Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Weefsel collectie van vleermuizen voor-omics analyses en primaire celcultuur

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59505
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 4, 5, *3,6, *2,7
1Department of Geology & Geophysics, Yale University, 2Department of Ecology & Evolution, Stony Brook University, 3Neurogenetics of Vocal Communication, Max Planck Institute for Psycholinguistics, 4School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London, 5School of Biology & Environmental Science, University College Dublin, 6Donders Institute for Brain, Cognition and Behavior, 7Consortium for Inter-Disciplinary Environmental Research, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

Dit is een protocol voor de optimale weefsel voorbereiding voor genomische, transcriptomische en proteomische analyses van vleermuizen die in het wild zijn gevangen. Het omvat de protocollen voor de inname van vleermuis en dissectie, weefsel conservering, en celculturing van vleermuis weefsel.

Abstract

Als high-throughput sequencing technologieën Advance, gestandaardiseerde methoden voor het verwerven en conserveren van weefsel van hoge kwaliteit zorgen voor de uitbreiding van deze methoden naar niet-model organismen. Een reeks protocollen om de weefsel verzameling van vleermuizen te optimaliseren is ontwikkeld voor een reeks benaderingen met hoge doorvoer sequentiëren. Hier geschetst zijn protocollen voor de inname van vleermuizen, gewenste demografische gegevens worden verzameld voor elke vleermuis, en geoptimaliseerde methoden om te minimaliseren van stress op een vleermuis tijdens weefsel verzameling. Specifiek beschreven zijn methoden voor het verzamelen en behandelen van weefsel om (i) DNA te verkrijgen voor genomische analysen met een hoog moleculair gewicht, (II) RNA voor Weefselspecifieke transcriptomen (III) eiwitten voor analyses op Proteomic-niveau. Tot slot, ook geschetst is een methode om dodelijke bemonstering te voorkomen door het creëren van levensvatbare primaire celculturen uit vleugel clips. Een centrale motivatie van deze methoden is om de hoeveelheid potentiële moleculaire en morfologische gegevens voor elke vleermuis te maximaliseren en optimale manieren te suggereren om weefsels te behouden, zodat ze hun waarde behouden als nieuwe methoden in de toekomst ontwikkelen. Deze standaardisatie is bijzonder belangrijk geworden als initiatieven voor het sequentiëren van chromosoom-niveau-en foutvrije genomen van soorten over de hele wereld zijn ontstaan, waarbij meerdere wetenschappelijke partijen de sequenties van verschillende taxonomische Groepen. De protocollen die hierin worden beschreven, definiëren de ideale methoden voor weefsel verzameling en weefsel conservering voor Bat1K, het consortium dat de genomen van elke soort vleermuis sequentieert.

Introduction

High-throughput sequencing (HTS) methoden zijn snel gevorderd in efficiëntie en lagere kosten, en het is nu mogelijk om deze benaderingen te schalen naar honderden of duizenden voorbeelden. Inzichten verkregen door de toepassing van deze technologieën hebben enorme impact op meerdere wetenschappelijke disciplines, van biomedische tot evolutie en ecologie1,2,3. Toch vertrouwen veel HTS-toepassingen kritisch op nucleïnezuren van hoge kwaliteit uit een levende bron. Deze beperking zal waarschijnlijk steeds problematischer worden met de ontwikkeling van sequencing van de derde generatie op basis van lang Lees moleculen4. Om deze redenen is het noodzakelijk om de inspanningen te concentreren op het vaststellen van beste praktijken voor het verzamelen van verse weefselmonsters van wilde organismen buiten het laboratorium, waardoor het nut van het materiaal wordt gemaximaliseerd en het aantal personen dat moet worden Verzameld.

Bat1K is een internationaal consortium van wetenschappers met een doorlopend initiatief om het genoom van elke soort vleermuis te sequenties op chromosoom niveau assembly5. Vleermuizen vertegenwoordigen 20% van de zoogdier diversiteit en hebben uitzonderlijke aanpassingen die implicaties hebben voor het begrijpen van veroudering, ziekte-ecologie, zintuiglijke biologie en metabolisme5,6. Veel vleermuizen worden ook bedreigd of bedreigd als gevolg van menselijke uitbuiting7 of snel afnemen als gevolg van pathogenen8,9, en Genome-niveau sequencing is van groot belang voor het behoud van deze soorten. Hoewel Bat1K momenteel tot doel heeft de genomen van alle BBT-soorten te sequentiëren, blijft de standaardisering van het verzamelen van weefselmonsters voor hoogwaardige genomische sequencing een belangrijke uitdaging in de Gemeenschap van organismale biologen. Naast de genomische gegevens vereist het functionele begrip van de diversiteit van de BBT-aanpassingen Weefselspecifieke transcriptome-en eiwit analyses, die vaak aparte inzamelings protocollen vereisen. Bovendien, zoals bij alle taxonomische groepen, terwijl optimale weefsel inzameling en-conservering essentieel is voor het verkrijgen van gegevens van de hoogste kwaliteit voor-omics-analyses, is het vaak moeilijk om beste praktijken te communiceren vanwege snel veranderende technologieën en meerdere onderzoeksteams werken zelfstandig.

De noodzaak om beste praktijken voor BBT-omics-onderzoek goed te keuren is met name urgent, gezien het feit dat veel vleermuissoorten zeldzaam of bedreigd zijn. In tegenstelling tot andere kleine zoogdieren zoals knaagdieren en spitsen, zijn vleermuizen lang geleefd, toe te schrijven aan uitzonderlijke DNA-herstelmechanismen10 en Slow reproductie11, met de meeste soorten die bevallen van slechts één of (in enkele gevallen) twee jonge per jaar. Om deze redenen kunnen vleermuis populaties traag zijn om te herstellen van verstoring, en het verzamelen van veel individuen uit het wild is noch wenselijk noch haalbaar. Met andere woorden, protocollen moeten worden geoptimaliseerd om de maximale hoeveelheid gegevens voor een enkel specimen te verkrijgen, waardoor de noodzaak om de bemonsterings inspanningen onnodig te repliceren, wordt verminderd.

Hier richt dit Protocol zich specifiek op gestandaardiseerde methoden voor het verzamelen en bemonsteren van BBT-weefsel voor genomische en transcriptomische sequencing en eiwit analyses. De hoogste prioriteit is ervoor te zorgen dat de BBT-weefsels op ethische en verantwoorde wijze worden verzameld, variërend van het vergunningsproces voor de inzameling, de uitvoer van weefsels tot de minimalisatie van stress naar het dier en de lange termijn opslagcondities. Er zijn uitgebreide dissecties ontwikkeld met als doel het nut van verschillende verzamelde materialen in de toekomst te testen. Dit manuscript biedt een stapsgewijze handleiding voor het verzamelen van vleermuizen op een humane manier die bedoeld is om de impact op de populaties te minimaliseren en de wetenschappelijke waarde te maximaliseren. Hoewel de focus van dit protocol specifiek is voor gebruik in vleermuizen, zijn veel van de stappen relevant voor andere gewervelde taxa, vooral zoogdieren.

