantener la bombilla olfativa unida.
  8. Si el bulbo olfativo aún no ha sido removido, raspe suavemente el tejido, y la placa cribriforme se hará evidente. Este es un hueso crítico para mantener al investigador orientado. Se puede identificar como la región más anterior del cráneo con múltiples foramen y el punto en el que descansan dos ranuras donde descansa la bombilla olfativa.
  9. Si es posible, mantenga la forma del cerebro intacta y colóquela inmediatamente sobre hielo seco para mantener la forma o en un vial de 5 ml de solución estabilizadora de ARN. Si la inmunohistoquímica se debe hacer en el cerebro, colóquela en un 4% de paraformaldehído, si está disponible.
  10. Haga dos incisiones donde la mandíbula superior e inferior se unen, y retire la mandíbula.
  11. Una vez que la mandíbula ha sido removida, retire la tribuna (mandíbula superior) de la parte restante del cráneo. Asegúrese de que la mandíbula incluya la placa cribriforme.
  12. Colocar la nariz en la solución estabilizadora del ARN y almacenar a 4 oC durante la noche. Debido a que se trata de un tejido denso, requiere tiempo para permitir que la solución estabilizadora del ARN permee todo el tejido.
  13. Coloque el vial de nariz en LN2 después de la solución estabilizadora de ARN durante la noche.
  14. Desde la mandíbula inferior, cortar la lengua con tijeras y colocar en un vial de 2 ml de ARN para más tarde.
  15. Este protocolo pierde la mayor parte del cráneo. Los dientes, particularmente los de la mandíbula, se pueden recuperar y pueden ser útiles para el diagnóstico de especies. El tejido óseo se puede almacenar en 1 salina tamponada con fosfato (PBS).

5. Disecciones postcraneales para ARN

  1. Utilice un bisturí para perforar a través de la cavidad abdominal, haciendo una incisión longitudinal hasta las costillas (Figura 3). Esto pierde el marco esquelético. Si se va a conservar el hueso, diseccione cuidadosamente de la piel en el músculo y guárdelo en 1x PBS después de que se complete la disección de tejidos blandos.
  2. Despojar la piel para revelar el músculo pectoral, tomar al menos dos muestras de músculo, una para la solución estabilizadora de ARN y otra para permanecer congelada para el ADN HMW, colocándolo inmediatamente en un vial para ponerlo en LN2.
  3. Cortar a través del esternón y tirar de las costillas para recoger muestras del pulmón.
  4. Recoger el corazón, que se puede tomar entero, pero debe ser seccionado en mitades, por lo que la solución estabilizadora de ARN se empapa a fondo.
  5. Tome muestras del hígado. Tomar al menos dos muestras de hígado, una para permanecer congelada para el ADN HMW, colocándolo inmediatamente en un vial vacío para ponerlo en LN2. El hígado es muy enzimático, y es importante hacer que las muestras sean lo suficientemente pequeñas como para que la solución estabilizadora del ARN se empape completamente.
  6. El conducto hepático, que funciona para drenar la bilis del hígado, conecta el hígado con el páncreas y el intestino delgado. Este recipiente es fácilmente identificable sondeando la porción inferior/posterior del hígado y rastreando el vaso de una manera posterior. El conducto es a menudo de un color verdoso, así. Siga el conducto hepático para encontrar el páncreas y la vesícula biliar y recogerlos por separado. Colocar en los viales respectivos de la solución estabilizadora del ARN.
  7. Recoger el estómago y, junto a él, en su base y aparecer como un tono diferente de púrpura, es el bazo similar a las plumas. El páncreas también debe ser visible aquí como una estructura blanca(Figura 3). Colocar en los viales respectivos de la solución estabilizadora del ARN.
  8. Recoger pequeñas muestras del intestino delgado y grueso. Colocar en los viales respectivos de la solución estabilizadora del ARN. Los intestinos también se pueden examinar para detectar endoparásitos. Si un parasitólogo está en el campo, se puede realizar una inspección de los parásitos. Si esto se debe hacer más adelante, todo el intestino se puede tomar en un vial criogénico de 5 ml.
  9. Tome uno de los riñones y siga sus conductos hasta la vejiga. Colocar en los viales respectivos de la solución estabilizadora del ARN.
  10. Utilice el otro riñón como guía para encontrar los testículos (si son varones) o el útero y a través de él los ovarios (si son femeninos). Recoger una o ambas gónadas, si es posible.
  11. Conservar muestras de varias partes de la piel del ala en viales separados (parte muscular frente a parte no muscular).

