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Biology

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59505
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 4, 5, *3,6, *2,7
1Department of Geology & Geophysics, Yale University, 2Department of Ecology & Evolution, Stony Brook University, 3Neurogenetics of Vocal Communication, Max Planck Institute for Psycholinguistics, 4School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London, 5School of Biology & Environmental Science, University College Dublin, 6Donders Institute for Brain, Cognition and Behavior, 7Consortium for Inter-Disciplinary Environmental Research, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

Dies ist ein Protokoll für die optimale Gewebevorbereitung für genomische, transkriptomische und proteomische Analysen von Fledermäusen, die in freier Wildbahn gefangen sind. Es enthält Protokolle für Fledermaus-Capture und -Sektion, Gewebekonservierung, und Zellkultivierung von Fledermausgewebe.

Abstract

Mit dem Fortschritt der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien ermöglichen standardisierte Methoden zur qualitativ hochwertigen Gewebeerfassung und -konservierung die Ausweitung dieser Methoden auf Nichtmodellorganismen. Eine Reihe von Protokollen zur Optimierung der Gewebesammlung von Fledermäusen wurde für eine Reihe von Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze entwickelt. Hier sind Protokolle für die Erfassung von Fledermäusen, gewünschte Demografie für jede Fledermaus gesammelt werden, und optimierte Methoden, um Stress auf eine Fledermaus während der Gewebesammlung zu minimieren. Konkret beschrieben werden Methoden zur Sammlung und Behandlung von Gewebe, um (i) DNA für genomische Analysen mit hohem Molekulargewicht zu erhalten, (ii) RNA für gewebespezifische Transkriptome und (iii) Proteine für proteomische Analysen. Schließlich wird auch eine Methode beschrieben, um tödliche Probenahmen zu vermeiden, indem aus Flügelclips lebensfähige primäre Zellkulturen erstellt werden. Eine zentrale Motivation dieser Methoden ist es, die Menge der potenziellen molekularen und morphologischen Daten für jede Fledermaus zu maximieren und schlagen optimale Möglichkeiten, um Gewebe zu erhalten, so dass sie ihren Wert behalten, wie neue Methoden in der Zukunft entwickeln. Diese Standardisierung ist besonders wichtig geworden, da Initiativen zur Sequenzierung von chromosomenfreien Genomen von Arten auf der ganzen Welt entstanden sind, in denen mehrere wissenschaftliche Parteien die Sequenzierung verschiedener taxonomischer Gruppen. Die hier beschriebenen Protokolle definieren die idealen Methoden zur Gewebesammlung und Gewebeerhaltung für Bat1K, das Konsortium, das die Genome jeder Fledermausart sequenziert.

Introduction

HTS-Methoden (High-Throughput-Sequenzierung) haben ihre Effizienz schnell weiterentwickelt und die Kosten gesenkt, und es ist nun möglich, diese Ansätze auf Hunderte oder Tausende von Proben zu skalieren. Erkenntnisse, die durch die Anwendung dieser Technologien gewonnen werden, haben enorme Auswirkungen auf mehrere wissenschaftliche Disziplinen, von der Biomedizin bis zur Evolution und Ökologie1,2,3. Dennoch setzen viele HTS-Anwendungen entscheidend auf hochwertige Nukleinsäuren aus einer lebenden Quelle. Diese Einschränkung dürfte mit der Entwicklung der Sequenzierung der dritten Generation auf der Grundlage lang gelesener Moleküle4zunehmend problematisch werden. Aus diesen Gründen ist es notwendig, die Bemühungen auf die Festlegung bewährter Verfahren für die Sammlung von probenfrischen Gewebeproben von Wildorganismen außerhalb des Labors zu konzentrieren, was den Nutzen von Material maximiert und die Anzahl der Personen verringert, die ruhig.

Bat1K ist ein internationales Konsortium von Wissenschaftlern mit einer laufenden Initiative, um das Genom jeder Fledermausart auf Chromosomenebene Assembly5zu sequenzieren. Fledermäuse stellen 20% der Säugetiervielfalt dar und haben außergewöhnliche Anpassungen, die Auswirkungen auf das Verständnis von Alterung, Krankheitsökologie, Sinnesbiologie und Stoffwechsel haben5,6. Viele Fledermäuse sind auch bedroht oder gefährdet durch menschliche Ausbeutung7 oder sind schnell rückläufig aufgrund von Krankheitserregern8,9, und Genom-Ebene Sequenzierung ist von großer Bedeutung für die Erhaltung dieser Arten. Obwohl Bat1K derzeit darauf abzielt, die Genome aller Fledermausarten zu sequenzieren, bleibt die Standardisierung der Sammlung von Gewebeproben für eine hochwertige genomische Sequenzierung eine zentrale Herausforderung in der Gemeinschaft der Organismusbiologen. Neben genomischen Daten erfordert das funktionelle Verständnis der Vielfalt der Fledermausanpassungen gewebespezifische Transkriptom- und Proteinanalysen, die oft separate Sammelprotokolle erfordern. Darüber hinaus ist die Kommunikation von Best Practices, wie bei allen taxonomischen Gruppen, während eine optimale Gewebesammlung und -konservierung für die Erstellung von Daten höchster Qualität für -omics-Analysen unerlässlich ist, aufgrund sich schnell ändernder Technologien und mehrere Forschungsteams, die unabhängig arbeiten.

Die Notwendigkeit, Best Practices für Fledermaus-Omics Forschung zu übernehmen ist besonders dringend, da viele Fledermausarten selten oder bedroht sind. Im Gegensatz zu anderen kleinen Säugetieren wie Nagetiere und Spitzmäuse, Fledermäuse sind langlebig, aufgrund außergewöhnlicher DNA-Reparatur-Mechanismen10 und langsame Fortpflanzung11, mit den meisten Arten, die Geburt nur eine oder (in einigen Fällen) zwei junge pro Jahr. Aus diesen Gründen, Fledermauspopulationen können langsam von Störungen zu erholen, und das Sammeln vieler Personen aus der Wildnis ist weder ratsam noch machbar. Mit anderen Worten, Protokolle müssen optimiert werden, um die maximale Datenmenge für eine einzelne Probe zu erhalten, wodurch die Notwendigkeit verringert wird, unnötigerweise Stichprobenzusazierarbeiten zu replizieren.

Dabei konzentriert sich dieses Protokoll speziell auf standardisierte Methoden zur Sammlung und Probenahme von Fledermausgewebe für genomische und transkriptomische Sequenzierungen und Proteinanalysen. Seine oberste Priorität ist es, sicherzustellen, dass Fledermausgewebe ethisch und verantwortungsvoll gesammelt werden, von der Genehmigung sverfahren für die Sammlung, Export von Geweben, die Minimierung von Stress auf das Tier, und langfristige Lagerungsbedingungen. Aufwendige Sezierungen wurden mit dem Ziel entwickelt, die Nützlichkeit der verschiedenen gesammelten Materialien zukunftssicher zu machen. Dieses Manuskript bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, um Fledermäuse auf humane Weise zu sammeln, die darauf abzielt, die Auswirkungen auf die Populationen zu minimieren und den wissenschaftlichen Wert zu maximieren. Während der Schwerpunkt dieses Protokolls ist speziell für den Einsatz bei Fledermäusen, viele der Schritte sind relevant für andere Wirbeltiere Taxa, vor allem Säugetiere.

Übersicht über die Gewebesammlung
Das Verfahren für die Gewebeentnahme, einschließlich der Lagertemperatur und der Wahl des Konservierungsmittels, wird durch die Art der geplanten nachgelagerten Analysen bestimmt. Es wird jedoch dringend empfohlen, dass, wenn möglich, Gewebe unter einer Reihe von Methoden gesammelt wird, um seinen zukünftigen Nutzen zu maximieren, auch wenn keine spezifische Analyse geplant ist. Im Allgemeinen wird Gewebe gesammelt und für nachfolgende Analysen von Nukleinsäuren (DNA und RNA) oder Proteinen konserviert. Für jede dieser Anwendungen kann Gewebe durch direktes Einfrieren in flüssigem Stickstoff (LN2) optimal konserviert werden. Ein sofortiges Eintauchen in LN2 ist jedoch nicht immer im Feld möglich. Mit fortschreitender Technologie werden Ressourcen wie spezialisierte Durchstechflaschen zur Speicherung von DNA und RNA bei Umgebungstemperaturen immer leichter verfügbar. Obwohl wir nicht alle derartigen Materialien in diesem Protokoll validiert haben, ermutigen wir andere Forscher, die Leistung neuer Materialien im Vergleich zu dem, was wir hier präsentieren, vergleichsweise zu analysieren. Wir bieten Methoden zur optimalen Gewebekonservierung für unterschiedliche Anwendungen in Situationen, in denen LN2 nicht zugänglich ist, z. B. wenn LN2-Transporte aufgrund des Standortzugangs über kleinfeines Flugzeug im Amazonas gebietnicht möglich sind. Darüber hinaus bieten wir eine Methode zum Sammeln von Gewebe, aus dem lebende Zellen angebaut und vermehrt werden können. Im Folgenden beschreiben wir die wichtigsten Überlegungen zur Materialsammlung für jeden dieser Zwecke und eine Übersicht über die Sammelmethoden finden Sie in Tabelle 1.