Tissue collectie overzicht
De procedure voor het verzamelen van weefsels, met inbegrip van de temperatuur voor opslag en de keuze van de conserveringsmiddel, wordt bepaald door de aard van de geplande stroomafwaartse analyses. Echter, het is sterk aanbevolen dat, indien mogelijk, weefsel wordt verzameld onder een scala aan methoden om zijn toekomstige nut te maximaliseren, zelfs als er geen specifieke analyse is gepland. In het algemeen wordt weefsel verzameld en bewaard voor latere analyses van ofwel nucleïnezuren (DNA en RNA), of eiwitten. Voor elk van deze toepassingen, weefsel kan optimaal worden bewaard door direct Flash invriezen in vloeibare stikstof (LN2). Directe onderdompeling in LN2 is echter niet altijd mogelijk in het veld. Naarmate de technologie vordert, worden middelen zoals gespecialiseerde flacons om DNA en RNA bij omgevingstemperaturen op te slaan steeds gemakkelijker beschikbaar. Hoewel we niet al deze materialen in dit protocol hebben gevalideerd, moedigen we andere onderzoekers aan om de prestaties van nieuwe materialen relatief te analyseren ten opzichte van wat we hier presenteren. We bieden methoden voor het idealiter behouden van weefsel voor verschillende toepassingen in situaties waar LN2 niet kan worden benaderd, bijvoorbeeld wanneer LN2 vervoer niet mogelijk is vanwege toegang tot de site via een klein vliegtuig in de Amazone. Daarnaast bieden we een methode voor het verzamelen van weefsel waaruit levende cellen kunnen worden gekweekt en gekweekt. Hieronder beschrijven we belangrijke overwegingen voor het verzamelen van materiaal voor elk van deze respectieve doeleinden en een overzicht van de inzamelings methoden wordt gegeven in tabel 1.

Weefsel voor DNA
Voor alle verzamelde geoogste weefsels zal de opslagmedia bepalen of het kan worden gebruikt voor DNA-extractie met een standaard of hoog moleculair gewicht (HMW). HMW is vereist voor sequentiëren met lange leesvolgorde en is momenteel vereist voor het genereren van genoom assemblages op chromosoom niveau, of een "Platinum Standard"-genoom. DNA van laag moleculair gewicht (LMW) kan worden geëxtraheerd uit Flash Frozen, AllProtect (hierna "weefsel stabiliserende oplossing" genoemd), of zelfs RNAlater (hierna "RNA stabiliserende oplossing")-bewaarde monsters (Hoewel Flash Frozen samples optimaal blijven ). DNA geïsoleerd door standaard laboratoriummethoden (bijvoorbeeld silicagel membraan spin kolommen, fenol-chloroform), kan nog steeds DNA-fragmenten van tot ~ 20 kilo bases (KB) opleveren. Daarom, mits er voldoende opbrengst is, kan deze vorm van geïsoleerd DNA worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek met één wisselplaatgrootte, waarbij de wisselplaatgrootte vaak ~ 500 base-pairs (BP) is en korte reeks leesbewerkingen van ~ 100 BP worden gegenereerd12. Dit DNA is vooral nuttig voor "resequencing"-projecten of studies waarbij volledige chromosomen gegevens niet nodig zijn. HMW-DNA (10-150 KB) is uitdagender en kan alleen betrouwbaar worden verkregen met behulp van weefsel dat snel is bevroren in LN2 na de oogst en gehandhaafd bij een maximum van-80 °C tot extractie.

Laag moleculair gewicht of gefragmenteerd DNA is vaak voldoende voor gerichte benaderingen, met inbegrip van genamplificatie via PCR en short-Read sequencing13. PCR-gebaseerde onderzoeken waarbij gebruik wordt gemaakt van lmw-DNA dat slechts één of enkele genen target, zijn zeer informatief in het begrijpen van adaptatie en de moleculaire evolutie van de BBT-sensorische biologie6,14, fysiologie15, fylogenetica 5,16en conservatie17,18. Voor talrijke gewervelde groepen, waaronder vleermuizen19, is ook gebleken dat een succesvolle reeks van laag moleculair gewicht en GEFRAGMENTEERD DNA is getarget. Deze methoden zijn vaak kosteneffectief en minimaal invasief voor de vleermuis, als fecale monsters en niet-dodelijke weefsel bemonstering via buccale doekjes of Wing biopsie stoten zijn ook gemeenschappelijke manieren om DNA te verkrijgen voor analyses met een laag moleculair gewicht20, 21.

De kwaliteit is echter sterk afhankelijk van het type media waarin het monster is opgeslagen22. Na systematische en kwantitatieve vergelijkingen van buccale doekjes en biopsie stoten, is gebleken dat Wing biopsie ponsen consistent hogere niveaus van DNA opleveren en minder belastend waren voor de vleermuis tijdens collectie22. Deze vergelijkingen toonden ook aan dat de beste resultaten werden verkregen toen de vleugel Punch werd bewaard in indicator silica (d.w.z. een type droogmiddel gemaakt van silicagel kralen dat van kleur verandert wanneer vocht wordt waargenomen) in plaats van in andere populaire opslagmedia zoals ethanol of DMSO22; Hoewel, andere opslagmedia met inbegrip van weefsel stabilisatie oplossing werden niet onderzocht. Vleugel stoten kan ook worden gebruikt om fibroblast cellen in cultuur te kweken, zoals in Kacprzyk et al.23 en zoals hieronder beschreven (zie rubriek 6). Voor deze methoden moet de vleugel of uropatagium voorzichtig worden verlengd, en moet een schone biopsie Punch, meestal 3 mm in diameter, worden gebruikt om het monster te verkrijgen. Deze aanpak lijkt te leiden tot geen blijvende schade, met littekens genezing over binnen weken in de meeste gevallen24.

HMW-DNA (10-150 KB) is uitdagender en wordt momenteel alleen betrouwbaar verkregen met behulp van weefsel dat snel is bevroren in LN2 na de oogst en gehandhaafd bij een maximum van-80 °C tot extractie. HMW DNA (10-150 KB) is cruciaal voor het lang lezen van DNA-sequencing en dus voor de Novo genoome assembly. Inderdaad, terwijl de meeste commerciële kits kunnen worden gebruikt om een standaard HMW-DNA te isoleren, voldoen de resulterende molecuul grootten vaak niet aan de vereisten van de derde generatie sequentie technologieën [bijv. die worden gelanceerd door bedrijven zoals Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, en 10x Genomics, of door middel van assemblage methoden aangeboden door Bionano Genomics of Dovetail Genomics]. Als zodanig is er een nieuwe vraag naar "Ultra HMW" DNA (> 150 KB). Bij het verkrijgen van ultra HMW DNA van vleermuizen, verse monsters van de lever, hersenen, of spier zijn allemaal geschikt, maar deze moeten onmiddellijk Flash bevroren in LN2 zonder opslag buffer of cryoprotectant. Een volledige beschrijving van deze stappen valt buiten het bestek van dit document, maar is elders beschikbaar25.

Weefsel voor RNA
RNA is een enkel-streng molecuul dat minder stabiel is dan DNA. Hoewel er vele vormen van RNA,-omics analyses hebben de neiging om zich te concentreren op mRNA (boodschapper RNA) en kleine Rna's (bv, microRNAs). Na transcriptie wordt de mRNA gesplitst om een volwassen transcript te vormen die geen intron bevat en het coderings gedeelte van genen/Genomes vertegenwoordigt. Codeer genen zijn voor een kleine fractie van de genoom grootte (1%-2%), waardoor het doel van mRNA een kosteneffectieve manier is om sequentie gegevens voor genen te verkrijgen. Microrna's zijn een klasse van Rna's die het vertaalproces van mRNA in eiwitten reguleren en dus belangrijke regelgevende Effectors zijn. RNA transcripten kunnen afzonderlijk worden geordend, of meer algemeen voor-omics analyses26,27,28,29,30, als onderdeel van een transcriptome; dat is, het totaal van alle RNA transcripten aanwezig in een bepaald monster.

Sequentiëren kan worden uitgevoerd volgens verschillende methoden (d.w.z. via kortlees-RNA-SEQ of lange-lees hele isovorm SEQ), waardoor analyse van zowel RNA-overvloed als isovorm-gebruik mogelijk is. Aangezien de hoeveelheid en de diversiteit van mRNA-transcripten varieert tussen cellen en weefsels, maakt RNA-sequencing het mogelijk om genexpressie en regulering over monsters te bestuderen en te vergelijken. Belangstelling voor het sequentiëren van kleine rna's en volledige isovorm-sequencing groeit, omdat deze methoden steeds meer biologisch informatief worden. Voorbereiding van weefselmonsters om verschillende klassen van RNA te sequenties kan op dezelfde manier worden uitgevoerd als in dit manuscript, met alleen de daaropvolgende extractiemethoden die verschillen van31,32. Ten slotte, omdat transcriptomes een hoge dekkings subset van het genoom met eiwit codering bieden, kan de verzamelde gegevensset nuttig zijn bij genoom assemblage en aantekening, waardoor het verzamelen van RNA-SEQ-gegevens over een reeks verschillende weefsels een belangrijk onderdeel van de Bat1K Initiative.