6. Recolección y Preparación de la Cultura de Tejidos

  1. Preparar el medio de crecimiento para las células mediante la conformado del medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 20% de suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina/estreptomicina (P/S) y 50 g/mL de gentamicina. Las alicuotas de medios de crecimiento deben ser frescas todos los días del protocolo.
  2. Después de la recolección, los punzones de biopsia de ala deben colocarse directamente en 1 ml de medio de crecimiento en frío en un tubo centrífugo de 1,5 ml bien sellado. Envuelva el tubo en un parafilm para sellar.
  3. Los tubos deben transportarse en una caja de poliestireno con elementos de refrigeración para mantener las muestras a 4 oC. El transporte debe acelerarse; aunque, las células sanas se pueden hacer de punzones que se han almacenado de esta manera durante un máximo de 6 días, pero menos de manera óptima23.
  4. Una vez transportado a la instalación de cultivo de tejidos, el siguiente protocolo se puede utilizar para generar cultivos celulares. Se deben utilizar técnicas estériles estándar para el resto del protocolo41.

7. Día 1 Cultivo de Tejidos: Disociación de Tejidos

  1. Transfiera el contenido del tubo (medio de crecimiento que contiene la biopsia de membrana del ala) en un tubo centrífugo cónico de 15 ml.
  2. Retire con cuidado el medio de crecimiento. Lave suavemente la biopsia dos veces con 500 ml de PBS estéril.
  3. Añadir 500 ml de colagenasa IV (1 mg/ml) al tubo. Esto causará la digestión del tejido en las células individuales.
  4. Incubar durante la noche (máximo 16 h) a 37oC sin agitación.