Gewebe für DNA
Für alle gesammelten Erntegewebe wird das Speichermedium bestimmen, ob es für die Standard- oder High-Molekular-Gewicht-DNA-Extraktion (HMW) verwendet werden kann. HMW ist für die lang gelesene Sequenzierung erforderlich und derzeit erforderlich, um Genomassemblys auf Chromosomenebene oder ein "Platinstandard"-Genom zu erzeugen. DNA mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) kann aus Flash-Frozen, AllProtect (daher als "Gewebestabilisierungslösung" bezeichnet) oder sogar RNAlater (daher "RNA-Stabilisierungslösung") konservierten Proben extrahiert werden (obwohl Blitz-Gefrierproben optimal bleiben ). DNA, die durch Standardlabormethoden isoliert wird (z. B. Kieselgel-Membran-Spin-Säulen, Phenol-Chlor-Form), kann immer noch DNA-Fragmente von bis zu 20 Kilobasen (kb) ergeben. Daher kann, sofern eine ausreichende Ausbeute vorhanden ist, diese Form der isolierten DNA für die Vorbereitung der Bibliotheksvorbereitung mit ein einsetzender Insert-Größe verwendet werden, bei der die Insert-Größe oft 500 Base-Pairs (bp) beträgt und kurze Sequenzlesungen von 100 bp12erzeugt werden. Diese DNA ist besonders nützlich für die "Resequenzierung" von Projekten oder Studien, bei denen keine Chromosomendaten in voller Länge benötigt werden. HMW DNA (10-150 kb) ist anspruchsvoller und kann nur zuverlässig mit Gewebe gewonnen werden, das in LN2 nach der Ernte schnell eingefroren und bis zur Extraktion bei einem Maximum von -80 °C gehalten wurde.

Niedriges Molekulargewicht oder fragmentierte DNA ist oft ausreichend für gezielte Ansätze, einschließlich Genverstärkung über PCR und kurzgelesene Sequenzierung13. PCR-basierte Untersuchungen mit LMW-DNA, die nur auf ein oder wenige Gene abzielen, waren sehr informativ, um die Anpassung und die molekulare Evolution der Fledermaus-Sensorik zu verstehen6,14, Physiologie15, Phylogenetik 5,16, und Konservierung17,18. Erfolgreiche gezielte Sequenzrückeroberung von niedermolekularem Gewicht und fragmentierter DNA wurde auch für zahlreiche Wirbeltiergruppen, einschließlich Fledermäuse19,nachgewiesen. Diese Methoden sind oft kostengünstig und minimal invasiv für die Fledermaus, wie Fäkalienproben und nicht-tödliche Gewebeprobenahme über bukkale Tupfer oder Flügelbiopsie Stempel sind auch häufige Möglichkeiten, um DNA für Niedrigmolekulargewicht Analysen zu erhalten20, 21.

Die Qualität hängt jedoch stark von der Art des Mediums ab, in dem die Probe gespeichert ist22. Nach systematischen und quantitativen Vergleichen von bukkalen Tupfern und Biopsieschlägen haben Flügelbiopsie-Punchs gezeigt, dass sie konstant höhere DNA-Werte ergeben und während der Sammlung weniger belastend für die Fledermaus während der Sammlung22waren. Diese Vergleiche zeigten auch, dass die besten Ergebnisse erzielt wurden, wenn der Flügelschlag in Indikator-Kieselsäure (d. h. einer Art Von-Deiccant aus Kieselgelperlen, die Farbe ändert, wenn Feuchtigkeit beobachtet wird) und nicht in anderen gängigen Speichermedien wie Ethanol oder DMSO22; andere Speichermedien einschließlich Gewebestabilisierungslösung wurden jedoch nicht untersucht. Flügelstanzen können auch verwendet werden, um Fibroblastenzellen in Kultur zu züchten, wie in Kacprzyk et al.23 und wie unten beschrieben (siehe Abschnitt 6). Für diese Methoden sollte der Flügel oder Uropatagium sanft verlängert werden, und ein sauberer Biopsie-Punch, typischerweise 3 mm Durchmesser, sollte verwendet werden, um die Probe zu erhalten. Dieser Ansatz scheint keine bleibenden Schäden zu verursachen, mit Narben Heilung über innerhalb von Wochen in den meisten Fällen24.

HMW DNA (10-150 kb) ist anspruchsvoller und wird derzeit nur zuverlässig mit Gewebe gewonnen, das in LN2 nach der Ernte schnell eingefroren und bis zur Extraktion bei einem Maximum von -80 °C gehalten wurde. HMW DNA (10-150 kb) ist entscheidend für die lang gelesene DNA-Sequenzierung und damit für die De-Novo-Genom-Montage. Während die meisten kommerziellen Kits verwendet werden können, um einige Standard-HMW-DNA zu isolieren, erfüllen die resultierenden Molekülgrößen oft nicht die Anforderungen von Sequenzierungstechnologien der dritten Generation [z. B. solche, die von Unternehmen wie Pacific Biosciences (PacBio) ins Leben gerufen wurden, Oxford Nanopore Technologies, und 10x Genomics, oder durch Montagemethoden von Bionano Genomics oder Dovetail Genomics]. Daher gibt es eine neue Nachfrage nach "ultra HMW" DNA (>150 kb). Bei der Beschaffung von Ultra-HMW-DNA von Fledermäusen, frische Proben von Leber, Gehirn, oder Muskel sind alle geeignet, aber diese müssen sofort flashgefroren in LN2 ohne Speicherpuffer oder Kryoprotektor. Eine vollständige Beschreibung dieser Schritte geht über den Rahmen dieses Papiers hinaus, ist aber an anderer Stelle verfügbar25.

Gewebe für RNA
RNA ist ein einsträngiges Molekül, das weniger stabil ist als DNA. Obwohl es viele Formen von RNA gibt, konzentrieren sich -omics-Analysen in der Regel auf mRNA (Messenger RNA) und kleine RNAs (z. B. microRNAs). Nach der Transkription wird die mRNA zu einem ausgereiften Transkript gespleißt, das keine Introns enthält und den kodierenden Teil von Genen/Genomen darstellt. Kodierungsgene machen einen winzigen Bruchteil der Genomgröße aus (1%-2%), was die Ausrichtung auf mRNA zu einem kostengünstigen Mittel zur Gewinnung von Sequenzdaten für Gene macht. MicroRNAs sind eine Klasse von RNAs, die den Prozess der Übersetzung von mRNA in Proteine regulieren und daher wichtige regulatorische Effektoren sind. RNA-Transkripte können einzeln oder häufiger für -omics-Analysen26,27,28,29,30, als Teil eines Transkriptoms sequenziert werden; d. h. die Summe aller RNA-Transkripte, die in einer bestimmten Probe vorhanden sind.

Die Sequenzierung kann nach mehreren Methoden (d.h. über kurzgelesene RNA-Seq oder lang gelesene ganze Isoform Seq) durchgeführt werden, was eine Analyse sowohl der RNA-Überfluss als auch der isoformen Verwendung ermöglicht. Da die Menge und Vielfalt der mRNA-Transkripte zwischen Zellen und Geweben variieren, ermöglicht die RNA-Sequenzierung das Studium und den Vergleich der Genexpression und -regulierung zwischen den Proben. Das Interesse an der Sequenzierung kleiner RNAs und der gesamten isoformen Sequenzierung wächst, da diese Methoden zunehmend biologisch informativer werden. Die Vorbereitung von Gewebeproben zur Sequenzierung verschiedener RNA-Klassen kann auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie in diesem Manuskript dargestellt, wobei nur die nachfolgenden Extraktionsmethoden31,32voneinander abweichen. Da Transkriptome eine hohe Abdeckung des Proteinkodierungsgenoms bieten, kann der zusammengesetzte Datensatz bei der Genommontage und -anmerkung nützlich sein, was die Sammlung von RNA-Seq-Daten über eine Reihe verschiedener Gewebe zu einem wichtigen Bestandteil der Bat1K-Initiative.