In tegenstelling tot DNA is RNA chemisch instabiel en ook doelwit van RNase-enzymen, die alomtegenwoordig aanwezig zijn in weefsel lysaten als een defensieve strategie tegen RNA-gebaseerde virussen. Om deze redenen begint de RNA-Fractie in cellen en weefsels kort na het punt van bemonstering en/of euthanasie te degraderen. Het behoud van het RNA vereist daarom stappen om de afbraak ervan te voorkomen. Dit impliceert meestal het behoud van vers ingezameld weefsel bij 4 °C in een stabiliserend middel zoals RNA stabiliserende oplossing om de Rnasen van nature aanwezig in weefsels te inactiveren, gevolgd door bevriezing voor langere termijn opslag. Als een voorkeur alternatief, weefsel kan worden Flash bevroren in LN2; Hoewel zoals hierboven vermeld, kan het transporteren van LN2 in het veld en het onderhouden van niveaus om te voorkomen dat het weefsel ontdooien logistisch uitdagend zijn.

Weefsel voor eiwitten
Eiwit samenstelling en relatieve overvloed variëren tussen cellen en weefsels op een vergelijkbare manier als wat werd besproken voor RNA; echter, eiwitten zijn gemiddeld stabieler dan RNA. Eiwit identificatie met behulp van proteomica komt meestal overeen met een fractie van, en niet de hele, eiwitsequentie, maar het kan informatie over de expressie over weefsels leveren en de aanwezige pathogenen karakteriseren. Aangezien veel eiwit sequenties over zoogdieren worden bewaard, kunnen BBT-monsters voor proteomica gemakkelijk worden verontreinigd met geconmaineerde menselijke eiwitten, waarbij steriele protocollen (bijv. handschoenen, Tang) nodig zijn tijdens het verzamelen. Terwijl het flitsen in LN2 de beste manier is om de afbraak van eiwitten te voorkomen, is het gebruik van droogijs,-20 °C vrieskisten en zelfs ijs geschikt als er geen andere middelen zijn. Naarmate de temperaturen toenemen, stijgt ook het risico van differentiële eiwitafbraak. Stabiliserend middelen zoals weefsel stabilisatie oplossing zijn effectief in het behoud van de eiwitfractie van weefsels bij kamertemperatuur en zijn geschikt voor kortstondig behoud (tot een week) wanneer het invriezen van de vlam niet haalbaar is.

Het enzymatische Profiel van een bepaald weefsel beïnvloedt direct het behoud van eiwitten daarin. Weefsels met een lage enzymatische activiteit zoals spier kunnen eiwit profielen behouden, zelfs bij de hogere temperaturen in een huishoudelijke vriezer. Daarentegen is leverweefsel enzymatisch reactief, en zijn eiwitten hebben hogere waarschijnlijkheden van vernederende tijdens de bereiding. Het groeiend aantal protocollen voor het verkrijgen van menselijke proteomische profielen uit formalin-Fixed paraffine-embedded (FFPE)-monsters suggereert dat Paraformaldehyde-fixatie van weefsels een belofte voor laaggeprijsde eiwit conservering bevat wanneer het invriezen niet wordt haalbaar33,34. Hoewel sterk afhankelijk van behoud tijd en conditie, zijn eiwitten geïdentificeerd via Immunohistochemie van formalin-vaste, met ethanol geconserveerde vleermuis specimens35. Deze aanpak is niet schaalbaar tot monsterneming op Proteomic-niveau, maar benadrukt het potentieel voor formalin-Fixed bat-weefsels om eiwit profielen te leveren wanneer het invriezen niet beschikbaar is en andere stabiliserend middelen te kostbaar zijn.

Weefsel voor celkweek
Monsternemings weefsel en flits bevriezing bieden een eindige hoeveelheid materiaal dat moet worden gebruikt en zodra het materiaal wordt gebruikt, is het niet meer beschikbaar. Celculturen bieden ook levende cellen die onmiddellijk kunnen worden gebruikt of bewaard voor toekomstige studies. Culturen vergemakkelijken ook de expansie van cellen om de opbrengst te verhogen wanneer weefselmonsters klein zijn. Het is vooral nuttig in gevallen waarin weefsel inzameling beperkt is, zoals experimenten met zeldzame soorten waarin niet-dodelijke bemonstering essentieel is en daarom grote gevolgen heeft voor de instandhouding. Beschreven is een protocol waarin celcultuur mogelijk is via niet-dodelijke bemonstering van vleugel membraan weefsel, maar kweek is mogelijk met meerdere weefsel typen36,37. Het protocol dat hier wordt geleverd, selecteert de cellen die zich bevinden. De combinatie van bron weefsel en groeimedia gebruikt maakt dit protocol geschikt voor het selecteren en groeien van fibroblasten, maar indien gewenst kunnen alternatieve protocollen worden gebruikt om te selecteren voor andere celtypen. In de context van het Bat1K-project wordt voorspeld dat voor zeldzame en bedreigde soorten, niet-dodelijke bemonstering van vleugel membranen en de uitbreiding van monsters via kweken essentieel is om het volume van DNA te genereren dat nodig is voor de verschillende technologieën die worden gebruikt5 .

Bat Capture
Alle mensen die vleermuizen hanteren, moeten worden getraind door een bat-competente onderzoeker en tegen rabiës worden gevaccineerd met een reeks pre-exposure injecties. Als bitten, een verdere reeks van post-exposure injecties is nog steeds nodig. Standaardmethoden voor het vangen van vleermuizen zijn mist netten (Figuur 1) en harp vallen (Figuur 2). Mist netten worden meestal gebruikt en zijn ideaal voor gebieden met een lage tot matige activiteit, omdat ze de meeste zorg nodig hebben voor het minimaliseren van de BBT-nood. Kleine vleermuizen zijn bijzonder kwetsbaar en kunnen van stress sterven als ze niet snel geneigd zijn. Frequente netto-inspecties minimaliseren bat letsel en sterfte, evenals schade aan het nevel net. Dit detail is belangrijk omdat de juiste weefsel verzameling vereist dat het weefsel vers is, en onjuiste aandacht voor de mist netten in vleermuizen kan leiden tot onnodige sterfte of vroegtijdige sterfte voordat de onderzoeker monsters goed kan verwerken. Omdat verschillende vleermuizen in een harp val kunnen rusten met minimale nood, is deze aanpak ideaal voor gebieden met een hoge vleermuis activiteit, zoals in de buurt van een grot of grote Roost. Gedetailleerde instructies voor de juiste BBT-vastlegging en gegevensverwerking voor het verzamelen van morfologische en demografische informatie zijn beschikbaar in de aanvullende methoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Stony Brook University (protocol #2013-2034).

1. euthanasie

  1. Bevochtig een wattenbolletje met een Isofluraan verdoving of een ander beschikbaar anestheticum.
  2. Plaats de katoenen bal in een hersluitbare, luchtdichte plastic zak. De zak moet groot genoeg zijn om een zak in een doek bat zak comfortabel te houden.
  3. Na enkele minuten van het toestaan van de zak te doordringen met verdoving, plaats een vleermuis zak met de vleermuis in de plastic zak.
  4. Wacht enkele minuten totdat de vleermuis is geëgaliseerd. Vleermuizen ~ 20 g of minder in gewicht vereisen ongeveer 5 – 10 min. vleermuizen groter dan dit kan tot 20 min. Merk op dat de lengte van de tijd kan ook afhangen van de permeabiliteit van de bat zak. Het wordt aanbevolen om het dunste mogelijke doek materiaal te gebruiken om de diffusie van het anestheticum te maximaliseren.
  5. Controleer op adem en hartslag om ervoor te zorgen dat de vleermuis is geëerd voordat het dissectie begint.