8. Día 2 Cultivo de Tejidos: Células de Chapado

  1. Hacer un medio de crecimiento fresco y precalentarlo a 37oC.
  2. Preparar una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos añadiendo 2 ml de medio de crecimiento fresco y precalentado en cada poca de la placa a utilizar (1 pozo por biopsia de ala de 3 mm). Almacene esta placa en una incubadora de 37oC y 5% deCO2 hasta que sea necesario (paso 8.7).
  3. Retire el tubo de 15 ml que contiene las células de la incubadora y saque la reacción de digestión añadiendo 1 ml de medio de crecimiento fresco (precalentado a 37 oC).
  4. Resuspenda las células triturando cuidadosamente la solución con una punta de pipeta P1000 para lograr una suspensión de una sola célula.
  5. Gire suavemente hacia abajo las células en una centrífuga de la parte superior de la mesa durante 3 minutos a 300 x g.
    NOTA: Los trozos pequeños de tejido todavía pueden ser visibles en suspensión o unidos a la pared del tubo de 15 ml. Sin embargo, esto no afecta la preparación de la suspensión celular
  6. Deseche el sobrenadante retirando suavemente 80%–90% del líquido con una pipeta P1000.
    NOTA: si sigue siendo visible, no deseche el trozo de tejido y desbloquéelo suavemente en el siguiente paso (8.7).
  7. Resuspenda el pellet en 500 ml de medio de crecimiento precalentado, tritura suavemente la suspensión para asegurarse de que el pellet o fragmentos grandes del pellet ya no son visibles y que las células están suficientemente suspendidas. El medio puede verse turbio debido a la presencia de células.
    NOTA: En esta etapa, se puede realizar un recuento celular viable para evaluar la calidad de la suspensión de las células y el rendimiento de las células derivadas del clip del ala (ver paso 10.11 para más detalles).
  8. Pipetear suavemente todo el volumen de la suspensión celular en un solo pozo de una placa de 6 pocillos.
    NOTA: Realice el paso anterior inmediatamente y no permita que las celdas se asienten después del paso 8.7. Utilice una pipeta para distribuir suavemente la suspensión celular a través de la superficie del pozo de una manera ligera. No pipetee toda la solución en el centro del pozo, ya que esto resultaría en que las células se agrupen en el centro del pozo.
    NOTA: si el trozo de tejido sigue siendo visible, no lo transfiera bien al recipiente de cultivo.
  9. Mece suavemente la placa de lado a lado y de adelante hacia atrás de 2x a 3x para ayudar a las células a distribuirse sobre la superficie del pozo en una sola capa.
  10. Compruebe las células chapadas bajo el microscopio, ya que deben ser células individuales que aparecen bola arriba y flotando pero muy densas.
  11. Colocar cuidadosamente la placa en una incubadora preestablecida a 37oC y 5% CO2.
  12. Después de 24 h, observe las células bajo el microscopio para determinar la salud del cultivo. Las celdas ahora deben estar unidas a la superficie de la placa y aparecer aplanadas(Figura 4A). Diferentes tipos de células pueden ser visibles en el cultivo cuando se mira a través del microscopio.
  13. Es probable que haya algunas celdas flotantes que no se hayan unido. Una proporción de estas células están muertas. Si hay una alta proporción de celdas flotantes visibles en el pozo, los medios deben actualizarse. En este caso, aspirar cuidadosamente el 50% del medio del pozo y añadir suavemente 1 ml de medio de crecimiento precalentado a un lado del pozo para no molestar a las células.
  14. Mantener las células en una incubadora preestablecida a 37 oC y 5% co2. Las células deben observarse bajo el microscopio regularmente (pero no más de una vez al día) para determinar la necesidad de refrescarse o dividirse los medios.
    NOTA: Cuando las células están recién chapadas, se dividirán rápidamente y así se deben comprobar todos los días. Después de algún tiempo en la cultura, el crecimiento se desacelerará, y se pueden comprobar cada 48-72 h.

9. Refrescantes Medios

  1. Compruebe las células bajo el microscopio regularmente para observar su crecimiento y calidad del cultivo. Monitoree el color de los medios como un indicador de su calidad. Las células deben permanecer en el mismo medio durante un máximo de 3 días o hasta que sea necesario pasar, lo que ocurra primero.
    1. Si las células están creciendo rápidamente y agotando los medios, esto también será visible a la vista, ya que el color de los medios cambiará de rojo a amarillo.
  2. Siempre que sea necesario, aspirar cuidadosamente el 50% del medio del pozo y añadir suavemente aproximadamente el mismo volumen de medio de crecimiento precalentado al lado del pozo para no molestar a las células.
  3. Devolver las células a la incubadora de 37oC y 5% deCO2.