Im Gegensatz zur DNA ist rna chemisch instabil und auch zielgerichtet von RNase-Enzymen, die in Gewebelysaten als Abwehrstrategie gegen RNA-basierte Viren allgegenwärtig sind. Aus diesen Gründen beginnt die RNA-Fraktion in Zellen und Geweben kurz nach dem Zeitpunkt der Probenahme und/oder Euthanasie zu abbauen. Die Erhaltung der RNA erfordert daher Schritte, um ihren Abbau zu verhindern. Dazu gehört in der Regel die Konservierung von frisch gesammeltem Gewebe bei 4 °C in einem stabilisierenden Mittel wie einer RNA-Stabilisierungslösung zur Inaktivierung der in Geweben natürlich endenden RNasen, gefolgt vom Einfrieren für eine längerfristige Lagerung. Als bevorzugte Alternative kann Gewebe in LN2 eingefroren werden; Obwohl, wie oben erwähnt, der Transport von LN2 ins Feld und die Aufrechterhaltung von Konzentrationen, um das Auftauen des Gewebes zu verhindern, logistisch schwierig sein kann.

Gewebe für Protein
Proteinzusammensetzung und relative Häufigkeit variieren zwischen Zellen und Geweben in ähnlicher Weise wie das, was für RNA diskutiert wurde; Proteine sind jedoch im Durchschnitt stabiler als RNA. Die Proteinidentifikation mit Proteomik entspricht in der Regel einem Bruchteil und nicht der gesamten Proteinsequenz, kann aber Informationen über die Expression über Gewebe liefern und die vorhandenen Krankheitserreger charakterisieren. Da viele Proteinsequenzen bei Säugetieren konserviert werden, können Fledermausproben für Proteomik leicht mit konservierten menschlichen Proteinen kontaminiert werden, was sterile Protokolle (z. B. Handschuhe, Zangen) während der Entnahme erfordert. Während Das Flash-Freezing in LN2 der beste Weg ist, um den Abbau von Proteinen zu verhindern, sind die Verwendung von Trockeneis, -20 °C Gefrierschränken und sogar Eis geeignet, wenn es keine anderen Mittel gibt. Mit steigenden Temperaturen steigt auch das Risiko eines differentialen Proteinabbaus. Stabilisierungsmittel wie Gewebestabilisierungslösung sind wirksam bei der Erhaltung der Proteinfraktion von Geweben bei Raumtemperatur und eignen sich für die kurzfristige Konservierung (bis zu einer Woche), wenn das Flash-Freezing nicht lebensfähig ist.

Das enzymatische Profil eines gegebenen Gewebes beeinflusst direkt die Konservierung von Protein enden. Gewebe mit geringer enzymatischer Aktivität wie Muskel können Proteinprofile auch bei höheren Temperaturen in einem Haushalts-Gefrierschrank erhalten. Im Gegensatz dazu ist Lebergewebe enzymatisch reaktiv, und seine Proteine haben höhere Erniedrigungswahrscheinlichkeiten während der Zubereitung. Die wachsende Anzahl von Protokollen zur Gewinnung von humanen proteomischen Profilen aus formal-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Proben legt nahe, dass die Paraformaldehyd-Fixierung von Geweben eine kostengünstige Proteinkonservierung beim Einfrieren bei der Entnahme nicht machbar33,34. Obwohl in hohem Maße abhängig von Konservierungszeit und Zustand, Proteine wurden durch Immunhistochemie aus formalinfixierten, Ethanol-konservierten Fledermausproben35identifiziert. Dieser Ansatz ist nicht skalierbar für probenfreundliche Proben auf proteomischer Ebene, hebt aber das Potenzial hervor, dass formal fixiertes Fledermausgewebe Proteinprofile liefert, wenn das Flash-Freezing nicht verfügbar ist und andere Stabilisierende zu teuer sind.

Gewebe für die Zellkultur
Probenahmegewebe und Flash-Freezing bietet eine begrenzte Menge an Material zu verwenden, und sobald das Material verwendet wird, ist es nicht mehr verfügbar. Alternativ bieten Zellkulturen lebende Zellen, die sofort für zukünftige Studien verwendet oder konserviert werden können. Kulturen erleichtern auch die Expansion von Zellen, um die Ausbeute zu erhöhen, wenn Gewebeproben klein sind. Sie ist besonders nützlich in Fällen, in denen die Gewebesammlung begrenzt ist, wie z. B. Experimente mit seltenen Arten, bei denen nicht-tödliche Probenahmen unerlässlich sind und daher weitreichende Auswirkungen auf die Erhaltung haben. Beschrieben ist ein Protokoll, in dem Zellkultur durch nicht-tödliche Probenahme von Flügelmembrangewebe möglich ist, aber Kultivierung ist mit mehreren Gewebetypenmöglich 36,37. Das hier bereitgestellte Protokoll wählt für anhimante Zellen aus. Die Kombination von Quellgewebe und Wachstumsmedien macht dieses Protokoll geeignet, um Fibroblasten auszuwählen und anzubauen, aber auf Wunsch können alternative Protokolle verwendet werden, um für andere Zelltypen auszuwählen. Im Rahmen des Bat1K-Projekts wird vorausgesagt, dass bei seltenen und bedrohten Arten die nicht-tödliche Probenahme von Flügelmembranen und die Erweiterung von Proben über die Kultivierung unerlässlich ist, um das Volumen der DNA zu erzeugen, das für die verwendeten verschiedenen Technologien benötigt wird5 .

Fledermaus-Capture
Alle Menschen, die mit Fledermäusen umgehen, sollten von einem Fledermaus-kompetenten Forscher trainiert und gegen Tollwut mit einer Reihe von Pre-Exposition-Injektionen geimpft werden. Wenn gebissen, ist eine weitere Reihe von Post-Exposition-Injektionen noch notwendig. Zu den Standardmethoden für die Aufnahme von Fledermäusen gehören Nebelnetze (Abbildung 1) und Harfenfallen (Abbildung 2). Nebelnetze werden am häufigsten verwendet und sind ideal für Bereiche mit geringer bis mäßiger Aktivität, da sie die größte Sorgfalt für die Minimierung von Fledermausnot erfordern. Kleine Fledermäuse sind besonders anfällig und können an Stress sterben, wenn sie nicht schnell gepflegt werden. Häufige Netzinspektionen minimieren Fledermausverletzungen und Sterblichkeit sowie Schäden am Nebelnetz. Dieses Detail ist wichtig, weil die richtige Gewebesammlung erfordert, dass das Gewebe frisch ist, und unsachgemäße Aufmerksamkeit auf die Nebelnetze bei Fledermäusen kann zu unnötiger Sterblichkeit oder vorzeitiger Sterblichkeit führen, bevor der Forscher Proben richtig verarbeiten kann. Da mehrere Fledermäuse in einer Harfenfalle mit minimaler Not ruhen können, ist dieser Ansatz ideal für Bereiche mit hoher Fledermausaktivität, wie in der Nähe einer Höhle oder großer Roost. Detaillierte Anweisungen für die richtige Fledermauserfassung und Datenverarbeitung für die Sammlung von morphologischen und demografischen Informationen sind in den ergänzenden Methoden verfügbar.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stony Brook University (Protokoll #2013-2034) genehmigt.

1. Euthanasie

  1. Befeuchten Sie eine Baumwollkugel mit einem Isofluran-Anästhetikum oder einem anderen verfügbaren Anästhetikum.
  2. Legen Sie die Baumwollkugel in eine wiederverschließbare, luftdichte Plastiktüte. Die Tasche sollte groß genug sein, um eine Tasche in einer Stofffledermaustasche bequem zu halten.
  3. Nach einigen Minuten, in denen die Tasche mit Anästhetikum durchdringen kann, legen Sie eine Fledermaustasche mit der Fledermaus in die Plastiktüte.
  4. Warten Sie einige Minuten, bis die Fledermaus eingeschläfert wird. Fledermäuse 20 g oder weniger Gewicht benötigen etwa 5–10 min. Fledermäuse größer als dies kann bis zu 20 min. Beachten Sie, dass die Länge der Zeit kann auch von der Durchlässigkeit der Fledermaustasche abhängen. Es wird empfohlen, das dünnste mögliche Stoffmaterial zu verwenden, um die Diffusion des Anästhetikums zu maximieren.
  5. Überprüfen Sie auf Atem und Herzschlag, um sicherzustellen, dass die Fledermaus eingeschläfert wurde, bevor die Sezierung beginnt.