2. voorbereiding van dissectie

  1. Houd alle instrumentatie schoon tussen dissecties, met behulp van het volgende protocol.
  2. Reinigings instrumenten met water-en afwas zeep. Veeg ze af met 10% bleekwater, weg van het dissectie gebied, omdat bleekmiddel nucleïnezuren zal afbreken.
  3. Veeg af met 70% ethanol.
  4. Veeg af met RNAse decontaminatie reagens.
  5. Herhaal deze sectie na elke dissectie.

3. voorbereiding van de flacons voor weefselmonsters

  1. Voor RNA:
    1. Bereid alle injectieflacons voor voordat u begint met dissecties om vertragingen te voorkomen.
    2. Stel het aantal injectieflacons dat nodig is voor elk monster opzij. Label elke buis met het weefseltype dat wordt verzameld, evenals standaardidentificatie gegevens van de specimen. Vul de flesjes 50% vol RNA stabiliserende oplossing, en ideaal Chill tot 4 °C.
    3. Zorg dat u de flacons niet volledig vult met RNA-stabiliserende oplossing, anders kan de buis ontploffen bij het plaatsen van het in LN2. Bij het nemen van weefselmonsters, vergeet niet dat grote klonten van weefsel niet volledig door de RNA-stabiliserende oplossing zal worden doorgepenetreerd. Daarom, snijd het weefsel in kleinere stukken van niet groter dan 0,5 cm in één dimensie, en handhaven van een verhouding van ten minste 10:1 volume voor RNA stabiliserende oplossing: weefsel.
    4. Ten minste moeten gedesected weefsels worden geplaatst in RNA stabiliserende oplossing, zelfs als de toegang tot LN2 of koude opslag in niet beschikbaar.
  2. Voor DNA:
    Let op:     het nucleaire DNA-gehalte is hetzelfde voor bijna alle weefsels; Daarom kan de bemonstering flexibel zijn. Echter, opgemerkt moet worden dat hogere dichtheden van mitochondriën in spierweefsel kan leiden tot een verlies van leesbewerkingen voor de nucleaire genoom38.
    1. Voor DNA met een laag molecuulgewicht, neem een of meer replicaten van vleugel membraan voor opslag in silica, en/of spier voor opslag in RNA stabilisatie oplossing of weefsel stabilisatie oplossing.
    2. Voor Ultra HMW-DNA, Flash-freeze in LN2 zonder opslag reagens, vervolgens overbrengen naar lange termijn opslag bij-80 °C of kouder. Uit de schedel dissectie, hersenweefsel is het meest geschikte weefseltype voor het ophalen van ultra HMW DNA39, terwijl van postcraniale dissecties, lever of spier zijn meer geschikt40.
    3. Voor de craniale dissectie, gebruik 5 mL flesjes (in tegenstelling tot de standaard 2 mL flesjes) van RNA stabiliserende oplossing voor sommige weefsel. Alle injectieflacons moeten cryogeen zijn. Bewaar de flacons op het ijs terwijl u ontleed.

4. craniale dissecties voor RNA

  1. Onthooi onmiddellijk na euthanasie het preparaat met een groot paar schaar-of botsnijders (Figuur 3).
  2. Verwijder de ogen met een tang met behulp van sterk genoeg kracht om de oogzenuw los te maken. Plaats de ogen in 2 mL flacon RNA stabiliserende oplossing.
  3. Met behulp van uw gereedschap naar keuze, huid de schedel van haar, fascia, en schedel spieren, met inbegrip van de huid op de neus. Zorg dat je de voorkant van de neus niet breekt.
  4. Maak met een schaar een sagittale snede op het ventrale gedeelte (Figuur 3) van de schedel, beginnend bij de nek, en zorg ervoor dat u de hersenen niet beschadigt.
  5. Met behulp van een tang, Trek voorzichtig aan beide zijden van de schedel totdat het is gebarsten open en de hersenen wordt blootgesteld.
  6. Op het staart uiteinde van de schedel moet de cochleae nu zijdelings zichtbaar zijn aan elke kant van het hoofd. Ze zijn klein, Sferische botten aan de linker-en rechterkant, gewoon rostrale migratoire naar de nek en posterieur aan de kauwspieren. Met behulp van een tang, Trek voorzichtig de cochleae en zet ze in een 2 mL flacon van RNA stabiliserende oplossing.
  7. Schraf de hersenen voorzichtig (die zeer zacht zullen zijn) met een tang. De olfactorische bol zal zichtbaar worden, zittend op het ventrale gedeelte van het binnenste van de schedel. Probeer de olfactorische lamp vast te houden.
  8. Als de olfactorische gloeilamp nog niet verwijderd is, schik het weefsel voorzichtig weg en zal de cribriform plaat zichtbaar worden. Dit is een kritisch bot om de onderzoeker georiënteerd te houden. Het kan worden geïdentificeerd als de meest anterieure regio van de schedel met meerdere foramen en het punt waar twee groeven waar de olfactorische bol rust.
  9. Houd indien mogelijk de vorm van de hersenen intact en plaats deze onmiddellijk op droogijs om de vorm te behouden of in een Injectieflacon van 5 mL RNA-stabiliserende oplossing. Als immunohistochemie moet worden gedaan op de hersenen, plaats in 4% Paraformaldehyde, indien beschikbaar.
  10. Maak twee incisies waar de bovenste en onderste kaak toetreden, en verwijder de mandible.
  11. Zodra de onderkaak is verwijderd, verwijder het rostrum (bovenkaak) van het overgebleven deel van de schedel. Zorg ervoor dat de kaak ook de cribriform plaat bevat.
  12. Plaats de neus in RNA stabiliserende oplossing en bewaar bij 4 °C 's nachts. Omdat dit een dicht weefsel is, vergt het tijd om RNA stabiliserende oplossing toe te staan om het hele weefsel te doordringen.
  13. Plaats de neus flacon in LN2 na de nachtelijke onderdompelen in RNA stabiliserende oplossing.
  14. Van de onderste onderkaak, snijd de tong met een schaar en plaats in een 2 mL flesje RNA voor later.
  15. Dit protocol verbeurde het grootste deel van de schedel. Tanden, met name die uit de onderkaak, kunnen worden teruggewonnen en kunnen nuttig zijn voor soorten diagnostiek. Botweefsel kan worden opgeslagen in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).

