Summary
Dette er en protokol for optimal vævs forberedelse til genomisk, transkriptomic og proteomiske analyser af flagermus fanget i naturen. Det omfatter protokoller for flagermus opsamling og dissektion, vævs bevaring, og celledyrkning af bat væv.
Abstract
Som high-gennemløb sekvensering teknologier forhånd, standardiserede metoder til høj kvalitet væv erhvervelse og bevaring giver mulighed for udvidelse af disse metoder til ikke-model organismer. En række protokoller til optimering vævs indsamling fra flagermus er blevet udviklet til en række High-gennemløb sekvensering tilgange. Skitseret her er protokoller til opsamling af flagermus, ønskede demografi, der skal indsamles for hver flagermus, og optimerede metoder til at minimere stress på en flagermus under vævs indsamling. Specifikt skitseret er metoder til indsamling og behandling af væv for at opnå (i) DNA for høj molekylvægt genomiske analyser, (II) RNA for vævsspecifikke transkriptomer, og (III) proteiner til proteomisk-niveau analyser. Endelig er også skitseret en metode til at undgå dødbringende prøvetagning ved at skabe levedygtige primære cellekulturer fra vinge klip. En central motivation af disse metoder er at maksimere mængden af potentielle molekylære og morfologiske data for hvert bat og foreslå optimale måder at bevare væv, så de bevarer deres værdi som nye metoder udvikler sig i fremtiden. Denne standardisering er blevet særlig vigtig som initiativer til sekvens kromosom-niveau, fejlfri genomer af arter i hele verden er dukket op, hvor flere videnskabelige partier er i spidsen for sekventering af forskellige taksonomiske Grupper. De protokoller, der er skitseret heri definerer den ideelle vævs indsamling og vævs bevaring metoder til Bat1K, konsortiet, som er sekventering af genomer af alle arter af bat.
Introduction
High-gennemløb sekvensering (HTS) metoder har hurtigt fremskreden i effektivitet og faldt i omkostninger, og det er nu muligt at skalere disse tilgange til hundreder eller tusinder af prøver. Indsigter opnået ved anvendelse af disse teknologier har enorme virkninger på tværs af flere videnskabelige discipliner, fra biomedicin til evolution og økologi1,2,3. Endnu, mange HTS applikationer stole kritisk på høj kvalitet nukleinsyre syrer fra en levende kilde. Denne begrænsning vil sandsynligvis blive stadig mere problematisk med udviklingen af tredje generations sekvensering baseret på lang læste molekyler4. Af disse årsager er der behov for at koncentrere indsatsen om at fastlægge bedste praksis for indsamling af fersk vævsprøver fra vilde organismer uden for laboratoriet, hvilket maksimerer materialets nytteværdi og reducerer antallet af individer, der skal Indsamlet.
Bat1K er et internationalt konsortium af videnskabsfolk med et igangværende initiativ til at sekvens genom af alle arter af bat til kromosom-niveau forsamling5. Flagermus repræsenterer 20% af pattedyrs mangfoldighed og har exceptionelle tilpasninger, der har betydning for forståelsen af aldring, sygdoms økologi, sensorisk biologi og metabolisme5,6. Mange flagermus er også truet eller truet på grund af menneskelig udnyttelse7 eller er hastigt faldende på grund af patogener8,9, og genomniveau sekvensering er af stor betydning for bevarelsen af disse arter. Selv om Bat1K i øjeblikket har til formål at sekvense genomer af alle bat-arter, er standardiseringen af indsamlingen af vævsprøver for genomisk sekvensering af høj kvalitet fortsat en central udfordring i hele Fællesskabet af organismal biologer. Ud over genomdata kræver funktionel forståelse af de forskellige bat-tilpasninger vævsspecifikke transkriptomer og proteinanalyser, der ofte kræver særskilte indsamlings protokoller. Som med alle taksonomiske grupper er optimal vævs indsamling og-bevaring afgørende for opnåelse af data af højeste kvalitet til omics-analyser, men det er ofte vanskeligt at formidle bedste praksis på grund af teknologier, der hurtigt ændrer sig, og flere forskerteams, som arbejder selvstændigt.
Behovet for at indføre bedste praksis for forskning i bat-omic'er er særlig presserende, da mange flagermusarter er sjældne eller truede. I modsætning til andre små pattedyr som gnavere og spidde, er flagermus langtids levede, kan henføres til exceptionelle DNA reparationsmekanismer10 og langsom reproduktion11, med de fleste arter føder kun én eller (i nogle få tilfælde) to unge om året. Af disse grunde kan flagermus populationer være langsomme til at komme sig efter forstyrrelser, og indsamling af mange individer fra naturen er hverken tilrådeligt eller gennemførligt. Med andre ord skal protokollerne optimeres for at opnå den maksimale mængde data for en enkelt prøve, hvilket reducerer behovet for unødigt at replikere prøvetagnings indsatsen.
Her fokuserer denne protokol specifikt på standardiserede metoder til indsamling og prøvetagning af bat-væv for genomisk og transkriptomic sekvensering og proteinanalyser. Dens højeste prioritet er at sikre, at bat-væv indsamles etisk og ansvarligt, lige fra Tilladelsesprocessen for indsamling, eksport af væv til minimering af stress til dyret, og langsigtede opbevaringsforhold. Udførlige dissektioner er blevet udviklet med det formål at fremtidssikret nytten af forskellige materialer indsamlet. Dette manuskript giver en trin-for-trin guide til at indsamle flagermus på en human måde, der er beregnet til at minimere indvirkningen på populationer og maksimere videnskabelig værdi. Mens fokus i denne protokol er specifikt til brug i flagermus, mange af trinene er relevante for andre hvirveldyr taxa, især pattedyr.
Vævs samling, oversigt
Proceduren for vævs opsamling, herunder opbevaringstemperatur og valg af konserveringsmiddel, bestemmes af arten af de planlagte downstream-analyser. Men, det anbefales kraftigt, at, når det er muligt, væv er indsamlet under en række metoder til at maksimere sin fremtidige nytte, selv om der ikke er planlagt nogen specifik analyse. Generelt indsamles og bevares vævet for efterfølgende analyser af enten nukleinsyrer (DNA og RNA) eller protein. For hver af disse applikationer, væv kan optimeres optimalt ved direkte flash frysning i flydende nitrogen (LN2). Men, umiddelbar fordybelse i LN2 er ikke altid muligt i marken. Som teknologiske fremskridt, ressourcer såsom specialiserede hætteglas til at opbevare DNA og RNA ved omgivende temperaturer bliver mere let tilgængelige. Selvom vi ikke har valideret alle sådanne materialer i denne protokol, opfordrer vi andre forskere til at analysere ydeevnen af nye materialer relativt i forhold til det, vi præsenterer her. Vi giver metoder til ideelt at bevare væv til forskellige applikationer i situationer, hvor LN2 ikke kan tilgås, f. eks, når LN2 transport er ikke muligt på grund af site adgang via lille fly i Amazonas. Derudover giver vi en metode til opsamling af væv, hvorfra levende celler kan dyrkes og udbredes. Nedenfor skitserer vi vigtige overvejelser ved indsamling af materiale til hvert af disse respektive formål, og der gives en oversigt over indsamlingsmetoderne i tabel 1.