2. Dissektionsvorbereitung

  1. Halten Sie alle Instrumente zwischen den Sezierungen sauber, mit dem folgenden Protokoll.
  2. Waschinstrumente mit Wasser und Geschirrseife waschen. Wischen Sie sie mit 10% Bleichmittel ab, weg vom Sezierbereich, da Bleichmittel Nukleinsäuren abbauen.
  3. Mit 70% Ethanol abwischen.
  4. Mit RNAse-Dekontaminationsreagenz abwischen.
  5. Wiederholen Sie diesen Abschnitt nach jeder Zerlegung.

3. Vorbereitung der Fläschchen für Gewebeproben

  1. Für RNA:
    1. Bereiten Sie alle Durchstechflaschen vor, bevor Sie mit den Sezierungen beginnen, um Verzögerungen zu vermeiden.
    2. Legen Sie die Anzahl der Fläschchen für jedes Exemplar beiseite. Beschriften Sie jedes Rohr mit dem gesammelten Gewebetyp sowie Standard-Probenidentifikationsinformationen. Füllen Sie die Durchstechflaschen 50% voll mit RNA-Stabilisierungslösung und kühlen Sie idealerweise auf 4 °C.
    3. Achten Sie darauf, die Durchstechflaschen nicht vollständig mit RNA-Stabilisierungslösung zu füllen, da sonst die Röhre explodieren kann, wenn sie in LN2 platziert wird. Denken Sie bei der Entnahme von Gewebeproben daran, dass große Gewebeklumpen nicht vollständig von der RNA-Stabilisierungslösung durchdrungen werden. Schneiden Sie daher das Gewebe in kleinere Stücke von nicht mehr als 0,5 cm in einer Dimension und halten Sie ein Verhältnis von mindestens 10:1 Volumen für RNA-Stabilisierungslösung:Gewebe.
    4. Zumindest müssen sezierte Gewebe in RNA-stabilisierungslösung platziert werden, auch wenn der Zugang zu LN2 oder Kühllagern nicht verfügbar ist.
  2. Für DNA:
    HINWEIS:     Der Kern-DNA-Gehalt ist für fast alle Gewebe gleich; Daher kann die Probenahme flexibel sein. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass höhere Dichten von Mitochondrien im Muskelgewebe zu einem Verlust von Lesevorgängen für das Kerngenom 38 führenkönnen.
    1. Für DNA mit niedrigem Molekulargewicht, nehmen Sie eine oder mehrere Replikationen der Flügelmembran für die Lagerung in Kieselsäure, und/oder Muskel zur Speicherung in RNA-Stabilisierungslösung oder Gewebestabilisierungslösung.
    2. Für Ultra-HMW-DNA, Flash-Freeze in LN2 ohne Speicherreagenz, dann in die Langzeitlagerung bei -80 °C oder kälter übertragen. Aus der Schädelsektion ist Hirngewebe der am besten geeignete Gewebetyp für die Abrufung von Ultra-HMW-DNA39, während aus postkraniellen Dissektionen Leber oder Muskel besser geeignet sind40.
    3. Für die Schädelsektion verwenden Sie 5 ml-Durchstechflaschen (im Gegensatz zu den Standard 2 ml-Durchstechflaschen) der RNA-Stabilisierungslösung für einige Gewebe. Alle Fläschchen sollten kryogen sein. Halten Sie die Fläschchen auf Eis, während Sie sezieren.

4. Cranial Dissections für RNA

  1. Unmittelbar nach der Euthanasie enthaupten Sie die Probe mit einer großen Schere oder einem Knochenschneider (Abbildung 3).
  2. Entfernen Sie die Augen mit Zangen mit starker Kraft, um den Sehnerv zu lösen. Legen Sie die Augen in 2 ml Durchstechflasche mit RNA-stabilisierungslösung.
  3. Mit Ihrem Werkzeug der Wahl, Haut den Schädel aus Haaren, Faszien, und SchädelMuskeln, einschließlich der Haut auf der Nase. Achten Sie darauf, das vordere Ende der Nase nicht zu brechen.
  4. Mit der Schere, machen Sie einen sagittalen Schnitt auf den ventralen Teil(Abbildung 3) des Schädels beginnend am Hals, wobei darauf zu achten ist, das Gehirn nicht zu beschädigen.
  5. Ziehen Sie mit Zangen beide Seiten des Schädels vorsichtig zurück, bis er sich aufgerissen hat und das Gehirn freigelegt ist.
  6. Am kaudalen Ende des Schädels sollte die Cochleae nun seitlich auf jeder Seite des Kopfes sichtbar sein. Sie sind kleine, kugelförmige Knochen auf der linken und rechten Seite, nur rostral bis zum Hals und hinter den MasseerMuskeln. Mit Zangen ziehen Sie die Cochleae vorsichtig und legen Sie sie in eine 2 ml Durchstechflasche mit RNA-Stabilisierungslösung.
  7. Kratzen Sie das Gehirn (das sehr weich sein wird) vorsichtig mit Zangen. Die olfaktorische Glühbirne wird sichtbar, sitzend am ventralen Teil des Inneren des Schädels. Versuchen Sie, die Olfaktor-Lampe anhängen zu halten.
  8. Wenn die Riechbirne noch nicht entfernt wurde, kratzen Sie das Gewebe vorsichtig weg, und die Cribriform-Platte wird sichtbar. Dies ist ein kritischer Knochen, um den Forscher orientiert zu halten. Es kann als die vordere Region des Schädels mit mehreren Foramen und dem Punkt identifiziert werden, an dem zwei Rillen, an denen die Riechbirne ruht.
  9. Wenn möglich, halten Sie die Gehirnform intakt und legen Sie sie sofort auf Trockeneis, um die Form zu halten, oder in einer 5 ml Durchstechflasche mit RNA-Stabilisierungslösung. Wenn die Immunhistochemie auf dem Gehirn durchgeführt werden soll, legen Sie 4% Paraformaldehyd, sofern verfügbar.
  10. Machen Sie zwei Einschnitte, wo der obere und untere Kiefer verbinden, und entfernen Sie den Unterkiefer.
  11. Sobald der Unterkiefer entfernt wurde, entfernen Sie die Tribüne (Oberkiefer) aus dem verbleibenden Teil des Schädels. Stellen Sie sicher, dass der Kiefer die Cribriform-Platte enthält.
  12. Die Nase in rnastabilisierende Lösung geben und über Nacht bei 4 °C lagern. Da es sich um ein dichtes Gewebe handelt, benötigt es Zeit, um rnastabilisierende Lösungen zu ermöglichen, das gesamte Gewebe zu durchdringen.
  13. Legen Sie die Nasendurchstechflasche in LN2 nach dem nächtlichen Einweichen in RNA-Stabilisierungslösung.
  14. Vom unteren Unterkiefer die Zunge mit der Schere schneiden und später in eine 2 ml-Durchstechflasche mit RNA legen.
  15. Dieses Protokoll verliert den größten Teil des Schädels. Zähne, insbesondere aus dem Unterkiefer, können zurückgewonnen werden und können für die Artendiagnostik nützlich sein. Knochengewebe kann in 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gelagert werden.