5. postcraniale dissecties voor RNA

  1. Gebruik een scalpel om door de buikholte te boren, waardoor een longitudinale incisie tot aan de ribben wordt (Figuur 3). Dit verbeurde het skelet frame. Als bot moet worden bewaard, zorgvuldig ontleden van de huid in de spier en op te slaan in 1x PBS na de weke delen sectie is voltooid.
  2. Strip de huid om de borstspier te onthullen, neem ten minste twee monsters van de spier, één voor RNA-stabiliserende oplossing en één om bevroren te blijven voor HMW-DNA, onmiddellijk in een injectieflacon te plaatsen om in LN2 te zetten.
  3. Snij door het borstbeen en trek de ribben weg om monsters van de longen te verzamelen.
  4. Verzamel het hart, dat in zijn geheel kan worden genomen, maar moet worden verdeeld in helften, zodat de RNA-stabiliserende oplossing grondig absorbeert.
  5. Neem monsters van de lever. Neem ten minste twee monsters van de lever, één te blijven bevroren voor HMW DNA, plaatsen onmiddellijk in een lege injectieflacon in te zetten LN2. De lever is zeer enzymatisch, en het is belangrijk om de monsters klein genoeg te maken voor de RNA-stabiliserende oplossing om volledig in te weken.
  6. De hepatische duct, die functioneert om gal uit de lever, verbindt de lever naar alvleesklier en dunne darm. Dit vat is gemakkelijk identificeerbaar door het opsporen van het inferieure/achterste gedeelte van de lever en het traceren van het vat op posterieure wijze. Het kanaal is vaak een groenachtige kleur, ook. Volg de hepatische buis te vinden van de alvleesklier en galblaas en verzamel deze afzonderlijk. Plaats in respectieve flesjes van RNA stabiliserende oplossing.
  7. Verzamel de maag en, naast het, aan de basis en verschijnen als een andere tint van paars, is de veer-achtige milt. De alvleesklier moet hier ook zichtbaar zijn als een witte structuur (Figuur 3). Plaats in respectieve flesjes van RNA stabiliserende oplossing.
  8. Verzamel kleine monsters van de dunne en dikke darm. Plaats in respectieve flesjes van RNA stabiliserende oplossing. Darmen kunnen ook worden vertoond voor endoparasiet. Als een parasitoloog in het veld is, kan een inspectie voor parasieten worden uitgevoerd. Als dit op een later tijdstip gedaan moet worden, kan de hele darm in een 5 mL cryogene injectieflacon worden ingenomen.
  9. Neem een van de nieren en volg hun kanalen naar de blaas. Plaats in respectieve flesjes van RNA stabiliserende oplossing.
  10. Gebruik de andere nier als een gids voor het vinden van de teelballen (als mannelijk) of baarmoeder en door het de eierstokken (als vrouw). Verzamel een of beide geslachtsklieren, indien mogelijk.
  11. Houd monsters van verschillende delen van de huid van de vleugel in afzonderlijke injectieflacons (gespierd versus niet-gespierd deel).

6. verzameling en voorbereiding van weefselkweek

  1. Bereid groeimedium voor op de cellen door de gemodificeerde Eagle medium (DMEM) van Dulbecco te maken met 20% foetaal runderserum (FBS), 1% penicileen/streptomycine (P/S) en 50 μg/mL gentamycine. Aliquots van groeimedia moeten elke dag van het protocol vers worden gemaakt.
  2. Na het verzamelen moeten vleugel biopsie stoten direct in 1 mL koud groeimedium worden geplaatst in een goed verzegelde 1,5 mL centrifugebuis. Wikkel de buis in Parafilm om te verzegelen.
  3. Buizen moeten vervolgens worden vervoerd in een piepschuim doos met koelelementen om monsters te houden bij 4 ° c. Vervoer moet worden versneld; Hoewel, gezonde cellen kunnen worden gemaakt van stoten die op deze manier zijn opgeslagen voor maximaal 6 dagen maar minder optimaal23.
  4. Eenmaal getransporteerd naar weefselcultuur faciliteit, kan het volgende protocol worden gebruikt om celculturen te genereren. Voor de rest van het protocol41moeten standaard steriele technieken worden gebruikt.

7. dag 1 weefselcultuur: dissociatie van weefsel

  1. Breng de inhoud van de buis (groeimedium met de vleugel membraan biopsie) over in een conische centrifugebuis van 15 mL.
  2. Verwijder voorzichtig het groeimedium. Was de biopsie voorzichtig tweemaal met 500 μL steriele PBS.
  3. Voeg 500 μL Collagenase IV (1 mg/mL) toe aan de buis. Dit zal leiden tot de vertering van het weefsel in individuele cellen.
  4. Incuberen 's nachts (maximaal 16 uur) bij 37 °C zonder roeren.

8. dag 2 weefselcultuur: plating cellen

  1. Maak een vers groeimedium en verwarm het voor op 37 °C.
  2. Bereid een 6 goed weefselkweek plaat door toevoeging van 2 mL vers, voorverwarmd groeimedium in elke put van de te gebruiken plaat (1 goed per 3 mm vleugel biopsie). Bewaar dit plaatje in een incubator van 37 °C en 5% CO2 tot het nodig is (stap 8,7).
  3. Verwijder de buis van 15 mL die de cellen uit de incubator bevat en Blus de digestie reactie door 1 mL vers groeimedium toe te voegen (voorverwarmd tot 37 °C).
  4. Rebreng de cellen uit door de oplossing zorgvuldig te tritureren met een P1000 pipetpunt om een enkele celsuspensie te bereiken.
  5. Draai de cellen voorzichtig in een tafelblad centrifuge gedurende 3 min bij 300 x g.
    Opmerking: Kleine stukjes weefsel kunnen nog zichtbaar zijn ofwel in suspensie of bevestigd aan de wand van de 15 mL buis. Dit heeft echter geen invloed op de voorbereiding van de celsuspensie
  6. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig verwijderen van 80% – 90% van de vloeistof met een P1000 pipet.
    Opmerking: indien nog zichtbaar, gooi het stukje weefsel niet weg en schud het voorzichtig in de volgende stap (8,7).
  7. Resuspendeer de pellet in 500 μL voorverwarmde groeimedium, schud voorzichtig de suspensie om ervoor te zorgen dat de pellet of grote fragmenten van de pellet niet meer zichtbaar zijn en dat de cellen voldoende zijn opgehangen. De media kunnen er bewolkt uitzien als gevolg van de aanwezigheid van cellen.
    Opmerking: In dit stadium kan een levensvatbare celtelling worden uitgevoerd om de kwaliteit van de cellen suspensie en het rendement van cellen afgeleid van de vleugel clip te beoordelen (zie stap 10,11 voor meer informatie).
  8. Pipetteer het volledige volume van de celsuspensie voorzichtig in een enkele put van een 6-put.
    Opmerking: Voer de bovenstaande stap onmiddellijk uit en sta niet toe dat cellen zich vestigen na stap 8,7. Gebruik een pipet om de celsuspensie voorzichtig over het oppervlak van de put te verdelen op een druppelsgewijs manier. Pipet niet de hele oplossing in het midden van de put, omdat dit zou resulteren in de cellen klonteren in het midden van de put.
    Opmerking: als het stukje weefsel nog zichtbaar is, breng het dan niet in het kweek vat goed over.
  9. Draai de plaat zachtjes van kant naar kant en voor-naar-achteren 2x – 3x om cellen te helpen verspreiden over het goed oppervlak in een enkele laag.
  10. Controleer de vergulde cellen onder de Microscoop, omdat ze enkelvoudige cellen moeten zijn die opgevuurd en zwevend lijken, maar zeer dicht.
  11. Plaats de plaat voorzichtig in een incubator die vooraf is ingesteld op 37 °C en 5% CO2.
  12. Na ~ 24 h, observeer de cellen onder de Microscoop om de gezondheid van de cultuur te bepalen. Cellen moeten nu worden gekoppeld aan het oppervlak van de plaat en worden afgevlakt (figuur 4a). Verschillende celtypen kunnen zichtbaar zijn in de cultuur bij het kijken door de Microscoop.
  13. Er zullen waarschijnlijk enkele zwevende cellen zijn die niet zijn bijgevoegd. Een deel van deze cellen is dood. Als er een groot deel van de zwevende cellen zichtbaar is in de put, moet de media worden vernieuwd. In dit geval, voorzichtig aspireren ~ 50% van het medium uit de put en zachtjes toe te voegen 1 mL voorverwarmde groeimedium aan de zijkant van de put, zodat de cellen niet verstoren.
  14. Houd de cellen in een incubator vooraf ingesteld op 37 °C en 5% CO2. De cellen moeten regelmatig (maar niet meer dan eenmaal per dag) onder de Microscoop worden geobserveerd om de behoefte aan media verfrissing of splitsing te bepalen.
    Opmerking: Wanneer cellen nieuw zijn geplateerd, zullen ze snel verdelen en dus elke dag gecontroleerd worden. Na enige tijd in de cultuur, de groei zal vertragen, en ze kunnen worden gecontroleerd elke 48 – 72 h.