Væv til DNA
For alt høstet væv indsamlet, vil lagringsmediet afgøre, om det kan bruges til enten standard eller høj molekylvægt (HMW) DNA-ekstraktion. HMW er påkrævet ved langtids læsning og er i øjeblikket nødvendig for at generere kromosomniveau genom-samlinger eller et "Platinum-standard"-genom. Lavmolekyl vægt (LMW) DNA kan udvindes fra flash frosne, AllProtect (herefter benævnt "vævs stabiliserende opløsning"), eller endda RNAlater (fremover "RNA-stabiliserende opløsning")-konserverede prøver (selvom flash frosne prøver forbliver optimale ). DNA isoleret ved standard laboratoriemetoder (f. eks. silicagel membran spin kolonner, phenol-chloroform), kan stadig give DNA-fragmenter på op til ~ 20 kilobaser (KB). Derfor, forudsat at der er tilstrækkelig udbytte, kan denne form for isoleret DNA anvendes til enkelt Indsæt størrelse bibliotek forberedelse, hvor skærstørrelse er ofte ~ 500 base-par (BP), og korte sekvens læsninger af ~ 100 BP genereres12. Dette DNA er især nyttigt til "gensekvensering" af projekter eller studier, hvor kromosomale data i fuld længde ikke er påkrævet. HMW DNA (10-150 KB) er mere udfordrende og kan kun pålideligt opnås ved hjælp af væv, der er blevet hurtigt flash frosset i LN2 efter høst og vedligeholdes ved et maksimum på-80 °C indtil ekstraktion.
Lav molekylvægt eller fragmenteret DNA er ofte tilstrækkeligt til målrettede tilgange, herunder genforstærkning via PCR og kort læsning af sekventering13. PCR-baserede undersøgelser med LMW-DNA, der kun er rettet mod et eller flere gener, har været meget informative i forståelsen af tilpasning og den molekylære evolution af bat sensorisk biologi6,14, fysiologi15, Phylogenetics 5,16og bevaring17,18. En vellykket målrettet sekvens generobringen af lav molekylvægt og fragmenteret DNA er også blevet påvist for talrige hvirveldyr grupper, herunder flagermus19. Disse metoder er ofte omkostningseffektive og minimalt invasive til flagermus, som fækale prøver og ikke-dødelig vævs prøvetagning via buccale servietter eller Wing biopsi slag er også almindelige måder at opnå DNA for lav molekylvægt analyser20, 21.
Men kvaliteten afhænger i høj grad af den type medier, hvor prøven er lagret22. Efter systematiske og kvantitative sammenligninger af buccale podninger og biopsi slag, fløj biopsi slag har vist sig at give konsekvent højere niveauer af DNA og var mindre stressende for flagermus under samlingen22. Disse sammenligninger viste også, at de bedste resultater blev opnået, når vinge punch blev bevaret i indikator silica (dvs. en type tørremiddel fremstillet af silica gel perler, der skifter farve, når fugt er observeret) snarere end i andre populære lagringsmedier såsom ethanol eller DMSO22; selv om andre lagringsmedier, herunder vævs stabiliserings opløsning, ikke blev undersøgt. Vingeslag kan også bruges til at dyrke fibroblast celler i kultur, såsom i Kacprzyk et al.23 og som beskrevet nedenfor (Se afsnit 6). For disse metoder bør vingen eller uropatagium forlænges forsigtigt, og en ren biopsi punch, typisk 3 mm i diameter, bør anvendes til at opnå prøven. Denne fremgangsmåde synes at forårsage ingen varige skader, med ar healing over inden for uger i de fleste tilfælde24.
HMW DNA (10-150 KB) er mere udfordrende og er i øjeblikket kun pålideligt opnået ved hjælp af væv, der er blevet hurtigt flash frosset i LN2 efter høst og vedligeholdes ved et maksimum på-80 °C indtil ekstraktion. HMW DNA (10-150 KB) er afgørende for lang læsning af DNA-sekvensering og derfor for de Novo genom-samlingen. Mens de fleste kommercielle kits kan bruges til at isolere nogle standard HMW-DNA, opfylder de resulterende molekyle størrelser ofte ikke kravene i tredje generations sekvensering teknologier [f. eks. dem, der lanceres af virksomheder som Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, og 10x Genomics, eller gennem Samlingsmetoder, der tilbydes af Bionano Genomics eller Dovetail Genomics]. Som sådan er der en ny efterspørgsel efter "ultra HMW" DNA (> 150 KB). Når der opnås ultra HMW DNA fra flagermus, friske prøver af leveren, hjernen, eller muskel er alle egnede, men disse skal straks blinke frosset i LN2 uden nogen lager buffer eller cryoprotectant. En fuldstændig beskrivelse af disse trin ligger uden for dette papirs anvendelsesområde, men findes andre steder25.
Væv til RNA
RNA er et enkeltstrenget molekyle, der er mindre stabilt end DNA. Selv om der er mange former for RNA,-omics analyser tendens til at fokusere på mRNA (Messenger RNA) og små RNAs (f. eks, microRNAs). Efter transskription, mRNA er splejret til at danne en moden afskrift, der indeholder ingen introns og repræsenterer kodning del af gener/genomer. Kodning gener tegner sig for en lille brøkdel af genom størrelse (1%-2%), hvilket gør målretning mRNA en omkostningseffektiv middel til at opnå sekvensdata for gener. MicroRNAs er en klasse af RNAs, der regulerer processen med oversættelse af mRNA til proteiner og er derfor vigtige regulerende effektorer. RNA-udskrifter kan sorteres enkeltvis eller mere almindeligt for-omics-analyser26,27,28,29,30, som en del af en transkriptom; Det betyder, at summen af alle RNA-udskrifter er til stede i en given prøve.
Sekvensering kan udføres efter flere metoder (dvs. via kort læsning af RNA-SEQ eller lang læsning af hele isoform SEQ), hvilket muliggør analyse af både RNA-overflod og brug af isoform. Da mængden og mangfoldigheden af mRNA-udskrifter varierer mellem celler og væv, gør RNA-sekvensering det muligt at studere og sammenligne genekspression og regulering på tværs af prøver. Interessen for sekvensering af små RNAs og hele isoform sekvensering er stigende, da disse metoder bliver mere og mere biologisk informative. Forberedelse af vævsprøver til sekvens af forskellige klasser af RNA kan udføres på samme måde som præsenteret i dette manuskript, med kun de efterfølgende ekstraktionsmetoder afviger31,32. Da transkriptomer giver et højt dæknings udsnit af protein kodnings genomet, kan det samlede datasæt være nyttigt i genom-samling og annotation, hvilket gør indsamlingen af RNA-SEQ-data på tværs af en række forskellige væv til en vigtig bestanddel af Bat1K initiativ.