5. Postkranielle Dissektionen für RNA

  1. Verwenden Sie ein Skalpell, um durch die Bauchhöhle zu durchbohren, so dass ein Längsschnitt bis zu den Rippen (Abbildung 3). Dadurch verfällt der Skelettrahmen. Wenn der Knochen erhalten werden soll, sezieren Sie vorsichtig von der Haut im Muskel und lagern Sie in 1x PBS, nachdem die Weichteilsektion abgeschlossen ist.
  2. Entfernen Sie die Haut, um den Brustmuskel zu offenbaren, nehmen Sie mindestens zwei Proben von Muskel, eine für RNA-Stabilisierungslösung und eine, um für HMW-DNA eingefroren zu bleiben, und legen Sie sofort in eine Durchstechflasche, um in LN2 zu setzen.
  3. Schneiden Sie das Brustbein durch und ziehen Sie die Rippen weg, um Proben aus der Lunge zu sammeln.
  4. Sammeln Sie das Herz, das ganz eingenommen werden kann, aber in Hälften geschnitten werden sollte, so dass die RNA-Stabilisierungslösung gründlich einweicht.
  5. Nehmen Sie Proben aus der Leber. Nehmen Sie mindestens zwei Proben von Leber, eine für HMW-DNA eingefroren bleiben, platzierung sofort in einer leeren Durchstechflasche in LN2 zu setzen. Die Leber ist sehr enzymatisch, und es ist wichtig, die Proben klein genug zu machen, damit die RNA-Stabilisierungslösung vollständig einweichen kann.
  6. Der Leberkanal, der funktioniert, um Galle aus der Leber zu entleeren, verbindet die Leber mit Bauchspeicheldrüse und Dünndarm. Dieses Gefäß ist leicht zu erkennen, indem es den minderwertigen/hinteren Teil der Leber untersucht und das Gefäß nachträvoll aufspüren kann. Der Kanal ist oft auch eine grünliche Farbe. Folgen Sie dem Leberkanal, um die Bauchspeicheldrüse und Gallenblase zu finden und diese separat zu sammeln. In die jeweiligen Durchstechflaschen der RNA-stabilisierungslösung geben.
  7. Sammeln Sie den Magen und, neben ihm, an seiner Basis und erscheint als ein anderer Farbton von Lila, ist die federartige Milz. Die Bauchspeicheldrüse sollte hier auch als weiße Struktur sichtbar sein (Abbildung 3). In die jeweiligen Durchstechflaschen der RNA-stabilisierungslösung geben.
  8. Sammeln Sie kleine Proben des Kleinen und Dickdarms. In die jeweiligen Durchstechflaschen der RNA-stabilisierungslösung geben. Der Darm kann auch auf Endoparasiten untersucht werden. Wenn ein Parasitologe vor Ort ist, kann eine Untersuchung auf Parasiten durchgeführt werden. Wenn dies zu einem späteren Zeitpunkt geschehen soll, kann der gesamte Darm in einer 5 ml kryogenen Durchstechflasche eingenommen werden.
  9. Nehmen Sie eine der Nieren und folgen Sie ihren Kanälen zur Blase. In die jeweiligen Durchstechflaschen der RNA-stabilisierungslösung geben.
  10. Verwenden Sie die andere Niere als Leitfaden, um die Hoden (wenn männlich) oder Gebärmutter und durch sie die Eierstöcke (wenn weiblich) zu finden. Sammeln Sie eine oder beide Gonaden, wenn möglich.
  11. Halten Sie Proben von verschiedenen Teilen der Haut des Flügels in separaten Durchstechflaschen (muskulös vs. nicht-muskulöser Teil).

6. Gewebekultur Sammlung und Vorbereitung

  1. Bereiten Sie das Wachstumsmedium für die Zellen vor, indem Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 20% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) und 50 g/ml Gentamycin bilden. Aliquots der Wachstumsmedien sollten jeden Tag des Protokolls neu gemacht werden.
  2. Nach der Entnahme müssen Flügelbiopsiesstanzen direkt in 1 ml kaltwüchsiges Medium in einem gut abgedichteten 1,5 ml Zentrifugenrohr platziert werden. Wickeln Sie das Rohr in Parafilm, um zu versiegeln.
  3. Rohre sollten dann in einer Polystyrol-Box mit Kühlelementen transportiert werden, um Proben bei 4 °C zu halten. Der Verkehr sollte beschleunigt werden; obwohl, gesunde Zellen können aus Schlägen hergestellt werden, die auf diese Weise für bis zu 6 Tage gelagert wurden, aber weniger optimal23.
  4. Einmal in die Gewebekultureinrichtung transportiert, kann das folgende Protokoll verwendet werden, um Zellkulturen zu erzeugen. Für den Rest des Protokolls41sollten sterile Standardtechniken verwendet werden.

7. Tag 1 Gewebekultur: Dissoziation des Gewebes

  1. Übertragen Sie den Inhalt des Rohres (Wachstumsmedium, das die Flügelmembranbiopsie enthält) in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr.
  2. Entfernen Sie vorsichtig das Wachstumsmedium. Waschen Sie die Biopsie zwei Mal vorsichtig mit 500 l sterilem PBS.
  3. Fügen Sie dem Röhrchen 500 l Kollagenase IV (1 mg/ml) hinzu. Dies wird zu einer Verdauung des Gewebes in einzelne Zellen führen.
  4. Über Nacht (maximal 16 h) bei 37 °C ohne Rührung inkubieren.

8. Tag 2 Gewebekultur: Plattzellen

  1. Frisches Wachstumsmedium aufstellen und auf 37 °C vorwärmen.
  2. Bereiten Sie eine 6 Brunnengewebe-Kulturplatte vor, indem Sie 2 ml frisches, vorgewärmtes Wachstumsmedium in jedem zu verwendenden Bohrstein (1 Brunnen pro 3 mm Flügelbiopsie) hinzufügen. Bewahren Sie diese Platte bis zum Bedarf in einem 37 °C und 5% CO2-Inkubator auf (Schritt 8.7).
  3. Entfernen Sie die 15 ml-Röhre, die die Zellen enthält, aus dem Inkubator und löschen Sie die Verdauungsreaktion, indem Sie 1 ml frisches Wachstumsmedium (vorgewärmt auf 37 °C) hinzufügen.
  4. Setzen Sie die Zellen wieder aus, indem Sie die Lösung sorgfältig mit einer P1000 Pipettenspitze trituieren, um eine Einzelzellsuspension zu erreichen.
  5. Drehen Sie die Zellen in einer Tischzentrifuge vorsichtig für 3 min bei 300 x gherunter.
    HINWEIS: Kleine Gewebestücke können entweder noch in suspension oder an der Wand des 15 ml-Rohres befestigt sein. Dies hat jedoch keine Auswirkungen auf die Zellsuspensionspräparation
  6. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie 80 %–90 % der Flüssigkeit mit einer P1000 Pipette vorsichtig entfernen.
    HINWEIS: Wenn noch sichtbar, entsorgen Sie das Stück Gewebe nicht und trituieren Sie es im nächsten Schritt (8.7).
  7. Setzen Sie das Pellet in 500 l vorgewärmtem Wachstumsmedium wieder auf, und trituieren Sie die Suspension vorsichtig, um sicherzustellen, dass das Pellet oder große Fragmente des Pellets nicht mehr sichtbar sind und die Zellen ausreichend suspendiert sind. Die Medien können aufgrund der Anwesenheit von Zellen trüb aussehen.
    HINWEIS: In diesem Stadium kann eine lebensfähige Zellzahl durchgeführt werden, um die Qualität der Zellsuspension und die Ausbeute der aus dem Flügelclip abgeleiteten Zellen zu beurteilen (weitere Details siehe Schritt 10.11).
  8. Das gesamte Volumen der Zellsuspension vorsichtig in einen einzigen Brunnen einer 6-Well-Platte zu zerlegen.
    HINWEIS: Führen Sie den obigen Schritt sofort aus, und lassen Sie nicht zu, dass sich Zellen nach Schritt 8.7 absetzen. Verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspension auf die Oberfläche des Brunnens in tropfenweiseer Weise sanft zu verteilen. Pipetten Sie nicht die gesamte Lösung in die Mitte des Brunnens, da dies dazu führen würde, dass die Zellen in der Mitte des Brunnens verklumpen.
    HINWEIS:Wenn das Gewebestück noch sichtbar ist, übertragen Sie es nicht gut in das Kulturgefäß.
  9. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig von Seite zu Seite und von vorne nach hinten 2x–3x, um Zellen zu helfen, sich über die Brunnenoberfläche in einer einzigen Schicht zu verteilen.
  10. Überprüfen Sie die plattierten Zellen unter dem Mikroskop, da es sich um einzelne Zellen handelt, die aufgeballt und schwebend, aber sehr dicht erscheinen.
  11. Legen Sie die Platte vorsichtig in einen Auf37 °C und 5%CO2voreingestellten Inkubator.
  12. Beobachten Sie nach 24 h die Zellen unter dem Mikroskop, um die Gesundheit der Kultur zu bestimmen. Zellen sollten nun an der Plattenoberfläche befestigt werden und abgeflacht erscheinen (Abbildung 4A). Verschiedene Zelltypen können in der Kultur sichtbar sein, wenn man durch das Mikroskop schaut.
  13. Es wird wahrscheinlich einige schwebende Zellen geben, die nicht angeschlossen sind. Ein Teil dieser Zellen ist tot. Wenn ein hoher Anteil schwebender Zellen im Brunnen sichtbar ist, sollten die Medien aktualisiert werden. In diesem Fall, sorgfältig aspirieren 50% des Mediums aus dem Brunnen und sanft 1 ml vorgewärmtes Wachstumsmedium zur Seite des Brunnens hinzufügen, um die Zellen nicht zu stören.
  14. Bewahren Sie die Zellen in einem Inkubator auf 37 °C und 5%CO2vor. Zellen sollten regelmäßig (aber nicht mehr als einmal am Tag) unter dem Mikroskop beobachtet werden, um den Bedarf an Medienerfrischung oder -spaltung zu bestimmen.
    HINWEIS: Wenn Zellen neu plattiert sind, teilen sie sich schnell und sollten daher jeden Tag überprüft werden. Nach einiger Zeit in der Kultur wird sich das Wachstum verlangsamen, und sie können alle 48-72 h überprüft werden.