9. Media vernieuwen

  1. Controleer de cellen onder de Microscoop regelmatig om hun groei en kwaliteit van de cultuur te observeren. De kleur van de media bewaken als een indicatie van de kwaliteit ervan. Cellen moeten gedurende maximaal 3 dagen in dezelfde media blijven of totdat de afdraaien noodzakelijk is, afhankelijk van wat het eerst komt.
    1. Als cellen snel groeien en de media uitputten, zal dit ook zichtbaar zijn voor het oog, omdat de kleur van de media van rood naar geel zal veranderen.
  2. Wanneer nodig zorgvuldig aspireren ~ 50% van het medium uit de put en zachtjes toevoegen ongeveer hetzelfde volume van pre-warmed groeimedium aan de zijkant van de put, zodat de cellen niet verstoren.
  3. Retourneer de cellen naar de incubator 37 °C en 5% CO2 .

10. doorgangen van cellen

  1. Passaging cellen verwijst naar het nemen van een bestaande cultuur en het opsplitsen in nieuwe putten. Passaging moet plaatsvinden wanneer de cellen ~ 80% Confluent Health [d.w.z., wanneer ze innemen ~ 80% van het oppervlak van de put en slechts ~ 20% van het plastic is nog steeds zichtbaar als hiaten (figuur 4b)].
  2. Voorzichtig aspireren en gooi ~ 90% van het groeimedium.
  3. Was de cellen zeer zacht door 1 mL steriele PBS aan de wand van de put toe te voegen om de cellen niet te storen. Draai de plaat voorzichtig heen en weer en zij-aan-zij 2x – 3x. Aspireren en gooi alle PBS van de plaat.
  4. Herhaal stap 10,3 om de cellen opnieuw te wassen.
  5. Voeg voorzichtig 250 μL trypsine-EDTA (sigma Aldrich, Cat #T4049) toe aan de put en incuberen gedurende 1,5 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de trypsine-EDTA-oplossing het hele oppervlak van de put bedekt door zachtjes op de plaat te schommelen.
  6. Quencheer de reactie door 1 mL vers voorverwarmde groeimedium toe te voegen.
  7. Pipetteer omhoog en omlaag ~ 5x om de cellen van het oppervlak van de plaat te wassen en zorg ervoor dat de cellen in suspensie zijn.
    Opmerking: De oplossing moet troebel worden door de aanwezigheid van de cellen.
  8. Plaats de celsuspensie in een buis van 15 mL en draai de cellen in een Table-Top centrifuge gedurende 3 min bij 300 x g.
  9. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig verwijderen van 80% – 90% van de vloeistof met een P1000 pipet.
  10. Rebreng de pellet in 1 mL voorverwarmde groeimedium en laat de suspensie zachtjes trillen. Zorg ervoor dat de pellet of grote fragmenten van de pellet niet meer zichtbaar zijn en dat cellen in één celsuspensie zitten.
  11. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller zoals hier beschreven, of handmatig met behulp van een hemocytometer zoals in detail beschreven in de referentie video42. Meng een 10 μL aliquot van de hangende cellen 1:1 met Trypan Blue om levensvatbare cellen te detecteren.
  12. Incuberen gedurende 1 minuut en Pipetteer 10 μL van de oplossing op de teldia. Plaats de teldia in een geautomatiseerde cel teller om de cellen te tellen met de juiste instellingen. De opbrengst moet ongeveer 1 – 2 miljoen cellen van een confluente enkele put van een 6-put, hoewel dit kan variëren afhankelijk van de grootte van de cellen en soorten. Als cellen zich niet in een enkele celsuspensie bevinden, is de celtelling niet nauwkeurig.
  13. Deze celculturen tolereren over het algemeen een 1:2 split [d.w.z. een confluente put van cellen kan worden opgesplitst in twee nieuwe Wells (totaal)]. Om dit te doen, schud de cellen voorzichtig opnieuw, neem vervolgens de celsuspensie in twee helften (~ 730 μL elk) en plaats ze in elk van de twee nieuwe putjes met 750 μL voorverwarmd groeimedium in druppelsgewijs Fashion.
    Opmerking: Na 2 – 3 dagen moeten de putten Confluent Health zijn en weer klaar zijn om te splitsen. Op dit punt wordt aanbevolen om een goed van de cellen te behouden door het protocol met een goede bevriezing (paragraaf 11). Verdere voorraden van cellen kunnen als wenselijk worden bevroren tijdens verdere passages.
    Opmerking: Na ~ 6 passages, de cellen hebben de neiging om senescentie in te voeren en zal niet meer verdelen. Dit is een indicatie dat de cellen niet langer kunnen worden gesplitst of uitgevouwen om de celaantallen te verhogen. Dit is ook een indicatie dat de cellen niet langer levensvatbaar zullen zijn.

11. het bevriezen van levensvatbare levende cellen

  1. Bereid Vries dragers voor door DMEM te combineren met 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S en 50 μg/mL gentamycine.
  2. Bevriezing wordt uitgevoerd door het innemen van cellen in de vorm van het afdraaien proces. De pellet moet worden bereid uit een 80% – 90% Confluent Health goed van een 6 goed plaat (vertegenwoordigt ~ 1 – 2 miljoen cellen), zoals per stappen 8.1 – 8.9.
  3. Respendeer de pellet in 1,5 mL Vries medium.
  4. Plaats ~ 750 μL celsuspensie in elk van de twee afzonderlijke cryoflesjes.
  5. Plaats de flacons in een cryogene Vries container, wat resulteert in de cellen die langzaam bevriezen om de celvitaliteit te behouden. Plaats ze onmiddellijk in-80 °C.
  6. Na 24 – 48 h, breng de cryoflacons van cellen over naar LN2 voor langdurige opslag. Opgeslagen op deze manier, cellen kunnen worden nieuw leven ingeblazen en zal levensvatbaar zijn voor jaren.

12. ontdooien van bevroren cellen

  1. Bereid een 6-goed bord met 2 mL voorverwarmde groeimedium in elke put die zal worden gebruikt (1 goed per flacon met cellen die ontdooid worden). Houd de plaat in de 37 °C en 5% CO2 incubator tot nodig.
  2. Neem één injectieflacon met cellen uit LN2 en plaats deze in een warmwaterbad (37 °C) om cellen snel te ontdooien. Dit moet 2 – 3 minuten duren.
    Opmerking: Laat de flacons niet langer ontdooien dan 3 – 5 minuten, aangezien de DMSO in de Vries media giftig is voor de cellen die eenmaal ontdooid zijn.
  3. Zodra de oplossing in de injectieflacon ontdooid is, pipetteer dan voorzichtig omhoog en omlaag om de oplossing te homogeniseren en plaats onmiddellijk de volledige oplossing (~ 750 μL) in een put van een 6-put (vooraf voorbereid in stap 12,1).
  4. Draai de plaat zachtjes van de zijkant naar de zijkant en voor naar achteren 2 – 3 keer om de cellen te helpen verdelen over het goed oppervlak in een enkele laag.
  5. Plaats de cellen in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 incubator voor 24 – 48 uur.
  6. Controleer en doorgang de cellen zoals hierboven beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dna
Voor standaard laag moleculair gewicht (LMW)-analyses werd DNA geëxtraheerd uit drie neotropische vleermuissoorten. Weefselmonsters werden verzameld op het gebied van de Dominicaanse Republiek en Costa Rica, volgens de in dit document beschreven protocollen. Na dissectie werden kleine stukjes (< 0,5 cm bij het dunste gedeelte) van gemengde weefsels (hersenen, lever en darmen) in RNA-stabiliserende oplossing geplaatst, Flash bevroren, en vervolgens opgeslagen bij-80 °C. Extracties werden uitgevoerd met behulp van standaard DNA-extractie protocollen met RNase behandeling43. Beoordeling van de DNA-integriteit met een geautomatiseerd elektroforese tool onthulde de volgende representatieve sample pieken van fragment groottes: soorten 1 (twee afzonderlijke extracties) bestond uit 22 kB en 20 KB; soort 2 bestond uit 25 KB; en soorten 3 bestond uit 24 KB (Figuur 5, tabel 2).