10. Células de paso

  1. Las células de paso se refieren a tomar un cultivo existente y dividirlo en nuevos pozos. El passing debe tener lugar cuando las células son confluentes del 80 % [es decir, cuando ocupan el 80% de la superficie del pozo y sólo el 20% del plástico sigue siendo visible como huecos(Figura 4B)].
  2. Aspirar con cuidado y descartar el 90% del medio de crecimiento.
  3. Lave las células muy suavemente añadiendo 1 ml de PBS estéril a la pared del pozo para no molestar a las células. Mece suavemente la placa de ida y vuelta y de lado a lado 2x–3x. Aspirar cuidadosamente y deseche todo el PBS de la placa.
  4. Repita el paso 10.3 para lavar las células de nuevo.
  5. Añadir suavemente 250 l de trippsina-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) al pozo e incubar durante 1,5 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Asegúrese de que la solución de trippsina-EDTA cubra toda la superficie del pozo balanceando suavemente la placa.
  6. Atemple la reacción añadiendo 1 ml de medio de crecimiento precalentado fresco.
  7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 5 veces para lavar las células de la superficie de la placa y asegurarse de que las células están en suspensión.
    NOTA: La solución debe volverse turbia debido a la presencia de las células.
  8. Coloque la suspensión celular en un tubo de 15 ml y gire hacia abajo las células en una centrífuga de mesa durante 3 minutos a 300 x g.
  9. Deseche el sobrenadante retirando suavemente 80%–90% del líquido con una pipeta P1000.
  10. Resuspende el pellet en 1 ml de medio de crecimiento precalentado y tritura suavemente la suspensión. Asegúrese de que el pellet o fragmentos grandes del pellet ya no son visibles, y las células están en una sola suspensión celular.
  11. Cuente las celdas utilizando un contador de celdas automatizado como se describe aquí, o manualmente mediante el uso de un hemocitómetro como se describe en detalle en el vídeo de referencia42. Mezcle una alícuota de 10 l de las células suspendidas 1:1 con el azul Trypan para detectar células viables.
  12. Incubar durante 1 min y pipetear 10 l de la solución en la corredera de recuento. Inserte la diapositiva de recuento en un contador de celdas automatizado para contar las celdas utilizando la configuración adecuada. El rendimiento debe ser de alrededor de 1-2 millones de células de un solo pozo confluente de una placa de 6 pozos, aunque esto puede variar dependiendo del tamaño de las células y especies. Si las células no están en una suspensión de una sola célula, el recuento de células no será preciso.
  13. Estos cultivos celulares generalmente tolerarán una división 1:2 [es decir, un pozo confluente de células se puede dividir en dos nuevos pozos (total)]. Para ello, triturar suavemente las células de nuevo, luego tomar la suspensión celular en dos mitades (730 ol cada una) y colocarlas en cada uno de dos nuevos pozos que contienen 750 s de medio de crecimiento precalentado en forma de gota.
    NOTA: Después de 2-3 días, los pozos deben ser confluentes y de nuevo listos para la división. En este punto, se recomienda preservar un pozo de células por el protocolo de congelación viable (sección 11). Otras existencias de células se pueden congelar durante más pasajes como sea deseable.
    NOTA: Después de 6 pasajes, las células tienden a entrar en la senescencia y ya no se dividirán. Esto es una indicación de que las celdas ya no se pueden dividir o expandir para aumentar el número de celdas. Esto también es una indicación de que las células no serán viables por mucho más tiempo.

11. Congelación de células vivas viables

  1. Prepare los medios de congelación combinando DMEM con 20% DE FBS, 10% DMSO, 1% P/S y 50 g/mL de gentamicina.
  2. La congelación se realiza tomando células peletizadas según el proceso de paso. El pellet se debe preparar a partir de un pozo confluente del 80%-90% de una placa de 6 pocillos (que representa entre 1 y 2 millones de células), según los pasos 8.1–8.9.
  3. Resuspenda el pellet en 1,5 ml de medio de congelación.
  4. Coloque 750 s de suspensión celular en cada uno de dos crioviales separados.
  5. Coloque los viales en un recipiente de congelación criogénico, lo que hace que las células se congelen lentamente para mantener la vitalidad celular. Colóquelos inmediatamente en -80 oC.
  6. Después de 24–48 h, transfiera los crioviales de células a LN2 para su almacenamiento a largo plazo. Almacenadas de esta manera, las células pueden ser revividas y serán viables durante años.