9. Erfrischende Medien

  1. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop regelmäßig, um ihr Wachstum und ihre Qualität der Kultur zu beobachten. Überwachen Sie die Farbe der Medien als Indikator für ihre Qualität. Zellen sollten maximal 3 Tage im selben Medium bleiben oder bis eine Passierung erforderlich ist, je nachdem, was zuerst eintritt.
    1. Wenn Zellen schnell wachsen und die Medien erschöpfen, wird dies auch für das Auge sichtbar sein, da die Farbe der Medien von rot zu gelb wird.
  2. Bei Bedarf vorsichtig 50% des Mediums aus dem Brunnen absaugen und sanft etwa das gleiche Volumen des vorgewärmten Wachstumsmediums zur Seite des Brunnens hinzufügen, um die Zellen nicht zu stören.
  3. Bringen Sie die Zellen in den 37 °C und 5%CO2-Inkubator zurück.

10. Passaging-Zellen

  1. Passaging-Zellen beziehen sich darauf, eine bestehende Kultur zu übernehmen und sie in neue Brunnen aufzuteilen. Die Passierung sollte erfolgen, wenn die Zellen zu 80 % konfluent sind [d. h., wenn sie 80 % der Oberfläche des Brunnens einnehmen und nur 20 % des Kunststoffs noch als Lücken sichtbar sind (Abbildung 4B)].
  2. Sorgsam ansaugen und entsorgen Sie 90 % des Wachstumsmediums.
  3. Waschen Sie die Zellen sehr sanft, indem Sie 1 ml steriles PBS an die Wand des Brunnens legen, um die Zellen nicht zu stören. Schaukeln Sie die Platte sanft hin und her und seite-zur-Seite 2x–3x. Sorgsam ansaugen und entsorgen Sie alle PBS von der Platte.
  4. Wiederholen Sie Schritt 10.3, um die Zellen erneut zu waschen.
  5. Fügen Sie dem Brunnen vorsichtig 250 l Trypsin-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) hinzu und brüten Sie 1,5 Min. bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Trypsin-EDTA-Lösung die gesamte Oberfläche des Brunnens abdeckt, indem Sie die Platte sanft schaukeln.
  6. Die Reaktion durch Zugabe von 1 ml frischem vorgewärmten Wachstumsmedium zu löschen.
  7. Pipette nach oben und unten 5x, um die Zellen von der Oberfläche der Platte zu waschen und sicherzustellen, dass die Zellen in Suspension sind.
    HINWEIS: Die Lösung sollte durch das Vorhandensein der Zellen trüb werden.
  8. Legen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Rohr und drehen Sie die Zellen in einer Tischzentrifuge für 3 min bei 300 x g.
  9. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie 80 %–90 % der Flüssigkeit mit einer P1000 Pipette vorsichtig entfernen.
  10. Das Pellet in 1 ml vorgewärmtem Wachstumsmedium aussetzen und die Suspension sanft trituieren. Stellen Sie sicher, dass das Pellet oder große Fragmente des Pellets nicht mehr sichtbar sind und sich die Zellen in einer Einzelzellsuspension befinden.
  11. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählers, wie hier beschrieben, oder manuell mithilfe eines Hämozytometers, wie im Referenzvideo42ausführlich beschrieben. Mischen Sie ein 10 L Aliquot der suspendierten Zellen 1:1 mit Trypan blue, um lebensfähige Zellen zu erkennen.
  12. Inkubieren Sie für 1 min, und Pipette 10 l der Lösung auf dem Zählschlitten. Fügen Sie die Zählfolie in einen automatisierten Zellenzähler ein, um die Zellen mit den entsprechenden Einstellungen zu zählen. Der Ertrag sollte etwa 1–2 Millionen Zellen aus einem konfluenten Einzelbrunnen einer 6-Well-Platte betragen, obwohl dies je nach Größe der Zellen und Arten variieren kann. Wenn sich Zellen nicht in einer Einzelzellsuspension befinden, ist die Zellanzahl nicht genau.
  13. Diese Zellkulturen tolerieren in der Regel eine 1:2-Teilung [d.h. ein konfluenter Brunnen von Zellen kann in zwei neue Brunnen (total)] aufgeteilt werden. Um dies zu tun, die Zellen vorsichtig wieder trituieren, dann nehmen Sie die Zellsuspension in zwei Hälften (ca. 730 L pro Stück) und legen Sie sie in zwei neue Brunnen mit 750 l vorgewärmten Wachstumsmedium in tropfender Weise.
    HINWEIS: Nach 2:3 Tagen sollten die Brunnen konfluent und wieder zum Aufspalten bereit sein. An dieser Stelle wird empfohlen, einen Brunnen der Zellen durch das viably Freezing-Protokoll zu erhalten (Abschnitt 11). Weitere Zellvorräte können in weiteren Passagen als wünschenswert eingefroren werden.
    HINWEIS: Nach 6 Passagen neigen die Zellen dazu, in die Seneszenz einzutreten und teilen sich nicht mehr. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Zellen nicht mehr geteilt oder erweitert werden können, um die Zellenzahlen zu erhöhen. Dies ist auch ein Hinweis darauf, dass die Zellen nicht mehr lange lebensfähig sein werden.

11. Einfrieren lebensfähiger Lebender Zellen

  1. Bereiten Sie Gefriermedien vor, indem Sie DMEM mit 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S und 50 g/ml Gentamycin kombinieren.
  2. Das Einfrieren erfolgt durch die Einnahme von Zellen, die nach dem Passaging-Prozess pelletiert werden. Das Pellet sollte aus einem 80 %-90% konfluenten Brunnen einer 6-Well-Platte (für die 1–2 Millionen Zellen) gemäß den Schritten 8.1–8.9 hergestellt werden.
  3. Das Pellet in 1,5 ml Gefriermedium wieder aufhängen.
  4. Platzieren Sie in jedem der beiden getrennten Kryovials eine Zellsuspension von 750 l.
  5. Legen Sie die Durchstechflaschen in einen kryogenen Gefrierbehälter, was dazu führt, dass die Zellen langsam einfrieren, um die Vitalität der Zelle aufrechtzuerhalten. Legen Sie sie sofort in -80 °C.
  6. Nach 24-48 h, übertragen Sie die Kryovials der Zellen auf LN2 für die langfristige Lagerung. Auf diese Weise gespeichert, können Zellen wiederbelebt werden und werden über Jahre lebensfähig sein.

12. Auftauen von gefrorenen Zellen

  1. Bereiten Sie eine 6 Well-Platte mit 2 ml vorgewärmtem Wachstumsmedium in jedem Brunnen vor, das verwendet wird (1 Brunnen pro Durchstechflasche der aufgetauten Zellen). Halten Sie die Platte im 37 °C und 5% CO2-Inkubator, bis erforderlich.
  2. Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit Zellen aus LN2 und legen Sie sie in ein warmes Wasserbad (37 °C), um Zellen schnell aufzutauen. Dies sollte 2-3 min dauern.
    HINWEIS: Lassen Sie die Durchstechflaschen nicht länger als 3–5 min auftauen, da das DMSO in den Gefriermedien nach dem Auftauen toxisch für die Zellen ist.
  3. Sobald die Lösung in der Durchstechflasche aufgetaut ist, die Pipette vorsichtig nach oben und unten aufundrohren, um die Lösung zu homogenisieren und sofort die gesamte Lösung (ca. 750 l) in einen Brunnen einer 6-Well-Platte (in Schritt 12.1 vorgefertigt) zu platzieren.
  4. Schaukeln Sie die Platte 2-3 Mal von Seite zu Seite und von vorne nach hinten, um Zellen zu helfen, sich in einer einzigen Schicht über die Brunnenoberfläche zu verteilen.
  5. Legen Sie die Zellen im Inkubator bei 37 °C und 5%CO2-Inkubator für 24–48 h.
  6. Überwachen und durchforsperen Sie die Zellen wie oben beschrieben.

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Representative Results

Dna
Für Standardanalysen mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) wurde DNA aus drei neotropischen Fledermausarten extrahiert. Gewebeproben wurden vor Ort aus der Dominikanischen Republik und Costa Rica nach den in diesem Papier beschriebenen Protokollen entnommen. Nach der Zerlegung wurden kleine Stücke (<0,5 cm im dünnsten Abschnitt) von Mischgeweben (Gehirn, Leber und Darm) in rnastabilisierende Lösung, blitzgefroren, dann bei -80 °C gelagert. Extraktionen wurden mit Standard-DNA-Extraktionsprotokollen mit RNase-Behandlung43durchgeführt. Die Beurteilung der DNA-Integrität mit einem automatisierten Elektrophorese-Tool ergab die folgenden repräsentativen Stichprobenspitzen von Fragmentgrößen: Art 1 (zwei getrennte Extraktionen) bestand aus 22 kb und 20 kb; Art 2 bestand aus 25 kb; und Art 3 bestand aus 24 kb (Abbildung 5, Tabelle 2).

DNA, die für die Sequenzierung der dritten Generation extrahiert wird, muss in hohen Konzentrationen gesammelt und minimal fragmentiert werden. HMW-DNA aus blitzgefrorenem Hirngewebe einer in Ghana gesammelten Old World-Fruchtfledermaus (Eidolon helvum) wurde gewonnen. HMW-DNA wurde mit dem Bionano-Extraktionsprotokoll für die nachfolgende Analyse auf der Irys-Plattform extrahiert. Diese DNA war 607.463 Mb lang und hatte eine durchschnittliche molekulare N50 von 194,5 Mb.

Rns
Ein gemeinsamer Erfolgsindikator für RNA-Extraktionen ist der RNA-Integritätsnummer (RIN)-Wert. Es wird von Sequenzierungseinrichtungen häufig nicht empfohlen, ein RNA-Seq-Bibliotheksvorbereitungs- oder Sequenzierungsprotokoll durchzuführen, wenn Extraktionen einen RIN-Wert von weniger als acht haben, da Werte unterhalb dieses Schwellenwerts beginnen, hohe Signaturen des Abbaus zu demonstrieren44 45. Abbildung 6 zeigt die RIN-Werte für RNA-Extraktionen verschiedener Gewebetypen nach diesem Protokoll. Die Extraktion von Gewebe, das mit den Protokollen gesammelt wurde, hat zu einer qualitativ hochwertigen RNA geführt, unabhängig von der Lokalität der Feldentnahme. Als LN2 nicht sofort im Amazonas verfügbar war, wurden Gewebe in RNA-Stabilisierungslösung gelegt und 1 Woche lang bei 4 °C gehalten, bis sie in LN2 gelegt wurden. Auch in solchen Fällen waren RIN-Werte mit denen vergleichbar, die sofort in rnastabilisierende Lösung und direkt in LN2 platziert wurden. Die RNA-Stabilisierungslösung ist ein wesentliches Stabilisierungsmittel.

Gewebekultur
Unmittelbar nach der Beschichtung werden die Zellen hochgeballt und schwebend. Innerhalb von 24 h sollten die Fibroblasten jedoch abflachen und an der Oberfläche der Platte befestigen (Abbildung 4A). An diesem Punkt sollten die Zellen bei etwa 20%-30% Zusammenfluss sein, um das Überleben zu gewährleisten. Ein niedrigerer Wert kann zum Tod der gesamten Kultur führen. Zunächst müssen sie genügend Platz zwischeneinander haben, um eine Expansion zu ermöglichen, da sich die Zellen in der Kultur teilen und erweitern. Sie sollten geteilt werden, wenn sie 80%-90% Zusammenfluss erreichen [d.h. sie decken >80% der Plattenoberfläche ab (Abbildung 4B)]. Auf diese Weise können Zellen in der Kultur für eine Reihe von Passagen (in der Regel >6 Passagen) beibehalten werden, bevor sie seneszenz durchlaufen. Wenn Zellen in Kultur über diese Zeit hinaus beibehalten werden oder nicht geteilt werden, wenn sie konfluent werden, können sie die Morphologie ändern und größer und länger werden (Abbildung 4C). Zellen mit dieser Morphologie können sich noch teilen, aber dies deutet in der Regel darauf hin, dass die Zellen in die Seneszenz eintreten oder bald in die Seneszenz eintreten werden und nicht mehr in der Kultur erhalten oder erweitert werden können.

Figure 1
Abbildung 1: Eine gemeinsame Einrichtung für Nebelnetze, um Fledermäuse im Wald zu fangen. Halten Sie eine Hand bedeckt, während mit der gegenüberliegenden Hand zu entwirren ist eine Möglichkeit, die Fledermaus sicher zu entfernen, während Stress zu minimieren. Dieses Foto wurde von Jon Flanders aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Eine Harfenfalle wird häufig verwendet, um außerhalb von Höhlen, großen Roosts oder Fly-aways zu fangen. Fledermäuse sammeln sich im unteren Beutel der Falle mit minimaler Verschränkung und einfacher Entfernung durch den Ermittler. Dieses Foto wurde von Stephen Rossiter aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Workflow von Sezierungen und Gewebeproben für die RNA-Gewebevorbereitung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Fledermauszellkulturen, die aus Flügelschlägen von Phyllostomus-Verfärbungenabgeleitet sind. (A) 24-48 h nach der Beschichtung werden Zellen abgeflacht und an der Plattenoberfläche befestigt. (B) Zellen decken 80%-90% der Plattenoberfläche ab und pflegen die ursprüngliche Morphologie. Dies stellt die optimale Phase für die Aufteilung dar. (C) Nach >6 Passagen ändern Zellen ihre Morphologie, um größer und länger zu werden, und die Zellen treten in die Seneszenz ein. In allen Bildern stellen helle, aufgeballte Zellen abgestorbene Zellen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse von DNA-Extraktionen aus der Konservierung für Standard-DNA-Analysen von drei Fledermausarten, DNA wurde zweimal aus Art 1 extrahiert. Ein einzelnes großes Band zeigt minimale Fragmentierung und ähnlich große DNA-Fragmente aus jeder einzelnen Extraktion an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: RNA-Integritätsnummern (RIN) von RNA-Extraktionen von 13 verschiedenen Gewebetypen von neotropischen Fledermausarten, die an vier verschiedenen Orten beprobt wurden. Diese Extraktionen wurden nach dem beschriebenen Protokoll erstellt und dann verwendet, um HiSeq/NextSeq Illumina Transkriptom-Bibliotheken vorzubereiten. MOE ist das wichtigste olfaktorische Epithel. VNO ist das vomeronasale Organ. Gewebe, das von Arten in den Anden, Costa Rica und der Dominikanischen Republik abgetastet wurde, wurden direkt in LN2 platziert, nachdem es über Nacht bei 4 °C in rnastabilisierende Lösung eingeweicht wurde. Gewebe, die von Arten im Amazonas gebietiert wurden, wurden ca. 1 Woche nach der Platzierung in eine RNA-Stabilisierungslösung in LN2 eingelagert und kontinuierlich bei 4 °C gehalten. N stellt die Anzahl der Personen dar, die für jede Gewebeextraktion dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

bewerbung Blitzgefroren (L2) RNAlater AllProtect FFPE medien
Hohe MW-DNA Y X Y X X
Low MW DNA Y Y Y X X
Rns Y Y Y X X
protein Y X Y Y X
Zellkultur X X X X Y

Tabelle 1: Überblick über Konservierungsmethoden und -anwendungen. MW = Molekulargewicht, FFPE = formalinfixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe. Häkchen weisen auf die bevorzugte Konservierungsmethode für jede beabsichtigte Anwendung hin. X-Markierungen weisen auf Konservierungen hin, die nicht verwendet werden sollten.

Arten-ID Beispiel-ID Konzentration (ng/l) Stichprobenfragment-Spitzengröße (bp)
Art 1 1.1 31.8 21,885
1.2 22.8 19,633
Art 2 2 30.4 25,198
Art 3 3 32 24,386

Tabelle 2: Repräsentative Ergebnisse für DNA-Extraktionen auf der Grundlage von Konservierungsmethoden in diesem Protokoll. Die Werte entsprechen den Gelelektrophoresebrunnen aus Abbildung 5.

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Discussion

Das in diesem Manuskript diskutierte Protokoll beschreibt die besten Probenahmeverfahren für verschiedene molekulare Analysen von Fledermäusen mit hohem Durchsatz. Alle erfolgreichen -omics-Studien erfordern qualitativ hochwertiges Gewebe, aber die Probenahme von Fledermausgewebe, sowie andere Nicht-Modellorganismen, tritt oft unter Feldbedingungen auf, die nicht auf die gleichen Standards wie die einer kontrollierten Laborumgebung eingestellt werden können. Probenahme findet häufig an abgelegenen Orten mit minimalen Ressourcen statt, einschließlich eingeschränktem Zugang zu Strom und Gefriertruhen. Es ist schwierig und oft unmöglich, völlig sterile Probenahmebedingungen zu gewährleisten. So werden die Protokolle als die erfolgreichsten in einer Vielzahl von Stichprobenorten und Feldbedingungen identifiziert. Um standardisierte Probenahmemethoden für die Bat1K-Initiative und damit verbundene Anstrengungen und Projekte zu haben, wird vorgeschlagen, dass Fledermausbiologen diese Protokolle befolgen, während sie Feldexpeditionen in dem Umfang planen, der erlaubt ist.

Protokollvorschläge
Während Thoraxkompression war ein gängiger Ansatz für Euthanasie in der Vergangenheit, Es wird vorgeschlagen, nie Thoraxkompression verwenden, um Fledermäuse für zu sammeln -omics Analysen. Es ist nicht mehr eine akzeptable Form der Euthanasie in den Vereinigten Staaten46, und diese Methode kann zum enzymatischen Abbau einer Reihe von Geweben führen, unabhängig von der Art von Interesse47. Wenn ein Tier eingeschläfert wird, wird vorgeschlagen, Gewebe für genomische und transkriptomische Analysen zu sammeln. Beide erfordern die Ernte von frischem Gewebe, das idealerweise in LN2 eingefroren werden würde, aber auch in verschiedenen Medien gespeichert werden kann, um DNA, RNA oder Proteinextraktion zu erleichtern. Es wird vorgeschlagen, parallel mit zwei Menschen an Schädel- und postkraniellen Dissektionen zu arbeiten, um den Abbau der RNA in Geweben zu reduzieren. Eine Person sollte das Schädel sezieren, während die andere am Post-Cranium arbeitet.

Zu den wesentlichen Einschränkungen bei der Durchführung der Sezierprotokolle gehören das an der Zerlegung beteiligte Personal und der Platz, der für die Gewebekonservierung zur Verfügung steht (z. B. im LN2-Tank). Die Vorbereitung von Durchstechflaschen im Voraus und eine ausreichende Anzahl von Personen zur Unterstützung bei der Kennzeichnung von Schläuchen und der Dokumentation von Durchstechflaschen und Geweben wird zu einer reibungslosen Probenverarbeitung beitragen. Es sei darauf hingewiesen, dass eine ordnungsgemäße Dokumentation der Proben unerlässlich ist, um die erforderlichen (Export-, Import-)Prozesse zu erhalten. Das postkranielle Sezierprotokoll beispielsweise verlangt mehr als 20 Fläschchen pro Tier.

Wenn Raum und Zeit begrenzt sind, sollte Folgendes priorisiert werden: 1) Priorisierung für ein Exemplar für Arten oder zumindest ein Exemplar pro Gattung; Priorisierung einer männlichen Probe, um die Sequenzierung von X- und Y-Chromosom und die Minimierung der Wahrscheinlichkeit einer Probenahme eines reproduktiven Weibchens zu ermöglichen; 2) für HMW DNA: Gehirn, Muskel und Leber sollten ohne Reagenz eingefroren werden; 3) für RNA: Gehirn, Verdauungsgewebe, Milz und Sinnesorgane haben hohe Priorität. Jede Gewebeprobe sollte in einer RNA-stabilisierenden Lösung gespeichert werden. Muskelgewebe sollte auch als Kontrolle für Expressionsanalysen von spezialisiertem Gewebe genommen werden; 4) zumindest sollten Gewebe kalt gehalten werden; 5) die Verfügbarkeit von LN2 kann ebenfalls bedenklich sein. LN2-Tanks müssen mindestens alle zwei Wochen aufgefüllt werden, aber häufiger in wärmeren Klimazonen oder wenn der Tank häufig geöffnet wird. LN2 ist oft in allen Ländern kommerziell erhältlich, da es häufig in der Landwirtschaft und im Gesundheitswesen für den Transport von Proben verwendet wird. In der Regel werden diese Dienstleistungen von Unternehmen erbracht, die auch andere Gase wie Kohlendioxid oder Sauerstoff verkaufen. Eisdielen bieten manchmal eine andere Option für Trockeneis oder LN2 (oder zumindest eine Kaufempfehlung), und es wird empfohlen, lokales Personal um Unterstützung zu bitten; 6) Abbildung 6 zeigt erfolgreiche Gewebeextraktionen für einige Sammelexpeditionen, bei denen die Bedingungen begrenzt waren.

Mit mehr Menschen und mehr Platz kann mehr Gewebe auf unterschiedliche Weise gesammelt werden. Im Folgenden sind zusätzliche Protokolle an anderer Stelle veröffentlicht, die Forscher berücksichtigen sollten, wenn die richtige Erfahrung und Materialien zur Verfügung stehen: 1) die Fledermaus Metabolom, oder alle ausgeschiedenen niedermolekularen Metaboliten von Zellen und Geweben, können bieten Einblick in außergewöhnliche FledermausLanglebigkeit oder Winterschlaf und metabolische Fluganforderungen. Blut sollte aus einem leicht zugänglichen Blutgefäß, wie den Knöchelvenen, in eine Durchstechflasche mit Heparin48entnommen werden, und Fäkalienproben sollten in LN249eingefroren werden; 2) Immunmie, oder die Reaktion des Tieres auf Krankheitserreger, kann analysiert werden, indem Oberschenkelknochen und Humeri genommen und in Gewebekulturlösung zu Kulturmakrophagen flussabwärts50platziert werden; 3) Kot kann für zwei Arten von nachgeschalteten Nukleinsäure-basierte Analysen nützlich sein, wie die Bestimmung der Ernährung51 und die Untersuchung des Darmmikrobioms52,53,54. In beiden Fällen reduzieren Reagenzien wie Gewebestabilisierungslösung den Abbau seltener Varianten im Kot; 4) Lipidomik, oder die Phospholipid-Repertoires eines Gewebetyps, hat sich im Verständnis des Weißnasensyndroms Pilzerreger55,56offenbart. Die Vorbereitung des Gewebes wird vorgeschlagen, sofort nach der Zerlegung eingefroren werden.

Gewebearchive für Bat1K
Bat1K zielt darauf ab, eine Gewebebank jeder einzelnen Fledermaus zu pflegen, die verwendet wird, um die Genome zu erzeugen. Derzeit werden diese Gewebebänke und die entsprechenden phänotypischen und ökologischen Daten, die pro Person erhoben werden, in den Laboren/Museumssammlungen der Bat1K-Beitragsmitglieder aufbewahrt. Im Laufe des Projekts wird Bat1K Gewebesammlungen und relevante Datenbanken über vernetzte Repositories wie das Global Genome Biodiversity Network zentralisieren und pflegen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Centro de Ecologa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sénchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vésquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo und Fanny Fernandez Melo für die Herstellung von Gewebe Sammlung in Peru möglich. Wir danken auch allen Mitgliedern der Grupo Jaragua und Yolanda Leon für die Möglichkeit der Gewebesammlung in der Dominikanischen Republik, sowie Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita und allen in der Biologischen Forschungsstation La Selva in Costa Rica für die Herstellung von Probenahme möglich. Wir danken Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe für den Zugang und die Mustersammlung von Flügelschlägen von Phyllostomus Verfärbung Fledermäuse für die Zellkultur-Generation. Phyllostomus Verfärbungfledermäuse stammen aus einer Zuchtkolonie im Fachbereich Biologie II der Ludwig-Maximilians-Universität München. Die Genehmigung zum Halten und Züchten der Fledermäuse wurde vom Landesveterinäramt München erteilt. LMD, SJR, KTJD und LRY wurden von NSF-DEB 1442142 finanziert. LMD wurde von NSF-DEB 1838273 finanziert. LRY wurde vom NSF-PRFB 1812035 finanziert. SCV und PD wurden durch einen Max-Planck-Forschungsgruppenpreis und ein Human Frontiers Science Program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016) gefördert. SJR, JHTP und KTJD wurden vom Europäischen Forschungsrat (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) an SJR, ECT wurde durch stipendium des Europäischen Forschungsrats (ERC-2012-StG311000) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 152 Fledermäuse Genomik Transkriptomik Gewebeprobenahme Gewebekonservierung Zerlegung Zellkultur
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Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. … More

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T. J., Potter, J. H. T., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

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