I modsætning til DNA er RNA kemisk ustabil og også målrettet af Rnaseenzymer, som er allestedsnærværende i vævs lysater som en defensiv strategi mod RNA-baserede vira. Af disse grunde begynder RNA-fraktionen i celler og væv at nedbrydes kort efterprøve udtagnings-og/eller eutanasi-punktet. Bevarelse af RNA kræver derfor skridt til at forhindre dets nedbrydning. Dette indebærer typisk at bevare frisk opsamlet væv ved 4 °C i et stabiliserende middel, såsom RNA-stabiliserende opløsning, for at inaktivere de Rnaser, der naturligt findes i vævet, efterfulgt af frysning til langtidsopbevaring. Som et foretrukket alternativ, væv kan blinke frosset i LN2; selv som nævnt ovenfor, transporterer LN2 ind i marken og opretholde niveauer for at forhindre væv optøning kan være logistisk udfordrende.
Væv til protein
Protein sammensætning og relativ overflod varierer mellem celler og væv på samme måde som det, der blev drøftet for RNA; Men, proteiner er i gennemsnit mere stabile end RNA. Protein identifikation ved hjælp af proteomics typisk matcher en brøkdel af, og ikke hele, protein sekvens, men det kan give oplysninger om udtryk på tværs af væv og karakterisere patogener til stede. Da mange protein sekvenser bevares på tværs af pattedyr, kan bat-prøver for proteomics let kontamineres med bevaret menneskelige proteiner, der kræver sterile protokoller (f. eks. handsker, pincet) under indsamlingen. Mens flash-frysning i LN2 er den bedste måde at forhindre nedbrydning af proteiner, brug af tøris,-20 °C frysere, og selv is er egnet, hvis der ikke er andre midler. Da temperaturerne stiger, stiger risikoen for differentiel protein opdeling også. Stabiliserende stoffer som vævs stabiliserings løsning er effektive til at bevare proteinfraktionen af væv ved stuetemperatur og er velegnede til kortvarig bevaring (op til en uge), når flash-frysning ikke er rentabelt.
Den enzymatiske profil af et givet væv har direkte indflydelse på bevarelsen af protein deri. Væv med lav enzymatisk aktivitet såsom muskel kan bevare protein profiler selv ved de højere temperaturer i en husholdning fryser. Derimod er levervævet enzymatisk reaktivt, og dets proteiner har højere sandsynligheder for nedværdigende under tilberedningen. Det stigende antal protokoller for opnåelse af humane proteomiske profiler fra formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) prøver tyder på, at PARAFORMALDEHYD fastgørelse af væv holder løfte om lave omkostninger protein bevarelse, når frysning ved indsamling ikke er muligt33,34. Selv om de er meget afhængige af konserverings tiden og-tilstanden, er proteiner blevet identificeret via Immunhistokemi fra formalin-faste, ethanol-bevarede bat-prøver35. Denne fremgangsmåde er ikke skalerbar til prøvetagning på proteomisk niveau, men fremhæver potentialet for formalin-faste bat-væv til at give protein profiler, når flash-frysning er utilgængelig, og andre stabiliserende stoffer er for dyre.
Væv til cellekultur
Prøveudtagning væv og flash-frysning tilbyder en begrænset mængde materiale, der skal anvendes, og når materialet er brugt, er det ikke længere tilgængelig. Alternativt, cellekulturer levere levende celler, der kan straks anvendes eller bevares til fremtidige undersøgelser. Kulturer også lette udvidelse af celler til at øge udbyttet, når vævsprøver er små. Det er særlig nyttigt i tilfælde, hvor vævs indsamlingen er begrænset, såsom eksperimenter med sjældne arter, hvor ikke-dødelig prøvetagning er afgørende og derfor har store konsekvenser for bevarelsen. Beskrevet er en protokol, hvor cellekulturen er mulig via ikke-dødelig prøvetagning af vinge membran væv, men dyrkning er mulig med flere vævstyper36,37. Den protokol, der er angivet her, vælger til vedlige celler. Kombinationen af kilde vævs-og vækstmedier bruges gør denne protokol egnet til at vælge og vokse fibroblaster, men hvis det ønskes, kan alternative protokoller bruges til at vælge for andre celletyper. I forbindelse med Bat1K-projektet forudses det, at for sjældne og truede arter er ikke-dødbringende prøveudtagning af vinge membraner og udvidelse af prøver via dyrkning afgørende for at frembringe den mængde DNA, der er nødvendig for de mange anvendte teknologier5 .
Bat Capture
Alle, der håndterer flagermus, bør uddannes af en bat-kompetent forsker og vaccineres mod rabies med en række præ-eksponerings injektioner. Hvis bidt, en yderligere række efter eksponering injektioner er stadig nødvendigt. Standard metoder til opsamling af flagermus omfatter tåge garn (figur 1) og harpe fælder (figur 2). Tåge garn bruges oftest og er ideelt til områder med lav til moderat aktivitet, da de kræver mest pleje for at minimere flagermus lidelse. Små flagermus er særligt sårbare og kan dø af stress, hvis ikke en tendens til hurtigt. Hyppige netto inspektioner minimerer flagermus skade og dødelighed samt beskadigelse af tåge nettet. Denne detalje er vigtig, fordi korrekt vævs indsamling kræver, at vævet skal være frisk, og ukorrekt opmærksomhed på tåge nettene i flagermus kan føre til unødvendig dødelighed eller for tidlig dødelighed, før forskeren kan behandle prøverne korrekt. Fordi flere flagermus kan hvile i en harpe fælde med minimal nød, denne tilgang er ideel til områder med høj flagermus aktivitet, såsom nær en hule eller store Roost. Detaljerede instruktioner til korrekt flagermus opsamling og databehandling til indsamling af morfologiske og demografiske oplysninger er tilgængelige i de supplerende metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Stony Brook University (protokol #2013-2034).
1. eutanasi
- Fugt en bomulds kugle med en isofluran bedøvelsesmiddel eller en anden tilgængelig bedøvelse.
- Placer bomulds kuglen i en resealable, lufttæt plastikpose. Posen skal være stor nok til at holde en pose i en klud bat taske komfortabelt.
- Efter flere minutter af at lade posen til at gennemtrænge med bedøvelsesmiddel, placere en bat taske indeholdende bat i plastikposen.
- Vent flere minutter, indtil flagermusen er euthanized. Flagermus ~ 20 g eller mindre i vægt kræver ca 5 – 10 min. flagermus større end dette kan kræve op til 20 min. Bemærk, at længden af tid kan også afhænge af permeabilitet af bat taske. Det anbefales at bruge den tyndeste mulige klud materiale til at maksimere diffusion af bedøvelsesmidlet.