12. Descongelar células congeladas

  1. Preparar una placa de 6 pocillos que contenga 2 ml de medio de crecimiento precalentado en cada pocal que se utilizará (1 pozo por vial de células que se descongelan). Mantener la placa en la incubadora de 37oC y 5% deCO2 hasta que sea necesario.
  2. Tome un vial de células de LN2 y colóquelo en un baño de agua tibia (37 oC) para descongelar rápidamente las células. Esto debe tomar de 2 a 3 minutos.
    NOTA: No deje los viales descongelando durante más de 3-5 min, ya que el DMSO en el medio de congelación es tóxico para las células una vez descongelados.
  3. Tan pronto como la solución en el vial se desconda, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la solución y colocar inmediatamente toda la solución (750 l) en un pozo de una placa de 6 pocillos (pre-preparado en el paso 12.1).
  4. Mece suavemente la placa de lado a lado y de adelante hacia atrás 2–3 veces para ayudar a las células a distribuir sobre la superficie del pozo en una sola capa.
  5. Colocar las células en la incubadora a 37oC y 5% deCO2 durante 24–48 h.
  6. Supervise y atraviese las celdas como se describió anteriormente.

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Representative Results

Adn
Para los análisis estándar de bajo peso molecular (LMW), el ADN se extrajo de tres especies de murciélagos neotropicales. Se recogieron muestras de tejidos en el campo de la República Dominicana y Costa Rica, siguiendo los protocolos descritos en este documento. Después de la disección, se colocaron trozos pequeños (<0,5 cm en la sección más delgada) de tejidos mixtos (cerebro, hígado e intestino) en solución estabilizadora de ARN, congelados y luego almacenados a -80 oC. Las extracciones se llevaron a cabo utilizando protocolos estándar de extracción de ADN con tratamiento RNase43. La evaluación de la integridad del ADN con una herramienta de electroforesis automatizada reveló los siguientes picos representativos de muestras de tamaños de fragmentos: la especie 1 (dos extracciones separadas) consistía en 22 kb y 20 kb; la especie 2 consistía en 25 kb; y la especie 3 consistía en 24 kb(Figura 5, Tabla 2).

Se requiere que el ADN extraído para la secuenciación de tercera generación se recoja en altas concentraciones y se fragmente mínimamente. Se obtuvo ADN HMW extraído del tejido cerebral congelado de un murciélago de frutas del Viejo Mundo (Eidolon helvum) recogido en Ghana. El ADN HMW se extrajo utilizando el protocolo de extracción Bionano para su posterior análisis en la plataforma Irys. Este ADN tenía 607.463 Mb de longitud y tenía un N50 molecular promedio de 194,5 Mb.

Arn
Un indicador común de éxito para las extracciones de ARN es el valor del número de integridad del ARN (RIN). A menudo no se recomienda por las instalaciones de secuenciación para llevar a cabo una preparación de la biblioteca de ARN-seq o un protocolo de secuenciación cuando las extracciones tienen un valor RIN inferior a ocho, ya que los valores por debajo de este umbral comienzan a demostrar altas firmas de degradación44 ,45. La Figura 6 muestra los valores RIN para extracciones de ARN de varios tipos de tejido siguiendo este protocolo. La extracción de tejido recogido con los protocolos ha dado lugar a ARN de alta calidad, independientemente de la localidad de muestreo de campo. Cuando lN2 no estaba disponible inmediatamente en el Amazonas, los tejidos se colocaban en solución estabilizadora de ARN y se mantenían a 4 oC durante 1 semana hasta que se colocaban en LN2. Incluso en tales casos, los valores de RIN fueron comparables a los que se colocaron inmediatamente en la solución estabilizadora de ARN y directamente en LN2. La solución estabilizadora del ARN es un agente estabilizador esencial.