DNA geëxtraheerd voor sequencing van de derde generatie moet worden verzameld in hoge concentraties en minimaal gefragmenteerd. HMW DNA geëxtraheerd uit Flash-Frozen hersenweefsel van een oude wereld fruit vleermuis (Eidolon helvum) verzameld in Ghana werd verkregen. Het HMW-DNA werd geëxtraheerd met behulp van het Bionano-extractie protocol voor latere analyse op het Irys-platform. Dit DNA was 607.463 MB lang en had een gemiddelde moleculaire N50 van 194,5 MB.

Rna
Een gemeenschappelijke indicator van succes voor RNA extracties is de RNA integrity Number (RIN) waarde. Het wordt vaak niet aanbevolen door het sequentiëren van faciliteiten om een RNA-SEQ Library Preparation of sequentieprotocol uit te voeren wanneer extracties een RIN-waarde hebben van minder dan acht, omdat de waarden onder deze drempel hoge handtekeningen van afbraak 44 kunnen aantonen ,45. Figuur 6 toont de Rin-waarden voor RNA-extracties van verschillende weefsel typen na dit protocol. Extractie van weefsel verzameld met de protocollen heeft geresulteerd in hoge kwaliteit RNA, onafhankelijk van veld bemonstering plaats. Toen LN2 niet onmiddellijk beschikbaar was in de Amazone, werden weefsels in RNA-stabiliserende oplossing geplaatst en gedurende 1 week bij 4 °c bewaard totdat ze in LN2 werden geplaatst. Zelfs in dergelijke gevallen, RIN waarden waren vergelijkbaar met die onmiddellijk geplaatst in RNA stabiliserende oplossing en rechtstreeks in LN2. RNA stabiliserende oplossing is een essentiële stabiliserend middel.

Weefselcultuur
Onmiddellijk na het beplating, zullen de cellen worden opkluit en zweven. Echter, binnen 24 h, de fibroblasten moeten afvlakken en hechten aan het oppervlak van de plaat (figuur 4a). Op dit punt, de cellen moeten op ongeveer 20%-30% samenvloeiing om te zorgen voor overleving. Een lagere waarde dan dit kan resulteren in de dood van de hele cultuur. In eerste instantie moeten ze voldoende ruimte tussen elkaar hebben om uitbreiding mogelijk te maken, omdat de cellen in cultuur zullen verdelen en uitbreiden. Ze moeten worden gesplitst wanneer ze 80%-90% samenvloeiing bereiken [dat wil zeggen, ze bedekken > 80% van het plaat oppervlak (figuur 4b)]. Op deze manier kunnen cellen in cultuur worden gehouden voor een aantal passages (meestal > 6 passages) voordat ze senescentie ondergaan. Als cellen langer dan deze tijd in cultuur worden gehouden of niet worden gesplitst wanneer ze Confluent worden, kunnen ze de morfologie veranderen en groter en langer worden (figuur 4c). Cellen met deze morfologie kunnen nog steeds worden verdeeld, maar dit geeft meestal aan dat de cellen snel senescentie zijn of zullen binnenkomen en dat ze niet langer in cultuur kunnen worden gehandhaafd of uitgebreid.

Figure 1
Figuur 1: een gemeenschappelijk opgezet voor nevel netten om vleermuizen in het bos te vangen. Het houden van een hand bedekt, terwijl het ontwart met de tegenovergestelde hand is een manier om veilig verwijderen van de vleermuis terwijl het minimaliseren van stress. Deze foto werd genomen door Jon Flanders. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: een harp vanger wordt vaak gebruikt om buiten grotten, grote roosten of vlieg-aways vast te leggen. Vleermuizen zullen zich ophopen in het onderste zakje van de val met minimale verstrikking en gemakkelijke verwijdering door de onderzoeker. Deze foto werd genomen door Stephen Rossiter. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: workflow van dissecties en weefsel bemonstering voor RNA-weefsel voorbereiding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: BBT-celculturen afkomstig van vleugel stoten van phyllostomus verkleuring. (a) 24-48 h na het beplating worden de cellen afgevlakt en aan het plaat oppervlak bevestigd. B) de cellen beslaan 80%-90% van het plaat oppervlak en behouden de oorspronkelijke morfologie. Dit vertegenwoordigt de optimale fase voor splitsen. (C) na > 6 passages zullen cellen hun morfologie veranderen om groter en langer te worden, en de cellen zullen senescentie invoeren. In alle Foto's vertegenwoordigen heldere, balled-up cellen dode cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: representatieve resultaten van DNA-extracties van conservering voor standaard DNA-analyses van drie soorten vleermuis, DNA werd tweemaal geëxtraheerd uit soort 1. Een enkele grote band duidt op minimale fragmentatie en vergelijkbare grootte fragmenten van DNA van elke respectieve extractie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: RNA-integriteits getallen (Rin) van RNA-extracties van 13 verschillende weefsel soorten van neotropische vleermuissoorten die op vier verschillende plaatsen worden bemonsterd. Deze extracties werden voorbereid naar aanleiding van het beschreven protocol en werden vervolgens gebruikt om HiSeq/NextSeq Illumina-transcriptome-bibliotheken voor te bereiden. MOE is het belangrijkste olfactorische epitheel. VNO is het vomeronasale orgel. Weefsels bemonsterd van soorten in de Andes, Costa Rica en Dominicaanse Republiek werden direct in LN2 geplaatst na onderdompelen in RNA stabiliserende oplossing bij 4 °C 's nachts. Weefsels bemonsterd van soorten in de Amazone werden geplaatst in LN2 ongeveer 1 week na het plaatsen in RNA stabiliserende oplossing en bewaard bij 4 °C continu. N vertegenwoordigt het aantal personen dat voor elke weefsel extractie wordt vertegenwoordigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Toepassing Flash bevroren (L2) RNAlater AllProtect FFPE Media
Hoog MW-DNA Y X Y X X
Laag MW-DNA Y Y Y X X
Rna Y Y Y X X
Eiwit Y X Y Y X
Celcultuur X X X X Y

Tabel 1: overzicht van conserveringsmethoden en-toepassingen. MW = moleculair gewicht, FFPE = formalin-vaste paraffine-ingesloten weefsel. Vinkjes geven de voorkeurs conserveringsmethode aan voor elke respectieve beoogde toepassing. X-markeringen geven de Preserve aan die niet mogen worden gebruikt.

Soort ID Voorbeeld-ID Concentratie (ng/μL) Voorbeeld fragment piekgrootte (BP)
Soorten 1 1,1 31,8 21.885
1,2 22,8 19.633
Soorten 2 2 30,4 25.198
Soorten 3 3 32 24.386

Tabel 2: representatieve resultaten voor DNA-extracties op basis van conserveringsmethoden in dit protocol. Waarden corresponderen met de gel elektroforese putten uit Figuur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol dat in dit manuscript wordt besproken, beschrijft de beste bemonsterings praktijken voor verschillende moleculaire analyses van vleermuizen met hoge doorvoer. Alle succesvol-omics studies vereisen weefsel van hoge kwaliteit, maar het bemonsteren van vleermuis weefsel, evenals andere niet-model organismen, komt vaak voor in veldomstandigheden die niet kunnen worden ingesteld op dezelfde normen als die van een gecontroleerde laboratorium instelling. Sampling vindt vaak plaats op afgelegen locaties, met minimale bronnen, inclusief beperkte toegang tot elektriciteit en vriezers. Het is moeilijk, en vaak onmogelijk, om te zorgen voor volledig steriele bemonsterings condities. Zo, geschetst zijn de protocollen geïdentificeerd als de meest succesvolle in een verscheidenheid van de bemonstering plaatsen en veldomstandigheden. Om gestandaardiseerde bemonsteringsmethoden voor het Bat1K-initiatief en aanverwante inspanningen en projecten te hebben, wordt gesuggereerd dat de BBT-biologen deze protocollen volgen tijdens het plannen van veld expedities in de mate die is toegestaan.