- Check for åndedræt og hjerteslag for at sikre, at flagermusen er blevet aflives før dissektion begynder.
2. klargøring af dissektion
- Hold alle instrumentering rene mellem dissektionerne ved hjælp af følgende protokol.
- Vask instrumenter med vand og parabol sæbe. Tør dem ned med 10% blegemiddel, væk fra dissektion område, som blegemiddel vil nedbryde nukleinsyre syrer.
- Tørres af med 70% ethanol.
- Tørres af med RNAse-dekontaminerings reagens.
- Gentag dette afsnit efter hver dissektion.
3. klargøring af hætteglassene til vævsprøver
-
For RNA:
- Forbered alle hætteglas, før du starter en dissektion for at undgå forsinkelser.
- Det antal hætteglas, der skal bruges til hver prøve, sættes til side. Mærk hvert rør med den vævstype, der vil blive indsamlet, samt standard identifikationsoplysninger for prøver. Fyld hætteglassene 50% fuld af RNA-stabiliserende opløsning, og afkøer ideelt til 4 °C.
- Pas på ikke at fylde hætteglassene helt med RNA-stabiliserende opløsning, ellers kan røret eksplodere, når det placeres i LN2. Når du tager vævsprøver, skal du huske, at store klumper af væv ikke vil være fuldt gennem syet af RNA-stabiliserende opløsning. Derfor skæres vævet i mindre stykker af ikke større end 0,5 cm i en dimension, og opretholde et forhold på mindst 10:1 volumen for RNA stabilisering løsning: væv.
- Som minimum skal dissekeret væv placeres i RNA-stabiliserende opløsning, selv om adgang til LN2 eller kolde lagre i utilgængelige.
-
For DNA:
Bemærk: det nukleare DNA-indhold er det samme for næsten alle væv; Derfor kan prøveudtagning være fleksibel. Det skal dog bemærkes, at højere tætheder af mitokondrier i muskelvæv kan føre til et tab af læsninger for det nukleare genom38.- For DNA med lav molekylvægt skal du tage en eller flere replikater af vinge membranen til opbevaring i silica og/eller muskel til opbevaring i RNA-stabiliserings opløsning eller vævs stabiliserings opløsning.
- For ultra HMW DNA, flash-fryse i LN2 uden nogen lager reagens, derefter overføre til langsigtet opbevaring ved-80 °C eller koldere. Fra kranie dissektion, hjernevæv er den mest egnede vævstype til at hente ultra HMW DNA39, mens fra postcraniale dissektioner, lever eller muskler er mere egnet40.
- For kranie dissektion skal du bruge 5 mL hætteglas (i modsætning til standard 2 mL hætteglas) af RNA-stabiliserende opløsning til noget væv. Alle hætteglas skal være kryogene. Opbevar hætteglassene på is, mens du dissekting.
4. kranielle dissektioner for RNA
- Umiddelbart efter eutanasi, halshug prøven med et stort par saks eller knogle fræsere (figur 3).
- Fjern øjnene med pincet ved hjælp af stærk nok kraft til at løsne synsnerven. Placer øjnene i 2 mL hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning.
- Ved hjælp af dit valg værktøj, hud kraniet fra hår, fascia, og kraniet muskler, herunder huden på næsen. Pas på ikke at bryde den forreste ende af næsen.
- Ved hjælp af en saks, gøre en sagittale skåret på ventrale del (figur 3) af kraniet starter ved halsen, at passe på ikke at beskadige hjernen.
- Brug pincet til forsigtigt at trække begge sider af kraniet tilbage, indtil det er revnet åbent og hjernen er eksponeret.
- På den hale ende af kraniet, skal cochleae nu være sideværts synlige på begge sider af hovedet. De er små, sfæriske knogler på venstre og højre side, bare rostral Columns til halsen og posterior til tyggemusklerne. Brug pincet, træk forsigtigt cochleae og læg dem i et 2 mL hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning.
- Forsigtigt skrabe hjernen (som vil være meget blød) med pincet. Den olfaktoriske pære vil blive synlige, sidder ved den ventrale del af det indre af kraniet. Prøv at holde den olfaktoriske pære vedhæftet.
- Hvis den olfaktoriske pære ikke allerede er blevet fjernet, forsigtigt skrabe vævet, og cribriform pladen vil blive tydeligt. Dette er en kritisk knogle til at holde forskeren orienteret. Det kan identificeres som den mest forreste region af kraniet med flere foramen og det punkt, hvor to riller, hvor olfaktoriske pære hviler.
- Hvis det er muligt, skal du holde hjerne formen intakt og straks placere på tøris for at holde formen eller i et 5 mL hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning. Hvis immun histokemi skal gøres på hjernen, sted i 4% PARAFORMALDEHYD, hvis det er muligt.
- Lav to snit, hvor den øverste og nederste kæbe tilslutter sig, og fjern mandiblen.
- Når mandiblen er fjernet, skal du fjerne talerstol (øvre kæbe) fra den resterende del af kraniet. Sørg for, at kæben indeholder cribriform pladen.
- Placer næsen i RNA-stabiliserende opløsning og opbevar ved 4 °C natten over. Fordi dette er et tæt væv, det kræver tid til at tillade RNA stabilisering løsning at gennemsyrer hele vævet.
- Anbring næse hætteglasset i LN2 efter den overnattende suge i RNA-stabiliserende opløsning.
- Fra den nedre Mandible, skær tungen med en saks og Placer i et 2 mL hætteglas med RNA til senere.
- Denne protokol mister det meste af kraniet. Tænder, især dem fra mandiblen, kan inddrives og kan være nyttige for Arts diagnostik. Knoglevæv kan opbevares i 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS).
5. postcraniale dissektioner for RNA
- Brug en skalpel til at gennembore bughulen, hvilket gør en langsgående indsnit op til ribbenene (figur 3). Dette mister skelet rammen. Hvis knoglen skal bevares, forsigtigt dissekere fra huden i muskler og opbevares i 1x PBS efter blødt væv dissektion er komplet.
- Strip huden for at afsløre brystmuskulaturen, tage mindst to prøver af muskler, en for RNA stabilisering løsning og en til at forblive frosset for HMW DNA, placere straks i et hætteglas til at sætte i LN2.
- Skær gennem brystbenet og træk ribbenene væk for at indsamle prøver fra lungerne.
- Saml hjertet, som kan tages hele, men bør opdeles i halvdele, så RNA stabiliserende løsning opsuger grundigt.
- Tag prøver fra leveren. Tag mindst to prøver af leveren, en til at forblive frosset for HMW DNA, placere straks i et tomt hætteglas til at sætte i LN2. Leveren er meget enzymatisk, og det er vigtigt at gøre prøverne små nok til RNA stabiliserende opløsning til fuldt ud at suge i.
- Den hepatiske kanal, som fungerer til at dræne galde fra leveren, forbinder leveren til bugspytkirtlen og tyndtarmen. Dette fartøj er let at identificere ved at prøve den ringere/bageste del af leveren og spore fartøjet på en posterior måde. Kanalen er ofte en grønlig farve, samt. Følg den hepatiske kanal for at finde bugspytkirtlen og galdeblæren og indsamle disse separat. Placeres i de respektive hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning.
- Saml maven og ved siden af det, på sin base og optræder som en anden nuance af lilla, er den fjer-lignende milt. Bugspytkirtlen bør også være synlig her som en hvid struktur (figur 3). Placeres i de respektive hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning.
- Indsamle små prøver af den lille og tyktarmen. Placeres i de respektive hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning. Tarmene kan også screenes for Endoparasite. Hvis en parasitologist er i marken, en inspektion for parasitter kan udføres. Hvis dette skal ske på et senere tidspunkt, kan hele tarmen tages i et 5 mL kryogen hætteglas.
- Tag en af nyrerne og følg deres kanaler til blæren. Placeres i de respektive hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning.
- Brug den anden nyre som en guide til at finde testiklerne (hvis han) eller uterus og gennem det æggestokkene (hvis kvinder). Saml en eller begge gonader, hvis det er muligt.
- Opbevar prøver af forskellige dele af huden på vingen i separate hætteglas (muskuløs vs. ikke-muskuløs del).
6. indsamling og tilberedning af vævskultur
- Forbered vækstmediet for cellerne ved at lave Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 20% føtal bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S) og 50 μg/mL gentamycin. Aliquoter af vækstmedier bør gøres friske hver dag i protokollen.
- Efter opsamling skal vinge biopsi placeres direkte i 1 mL kold vækstmedium i et velforseglet 1,5 mL centrifugeglas. Pak røret i parafilm for at forsegle.
- Rørene skal derefter transporteres i en polystyren æske med køleelementer for at holde prøverne ved 4 °C. Transporten bør fremskyndes; selv, raske celler kan laves af slag, der er blevet opbevaret på denne måde i op til 6 dage, men mindre optimalt23.
- Når transporteret til vævskultur facilitet, kan følgende protokol bruges til at generere cellekulturer. Der bør anvendes standard sterile teknikker i resten af protokol41.
7. dag 1 vævskultur: dissociation af væv
- Indholdet af røret (vækstmedium, der indeholder vinge membran biopsi) overføres til et 15 mL konisk centrifugeglas.
- Fjern forsigtigt vækstmediet. Vask forsigtigt biopsi to gange med 500 μL steril PBS.
- Tilsæt 500 μL kollagenase IV (1 mg/mL) til røret. Dette vil forårsage fordøjelsen af vævet i individuelle celler.
- Inkuber natten over (maksimum 16 timer) ved 37 °C uden agitation.
8. dag 2 vævskultur: plating celler
- Lav frisk vækstmedium og pre-Warm det til 37 °C.
- Forbered en 6 brønd vævskultur plade ved at tilsætte 2 mL frisk, forvarmet vækstmedium i hver brønd af pladen, der skal anvendes (1 brønd pr. 3 mm vinge biopsi). Denne plade opbevares i en 37 °C og 5% CO2 inkubator, indtil det er nødvendigt (trin 8,7).
- Fjern det 15 mL rør, der indeholder cellerne fra inkubatoren, og sluk for fordøjelses reaktionen ved at tilsætte 1 mL frisk vækstmedium (forvarmet til 37 °C).
- Resuspender cellerne ved omhyggeligt at triturere opløsningen med en P1000-pipettespids for at opnå en enkelt cellesuspension.
- Drej forsigtigt cellerne i en bord top centrifuge i 3 min ved 300 x g.
Bemærk: Små stykker væv kan stadig være synlige enten i suspension eller fastgjort til væggen af 15 mL røret. Dette påvirker dog ikke klargøring af cellesuspension - Kassér supernatanten ved forsigtigt at fjerne 80% – 90% af væsken med en P1000-pipette.
Bemærk: hvis det stadig er synligt, må du ikke kassere det stykke væv, og forsigtigt udriv det i næste trin (8,7). - Resuspension af pellet i 500 μl forvarmet vækstmedium, forsigtigt udriv suspensionen for at sikre, at pellet eller store fragmenter af pellet ikke længere er synlige, og at cellerne er tilstrækkeligt suspenderet. Medierne kan se uklar på grund af tilstedeværelsen af celler.
Bemærk: På dette stadium, en levedygtig celle tælle kan udføres for at vurdere kvaliteten af cellerne suspension og udbytte af celler afledt af vinge klip (Se trin 10,11 for yderligere detaljer). - Pipetten forsigtigt hele volumen af cellesuspension i en enkelt brønd af en 6 brønd plade.
Bemærk: Udfør ovenstående trin med det samme og Tillad ikke, at cellerne afregnes efter trin 8,7. Brug en pipette til forsigtigt at distribuere cellesuspensionen over overfladen af brønden i en dråbevis mode. Du må ikke pipet hele opløsningen ind i midten af brønden, da dette ville resultere i cellerne sammenklumpning i midten af brønden.
Bemærk: Hvis vævet stadig er synligt, må det ikke overføres til kultur beholderen godt. - Du skal forsigtigt klippe pladen fra side-til-side og front-to-back 2x – 3x for at hjælpe cellerne med at distribuere over brønd overfladen i et enkelt lag.
- Kontroller de belagte celler under mikroskopet, da de skal være enkeltceller, der vises balled op og flydende, men meget tætte.
- Anbring forsigtigt pladen i en inkubator, der er forudindstillet til 37 °C og 5% CO2.
- Efter ~ 24 h, observere cellerne under mikroskop til at bestemme sundhed af kulturen. Cellerne skal nu være fastgjort til pladens overflade og fremstå fladt (figur 4a). Forskellige celletyper kan være synlige i kulturen, når man kigger gennem mikroskopet.
- Der vil sandsynligvis være nogle flydende celler, der ikke har vedhæftet. En del af disse celler er døde. Hvis der er en høj andel af flydende celler synlige i brønden, bør medierne opdateres. I dette tilfælde skal du forsigtigt aspirere ~ 50% af mediet fra brønden og forsigtigt tilføje 1 mL forvarmet vækstmedium til siden af brønden for ikke at forstyrre cellerne.
- Vedligehold cellerne i en inkubator, der er forudindstillet til 37 °C og 5% CO2. Celler bør observeres under mikroskopet regelmæssigt (men ikke mere end en gang om dagen) for at bestemme behovet for medie forfriskning eller opdeling.
Bemærk: Når cellerne er nybelagte, vil de opdele hurtigt og så bør kontrolleres hver dag. Efter nogen tid i kulturen, vil væksten langsomt, og de kan kontrolleres hver 48 – 72 h.
9. forfriskende medier
-
Kontroller cellerne under mikroskop regelmæssigt for at observere deres vækst og kvaliteten af kulturen. Overvåg mediernes farve som en indikator for dens kvalitet. Cellerne skal forblive i de samme medier i højst 3 dage, eller indtil passaging er nødvendig, alt efter hvad der indtræffer først.
- Hvis cellerne vokser hurtigt og udmattende medierne, vil dette også være synligt for øjet, da farven på medierne vil vende fra rød til gul.
- Når det er nødvendigt omhyggeligt aspirere ~ 50% af mediet fra brønden og forsigtigt tilføje omtrent den samme volumen af præ-varmet vækstmedium til siden af brønden for ikke at forstyrre cellerne.
- Cellerne returneres til 37 °C og 5% CO2 -inkubator.
10. passaging celler
- Passaging celler refererer til at tage en eksisterende kultur og opdele det i nye brønde. Passaging bør finde sted, når cellerne er ~ 80% flydende [dvs., når de indtager ~ 80% af overfladen af brønden og kun ~ 20% af plast er stadig synlige som huller (figur 4b)].
- Sug forsigtigt og kassér ~ 90% af vækstmediet.
- Cellerne vaskes meget forsigtigt ved at tilsætte 1 mL sterilt PBS til brøndens væg for ikke at forstyrre cellerne. Du skal forsigtigt klippe pladen frem og tilbage og side-til-side 2x – 3x. Sug forsigtigt og Kassér alle PBS fra pladen.
- Gentag trin 10,3 for at vaske cellerne igen.
- Tilsæt forsigtigt 250 μL trypsin-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) til brønden og Inkuber i 1,5 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: Sørg for, at trypsin-EDTA-opløsningen dækker hele overfladen af brønden ved forsigtigt at Rocking pladen. - Reaktionen slukkes ved tilsætning af 1 mL frisk forvarmet vækstmedium.
- Pipetten op og ned ~ 5x for at vaske cellerne fra pladens overflade og sikre, at cellerne er i suspension.
Bemærk: Opløsningen skal blive uklar på grund af tilstedeværelsen af cellerne. - Placer cellesuspensionen i et 15 mL rør og drej cellerne i en bordplade centrifuge i 3 min ved 300 x g.
- Kassér supernatanten ved forsigtigt at fjerne 80% – 90% af væsken med en P1000-pipette.
- Resuspension af pellet i 1 ml forvarmet vækstmedium og forsigtigt udriv suspensionen. Sørg for, at pellet eller store fragmenter af pellet ikke længere er synlige, og cellerne er i en enkelt cellesuspension.
- Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celle tæller som beskrevet her, eller manuelt ved hjælp af et hemocytometer som beskrevet i detaljer i reference videoen42. Bland en 10 μL alikvot af de suspenderede celler 1:1 med Trypan Blue for at detektere levedygtige celler.
- Inkuber i 1 min., og afpipetteres 10 μL af opløsningen på tælle sliden. Indsæt optællings diaset i en automatiseret celle tæller for at tælle cellerne ved hjælp af de relevante indstillinger. Udbyttet bør være omkring 1 – 2 millioner celler fra en flydende enkelt brønd af en 6 brønd plade, selv om dette kan variere afhængigt af størrelsen af cellerne og arterne. Hvis cellerne ikke er i en enkelt cellesuspension, vil celletal ikke være nøjagtigt.
- Disse cellekulturer vil generelt tolerere en 1:2 split [dvs., en konflydende brønd af celler kan opdeles i to nye brønde (total)]. For at gøre dette, forsigtigt udriv cellerne igen, derefter tage cellen suspension i to halvdele (~ 730 μl hver) og placere dem i hver af to nye brønde, der indeholder 750 μl af præ-varmet vækstmedium i dråbevis mode.
Bemærk: Efter 2 – 3 dage brøndene skal være flydende og igen klar til opdeling. På dette tidspunkt, anbefales det at bevare en brønd af celler ved bæredygtigt frysning protokol (afsnit 11). Yderligere lagre af celler kan fryses under yderligere passager som ønskeligt.
Bemærk: Efter ~ 6 passager, cellerne tendens til at indtaste senescens og vil ikke længere opdele. Dette er en indikation af, at cellerne ikke længere kan opdeles eller udvides for at øge celle numrene. Dette er også en indikation af, at cellerne ikke vil være levedygtige for meget længere.
11. frysning levedygtige levende celler
- Forbered fryse mediet ved at kombinere DMEM med 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S og 50 μg/mL gentamycin.
- Frysning udføres ved at tage celler foderpiller som pr passaging proces. Pellet skal fremstilles fra en 80%-90% flydende godt af en 6 brønd plade (repræsenterer ~ 1-2 million celler), som pr trin 8.1 – 8,9.
- Resuspension af pellet i 1,5 mL fryse middel.
- Placer ~ 750 μL cellesuspension i hver af to separate cryovials.
- Sæt hætteglassene i en kryogen fryse beholder, hvilket resulterer i, at cellerne fryser langsomt for at bevare cellens vitalitet. Placer dem straks i-80 °C.
- Efter 24 – 48 h, overføre cryovials af celler til LN2 for langsigtet opbevaring. Lagret på denne måde, kan cellerne blive genoplivet og vil være levedygtige i årevis.
12. optøning af frosne celler
- Forbered en 6-brønd plade, der indeholder 2 mL præ-opvarmet vækstmedium i hver brønd, der vil blive anvendt (1 brønd pr. hætteglas med celler optøet). Hold pladen i 37 °C og 5% CO2 inkubator, indtil det er nødvendigt.
- Tag et hætteglas med celler fra LN2 og Placer det i et varmt vandbad (37 °C) for hurtigt at tø celler. Dette bør tage 2 – 3 min.
Bemærk: Lad ikke hætteglassene optøning i længere tid end 3 – 5 min, da DMSO i fryse mediet er giftigt for cellerne, når de er optøet. - Så snart opløsningen i hætteglasset er optøet, pipetten forsigtigt op og ned for at homogenisere opløsningen og straks placere hele opløsningen (~ 750 μL) i en brønd af en 6 brønd plade (præ-forberedt i trin 12,1).
- Du skal forsigtigt klippe pladen fra side til side og foran til 2 – 3 gange for at hjælpe cellerne med at distribuere over overfladen i et enkelt lag.
- Placer cellerne i inkubator ved 37 °C og 5% CO2 inkubator i 24 – 48 timer.
- Overvåge og passere cellerne som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dna
For standard analyser med lav molekylvægt (LMW) blev DNA ekstraheret fra tre neotropiske bat-arter. Vævsprøver blev indsamlet i marken fra den Dominikanske Republik og Costa Rica, efter de protokoller, der er beskrevet i dette papir. Efter dissektion blev små stykker (< 0,5 cm i den tyndeste del) af blandet væv (hjerne, lever og tarm) anbragt i RNA-stabiliserende opløsning, flash frosset og derefter opbevaret ved-80 °C. Ekstraktioner blev udført ved hjælp af standard DNA ekstraktions protokoller med RNase-behandling43. Vurdering af DNA-integritet med et automatiseret elektroforese-værktøj afslørede følgende repræsentative prøve toppe af fragment størrelser: art 1 (to separate ekstraktioner) bestod af 22 kb og 20 kb; art 2 bestod af 25 KB; og art 3 bestod af 24 KB (figur 5, tabel 2).
DNA ekstraheret til tredje generations sekvensering skal indsamles i høje koncentrationer og minimalt fragmenteret. HMW DNA udvundet fra flash-frosset hjernevæv fra en gammel verden frugt bat (Eidolon helvum) indsamlet i Ghana blev opnået. HMW-DNA blev ekstraheret ved hjælp af Bionano-ekstraktions protokollen til efterfølgende analyse på Irys-platformen. Denne DNA var 607.463 MB i længden og havde en gennemsnitlig molekyle N50 på 194,5 MB.
Rna
En fælles indikator for succes for RNA-ekstraktioner er værdien af RNA-integritets nummeret (RIN). Det anbefales ofte ikke af sekvensering faciliteter til at udføre en RNA-SEQ bibliotek forberedelse eller sekvensering protokol, når ekstraktioner har en RIN værdi mindre end otte, som værdier under denne tærskel begynder at demonstrere høje underskrifter af nedbrydning44 ,45. Figur 6 viser Rin-værdierne for RNA-ekstraktioner af forskellige vævstyper efter denne protokol. Ekstraktion af væv indsamlet med protokollerne har resulteret i høj kvalitet RNA, uafhængig af Mark sampling lokalitet. Da LN2 ikke umiddelbart var tilgængelig i Amazonas, blev vævet anbragt i RNA-stabiliserende opløsning og holdt ved 4 °c i 1 uge, indtil det blev anbragt i LN2. Selv i sådanne tilfælde var RIN-værdierne sammenlignelige med dem, der straks blev anbragt i RNA-stabiliserende opløsning og direkte i LN2. RNA-stabiliserende opløsning er et vigtigt stabiliserende middel.
Vævskultur
Umiddelbart efter plating, vil cellerne blive balled op og flydende. Inden for 24 timer skal fibroblasterne dog flade og fastgøres til pladens overflade (figur 4a). På dette tidspunkt bør cellerne være omkring 20%-30% sammenløbet for at sikre overlevelse. En lavere værdi end dette kan resultere i døden for hele kulturen. I første omgang skal de have rigelig plads mellem hinanden for at muliggøre ekspansion, som cellerne vil opdele og udvide i kulturen. De bør opdeles, når de når 80%-90% sammenløbet [dvs. de dækker > 80% af pladens overflade (figur 4b)]. På denne måde kan cellerne bevares i kulturen for en række passager (normalt > 6 passager), før de gennemgår en senescens. Hvis cellerne bevares i kulturen ud over denne tid eller ikke splittes, når de bliver flydende, kan de ændre morfologien og blive større og længere (figur 4c). Celler med denne morfologi kan stadig opdele, men dette indikerer normalt, at cellerne er eller snart vil komme ind i senescens og vil ikke længere være i stand til at blive vedligeholdt eller udvidet i kulturen.
Figur 1: en fælles opsætning for tåge garn til opsamling af flagermus i skoven. Holde den ene hånd dækket, mens adskillelse med den modsatte hånd er en måde at sikkert fjerne bat samtidig minimere stress. Dette foto blev taget af Jon Flanders. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: en Harp fælde bruges ofte til at fange uden huler, store roosts, eller flyve-aways. Flagermus vil ophobes i den nedre pose af fælden med minimal indfiltrning og nem fjernelse af investigator. Dette foto blev taget af Stephen Rossiter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: arbejdsgang for dissektioner og vævs prøvetagning til forberedelse af RNA-væv Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: bat-cellekulturer afledt af vingeslag af phyllostomus misfarvet. (A) 24-48 h efter plating, vil cellerne blive fladtrykt og fastgøres til pladens overflade. B) cellerne dækker 80%-90% af pladens overflade og bevarer den oprindelige morfologi. Dette repræsenterer den optimale fase for opdeling. (C) efter > 6 passager, vil cellerne ændre deres morfologi til at blive større og længere, og cellerne vil indtaste senescens. I alle billeder repræsenterer lyse, balled-up celler døde celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative resultater af DNA-ekstraktioner fra bevaring af standard DNA-analyser fra tre bat-arter blev dna ekstraheret to gange fra art 1. Et enkelt stort bånd indikerer minimal fragmentering og lignende størrelse fragmenter af DNA fra hver respektive ekstraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: RNA-integritets numre (Rin) af RNA-ekstraktioner fra 13 forskellige vævstyper fra neotropiske flagermusarter udtaget på fire forskellige lokaliteter. Disse ekstraktioner blev udarbejdet efter den beskrevne protokol og blev derefter brugt til at forberede HiSeq/NextSeq Illumina transcriptome libraries. Moe er den vigtigste olfaktoriske epithelium. VNO er vomeronasal orgel. Væv udtaget fra arter i Andes bjergene, Costa Rica og den Dominikanske Republik blev placeret direkte i LN2 efter iblødsætning i RNA-stabiliserende opløsning ved 4 °C natten over. Væv udtaget fra arter i Amazonas blev anbragt i LN2 ca. 1 uge efter placering i RNA-stabiliserende opløsning og holdt ved 4 °C kontinuerligt. N repræsenterer antallet af personer, som repræsenteres for hver vævs ekstraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Program | Flash frosset (L2) | RNAlater | AllProtect | FFPE | Medier |
| Højt MW-DNA |  |
 |
|
|
|
| Lav MW-DNA | |
|
|
|
|
| Rna | |
|
|
|
|
| Protein | |
|
|
|
|
| Cellekultur | |
|
|
|
|
Tabel 1: oversigt over konserveringsmetoder og-applikationer. MW = molekylvægt, FFPE = formalin-fast paraffin-indlejret væv. Flueben angiver foretrukken konserveringsmetode for hver påtænkt applikation. X-mærker angiver konserveringsmidler, der ikke må anvendes.
| Arts-ID | Eksempel-ID | Koncentration (ng/μL) | Eksempel på fragment peak-størrelse (BP) |
| Art 1 | 1,1 | 31,8 | 21.885 |
| 1,2 | 22,8 | 19.633 | |
| Art 2 | 2 | 30,4 | 25.198 |
| Art 3 | 3 | 32 | 24.386 |
Tabel 2: repræsentative resultater for DNA-ekstraktioner baseret på konserveringsmetoder i denne protokol. Værdierne svarer til gelelektroforese brøndene fra figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, som omtales i dette manuskript, beskriver den bedste prøveudtagnings praksis for forskellige molekylære analyser af flagermus med høj gennemløb. Alle vellykkede omics-undersøgelser kræver væv af høj kvalitet, men prøveudtagning af bat-væv samt andre ikke-modelorganismer forekommer ofte i feltforhold, der ikke kan indstilles til de samme standarder som i kontrollerede laboratorieomgivelser. Stikprøveudtagning sker ofte på fjerntliggende steder med minimale ressourcer, herunder begrænset adgang til el og frysere. Det er vanskeligt, og ofte umuligt, at sikre fuldstændig sterile prøveudtagnings betingelser. Således skitseret er de protokoller, der identificeres som den mest vellykkede i en række forskellige prøvetagningssteder og feltbetingelser. For at have standardiserede prøvetagningsmetoder for Bat1K-initiativet og relaterede indsatser og projekter foreslås det, at bat-biologer følger disse protokoller, mens de planlægger felt ekspeditioner i det omfang, det er tilladt.
Protokol forslag
Mens thorax kompression var en fælles tilgang til eutanasi i fortiden, det foreslås at aldrig bruge thorax kompression til at indsamle flagermus for-omik analyser. Det er ikke længere en acceptabel form for eutanasi i USA46, og denne metode kan føre til Enzymatisk nedbrydning af en række væv, uanset arten af interesse47. Hvis et dyr vil blive euthanized, foreslås det, at væv til både genomisk og transkriptomic analyser indsamles. Begge kræver høst frisk væv, der ville ideelt set være flash frosset i LN2, men der kan også lagres i forskellige medier for at lette DNA, RNA, eller protein udvinding. Det foreslås at arbejde parallelt med to personer på kranielle og postcraniale dissektioner for at reducere nedbrydningen af RNA i væv. En person bør dissekere kraniet, mens de andre arbejder på post-kraniet.
De vigtigste begrænsninger ved at gennemføre dissektions protokoller omfatter det personale, der er involveret i dissektion og plads til vævs bevaring (f. eks. i LN2 tanken). Forberedelse af hætteglas på forhånd og et tilstrækkeligt antal mennesker til at hjælpe med mærkning rør og dokumentere hætteglas og væv indsamlet vil bidrage til glat prøve behandling. Det skal bemærkes, at korrekt dokumentation af prøver er afgørende for at opnå de nødvendige (eksport, import) processer. Den postcraniale dissektion-protokol kræver for eksempel mere end 20 hætteglas pr. dyr.
Hvis der er begrænset plads og tid, skal følgende prioriteres: 1) prioritering af en prøve for arter eller som minimum én prøve pr. slægt; prioritering af en mandlig prøve for at tillade sekventering af både X og Y kromosom og minimering af sandsynligheden for prøvetagning af en reproduktiv kvinde; 2) for HMW-DNA: hjernen, musklen og leveren bør opfryses uden reagens; 3) for RNA: hjernen, fordøjelsessystemet væv, milt, og sensoriske organer er af høj prioritet. Hver vævsprøve skal opbevares i RNA-stabiliserende opløsning. Muskelvæv bør også tages som en kontrol for ekspressions analyser af specialiseret væv; 4) som minimum bør væv holdes koldt; 5) tilgængeligheden af LN2 kan også være problematisk. LN2 tanke skal fyldes op mindst hver anden uge, men hyppigere i varmere klimaer, eller hvis tanken ofte åbnes. LN2 er ofte kommercielt tilgængelige i alle lande, da det ofte bruges i landbrug og sundhedspleje til at transportere prøver. Normalt disse tjenester leveres af virksomheder, der også sælger andre gasser, såsom kuldioxid eller ilt. Isbutikker tilbyder nogle gange en anden mulighed for tøris eller LN2 (eller i det mindste give en anbefaling om køb), og det foreslås at bede lokalt personale om assistance med dette; 6) figur 6 skitserer vellykkede vævs ekstraktioner for nogle indsamlings ekspeditioner, hvor betingelserne var begrænsede.
Med flere mennesker og mere plads, mere væv kan indsamles på forskellige måder. Følgende er yderligere protokoller offentliggjort andetsteds, at efterforskere bør overveje, om den korrekte erfaring og materialer er tilgængelige: 1) bat metabolome, eller alle de udskilte lavmolekylære metabolitter af celler og væv, kan give indblik i exceptionel flagermus levetid eller dvale og metaboliske flykrav. Blod bør indsamles fra et let tilgængeligt blodkar, såsom ankel vener, i et hætteglas med heparin48, og fækale prøver bør FRYSES i LN249; 2) immunomics, eller dyrets reaktion på patogener, kan analyseres ved at tage skinneben er fuldstændig og doser og placere dem i vævskultur løsning til kultur makrofager downstream50; 3) afføring kan være nyttige for to typer af downstream-nukleinsyre-baserede analyser, såsom bestemmelse af kost51 og sondering af Gut mikrobiome52,53,54. I begge tilfælde reducerer reagenser såsom vævs stabiliserende opløsning nedbrydningen af sjældne varianter, der findes i fæser; 4) lipidomics, eller phospholipid repertoirer af en vævstype, har været afslørende i forståelsen af hvid-næse syndrom svampe patogenet55,56. Fremstilling af væv foreslås at blive frosset umiddelbart efter dissektion.
Vævs arkiver til Bat1K
Bat1K har til formål at opretholde en vævsbank af hver enkelt bat, der bruges til at generere genomer. I øjeblikket bevares disse vævsbanker og de relevante fænotypiske og økologiske data, der indsamles pr. individ, i laboratoriernes/Museums samlingerne i de Bat1K bidragydende medlemmer. I takt med at projektet skrider frem, vil Bat1K centralisere og vedligeholde vævs samlinger og relevante databaser via netværksbaserede arkiver såsom det globale Genome Biodiversity-netværk < http://www.ggbn.org/ggbn_portal/>.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo og Fanny Fernández Melo for at gøre vævs indsamling i Peru muligt. Vi takker også alle medlemmer af Grupo Jaragua og Yolanda León for at gøre vævs indsamling i den Dominikanske Republik muligt, samt til Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, og alle på La Selva biologisk forsknings station i Costa Rica, for at gøre mulighed for stikprøveudtagning. Vi takker Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe for adgang og prøve samling af vingeslag fra Phyllostomus misfarve flagermus til generering af cellekultur. Phyllostomus misfarende flagermus stammede fra en avls koloni i Department Biology II af Ludwig-Maximilians-universitetet i München. Godkendelse til at beholde og opdrætte flagermus blev udstedt af München distrikts Veterinærkontor. LMD, SJR, KTJD og LRY blev finansieret af NSF-DEB 1442142. LMD blev finansieret af NSF-DEB 1838273. LRY blev finansieret af NSF-PRFB 1812035. SCV og PD blev finansieret af en Max Planck-forskningsgruppe Award og et forskningsstipendium til human grænse Science program (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP og KTJD blev finansieret af det Europæiske Forskningsråd (ERC start Grant 310482 [EVOGENO]) tildelt SJR, ECT blev finansieret af det Europæiske Forskningsråd (ERC-2012-StG311000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3 mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| Collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
References
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen? Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J.
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , Museum of Texas Tech University. (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Schaumburg, IL. (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity? PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