Cultivo de tejidos
Inmediatamente después del enchapado, las células se pondrán en marcha y flotarán. Sin embargo, dentro de 24 h, los fibroblastos deben aplanarse y adherirse a la superficie de la placa(Figura 4A). En este punto, las células deben estar en aproximadamente 20%-30% de confluencia para asegurar la supervivencia. Un valor menor que este puede resultar en la muerte de toda la cultura. Inicialmente, deben tener un amplio espacio entre sí para permitir la expansión, ya que las células se dividirán y se expandirán en cultivo. Deben dividirse cuando alcancen una confluencia del 80%-90% [es decir, cubren >80% de la superficie de la placa(Figura 4B)]. De esta manera, las celdas se pueden mantener en cultivo para una serie de pasajes (generalmente >6 pasajes) antes de someterse a senescencia. Si las células se mantienen en cultivo más allá de este tiempo o no se dividen cuando se vuelven confluentes, pueden cambiar la morfología y hacerse más grandes y más largas(Figura 4C). Las células con esta morfología todavía pueden dividirse, pero esto generalmente indica que las células son o pronto entrarán en senescencia y ya no podrán mantenerse o expandirse en cultivo.

Figure 1
Figura 1: Una configuración común para redes de niebla para capturar murciélagos en el bosque. Mantener una mano cubierta mientras se desenreda con la mano opuesta es una manera de quitar el bate de forma segura mientras se minimiza el estrés. Esta foto fue tomada por Jon Flanders. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Una trampa de arpa se utiliza a menudo para capturar cuevas exteriores, dormideros grandes o voladores. Los murciélagos se acumularán en la bolsa inferior de la trampa con un enredo mínimo y una fácil extracción por parte del investigador. Esta foto fue tomada por Stephen Rossiter. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Flujo de trabajo de disecciones y muestreo de tejidos para la preparación de tejido sorna.

Figure 4
Figura 4: Cultivos de células murciélagos derivados de los golpes de las alas de Phyllostomus discolor. (A) 24-48 h después del chapado, las células se aplanarán y se unirán a la superficie de la placa. (B) Las células cubren 80%-90% de la superficie de la placa y mantienen la morfología original. Esto representa la etapa óptima para la división. (C) Después de >6 pasajes, las células cambiarán su morfología para hacerse más grandes y más largas, y las células entrarán en la senescencia. En todas las imágenes, las células brillantes con bolas representan células muertas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos de las extracciones de ADN de la preservación para análisis de ADN estándar de tres especies de murciélagos, el ADN se extrajo dos veces de la Especie 1. Una sola banda grande indica una fragmentación mínima y fragmentos de ADN de tamaño similar de cada extracción respectiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Números de integridad de ARN (RIN) de extracciones de ARN de 13 tipos de tejidos diferentes de especies de murciélagos neotropicales muestreados en cuatro localidades diferentes. Estas extracciones se prepararon siguiendo el protocolo descrito y luego se utilizaron para preparar bibliotecas de transcriptome HiSeq/NextSeq Illumina. MOE es el principal epitelio olfativo. VNO es el órgano vomeronasal. Los tejidos muestreados de especies en los Andes, Costa Rica y República Dominicana se colocaron directamente en LN2 después de empaparse en la solución estabilizadora de ARN a 4oC durante la noche. Los tejidos muestreados de especies en el Amazonas se colocaron en LN2 aproximadamente 1 semana después de colocar en la solución estabilizadora del ARN y se mantuvieron a 4 oC continuamente. N representa el número de individuos representados para cada extracción de tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aplicación Flash congelado (L2) RNAlater AllProtect FFPE Medio
ADN de alto MW Y X Y X X
ADN de BAJO MW Y Y Y X X
Arn Y Y Y X X
Proteína Y X Y Y X
Cultura celular X X X X Y

Tabla 1: Descripción general de los métodos y aplicaciones de conservación. MW - peso molecular, FFPE - tejido investido de parafina fijado por formalina. Las marcas de verificación indican el método de conservación preferido para cada aplicación prevista respectiva. Las marcas X indican conservaciones que no deben utilizarse.

Identificación de especies ID de muestra Concentración (ng/L) Tamaño del pico del fragmento de muestra (bp)
Especies 1 1.1 31.8 21,885
1.2 22.8 19,633
Especies 2 2 30.4 25,198
Especies 3 3 32 24,386

Tabla 2: Resultados representativos de las extracciones de ADN basadas en métodos de conservación en este protocolo. Los valores corresponden a los pozos de electroforesis de gel de la Figura 5.

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Discussion

El protocolo discutido en este manuscrito describe las mejores prácticas de muestreo para varios análisis moleculares de alto rendimiento de murciélagos. Todos los estudios exitosos -omics requieren tejido de alta calidad, pero el muestreo de tejido murciélago, así como otros organismos no modelo, a menudo ocurre en condiciones de campo que no se pueden establecer en los mismos estándares que los de un entorno de laboratorio controlado. El muestreo a menudo ocurre en lugares remotos, con recursos mínimos, incluido el acceso limitado a electricidad y congeladores. Es difícil, y a menudo imposible, asegurar condiciones de muestreo completamente estériles. Por lo tanto, se describen los protocolos identificados como los más exitosos en una variedad de localidades de muestreo y condiciones de campo. Con el fin de tener métodos de muestreo estandarizados para la iniciativa Bat1K y los esfuerzos y proyectos relacionados, se sugiere que los biólogos de murciélagos sigan estos protocolos mientras planifican las expediciones de campo en la medida en que se permita.

Sugerencias de protocolo
Mientras que la compresión torácica era un enfoque común para la eutanasia en el pasado, se sugiere nunca utilizar la compresión torácica para recoger murciélagos para - análisisde émica. Ya no es una forma aceptable de eutanasia en los Estados Unidos46, y este método puede conducir a la degradación enzimática de una gama de tejidos sin importar la especie de interés47. Si un animal va a ser eutanasiado, se sugiere que se recopilen tejidos para análisis genómicos y transcriptómicos. Ambos requieren la cosecha de tejido fresco que idealmente sería congelado con flash en LN2, pero que también se puede almacenar en diferentes medios para facilitar el ADN, ARN, o extracción de proteínas. Se sugiere trabajar en paralelo con dos personas en disecciones craneales y postcraneales para reducir la degradación del ARN en los tejidos. Una persona debe diseccionar el cráneo mientras la otra trabaja en el pos-cráneo.

Las principales limitaciones de la realización de los protocolos de disección incluyen el personal involucrado en la disección y el espacio disponible para la preservación de tejidos (por ejemplo, en el tanque LN2). La preparación de viales por adelantado y un número suficiente de personas para ayudar con el etiquetado de tubos y la documentación de viales y tejidos recogidos contribuirá a un procesamiento suave de la muestra. Cabe señalar que la documentación adecuada de las muestras es esencial para obtener los procesos necesarios (exportación, importación). El protocolo de disección postcraneal, por ejemplo, exige más de 20 viales por animal.

Si el espacio y el tiempo son limitados, se debe priorizar lo siguiente: 1) priorización de un espécimen para especies, o como mínimo, un espécimen por género; priorización de un espécimen macho para permitir la secuenciación de los cromosomas X e Y y la minimización de la probabilidad de tomar muestras de una hembra reproductora; 2) para el ADN HMW: cerebro, músculo, y el hígado deben ser congelados sin ningún reactivo; 3) para el ARN: cerebro, tejidos digestivos, bazo, y órganos sensoriales son de alta prioridad. Cada muestra de tejido debe almacenarse en solución estabilizadora de ARN. El tejido muscular también debe tomarse como un control para los análisis de expresión de tejido especializado; 4) como mínimo, los tejidos deben mantenerse fríos; 5) la disponibilidad de LN2 también puede ser preocupante. Los tanques LN2 deben rellenarse como mínimo cada dos semanas, pero con mayor frecuencia en climas más cálidos o si el tanque se abre con frecuencia. LN2 está a menudo disponible comercialmente en todos los países, ya que se utiliza con frecuencia en la agricultura y la atención sanitaria para el transporte de muestras. Por lo general, estos servicios son proporcionados por empresas que también venden otros gases, como dióxido de carbono u oxígeno. Las heladerías a veces ofrecen otra opción para el hielo seco o LN2 (o al menos proporcionar una recomendación para la compra), y se sugiere pedir ayuda al personal local con esto; 6) La Figura 6 describe extracciones exitosas de tejido para algunas expediciones de recolección en las que las condiciones eran limitadas.

Con más personas y más espacio, se puede recolectar más tejido de diferentes maneras. Los siguientes son protocolos adicionales publicados en otros lugares que los investigadores deben considerar si la experiencia y los materiales adecuados están disponibles: 1) el metabollome del murciélago, o todos los metabolitos excretados de bajo peso molecular de células y tejidos, pueden proporcionar información sobre la excepcional longevidad o hibernación de los murciélagos y las demandas de vuelo metabólico. La sangre debe recogerse de un vaso sanguíneo de fácil acceso, como las venas del tobillo, en un vial con heparina48,y las muestras fecales deben congelarse en LN249; 2) la inmunomics, o la respuesta del animal a los patógenos, puede analizarse tomando fémures y humeri y colocándolos en la solución de cultivo tisular a los macrófagos de cultivo aguas abajo50; 3) las heces pueden ser útiles para dos tipos de análisis basados en ácido nucleico aguas abajo, como determinar la dieta51 y sondear el microbioma intestinal52,53,54. En ambos casos, los reactivos como la solución estabilizadora de tejidos reducen la degradación de variantes raras presentes en las heces; 4) lipidómica, o los repertorios de fosfolípidos de un tipo de tejido, ha sido revelador en la comprensión del patógeno fúngico síndrome de nariz blanca55,56. Se sugiere que la preparación del tejido se congele inmediatamente después de la disección.

Archivos de tejidos para Bat1K
Bat1K tiene como objetivo mantener un banco de tejido de cada murciélago individual que se utiliza para generar los genomas. Actualmente, estos bancos de tejidos y los datos fenotípicos y ecológicos relevantes recopilados por individuo se mantienen en los laboratorios/colecciones de museos de los miembros contribuyentes Bat1K. A medida que el proyecto avanza, Bat1K centralizará y mantendrá colecciones de tejidos y bases de datos pertinentes a través de repositorios en red como la Red Mundial de Biodiversidad del Genoma .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo y Fanny Fernández Melo por hacer tejido colección en Perú posible. También damos las gracias a todos los miembros de Grupo Jaragua y Yolanda León por hacer posible la recolección de tejidos en la República Dominicana, así como a Bernal Rodríguez Hernández, Bernal Matarrita, y a todos en la Estación de Investigación Biológica La Selva en Costa Rica, por hacer muestreo posible. Agradecemos a Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe por el acceso y la colección de muestras de golpes de alas de phyllostomus decolorado murciélagos para la generación de cultivo celular. Phyllostomus discolor murciélagos se originaron en una colonia de cría en el Departamento de Biología II de la Universidad Ludwig-Maximilians en Múnich. La aprobación para mantener y criar los murciélagos fue emitida por la oficina veterinaria del distrito de Múnich. LMD, SJR, KTJD y LRY fueron financiados por NSF-DEB 1442142. LMD fue financiado por NSF-DEB 1838273. LRY fue financiado por el NSF-PRFB 1812035. SCV y PD fueron financiados por un Premio Max Planck Research Group, y una beca de Investigación del Programa de Ciencias de Fronteras Humanas (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP y KTJD fueron financiados por el Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting grant 310482 [EVOGENO]) otorgado a SJR, ECT fue financiado por la subvención del Consejo Europeo de Investigación (ERC-2012-StG311000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

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Biología Número 152 murciélagos genómica transcriptomica muestreo de tejidos preservación de tejidos disección cultivo celular
Colección de tejidos de murciélagos para análisis de émica y cultivo celular primario
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Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. … More

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T. J., Potter, J. H. T., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

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