Suggesties voor protocollen
Terwijl thoracische compressie een gemeenschappelijke aanpak was voor euthanasie in het verleden, wordt voorgesteld om nooit thoracische compressie te gebruiken om vleermuizen voor-omics analyses te verzamelen. Het is niet langer een acceptabele vorm van euthanasie in de Verenigde Staten46, en deze methode kan leiden tot de enzymatische afbraak van een reeks weefsels, ongeacht de soort van belang47. Als een dier wordt geëcaliseerd, wordt gesuggereerd dat weefsel voor zowel genomische als transcriptomische analyses wordt verzameld. Beide vereisen het oogsten van vers weefsel dat idealiter zou worden bevroren in LN2, maar dat kan ook worden opgeslagen in verschillende media om DNA, RNA, of EiwitExtractie te vergemakkelijken. Het wordt voorgesteld parallel te werken met twee mensen op craniale en postcraniale dissecties om de afbraak van het RNA in de weefsels te verminderen. Een persoon moet de schedel ontleden, terwijl de andere werken op de post-cranium.

Belangrijke beperkingen bij het uitvoeren van de dissectie protocollen zijn het personeel dat betrokken is bij de dissectie en de ruimte die beschikbaar is voor weefsel conservering (bijv. in de LN2 tank). Voorbereiding van injectieflacons op voorhand en voldoende aantal mensen om te helpen met het labelen van buizen en documenteren van flacons en weefsels verzameld zal bijdragen tot soepele monsterverwerking. Opgemerkt moet worden dat de juiste documentatie van de monsters essentieel is om de noodzakelijke (export, import) processen te verkrijgen. Het postcraniale dissectie protocol eist bijvoorbeeld meer dan 20 injectieflacons per dier.

Als de ruimte en de tijd beperkt zijn, moet het volgende worden geprioriteerd: 1) prioritering voor één specimen voor soorten, of ten minste één specimen per geslacht; prioritering voor een mannelijk specimen om sequentiëring van zowel X-als Y-chromosoom mogelijk te maken en de kans op het bemonsteren van een vruchtbaarheids vrouwtje te minimaliseren; 2) voor HMW DNA: hersenen, spier, en lever moet knipperen bevroren zonder enig reagens; 3) voor RNA: hersenen, spijsvertering weefsels, milt, en zintuiglijke organen zijn van hoge prioriteit. Elk weefselmonster moet worden opgeslagen in RNA-stabiliserende oplossing. Spierweefsel moet ook worden opgevat als een controle voor expressie analyses van gespecialiseerd weefsel; 4) op zijn minimaal, weefsels moeten koud worden gehouden; 5) de beschikbaarheid van LN2 kan ook zorgwekkend zijn. LN2 tanks moeten minstens om de twee weken opnieuw worden gevuld, maar vaker in warmere klimaten of als de tank regelmatig wordt geopend. LN2 is vaak commercieel beschikbaar in alle landen, omdat het veelvuldig wordt gebruikt in de landbouw en de gezondheidszorg om monsters te vervoeren. Meestal worden deze diensten geleverd door bedrijven die ook andere gassen verkopen, zoals koolstofdioxide of zuurstof. IJssalons bieden soms een andere optie voor droogijs of LN2 (of op zijn minst een aanbeveling voor aankoop), en er wordt voorgesteld om lokaal personeel te vragen om hulp bij dit; 6) Figuur 6 schetst succesvolle weefsel extracties voor sommige inzamelings expedities waarbij de omstandigheden beperkt waren.

Met meer mensen en meer ruimte, meer weefsel kan worden verzameld op verschillende manieren. De volgende aanvullende protocollen zijn elders gepubliceerd die onderzoekers moeten overwegen als de juiste ervaring en materialen beschikbaar zijn: 1) de BBT metabolome, of alle uitgescheiden laagmoleculaire metabolieten van cellen en weefsels, kunnen inzicht in uitzonderlijke bat levensduur of winterslaap en metabole vlucht eisen. Bloed moet worden opgevangen uit een gemakkelijk toegankelijk bloedvat, zoals de enkeladers, in een injectieflacon met heparine48, en fecale monsters moeten worden bevroren in LN249; 2) immunomics, of de reactie van het dier op pathogenen, kan worden geanalyseerd door het nemen van dijbeen en humeri en ze in weefselcultuur oplossing voor cultuur macrofagen downstream50; 3) ontlasting kan nuttig zijn voor twee soorten downstream nucleïnezuur gebaseerde analyses, zoals het bepalen van dieet51 en het indringende van de gut microbiome52,53,54. In beide gevallen verminderen reagentia zoals weefsel stabiliserende oplossing de afbraak van zeldzame varianten die in de ontlasting aanwezig zijn; 4) lipidomics, of de fosfolipide repertoires van een weefseltype, heeft onthuld in het begrijpen van de witte-neus syndroom schimmel pathogeen55,56. Voorbereiding van weefsel wordt voorgesteld om te worden bevroren onmiddellijk na dissectie.

Weefsel archieven voor Bat1K
Bat1K streeft naar het handhaven van een weefselbank van elke individuele vleermuis die wordt gebruikt voor het genereren van de Genomes. Momenteel worden deze weefselbanken en de relevante fenotypische en ecologische gegevens die per individu worden verzameld, bijgehouden in de laboratoria/museumcollecties van de Bat1K bijdragende leden. Naarmate het project vordert, zal Bat1K weefsel collecties en relevante databases centraliseren en onderhouden via netwerk opslagplaatsen zoals het wereldwijde netwerk van genoom biodiversiteit < http://www.ggbn.org/ggbn_portal/>.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo en Fanny Fernández Melo voor het maken van weefsel collectie in Peru mogelijk. We danken ook alle leden van Grupo Jaragua en Yolanda León voor het maken van weefsel inzameling in de Dominicaanse Republiek mogelijk, evenals aan Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, en iedereen bij La Selva Biological Research Station in Costa Rica, voor het maken bemonstering mogelijk. We bedanken Ella latten kamp & Lutz Wiegrebe voor toegang en monster collectie van vleugel stoten van Phyllostomus verkleuren vleermuizen voor celkweek generatie. Phyllostomus verkleurde vleermuizen zijn ontstaan uit een broed kolonie in het departement biologie II van de Ludwig-Maximilians-Universiteit in München. Goedkeuring voor het houden en fokken van de vleermuizen werd afgegeven door het district Veterinair Bureau van München. LMD, SJR, KTJD en LRY werden gefinancierd door NSF-DEB 1442142. LMD werd gefinancierd door NSF-DEB 1838273. LRY werd gefinancierd door de NSF-PRFB 1812035. SCV en PD werden gefinancierd door een Max Planck Research Group Award, en een Human Frontiers Science Program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016). SJR, JHTP, en KTJD werden gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) toegekend aan SJR, ECT werd gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad Grant (ERC-2012-StG311000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
  2. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
  3. Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
  4. Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
  5. Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
  6. Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
  7. Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
  8. Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen? Science. 323 (5911), 227 (2009).
  9. Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
  10. Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
  11. Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
  12. Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
  13. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  14. Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
  15. Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
  16. Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
  17. Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
  18. Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
  19. Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
  20. Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
  21. Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
  22. Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
  23. Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
  24. Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
  26. Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
  27. Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
  28. Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  29. Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
  30. Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
  31. Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
  32. Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
  33. Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
  34. Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
  35. Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
  36. Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
  37. Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , Museum of Texas Tech University. (2003).
  38. Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
  39. Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
  40. Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
  41. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
  42. Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
  43. Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
  44. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  45. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
  46. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Schaumburg, IL. (2013).
  47. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  48. Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  49. Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
  50. Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
  51. Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
  52. Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
  53. Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
  54. Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity? PeerJ. 6, e4174 (2018).
  55. Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
  56. Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).

Tags

Biologie uitgave 152 vleermuizen Genomics transcriptomics weefsel bemonstering weefsel conservering dissectie celcultuur
Weefsel collectie van vleermuizen voor-omics analyses en primaire celcultuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. … More

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T. J., Potter, J. H. T., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter