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Biology

-Omics विश्लेषण और प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए चमगादड़ के ऊतक संग्रह

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59505
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 4, 5, *3,6, *2,7
1Department of Geology & Geophysics, Yale University, 2Department of Ecology & Evolution, Stony Brook University, 3Neurogenetics of Vocal Communication, Max Planck Institute for Psycholinguistics, 4School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London, 5School of Biology & Environmental Science, University College Dublin, 6Donders Institute for Brain, Cognition and Behavior, 7Consortium for Inter-Disciplinary Environmental Research, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

यह जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक, और चमगादड़ के प्रोटीओमिक विश्लेषण के लिए इष्टतम ऊतक तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो जंगली में पकड़ा गया है। यह बल्ले पर कब्जा और विच्छेदन, ऊतक संरक्षण, और बल्ले ऊतक के सेल culturing के लिए प्रोटोकॉल भी शामिल है.

Abstract

उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों अग्रिम के रूप में, उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक अधिग्रहण और संरक्षण के लिए मानकीकृत तरीकों गैर मॉडल जीवों के लिए इन तरीकों के विस्तार के लिए अनुमति देते हैं। चमगादड़ से ऊतक संग्रह का अनुकूलन करने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोण की एक श्रृंखला के लिए विकसित किया गया है। यहाँ रेखांकित चमगादड़, वांछित जनसांख्यिकी प्रत्येक बल्ले के लिए एकत्र किया जा करने के लिए, और अनुकूलित तरीकों ऊतक संग्रह के दौरान एक बल्ले पर तनाव को कम करने के लिए कब्जा करने के लिए प्रोटोकॉल हैं। विशेष रूप से रेखांकित ऊतक को प्राप्त करने के लिए (i) उच्च आणविक वजन जीनोमिक विश्लेषण के लिए डीएनए, (ii) ऊतक-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टम के लिए आरएनए, और (iii) प्रोटीओमिक स्तर के विश्लेषण के लिए प्रोटीन प्राप्त करने के लिए तरीके हैं। अंत में, यह भी रेखांकित विंग क्लिप से व्यवहार्य प्राथमिक सेल संस्कृतियों बनाने के द्वारा घातक नमूना से बचने के लिए एक तरीका है. इन तरीकों की एक केंद्रीय प्रेरणा प्रत्येक बल्ले के लिए संभावित आणविक और रूपात्मक डेटा की मात्रा को अधिकतम करने और ऊतकों को संरक्षित करने के लिए इष्टतम तरीके सुझाने के लिए है ताकि वे भविष्य में विकसित नए तरीकों के रूप में अपने मूल्य को बनाए रखें। यह मानकीकरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गया है क्योंकि क्रोमोसोम स्तर, दुनिया भर में प्रजातियों के त्रुटि-मुक्त जीनोम के अनुक्रम के लिए पहल उभरा है, जिसमें कई वैज्ञानिक दलों विभिन्न वर्गीकरण के अनुक्रमण का नेतृत्व कर रहे हैं समूहों. प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित आदर्श ऊतक संग्रह और Bat1K के लिए ऊतक संरक्षण विधियों को परिभाषित, संघ है कि बल्ले की हर प्रजाति के जीनोम अनुक्रमण है.

Introduction

उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण (एचटीएस) तरीकों तेजी से दक्षता में उन्नत और लागत में कमी आई है, और यह सैकड़ों या नमूने के हजारों के लिए इन तरीकों पैमाने पर करने के लिए अब संभव है. इन प्रौद्योगिकियों के अनुप्रयोग द्वारा प्राप्त अंतर्दृष्टि का अनेक वैज्ञानिक विषयों में, बायोमेडिसिन से लेकर विकास तथा पारिस्थितिकी1,2,3तक बहुत अधिक प्रभाव पड़ता है . फिर भी, कई एचटीएस अनुप्रयोगों एक जीवित स्रोत से उच्च गुणवत्ता न्यूक्लिक एसिड पर गंभीर रूप से भरोसा करते हैं. यह सीमा लंबी अवधि के अणुओं के आधार पर तीसरी पीढ़ी अनुक्रमण के विकास के साथ तेजी से समस्याग्रस्त होने की संभावनाहै 4. इन कारणों के लिए, प्रयोगशाला के बाहर जंगली जीवों से ताजा ऊतक नमूने इकट्ठा करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं की स्थापना पर ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है, जो सामग्री की उपयोगिता को अधिकतम करता है और व्यक्तियों की संख्या को कम करता है जो होने की आवश्यकता है एकत्र.

Bat1K गुणसूत्र स्तर विधानसभा5के लिए बल्ले की हर प्रजाति के जीनोम अनुक्रम करने के लिए एक सतत पहल के साथ वैज्ञानिकों का एक अंतरराष्ट्रीय संघ है। चमगादड़ स्तनधारी विविधता का 20% का प्रतिनिधित्व करते हैं और असाधारण अनुकूलन है कि उम्र बढ़ने को समझने के लिए निहितार्थ हैं, रोग पारिस्थितिकी, संवेदी जीव विज्ञान, और चयापचय5,6. कई चमगादड़ भी खतरे में हैं या मानव शोषण के कारण खतरे मेंहैं 7 या तेजी से रोगजनकों के कारण गिरावट आ रही है8,9, और जीनोम स्तर अनुक्रमण इन प्रजातियों के संरक्षण के लिए बहुत महत्व का है. हालांकि Bat1K वर्तमान में सभी चमगादड़ प्रजातियों के जीनोम अनुक्रम करना है, उच्च गुणवत्ता वाले जीनोम अनुक्रम के लिए ऊतक के नमूने के संग्रह के मानकीकरण जीव जीव के समुदाय भर में एक प्रमुख चुनौती बनी हुई है. जीनोमिक डेटा के अलावा, चमगादड़ रूपांतरों की विविधता के कार्यात्मक समझ ऊतक विशेष transcriptome और प्रोटीन विश्लेषण की आवश्यकता है, अक्सर अलग संग्रह प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, सभी वर्गीकरण समूहों के साथ के रूप में, जबकि इष्टतम ऊतक संग्रह और संरक्षण के लिए उच्चतम गुणवत्ता डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है -omics विश्लेषण, सर्वोत्तम प्रथाओं संवाद अक्सर क्योंकि तेजी से बदलते प्रौद्योगिकियों के लिए मुश्किल है और कई अनुसंधान टीमों स्वतंत्र रूप से काम कर रहे.

कई चमगादड़ प्रजातियों दुर्लभ या धमकी दी है कि यह देखते हुए बल्ले -omics अनुसंधान के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं को अपनाने की जरूरत है, विशेष रूप से जरूरी है। ऐसे कृन्तकों और shrews के रूप में अन्य छोटे स्तनधारियों के विपरीत, चमगादड़ लंबे समय तक रहते हैं, असाधारण डीएनए मरम्मत तंत्र के कारण10 और धीमी प्रजनन11,सबसे प्रजातियों सिर्फ एक को जन्म देने के साथ या (कुछ मामलों में) प्रति वर्ष दो युवा. इन कारणों के लिए, बल्ले आबादी अशांति से उबरने के लिए धीमी गति से किया जा सकता है, और जंगली से कई व्यक्तियों को इकट्ठा न तो उचित है और न ही संभव है. दूसरे शब्दों में, प्रोटोकॉल एक नमूना के लिए डेटा की अधिकतम राशि प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, जिससे अनावश्यक रूप से नमूना प्रयासों को दोहराने की आवश्यकता को कम करने.

यहाँ, इस प्रोटोकॉल संग्रह और जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक अनुक्रमण और प्रोटीन विश्लेषण के लिए बल्ले ऊतक के नमूने के लिए मानकीकृत तरीकों पर विशेष रूप से केंद्रित है. इसकी सर्वोच्च प्राथमिकता यह सुनिश्चित करना है कि चमगादड़ के ऊतकों को नैतिक और जिम्मेदारी से एकत्र किया जाए, संग्रह के लिए अनुमति प्रक्रिया से लेकर, ऊतकों के निर्यात को पशु को तनाव को कम करने के लिए, और दीर्घकालिक भंडारण की स्थिति। भविष्य में एकत्र विभिन्न सामग्रियों की उपयोगिता को प्रूफ करने के उद्देश्य से विस्तृत विच्छेदन विकसित किए गए हैं। इस पांडुलिपि एक मानवीय तरीका है कि आबादी पर प्रभाव को कम करने और वैज्ञानिक मूल्य को अधिकतम करने का इरादा है में चमगादड़ इकट्ठा करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड प्रदान करता है. जबकि इस प्रोटोकॉल का ध्यान चमगादड़ में उपयोग के लिए विशेष रूप से है, कदम के कई अन्य कशेरुकी taxa, विशेष रूप से स्तनधारियों के लिए प्रासंगिक हैं.

ऊतक संग्रह अवलोकन
ऊतक संग्रह के लिए प्रक्रिया, भंडारण के लिए तापमान और संरक्षण एजेंट के विकल्प सहित, किसी भी बहाव विश्लेषण की योजना बनाई की प्रकृति द्वारा निर्धारित किया जाएगा. हालांकि, यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि, जब संभव हो, ऊतक तरीकों की एक श्रृंखला के तहत एकत्र की है अपनी भविष्य उपयोगिता को अधिकतम भले ही कोई विशिष्ट विश्लेषण की योजना बनाई है. सामान्य में, ऊतक एकत्र और या तो न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए), या प्रोटीन के बाद विश्लेषण के लिए संरक्षित किया जाता है। इन अनुप्रयोगों में से प्रत्येक के लिए, ऊतक बेहतर तरल नाइट्रोजन (LN2) में सीधे फ्लैश ठंड से संरक्षित किया जा सकता है. हालांकि, LN2 में तत्काल विसर्जन हमेशा क्षेत्र में संभव नहीं है. प्रौद्योगिकी अग्रिम के रूप में, परिवेश के तापमान पर डीएनए और आरएनए स्टोर करने के लिए विशेष शीशियों जैसे संसाधन अधिक आसानी से उपलब्ध होते जा रहे हैं। जबकि हम इस प्रोटोकॉल में ऐसी सभी सामग्रियों को मान्य नहीं है, हम अन्य शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित करने के लिए तुलनात्मक रूप से क्या हम यहाँ मौजूद के सापेक्ष नई सामग्री के प्रदर्शन का विश्लेषण. हम आदर्श स्थितियों में जहां LN2 पहुँचा नहीं जा सकता है में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए ऊतक को संरक्षित करने के लिए तरीके प्रदान करते हैं, उदाहरण के लिए, जब LN2 परिवहन अमेज़न में छोटे विमान के माध्यम से साइट का उपयोग करने के कारण संभव नहीं है. इसके अलावा, हम ऊतक इकट्ठा करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं जिसमें से जीवित कोशिकाओं को उगाया और प्रचारित किया जा सकता है। नीचे हम इन संबंधित प्रयोजनों में से प्रत्येक के लिए सामग्री एकत्र करने के लिए मुख्य विचारों की रूपरेखा और संग्रह विधियों का अवलोकन तालिका 1में दिया गया है।

डीएनए के लिए ऊतक
एकत्र सभी काटा ऊतक के लिए, भंडारण मीडिया निर्धारित करेगा अगर यह या तो मानक या उच्च आणविक वजन (HMW) डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HMW लंबे समय से पढ़ने अनुक्रमण के लिए आवश्यक है और वर्तमान में गुणसूत्र स्तर जीनोम विधानसभाओं, या एक "प्लेटिनम मानक" जीनोम उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. कम आणविक वजन (LMW) डीएनए फ्लैश जमे हुए से निकाला जा सकता है, AllProtect (henceforth के रूप में संदर्भित "ऊतक स्थिर समाधान"), या यहां तक कि RNAlater (इसलिए "RNA स्थिर समाधान")-संरक्षित नमूने (हालांकि फ्लैश जमे हुए नमूने इष्टतम रहते हैं ). डीएनए मानक प्रयोगशाला विधियों (उदा., सिलिका जेल झिल्ली स्पिन कॉलम, फिनोल-क्लोरोफॉर्म) द्वारा अलग, अभी भी $ 20 किलोबेस (केबी) तक के डीएनए टुकड़े उपज सकता है। इसलिए, बशर्ते वहाँ पर्याप्त उपज है, अलग डीएनए के इस रूप एकल डालने आकार पुस्तकालय की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसमें डालने के आकार अक्सर है $500 आधार-जोड़ों (बीपी), और कम अनुक्रम के पढ़ता है $100 बीपी उत्पन्न कर रहे हैं12. यह डीएनए विशेष रूप से "पुन: अनुक्रमण" परियोजनाओं या अध्ययन जिसमें पूर्ण लंबाई गुणसूत्र डेटा की आवश्यकता नहीं है के लिए उपयोगी है। HMW डीएनए (10-150 kb) अधिक चुनौतीपूर्ण है और केवल मज़बूती से ऊतक है कि तेजी से फसल के बाद LN2 में जमे हुए फ्लैश किया गया है और निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस की एक अधिकतम पर बनाए रखा का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.

कम आणविक वजन या खंडित डीएनए अक्सर लक्षित दृष्टिकोण के लिए पर्याप्त है, पीसीआर और कम पढ़ा अनुक्रमण13के माध्यम से जीन प्रवर्धन सहित. पीसीआर आधारित जांच LMW डीएनए का उपयोग कर कि केवल एक या कुछ जीन लक्ष्य अनुकूलन और बल्ले संवेदी जीव विज्ञान के आणविक विकास के बारे में अत्यधिक जानकारीपूर्ण किया गया है6,14, शरीर क्रिया विज्ञान15, phylogenetics 5,16, और संरक्षण17,18. सफल लक्षित अनुक्रम कम आणविक वजन और खंडित डीएनए के पुनः कब्जा भी चमगादड़19सहित कई कशेरुकी समूहों के लिए प्रदर्शन किया गया है. इन तरीकों अक्सर लागत प्रभावी और बल्ले के लिए न्यूनतम इनवेसिव हैं, के रूप में मल के नमूने और गैर घातक ऊतक नमूने buccal swabs या विंग बायोप्सी घूंसे के माध्यम से भी आम तरीके कम आणविक वजन विश्लेषण के लिए डीएनए प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं20, 21|

तथापि, गुणवत्ता मीडिया के प्रकार पर काफी निर्भर करती है जिसमें नमूना22संग्रहीत किया जाता है। मुख swabs और बायोप्सी घूंसे के व्यवस्थित और मात्रात्मक तुलना के बाद, पंख बायोप्सी घूंसे डीएनए के लगातार उच्च स्तर उपज दिखाया गया है और संग्रह22के दौरान बल्ले के लिए कम तनावपूर्ण थे . इन तुलना ओंकार सिलिका में विंग पंच संरक्षित किया गया था जब सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त किया गया था कि (यानी, सिलिका जेल मोती से बना desiccant का एक प्रकार है कि जब नमी मनाया जाता है रंग बदलता है) के बजाय अन्य लोकप्रिय भंडारण मीडिया में इस तरह के रूप में इथेनॉल या DMSO22; हालांकि, ऊतक स्थिरीकरण समाधान सहित अन्य भंडारण मीडिया की जांच नहीं की गई. विंग घूंसे भी संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे Kacprzyk एट अल में23 और के रूप में नीचे वर्णित (अनुभाग 6 देखें). इन तरीकों के लिए, विंग या uropatagium धीरे बढ़ाया जाना चाहिए, और एक साफ बायोप्सी पंच, आम तौर पर 3 मिमी व्यास में, नमूना प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस दृष्टिकोण के लिए कोई स्थायी नुकसान का कारण प्रतीत होता है, ज्यादातर मामलों में सप्ताह के भीतर खत्म निशान के साथ24.

HMW डीएनए (10-150 kb) अधिक चुनौतीपूर्ण है और वर्तमान में केवल मज़बूती से ऊतक है कि तेजी से LN2 में जमे हुए फसल के बाद फ्लैश किया गया है और निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस की एक अधिकतम पर बनाए रखा का उपयोग कर प्राप्त की है. HMW डीएनए (10-150 kb) लंबे समय से पढ़ा डीएनए अनुक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है और इसलिए de नोवो जीनोम विधानसभा के लिए. वास्तव में, जबकि सबसे वाणिज्यिक किट कुछ मानक HMW डीएनए को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अणु आकार अक्सर तीसरी पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते हैं जैसे, प्रशांत बायोसाइंसेज (PacBio) जैसी कंपनियों द्वारा शुरू की गई उन, ऑक्सफोर्ड नैनोपोर टेक्नोलॉजीज, और 10x जीनोमिक्स, या बायोनैनो जीनोमिक्स या Dovetail जीनोमिक्स द्वारा की पेशकश की विधानसभा तरीकों के माध्यम से]। इस तरह के रूप में, वहाँ के लिए एक नई मांग है "अल्ट्रा HMW" डीएनए (gt; 150 kb). जब चमगादड़ से अल्ट्रा HMW डीएनए प्राप्त करने, जिगर, मस्तिष्क, या मांसपेशियों के ताजा नमूने सभी उपयुक्त हैं, लेकिन इन तुरंत किसी भी भंडारण बफर या cryoprotectant बिना LN2 में जमे हुए फ्लैश किया जाना चाहिए. इन चरणों का पूर्ण विवरण इस काग़ज़ के दायरे से बाहर है लेकिनयहकहीं और उपलब्ध है।

आरएनए के लिए ऊतक
आरएनए एक एकल-स्लेड अणु है जो डीएनए की तुलना में कम स्थिर है। हालांकि आरएनए के कई रूप हैं, -omics विश्लेषण MRNA (संदेश आरएनए) और छोटे आरएनए (जैसे, microRNAs) पर ध्यान केंद्रित करते हैं। प्रतिलेखन के बाद, MRNA एक परिपक्व प्रतिलिपि है कि कोई introns शामिल हैं और जीन / जीनोम की कोडिंग भाग का प्रतिनिधित्व करता है बनाने के लिए spliced है. कोडिंग जीन जीनोम आकार (1%-2%) का एक छोटा सा अंश के लिए खाते हैं, लक्ष्य MRNA जीन के लिए अनुक्रम डेटा प्राप्त करने का एक लागत प्रभावी साधन बना रही है. MicroRNAs आरएनए का एक वर्ग है कि प्रोटीन में mRNA के अनुवाद की प्रक्रिया को विनियमित कर रहे हैं और इस प्रकार महत्वपूर्ण नियामक effectors हैं. आरएनए प्रतिलिपियों को व्यक्तिगत रूप से अनुक्रमित किया जा सकता है , या अधिक सामान्यतः -ओमिक्स विश्लेषण26,27,28,29,30, एक ट्रांसक्रिप्टोम के भाग के रूप में ; अर्थात, किसी दिए गए नमूने में मौजूद सभी आरएनए प्रतिलिपियों की कुल.

अनुक्रमण कई तरीकों का पालन किया जा सकता है (यानी, लघु पढ़ने के लिए आरएनए-सेक या लंबे समय से पढ़ा पूरे आइसोफॉर्म सेक के माध्यम से), दोनों आरएनए बहुतायत और समरूप उपयोग के विश्लेषण की अनुमति. के रूप में मात्रा और MRNA प्रतिलिपि की विविधता कोशिकाओं और ऊतकों के बीच भिन्न होता है, आरएनए अनुक्रमण यह संभव अध्ययन और नमूनों में जीन अभिव्यक्ति और विनियमन की तुलना करने के लिए बनाता है. अनुक्रमण में रुचि छोटे RNAs और पूरे आइसोफॉर्म अनुक्रमण बढ़ रहा है, के रूप में इन तरीकों तेजी से और अधिक जैविक रूप से जानकारीपूर्ण होते जा रहे हैं. आरएनए के विभिन्न वर्गों के अनुक्रम के लिए ऊतक के नमूने तैयार करने के रूप में इस पांडुलिपि में प्रस्तुत के रूप में एक ही तरह से किया जा सकता है, केवल बाद निष्कर्षण विधियों31,32भिन्न के साथ . अंत में, क्योंकि transcriptomes प्रोटीन-कोडिंग जीनोम के एक उच्च कवरेज सबसेट की पेशकश, इकट्ठे डेटासेट जीनोम विधानसभा और एनोटेशन में उपयोगी हो सकता है, विभिन्न ऊतकों की एक श्रृंखला भर में आरएनए-सेक डेटा का संग्रह बनाने का एक महत्वपूर्ण घटक Bat1K पहल.

डीएनए के विपरीत, आरएनए रासायनिक अस्थिर है और यह भी RNase एंजाइमों, जो सर्वव्यापक रूप से आरएनए आधारित वायरस के खिलाफ एक रक्षात्मक रणनीति के रूप में ऊतक lysates में मौजूद हैं द्वारा लक्षित है. इन कारणों के लिए, कोशिकाओं और ऊतकों में आरएनए अंश नमूना और / आरएनए के संरक्षण के लिए इसके क्षरण को रोकने के लिए कदम उठाने की आवश्यकता होती है। यह आम तौर पर एक स्थिर एजेंट में 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा एकत्र ऊतक के संरक्षण शामिल है आरएनए स्थिर समाधान के रूप में ऊतकों में स्वाभाविक रूप से मौजूद RNases निष्क्रिय करने के लिए, लंबी अवधि के भंडारण के लिए ठंड के बाद. एक पसंदीदा विकल्प के रूप में, ऊतक LN2 में जमे हुए फ्लैश किया जा सकता है; हालांकि जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, क्षेत्र में LN2 परिवहन और ऊतक thawing को रोकने के स्तर को बनाए रखने logically चुनौतीपूर्ण हो सकता है.

प्रोटीन के लिए ऊतक
प्रोटीन संरचना और सापेक्ष बहुतायत क्या आरएनए के लिए चर्चा की गई थी करने के लिए एक समान तरीके से कोशिकाओं और ऊतकों के बीच बदलती हैं; तथापि, प्रोटीन आरएनए की तुलना में औसतन अधिक स्थिर होते हैं। प्रोटीन पहचान proteomics का उपयोग कर आम तौर पर के एक अंश से मेल खाता है, और नहीं पूरे, प्रोटीन अनुक्रम, लेकिन यह ऊतकों में अभिव्यक्ति पर जानकारी की आपूर्ति और मौजूद रोगजनकों की विशेषता कर सकते हैं. के रूप में कई प्रोटीन दृश्यों स्तनधारियों भर में संरक्षित कर रहे हैं, proteomics के लिए बल्ले के नमूने आसानी से संरक्षित मानव प्रोटीन के साथ दूषित किया जा सकता है, बाँझ प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है (जैसे, दस्ताने, संदंश) संग्रह के दौरान. जबकि LN2 में फ्लैश फ्रीजिंग प्रोटीन की गिरावट को रोकने के लिए सबसे अच्छा तरीका है, सूखी बर्फ का उपयोग, -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, और यहां तक कि बर्फ उपयुक्त हैं अगर कोई अन्य साधन नहीं हैं. जैसे-जैसे तापमान बढ़ता है, अंतर प्रोटीन टूटने का खतरा भी बढ़ जाता है। इस तरह के ऊतक स्थिरीकरण समाधान के रूप में स्थिर एजेंटों कमरे के तापमान पर ऊतकों के प्रोटीन अंश के संरक्षण में प्रभावी रहे हैं और अल्पकालिक संरक्षण के लिए उपयुक्त हैं (एक सप्ताह तक) जब फ्लैश फ्रीजिंग व्यवहार्य नहीं है.

दिए गए ऊतक की एंजाइमी प्रोफाइल उसमें प्रोटीन के संरक्षण को सीधे प्रभावित करती है। इस तरह की मांसपेशियों के रूप में कम एंजाइमी गतिविधि के साथ ऊतक भी एक घर फ्रीजर में उच्च तापमान पर प्रोटीन प्रोफाइल की रक्षा कर सकते हैं। इसके विपरीत, जिगर के ऊतकों enzymatically प्रतिक्रियाशील है, और इसके प्रोटीन तैयारी के दौरान अपमानजनक के उच्च संभावनाओं है. औपचारिक रूप से तय पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) नमूनों से मानव प्रोटीओमिक प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल की बढ़ती संख्या से पता चलता है कि ऊतकों के paraformaldehyde फिक्सिंग कम लागत प्रोटीन संरक्षण के लिए वादा रखती है जब संग्रह पर ठंड नहीं है संभव33,34. हालांकि संरक्षण समय और स्थिति पर अत्यधिक निर्भर है, प्रोटीन formalin-फिक्स्ड, इथेनॉल संरक्षित चमगादड़ नमूनों से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से पहचान की गई है35. इस दृष्टिकोण proteomic स्तर के नमूने के लिए स्केलेबल नहीं है, लेकिन औपचारिक रूप से तय चमगादड़ ऊतकों के लिए क्षमता पर प्रकाश डाला गया प्रोटीन प्रोफाइल उपज जब फ्लैश फ्रीजिंग अनुपलब्ध है और अन्य स्थिर एजेंटों बहुत महंगा कर रहे हैं.

सेल संस्कृति के लिए ऊतक
नमूना ऊतक और फ्लैश फ्रीजिंग सामग्री की एक सीमित राशि के लिए इस्तेमाल किया जा प्रदान करता है, और एक बार सामग्री का उपयोग किया जाता है, यह अब उपलब्ध नहीं है. वैकल्पिक रूप से, सेल संस्कृतियों लाइव कोशिकाओं है कि तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या भविष्य के अध्ययन के लिए संरक्षित प्रदान करते हैं. संस्कृति भी कोशिकाओं के विस्तार की सुविधा के लिए उपज बढ़ाने के लिए जब ऊतक के नमूने छोटे हैं. यह विशेष रूप से उन मामलों में उपयोगी है जहां ऊतक संग्रह सीमित है, जैसे दुर्लभ प्रजातियों के साथ प्रयोग जिसमें गैर घातक नमूना आवश्यक है और इसलिए संरक्षण के लिए व्यापक निहितार्थ हैं। वर्णित एक प्रोटोकॉल है जिसमें कोशिका संस्कृति पंख झिल्ली ऊतक के गैर घातक नमूना के माध्यम से संभव है, लेकिन कई ऊतक प्रकार36,37के साथ culturing संभव है. यहाँ प्रदान किया गया प्रोटोकॉल अनुलग्न कक्षों के लिए चयन करता है. स्रोत ऊतक और विकास मीडिया का इस्तेमाल किया संयोजन इस प्रोटोकॉल का चयन करें और फाइब्रोब्लास्ट्स विकसित करने के लिए उपयुक्त बनाता है, लेकिन अगर वांछित, वैकल्पिक प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के लिए चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Bat1K परियोजना के संदर्भ में, यह भविष्यवाणी की है कि दुर्लभ और धमकी दी प्रजातियों के लिए, पंख झिल्ली के गैर घातक नमूना और culturing के माध्यम से नमूनों के विस्तार के लिए कई प्रौद्योगिकियों कार्यरत कई प्रौद्योगिकियों के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है5 .

चमगादड़ पर कब्जा
चमगादड़ों को संभालने वाले सभी लोगों को बल्ले-कांस्ट अनुसंधानकर्ता द्वारा प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और रेबीज के खिलाफ पूर्व-एक्सपोजर इंजेक्शन की एक श्रृंखला के साथ टीका लगाया जाना चाहिए। अगर काट लिया, पोस्ट-एक्सपोजर इंजेक्शन की एक और श्रृंखला अभी भी आवश्यक है. चमगादड़ों को पकड़ने के मानक विधियों में कुहास जाल (चित्र 1) और वीणा जाल (चित्र 2) शामिल हैं . धुंध जाल सबसे अधिक इस्तेमाल किया और मध्यम गतिविधि के लिए कम के साथ क्षेत्रों के लिए आदर्श हैं, के रूप में वे बल्ले संकट को कम करने के लिए सबसे अधिक देखभाल की आवश्यकता है. छोटे चमगादड़ विशेष रूप से कमजोर होते हैं और तनाव से मर सकते हैं अगर जल्दी से नहीं होता है। लगातार नेट निरीक्षण बल्ले की चोट और मृत्यु दर को कम करने के साथ ही धुंध जाल को नुकसान. यह विस्तार महत्वपूर्ण है क्योंकि उचित ऊतक संग्रह ऊतक ताजा होने की आवश्यकता है, और चमगादड़ में धुंध जाल के लिए अनुचित ध्यान अनावश्यक मृत्यु या समय से पहले मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं इससे पहले कि शोधकर्ता ठीक से नमूने प्रक्रिया कर सकते हैं. क्योंकि कई चमगादड़ कम से कम संकट के साथ एक वीणा जाल में आराम कर सकते हैं, इस दृष्टिकोण उच्च बल्ले गतिविधि के साथ क्षेत्रों के लिए आदर्श है, जैसे एक गुफा या बड़े बसेरा के पास के रूप में. रूपात्मक और जनसांख्यिकीय जानकारी के संग्रह के लिए उचित चमगादड़ पर कब्जा और डेटा प्रसंस्करण के लिए विस्तृत निर्देश पूरक विधियों में उपलब्ध हैं।

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों को Stony Brook विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है (प्रोटोकॉल #2013-2034).

1. इच्छामृत्यु

  1. एक isoflurane संवेदनाहारी या किसी अन्य उपलब्ध संवेदनाहारी के साथ एक कपास की गेंद को नमी.
  2. कपास की गेंद को रीसीलेबल, एयरटाइट प्लास्टिक बैग में रखें। बैग इतना बड़ा होना चाहिए कि वह एक कपड़े के बल्ले के बैग में आराम से बैग रख सकता है।
  3. बैग संवेदनाहारी के साथ permeate करने के लिए अनुमति देने के कई मिनट के बाद, प्लास्टिक बैग में बल्ले युक्त एक बल्ले बैग जगह है.
  4. बल्ले ethanized है जब तक कई मिनट रुको. चमगादड़ $ 20 ग्राम या कम वजन में लगभग 5-10 मिनट की आवश्यकता होती है इससे बड़ा चमगादड़ 20 मिनट तक की आवश्यकता हो सकती है ध्यान दें कि समय की लंबाई भी बल्ले बैग की पारगम्यता पर निर्भर हो सकता है. एनेस्थेटिक के प्रसार को अधिकतम करने के लिए thinnest संभव कपड़ा सामग्री का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।
  5. विच्छेदन शुरू होने से पहले बल्ले को सुहावने किया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए सांस और दिल की धड़कन के लिए जाँच करें।

2. विच्छेदन तैयारी

  1. निम्नप्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, विच्छेदनों के बीच सभी इंस्ट्रूमेंटेशन को साफ रखें।
  2. पानी और पकवान साबुन के साथ उपकरणों धो लो. उन्हें 10% ब्लीच के साथ नीचे साफ, विच्छेदन क्षेत्र से दूर, ब्लीच नीचे न्यूक्लिक एसिड टूट जाएगा के रूप में.
  3. 70% इथेनॉल के साथ नीचे साफ करें.
  4. RNAse decontamination अभिकर्मक के साथ नीचे साफ करें.
  5. प्रत्येक विच्छेदन के बाद इस अनुभाग को दोहराएँ.

3. ऊतक नमूने के लिए Vials की तैयारी

  1. आरएनए के लिए:
    1. देरी से बचने के लिए किसी भी विच्छेदन शुरू करने से पहले सभी शीशियों तैयार करें।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक शीशियों की संख्या अलग सेट करें। ऊतक प्रकार है कि एकत्र किया जाएगा के साथ प्रत्येक ट्यूब लेबल, साथ ही मानक नमूना पहचान जानकारी. शीशियों को भरें 50% आरएनए स्थिर समाधान से भरा है, और आदर्श रूप से 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा।
    3. ध्यान रखना निशा: शीशी पूरी तरह से आरएनए स्टेबिलिंग solution के साथ नहीं भरें, अन्यथा LN2 में रखकर ट्यूब फट सकती है. जब ऊतक के नमूने लेने, याद है कि ऊतक की बड़ी गांठ पूरी तरह से आरएनए स्थिर समाधान द्वारा permeated नहीं किया जाएगा. इसलिए, ऊतक को एक आयाम में 0.5 सेमी से बड़ा नहीं के छोटे टुकड़ों में काटें, और आरएनए स्थिर समाधान के लिए कम से कम 10:1 मात्रा का अनुपात बनाए रखें: ऊतक।
    4. कम से कम, विच्छेदित ऊतकों को आरएनए स्थिर समाधान में रखा जाना चाहिए, भले ही अनुपलब्ध में LN2 या कोल्ड स्टोरेज तक पहुंच हो।
  2. डीएनए के लिए:
    नोट:     परमाणु डीएनए सामग्री लगभग सभी ऊतकों के लिए एक ही है; इसलिए, नमूना लचीला हो सकता है. तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मांसपेशियों के ऊतकों में माइटोकोंड्रिया के उच्च घनत्व से परमाणु जीनोम38के लिए रीड का नुकसान हो सकता है।
    1. कम आणविक वजन डीएनए के लिए, सिलिका में भंडारण के लिए विंग झिल्ली के एक या एक से अधिक प्रतिकृति ले, और /
    2. अल्ट्रा HMW डीएनए के लिए, किसी भी भंडारण अभिकर्मक के बिना LN2 में फ्लैश फ्रीज, तो -80 डिग्री सेल्सियस या ठंडा पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए स्थानांतरण. कपाल विच्छेदन से, मस्तिष्क ऊतक अल्ट्रा HMW डीएनए39को पुन: प्राप्त करने के लिए सबसे उपयुक्त ऊतक प्रकार है , जबकि postcranial विच्छेदन से, जिगर या मांसपेशियों को अधिक उपयुक्त हैं40.
    3. कपाल विच्छेदन के लिए, का उपयोग करें 5 एमएल शीशियों (के रूप में मानक 2 एमएल शीशियों के लिए विरोध) आरएनए स्थिर समाधान के कुछ ऊतकों के लिए. सभी शीशियों क्रायोजेनिक होना चाहिए। विच्छेदन करते समय बर्फ पर शीशियों रखें।

4. आरएनए के लिए कपाल विच्छेदन

  1. इच्छामृत्यु के तुरंत बाद, कैंची या हड्डी कटर की एक बड़ी जोड़ी के साथ नमूना decapitate (चित्र 3).
  2. ऑप्टिक तंत्रिका अलग करने के लिए मजबूत पर्याप्त बल का उपयोग कर forceps के साथ आंखों को निकालें। RNA स्थिर समाधान के 2 एमएल शीशी में आंखों प्लेस.
  3. अपनी पसंद के उपकरण का उपयोग करना, नाक पर त्वचा सहित बाल, फासिया, और खोपड़ी की मांसपेशियों से खोपड़ी की त्वचा। नाक के सामने के अंत को तोड़ने के लिए नहीं ध्यान रखना।
  4. कैंची का उपयोग करके, गर्दन से शुरू होने वाली खोपड़ी के अधर भाग (चित्र 3) पर एक सैगिटल कट करें, जिससे मस्तिष्क को नुकसान न हो।
  5. संदंश का उपयोग करना, धीरे खोपड़ी के दोनों पक्षों को वापस खींच जब तक यह खुला टूट गया है और मस्तिष्क को उजागर किया है.
  6. खोपड़ी के पुच्छल अंत पर, कोकले अब बाद में सिर के प्रत्येक पक्ष पर दिखाई देना चाहिए। वे बाईं और दाईं ओर छोटे, गोलाकार हड्डियों, सिर्फ गर्दन के लिए रोस्ट्रल और मालिश की मांसपेशियों के पीछे हैं. संदंश का प्रयोग करते हुए, धीरे से cochleae खींच और उन्हें आरएनए स्थिर समाधान के एक 2 एमएल शीशी में डाल दिया.
  7. धीरे से मस्तिष्क परिमार्जन (जो बहुत नरम हो जाएगा) forceps के साथ. घ्राण बल्ब दिखाई देगा, खोपड़ी के इंटीरियर के अधर भाग पर बैठे. घ्राण बल्ब को संलग्न रखने का प्रयास करें।
  8. यदि घ्राण बल्ब पहले से ही नहीं हटाया गया है, धीरे दूर ऊतक परिमार्जन, और cribriform प्लेट स्पष्ट हो जाएगा. शोधकर्ता को उन्मुख रखने के लिए यह एक महत्वपूर्ण हड्डी है। यह कई रंमन के साथ खोपड़ी के सबसे पूर्वकाल क्षेत्र के रूप में पहचाना जा सकता है और बिंदु जिस पर दो grooves जहां घ्राण बल्ब टिकी हुई है.
  9. यदि संभव हो तो, मस्तिष्क के आकार को बरकरार रखें और तुरंत सूखी बर्फ पर रखें आकार रखने के लिए या आरएनए स्थिर समाधान के एक 5 एमएल शीशी में। यदि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री मस्तिष्क पर किया जाना है, तो यदि उपलब्ध हो तो 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में रखें।
  10. दो चीरों बनाओ जहां ऊपर और नीचे जबड़े में शामिल होने, और mandible हटा दें.
  11. एक बार जब मैंडिबल को हटा दिया गया है, तो खोपड़ी के शेष भाग से रोस्ट्रम (ऊपरी जबड़े) को हटा दें। सुनिश्चित करें कि जबड़े में क्रिबरीफॉर्म प्लेट शामिल है।
  12. आरएनए स्थिर समाधान में नाक प्लेस और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। क्योंकि यह एक घने ऊतक है, यह समय की आवश्यकता है आरएनए स्थिर समाधान पूरे ऊतक व्याप्त करने के लिए अनुमति देते हैं.
  13. आरएनए स्थिर समाधान में रात भर भिगोने के बाद LN2 में नाक शीशी रखें।
  14. निचले मनसे से जीभ को कैंची से काट कर बाद के लिए आरएनए की 2 एमएल शीशी में रख दें।
  15. इस प्रोटोकॉल खोपड़ी के सबसे जब्त. दांत, विशेष रूप से mandible से उन, बरामद किया जा सकता है और प्रजातियों निदान के लिए उपयोगी हो सकता है. अस्थि ऊतक 1x फॉस्फेट-बफर ्ड लवण (पीबीएस) में संग्रहीत किया जा सकता है।

5. आरएनए के लिए पोस्टक्रैनियल डिक्क्मेंस

  1. पेट की गुहा के माध्यम से छेद करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, पसलियों तक एक अनुदैर्घ्य चीरा बनाते हुए (चित्र 3)। यह कंकाल फ्रेम जब्त कर देता है. यदि हड्डी को संरक्षित किया जाना है, तो नरम ऊतक विच्छेदन पूरा होने के बाद मांसपेशियों में त्वचा से और 1x पीबीएस में स्टोर करें।
  2. त्वचा पेक्टोरल मांसपेशियों को प्रकट करने के लिए पट्टी, मांसपेशियों के कम से कम दो नमूने लेने के लिए, आरएनए स्थिर समाधान के लिए एक और एक HMW डीएनए के लिए जमे हुए रहने के लिए, LN2 में डाल करने के लिए एक शीशी में तुरंत रखने.
  3. स्टर्नम के माध्यम से कट और पसलियों दूर खींच फेफड़ों से नमूने इकट्ठा करने के लिए।
  4. दिल है, जो पूरी तरह से लिया जा सकता है, लेकिन आधा में काट दिया जाना चाहिए लीजिए, तो आरएनए स्थिर समाधान अच्छी तरह से soaks.
  5. जिगर से नमूने ले लो. जिगर के कम से कम दो नमूने ले लो, एक HMW डीएनए के लिए जमे हुए रहने के लिए, एक खाली शीशी में तुरंत रखने के लिए LN2 में डाल दिया. जिगर बहुत एंजाइमी है, और यह पूरी तरह से में सोख करने के लिए आरएनए स्थिर समाधान के लिए काफी छोटे नमूने बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. यकृत नलिका, जो जिगर से पित्त नाली के लिए कार्य करता है, अग्न्याशय और छोटी आंत के लिए जिगर को जोड़ता है. यह पोत यकृत के निम्न/पश् च भाग की जांच करके और पश्च रूप में पोत का अनुरेखण करके आसानी से पहचाना जा सकता है। वाहिनी अक्सर एक हरे रंग की है, के रूप में अच्छी तरह से. अग्न्याशय और पित्ताशय की थैली खोजने के लिए और इन अलग से इकट्ठा करने के लिए यकृत नली का पालन करें। आरएनए स्थिर समाधान के संबंधित शीशियों में रखें.
  7. पेट ले लीजिए और, इसके बगल में, इसके आधार पर और बैंगनी रंग की एक अलग छाया के रूप में प्रदर्शित होने, पंख की तरह तिल्ली है. अग्न्याशय भी एक सफेद संरचना के रूप में यहाँ दिखाई देना चाहिए (चित्र 3) . आरएनए स्थिर समाधान के संबंधित शीशियों में रखें.
  8. छोटी और बड़ी आंत के छोटे नमूने ले लीजिए. आरएनए स्थिर समाधान के संबंधित शीशियों में रखें. एंडोपैरासाइट के लिए आंत्र की भी जांच की जा सकती है। यदि एक परजीवी विशेषज्ञ क्षेत्र में है, परजीवी के लिए एक निरीक्षण किया जा सकता है. यदि यह बाद में किया जाना है, तो पूरी आंत को 5 एमएल क्रायोजेनिक शीशी में लिया जा सकता है।
  9. गुर्दे में से एक ले लो और मूत्राशय के लिए उनकी नलिकाओं का पालन करें. आरएनए स्थिर समाधान के संबंधित शीशियों में रखें.
  10. testes (यदि पुरुष) या गर्भाशय और इसके माध्यम से अंडाशय (यदि महिला) को खोजने के लिए एक गाइड के रूप में अन्य गुर्दे का प्रयोग करें। यदि संभव हो तो एक या दोनों gonads ले लीजिए.
  11. अलग शीशियों में विंग की त्वचा के विभिन्न भागों के नमूने रखें (मस्क्युलर बनाम गैर पेशी हिस्सा).

6. ऊतक संस्कृति संग्रह और तैयारी

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन / विकास मीडिया के अलीकोट प्रोटोकॉल के हर दिन ताजा किया जाना चाहिए.
  2. संग्रह के बाद, विंग बायोप्सी घूंसे सीधे एक अच्छी तरह से सील 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ठंड विकास माध्यम के 1 एमएल में रखा जाना चाहिए। ट्यूब को पैराफिल्म में सील करने के लिए लपेटें।
  3. ट्यूब तो ठंडा तत्वों के साथ एक polystyrene बॉक्स में ले जाया जाना चाहिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखने के लिए. परिवहन में तेजी लाई जानी चाहिए; हालांकि, स्वस्थ कोशिकाओं घूंसे कि अप करने के लिए 6 दिनों के लिए इस तरह से संग्रहीत किया गया है, लेकिन कम इष्टतम23से बनाया जा सकता है.
  4. एक बार ऊतक संस्कृति की सुविधा के लिए ले जाया, निम्नलिखित प्रोटोकॉल सेल संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मानक बाँझ तकनीक प्रोटोकॉल41के बाकी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए .

7. दिन 1 ऊतक संस्कृति: ऊतक का विघटन

  1. ट्यूब की सामग्री को स्थानांतरित करें (विंग झिल्ली बायोप्सी युक्त विकास माध्यम) को 15 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. ध्यान से विकास माध्यम को हटा दें। बायोप्सी को 500 डिग्री सेल्सियस बाँझ पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  3. ट्यूब में कोलैजाइनेज IV (1 मिलीग्राम/एमएल) का 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। यह व्यक्तिगत कोशिकाओं में ऊतक के पाचन का कारण होगा.
  4. आंदोलन के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (अधिकतम 16 ज) इनक्यूबेट करें।

8. दिन 2 ऊतक संस्कृति: चढ़ाना कोशिकाओं

  1. ताजा विकास माध्यम बनाएं और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें।
  2. एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से (1 अच्छी तरह से प्रति 3 मिमी विंग बायोप्सी) इस्तेमाल किया जा करने के लिए ताजा, पूर्व गर्म विकास माध्यम के 2 एमएल जोड़कर तैयार करें। इस प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में तब तक स्टोर करें जब तक कि आवश्यक न हो (चरण 8.7)।
  3. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं से युक्त 15 एमएल ट्यूब निकालें और ताजा विकास माध्यम के 1 एमएल जोड़कर पाचन प्रतिक्रिया को बुझादें (पूर्व-37 डिग्री सेल्सियस तक।
  4. एक एकल सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए एक P1000 पिपेट टिप के साथ समाधान को सावधानी से triturating द्वारा कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  5. 300 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए टेबुल के शीर्ष केन्द्रमें कोशिकाओं को धीरे से घुमाएं।
    नोट: ऊतक के छोटे टुकड़े अभी भी निलंबन में या 15 एमएल ट्यूब की दीवार से जुड़े या दिखाई दे सकते हैं। हालांकि यह सेल निलंबन की तैयारी को प्रभावित नहीं करता है
  6. धीरे से एक P1000 पिपेट के साथ तरल के 80%-90% को हटाने के द्वारा supernatant छोड़ ें.
    नोट: अगर अभी भी दिखाई, ऊतक के टुकड़े को त्याग नहीं है, और धीरे से यह अगले चरण (8.7) में triturate.
  7. पूर्व-गर्म वृद्धि माध्यम के 500 डिग्री सेल्सियस में गोली को फिर से निलंबित करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि गोली या गोली के बड़े टुकड़े अब दिखाई नहीं दे रहे हैं और कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से निलंबित कर दिया गया है, निलंबन को धीरे से triturate करें। कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण मीडिया बादल लग सकता है।
    नोट: इस स्तर पर, एक व्यवहार्य सेल गिनती के क्रम में कोशिकाओं निलंबन और विंग क्लिप से व्युत्पन्न कोशिकाओं की उपज की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है (अधिक जानकारी के लिए कदम 10.11 देखें).
  8. धीरे एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक ही कुएं में सेल निलंबन की पूरी मात्रा pippette.
    नोट: ऊपर दिए गए चरण को तुरंत निष्पादित करें और कोशिकाओं को चरण 8.7 के बाद व्यवस्थित होने की अनुमति न दें। धीरे एक dropwise फैशन में अच्छी तरह से की सतह भर में सेल निलंबन वितरित करने के लिए एक pippette का प्रयोग करें. अच्छी तरह से केंद्र में पूरे समाधान पाइप मत करो, के रूप में इस अच्छी तरह से बीच में clumping कोशिकाओं में परिणाम होगा.
    नोट:यदि ऊतक का टुकड़ा अभी भी दिखाई दे रहा है, यह संस्कृति पोत में अच्छी तरह से हस्तांतरण नहीं है.
  9. कोशिकाओं को एक ही परत में अच्छी तरह से सतह पर वितरित करने में मदद करने के लिए साइड-टू-साइड और सामने से पीछे 2x-3x से प्लेट को धीरे से रॉक करें।
  10. माइक्रोस्कोप के नीचे चढ़ाया कोशिकाओं की जाँच करें, के रूप में वे एक कोशिकाओं है कि ऊपर balled और चल लेकिन बहुत घने दिखाई देना चाहिए.
  11. प्लेट को एक इन्क्यूबेटर प्री-सेट में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2 मेंसावधानी से रखें।
  12. $24 ज के बाद, संस्कृति के स्वास्थ्य का निर्धारण करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें। कोशिकाओं को अब प्लेट की सतह से जोड़ना चाहिए और चपटा दिखाई देना चाहिए (चित्र 4क) । विभिन्न कोशिका प्रकार जब माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख संस्कृति में दिखाई दे सकता है.
  13. संभावना है कि कुछ अस्थायी कोशिकाओं है कि संलग्न नहीं किया है हो जाएगा. इन कोशिकाओं का एक अनुपात मर चुके हैं. यदि वहाँ चल कोशिकाओं के एक उच्च अनुपात में अच्छी तरह से दिखाई है, मीडिया ताजा किया जाना चाहिए. इस मामले में, अच्छी तरह से मध्यम के 50% को ध्यान से प्रेरित करें और धीरे से अच्छी तरह से पक्ष में पूर्व-वार्म्ड विकास माध्यम के 1 एमएल जोड़ें ताकि कोशिकाओं को परेशान न करें।
  14. एक इनक्यूबेटर पूर्व निर्धारित में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2. कोशिकाओं को नियमित रूप से माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाना चाहिए (लेकिन एक दिन में एक से अधिक बार नहीं) मीडिया जलपान या बंटवारे की आवश्यकता निर्धारित करने के लिए.
    नोट: जब कोशिकाओं को नए चढ़ाया जाता है, वे जल्दी से विभाजित हो जाएगा और इसलिए हर दिन की जाँच की जानी चाहिए. संस्कृति में कुछ समय के बाद, विकास धीमी गति से होगा, और वे हर 48-72 ज की जाँच की जा सकती है.

9. ताज़ा मीडिया

  1. उनकी वृद्धि और संस्कृति की गुणवत्ता का निरीक्षण करने के लिए नियमित रूप से माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जाँच करें। इसकी गुणवत्ता का एक संकेतक के रूप में मीडिया के रंग की निगरानी करें। कोशिकाओं को अधिकतम 3 दिनों के लिए एक ही मीडिया में रहना चाहिए या जब तक पासिंग आवश्यक नहीं है, जो भी पहले आता है।
    1. यदि कोशिकाओं को जल्दी से बढ़ रहे हैं और मीडिया थकाऊ, यह भी आंख को दिखाई देगा, के रूप में मीडिया का रंग लाल से पीले रंग में बदल जाएगा.
  2. जब भी आवश्यक सावधानी से अच्छी तरह से माध्यम के 50% aspirate और धीरे अच्छी तरह से पक्ष में पूर्व गर्म विकास माध्यम के लगभग एक ही मात्रा में जोड़ें ताकि कोशिकाओं को परेशान नहीं करने के लिए.
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर पर वापस लाएं।

10. पासिंग सेल

  1. दर्राण कोशिकाओं को एक मौजूदा संस्कृति लेने और इसे नए कुओं में विभाजित करने के लिए संदर्भित करता है। जब कोशिकाएं 80% से अधिक होती हैं, तो जब वे कुएं की सतह के 80% हिस्से पर कब्जा कर लेते हैं और केवल $20% प्लास्टिक अभी भी अंतराल के रूप में दिखाई देते हैं (चित्र 4B))]।
  2. विकास माध्यम के ९०% की सावधानी से वृद्धि करें और त्यागें।
  3. कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए कुएं की दीवार में 1 एमएल बाँझ पीबीएस जोड़कर कोशिकाओं को बहुत धीरे से धोएं। धीरे से प्लेट वापस रॉक और आगे और पक्ष से साइड 2x-3x. सावधानी से aspirate और थाली से सभी पीबीएस त्याग दें.
  4. कोशिकाओं को फिर से धोने के लिए चरण 10.3 दोहराएँ.
  5. धीरे trypsin-EDTA के 250 $L जोड़ें (सिग्मा Aldrich, बिल्ली #T4049) अच्छी तरह से करने के लिए और कमरे के तापमान पर 1.5 मिनट के लिए incubate.
    नोट: सुनिश्चित करें कि trypsin-EDTA समाधान धीरे थाली कमाल से अच्छी तरह से की पूरी सतह को शामिल किया गया.
  6. ताजा पूर्व-गर्म विकास माध्यम के 1 एमएल जोड़कर प्रतिक्रिया को कम करें।
  7. प्लेट की सतह से कोशिकाओं को धोने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को निलंबन में हैं, ऊपर और नीचे पिपेट।
    नोट: कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण समाधान बादल हो जाना चाहिए।
  8. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में रखें और कोशिकाओं को 300 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए टेबल-टॉप अपकेंद्रण में घुमाएं।
  9. धीरे से एक P1000 पिपेट के साथ तरल के 80%-90% को हटाने के द्वारा supernatant छोड़ ें.
  10. पूर्व-गर्म विकास माध्यम के 1 एमएल में गोली को फिर से भरें और निलंबन को धीरे से त्रितुरेट करें। सुनिश्चित करें कि गोली या गोली के बड़े टुकड़े अब दिखाई नहीं दे रहे हैं, और कोशिकाओं को एक एकल सेल निलंबन में हैं.
  11. यहाँ वर्णित के रूप में एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना, या मैन्युअल रूप से संदर्भ वीडियो42में विस्तार से वर्णित के रूप में एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके। व्यवहार्य कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ट्रिपैन ब्लू के साथ निलंबित कोशिकाओं 1:1 के 10 डिग्री एल एलिकोट मिलाएं।
  12. 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट, और पिपेट 10 $L समाधान की गिनती स्लाइड पर। उपयुक्त सेटिंग्स का उपयोग करके कक्षों की गणना करने के लिए किसी स्वचालित कक्ष काउंटर में गणना स्लाइड सम्मिलित करें. उपज एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक confluent एकल अच्छी तरह से लगभग 1-2 लाख कोशिकाओं होना चाहिए, हालांकि यह कोशिकाओं और प्रजातियों के आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. यदि कक्ष किसी एकल कक्ष निलंबन में नहीं हैं, तो कक्ष संख्या सटीक नहीं होगी.
  13. इन सेल संस्कृतियों आम तौर पर एक 1:2 विभाजन बर्दाश्त करेंगे [यानी, कोशिकाओं की एक confluent अच्छी तरह से दो नए कुओं में विभाजित किया जा सकता है (कुल)]. ऐसा करने के लिए, धीरे से कोशिकाओं को फिर से triturate, तो दो हिस्सों में सेल निलंबन ले ($730 $L प्रत्येक) और उन्हें दो नए कुओं में से प्रत्येक में जगह है जिसमें 750 $L पूर्व-गर्म विकास माध्यम के dropwise फैशन में.
    नोट: 2-3 दिनों के बाद कुओं confluent और फिर से बंटवारे के लिए तैयार होना चाहिए. इस बिंदु पर, यह viably ठंड प्रोटोकॉल (धारा 11) द्वारा कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से संरक्षित करने के लिए सिफारिश की है. कोशिकाओं के आगे स्टॉक वांछनीय के रूप में आगे मार्ग के दौरान जमे हुए किया जा सकता है.
    नोट: $6 मार्ग के बाद, कोशिकाओं को जीर्णता में प्रवेश करते हैं और अब विभाजित नहीं होगा. यह एक संकेत है कि कक्षों को अब विभाजित या कक्ष संख्याबढ़ाने के लिए विस्तृत नहीं किया जा सकता है। यह भी एक संकेत है कि कोशिकाओं को बहुत लंबे समय के लिए व्यवहार्य नहीं होगा.

11. बर्फ़ीली व्यवहार्य रहने वाले सेल

  1. 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S, और 50 g/
  2. फ्रीजिंग पासिंग प्रक्रिया के अनुसार सेल को छर्रने के द्वारा किया जाता है। गोली एक से तैयार किया जाना चाहिए 80%-90% एक 6 अच्छी तरह से थाली के confluent अच्छी तरह से (1-2 लाख कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व), कदम के अनुसार 8.1-8.9.
  3. ठंड मध्यम के 1.5 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करें।
  4. दो अलग-अलग क्रायोविएलों में से प्रत्येक में कोशिका निलंबन का 750 डिग्री सेल्सियस रखें।
  5. एक क्रायोजेनिक ठंड कंटेनर में शीशियों रखें, जो कोशिकाओं को धीरे-धीरे सेल जीवन शक्ति बनाए रखने के लिए ठंड में परिणाम. उन्हें तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस में रखें।
  6. 24-48 ज के बाद, दीर्घावधि भंडारण के लिए कोशिकाओं के क्रायोविलियों को एलएन2 में स्थानांतरित करें। इस तरह संग्रहीत, कोशिकाओं को पुनर्जीवित किया जा सकता है और साल के लिए व्यवहार्य हो जाएगा.

12. थिंग फ्रोजन सेल

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जाएगा कि (1 कोशिकाओं की शीशी प्रति अच्छी तरह से thawed जा रहा है) में पूर्व गर्म विकास माध्यम के 2 एमएल युक्त एक 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करें. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट बनाए रखें जब तक कि आवश्यक न हो।
  2. LN2 से कोशिकाओं की एक शीशी ले लो और यह एक गर्म पानी स्नान में जगह (37 डिग्री सेल्सियस) तेजी से कोशिकाओं thaw करने के लिए. यह 2-3 मिनट लेना चाहिए.
    नोट: 3-5 मिनट से अधिक समय के लिए शीशियों thawing मत छोड़ो, ठंड मीडिया में DMSO के रूप में कोशिकाओं को विषाक्त है एक बार thawed.
  3. जैसे ही शीशी में समाधान thawed है, धीरे pipette ऊपर और नीचे समाधान homogenize करने के लिए और तुरंत एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से पूरे समाधान ($750 $L) जगह (पूर्व चरण 12.1 में तैयार).
  4. कोशिकाओं को एक ही परत में अच्छी तरह से सतह पर वितरित करने में मदद करने के लिए धीरे से पक्ष और सामने से वापस करने के लिए 2-3 बार की ओर से थाली रॉक.
  5. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2 इनक्यूबेटर को 24-48 ज के लिए रखें।
  6. ऊपर वर्णित के रूप में कोशिकाओं की निगरानी और मार्ग.

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Representative Results

डीएनए
मानक कम आणविक वजन (LMW) विश्लेषण के लिए, डीएनए तीन netropical चमगादड़ प्रजातियों से निकाला गया था. ऊतक नमूने डोमिनिकन गणराज्य और कोस्टा रिका से क्षेत्र में एकत्र किए गए थे, इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद. विच्छेदन के बाद, मिश्रित ऊतकों (मस्तिष्क, जिगर, और आंत) के छोटे टुकड़े (0.5 सेमी) आरएनए स्थिर समाधान में रखा गया था, फ्लैश जमे हुए, फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। RNase उपचार43के साथ मानक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग कर निष्कर्षण किया गया. एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरोसिस उपकरण के साथ डीएनए अखंडता का आकलन टुकड़ा आकार के निम्नलिखित प्रतिनिधि नमूना चोटियों से पता चला: प्रजातियों 1 (दो अलग extractions) 22 kb और 20 kb से मिलकर; प्रजातियों 2 25 kb के साथ शामिल; और प्रजातियों 3 में 24 केबी शामिल थे (चित्र 5, सारणी 2) ।

तीसरी पीढ़ी अनुक्रमण के लिए निकाले गए डीएनए उच्च सांद्रता और न्यूनतम खंडित में एकत्र किया जा करने के लिए आवश्यक है। घाना में एकत्र एक पुरानी दुनिया फल बल्ले (Eidolon helvum) से फ्लैश-फ्रोज़न मस्तिष्क ऊतक से निकाले गए HMW डीएनए प्राप्त किया गया था। HMW डीएनए Irys मंच पर बाद में विश्लेषण के लिए Bionano निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग कर निकाला गया था. इस डीएनए लंबाई में 607,463 एमबी था और 194.5 एमबी की एक औसत आणविक N50 था.

आरएनए
आरएनए निष्कर्षण के लिए सफलता का एक आम सूचक आरएनए अखंडता संख्या (RIN) मान है। यह अक्सर अनुक्रमण सुविधाओं द्वारा एक आरएनए-सेक पुस्तकालय की तैयारी या अनुक्रमण प्रोटोकॉल बाहर ले जाने के लिए अनुशंसित नहीं है जब extractions एक RIN मान आठ से कम है, इस सीमा से नीचे मूल्यों के रूप में गिरावट 44 के उच्च हस्ताक्षर प्रदर्शित करने के लिए शुरू ,45. चित्र 6 इस प्रोटोकॉल के बाद विभिन्न ऊतक प्रकारों के आरएनए निष्कर्षणों के लिए RIN मानों को दर्शाता है। प्रोटोकॉल के साथ एकत्र ऊतक के निष्कर्षण उच्च गुणवत्ता आरएनए, क्षेत्र नमूना इलाके से स्वतंत्र में हुई है। जब LN2 अमेज़न में तुरंत उपलब्ध नहीं था, ऊतकों आरएनए स्थिर समाधान में रखा गया था और 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जब तक LN2 में रखा. यहां तक कि ऐसे मामलों में, RIN मूल्यों उन तुरंत आरएनए स्थिर समाधान में रखा और सीधे LN2 में रखा उन लोगों के लिए तुलनीय थे. आरएनए स्थिरीकरण समाधान एक आवश्यक स्थिरीकरण एजेंट है।

ऊतक संस्कृति
चढ़ाना के तुरंत बाद, कोशिकाओं को ऊपर balled और चल जाएगा। तथापि, 24 ज के भीतर, फाइब्रोब्लास्ट्स को समतल करना चाहिए और प्लेट की सतह से जोड़ना चाहिए (चित्र 4क)। इस बिंदु पर, कोशिकाओं को लगभग 20%-30% संगम पर अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए होना चाहिए. इससे कम मूल्य के परिणामस्वरूप पूरी संस्कृति की मृत्यु हो सकती है। शुरू में, उनके पास विस्तार की अनुमति देने के लिए एक दूसरे के बीच पर्याप्त स्थान होना चाहिए, क्योंकि कोशिकाएं संस्कृति में विभाजित और विस्तार करेंगी। जब वे 80%-90% संगम [यानी, वे कवर और प्लेट सतह के 80% (चित्र 4B) तक पहुँचने के लिए विभाजित किया जाना चाहिए। इस तरह, कोशिकाओं को संस्कृति में कई मार्ग के लिए बनाए रखा जा सकता है (आमतौर पर gt; 6 मार्ग) जीर्णता से गुजरने से पहले. यदि कोशिकाओं को इस समय से परे संस्कृति में बनाए रखा जाता है या जब वे संप्रवाही हो जाते हैं तो विभाजित नहीं होते हैं, तो वे आकृति विज्ञान को बदल सकते हैं और बड़े और लंबे हो जाते हैं (चित्र 4ै)। इस आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं को अभी भी विभाजित हो सकता है, लेकिन यह आमतौर पर इंगित करता है कि कोशिकाओं रहे हैं या जल्द ही जीर्णता में प्रवेश करेंगे और अब बनाए रखा या संस्कृति में विस्तार करने में सक्षम हो जाएगा.

Figure 1
चित्र 1: जंगल में चमगादड़ ों को पकड़ने के लिए धुंध जाल के लिए स्थापित एक आम। विपरीत हाथ से अलग होने के दौरान एक हाथ को ढककर रखना तनाव को कम करते हुए बल्ले को सुरक्षित रूप से हटाने का एक तरीका है। यह तस्वीर जॉन Flanders द्वारा लिया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक वीणा जाल अक्सर बाहर गुफाओं, बड़े बसेरा, या मक्खी-aways पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चमगादड़ कम से कम उलझन और अन्वेषक द्वारा आसान हटाने के साथ जाल के निचले थैली में जमा होगा. यह तस्वीर स्टीफन Rossiter द्वारा लिया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: आरएनए ऊतक तैयारी के लिए विच्छेदनों और ऊतक ोंकेचयन का कार्यप्रवाह। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: चमगादड़ सेल संस्कृतियों Phyllostomus discolorके पंख घूंसे से व्युत्पन्न . (ए) 24-48 एच चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं चपटा हो जाएगा और थाली की सतह को देते हैं। (ख)कोशिकाएं प्लेट की सतह के 80%-90% को कवर करते हैं और मूल आकारिकी को बनाए रखते हैं। यह विभाजन के लिए इष्टतम चरण का प्रतिनिधित्व करता है। (C) के बाद और 6 मार्ग, कोशिकाओं को उनकी आकृति विज्ञान बदल जाएगा बड़ा और लंबे समय तक हो, और कोशिकाओं को जीर्णता में प्रवेश करेंगे. सभी चित्रों में, उज्ज्वल, balled-अप कोशिकाओं मृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: तीन चमगादड़ प्रजातियों से मानक डीएनए विश्लेषण के लिए संरक्षण से डीएनए extractions के प्रतिनिधि परिणाम, डीएनए प्रजातियों 1 से दो बार निकाला गया था. एक एकल बड़े बैंड कम से कम विखंडन और प्रत्येक संबंधित निष्कर्षण से डीएनए के समान आकार के टुकड़े इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) चार अलग-अलग इलाकों में नमूना निओटिट्रॉल चमगादड़ प्रजातियों से 13 विभिन्न ऊतक प्रकारों से RNA निष्कर्षण। ये निष्कर्षण वर्णित प्रोटोकॉल के बाद तैयार किए गए थे और फिर HiSeQ/NextSeQ Illumina transcriptome लायब्रेरीज़ तैयार करने के लिए उपयोग किया गया था। एमओई मुख्य घ्राण उपकला है। वीएनओ वोमेरोनासल अंग है। Andes, कोस्टा रिका और डोमिनिकन गणराज्य में प्रजातियों से नमूने ऊतक सीधे LN2 में रखा गया था आरएनए स्थिर समाधान में भिगोने के बाद 4 डिग्री सेल्सियस रात भर. अमेज़न में प्रजातियों से नमूने ऊतक LN2 में लगभग 1 सप्ताह आरएनए स्थिर समाधान में रखने के बाद रखा गया था और लगातार 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा. N प्रत्येक ऊतक निष्कर्षण के लिए प्रतिनिधित्व व्यक्तियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुप्रयोग फ़्लैश जमे हुए (L2) आरएनएलेटर सभी सुरक्षित करें एफएफईई मीडिया
उच्च मेगावाट डीएनए Y X Y X X
कम मेगावाट डीएनए Y Y Y X X
आरएनए Y Y Y X X
प्रोटीन Y X Y Y X
सेल संस्कृति X X X X Y

तालिका 1: संरक्षण विधियों और अनुप्रयोगों का अवलोकन. मेगावाट - आणविक वजन, FFPE - formalin-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक. चेकमार्क प्रत्येक संबंधित इच्छित अनुप्रयोग के लिए पसंदीदा संरक्षण विधि इंगित करते हैं। X-चिह्न उन परिरक्षणों को इंगित करता है जिनका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए.

प्रजाति आईडी नमूना आईडी एकाग्रता (एनजी/ नमूना टुकड़ा शिखर आकार (बीपी)
प्रजाति 1 1.1 31.8 21,885
1.2 22.8 19,633
प्रजाति 2 2 30.4 25,198
प्रजाति 3 3 32 24,386

तालिका 2: इस प्रोटोकॉल में संरक्षण विधियों के आधार पर डीएनए extractions के लिए प्रतिनिधि परिणाम. मान चित्र 5से जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस कुओं के अनुरूप हैं।

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Discussion

इस पांडुलिपि में चर्चा किए गए प्रोटोकॉल में चमगादड़ों के विभिन्न उच्च-थ्रूपुट आण्विक विश्लेषणों के लिए सर्वोत्तम नमूना पद्धतियों का वर्णन किया गया है। सभी सफल -omics अध्ययन उच्च गुणवत्ता ऊतक की आवश्यकता होती है, लेकिन नमूना बल्ले ऊतक, साथ ही अन्य गैर मॉडल जीवों, अक्सर क्षेत्र की स्थिति है कि एक नियंत्रित प्रयोगशाला सेटिंग के उन लोगों के रूप में एक ही मानकों के लिए सेट नहीं किया जा सकता में होता है. नमूना अक्सर बिजली और फ्रीजर के लिए सीमित उपयोग सहित कम से कम संसाधनों के साथ, दूरदराज के स्थानों में होता है। यह मुश्किल है, और अक्सर असंभव, पूरी तरह से बाँझ नमूना स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए. इस प्रकार, उल्लिखित प्रोटोकॉल नमूना इलाकों और क्षेत्र की स्थिति की एक किस्म में सबसे सफल के रूप में पहचान कर रहे हैं. आदेश में Bat1K पहल और संबंधित प्रयासों और परियोजनाओं के लिए मानकीकृत नमूना तरीकों के लिए, यह सुझाव दिया है कि चमगादड़ जीवविज्ञानी इन प्रोटोकॉल का पालन करते हुए हद तक क्षेत्र अभियानों की योजना बना है कि अनुमति दी है.

प्रोटोकॉल सुझाव
जबकि वक्ष संपीड़न अतीत में इच्छामृत्यु के लिए एक आम दृष्टिकोण था, यह वक्ष संपीड़न का उपयोग करने के लिए चमगादड़ इकट्ठा करने के लिए कभी नहीं सुझाव दिया है -omics विश्लेषण. यह अब अमेरिका46में इच्छामृत्यु का स्वीकार्य रूप नहीं है , और इस विधि से कई ऊतकों का एंजाइमी अवक्रमण हो सकता है , चाहे ब्याज की प्रजातियांकुछभी हों . यदि किसी जानवर को इच्छामृत्यु दी जाएगी, तो यह सुझाव दिया जाता है कि जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण दोनों के लिए ऊतक एकत्र किए जाएं। दोनों ताजा ऊतक है कि आदर्श LN2 में जमे हुए फ्लैश होगा कटाई की आवश्यकता है, लेकिन यह भी डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन निष्कर्षण की सुविधा के लिए अलग मीडिया में संग्रहीत किया जा सकता है. यह कपाल और postcranial विच्छेदन में दो लोगों के साथ समानांतर में काम करने का सुझाव दिया है ऊतकों में आरएनए की गिरावट को कम करने के लिए. एक व्यक्ति को कपाल को काटना चाहिए जबकि अन्य कार्य पोस्ट-कपाल पर किया जाता है।

विच्छेदन प्रोटोकॉल बाहर ले जाने के प्रमुख सीमाओं ऊतक संरक्षण के लिए उपलब्ध विच्छेदन और अंतरिक्ष में शामिल कर्मियों में शामिल हैं (उदाहरण के लिए, LN2 टैंक में). अग्रिम और लोगों की पर्याप्त संख्या में शीशियों की तैयारी लेबलिंग ट्यूबों और दस्तावेजीकरण शीशियों और एकत्र ऊतकों चिकनी नमूना प्रसंस्करण के लिए योगदान देगा के साथ सहायता करने के लिए। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नमूनों के उचित प्रलेखन आवश्यक (निर्यात, आयात) प्रक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। postcranial विच्छेदन प्रोटोकॉल, उदाहरण के लिए, प्रति जानवर 20 से अधिक शीशियों की मांग.

यदि स्थान और समय सीमित हैं, तो निम्नलिखित को प्राथमिकता दी जानी चाहिए: 1) प्रजातियों के लिए एक नमूने के लिए प्राथमिकता, या कम से कम, जीनस प्रति एक नमूना; एक पुरुष नमूने के लिए प्राथमिकता दोनों एक्स और वाई गुणसूत्र के अनुक्रमण और एक प्रजनन महिला के नमूने की संभावना को कम करने की अनुमति देने के लिए; 2) HMW डीएनए के लिए: मस्तिष्क, मांसपेशियों, और जिगर फ्लैश किसी भी अभिकर्मक के बिना जमे हुए होना चाहिए; 3) आरएनए के लिए: मस्तिष्क, पाचन ऊतक, तिल्ली, और संवेदी अंगों उच्च प्राथमिकता के हैं। प्रत्येक ऊतक नमूना आरएनए स्थिर समाधान में संग्रहीत किया जाना चाहिए. मांसपेशियों के ऊतकों को भी विशेष ऊतक की अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक नियंत्रण के रूप में लिया जाना चाहिए; 4) बहुत कम से कम, ऊतकों को ठंडा रखा जाना चाहिए; 5) LN2 की उपलब्धता भी चिंता का विषय हो सकता है. LN2 टैंक कम से कम हर दो सप्ताह में फिर से भरना चाहिए, लेकिन अधिक बार गर्म मौसम में या अगर टैंक अक्सर खोला जाता है. LN2 अक्सर व्यावसायिक रूप से सभी देशों में उपलब्ध है, के रूप में यह अक्सर कृषि और स्वास्थ्य देखभाल में प्रयोग किया जाता है के लिए नमूने परिवहन. आमतौर पर इन सेवाओं कंपनियों है कि भी अन्य गैसों, जैसे कार्बन डाइऑक्साइड या ऑक्सीजन बेचने के द्वारा प्रदान की जाती हैं. आइसक्रीम की दुकानों कभी कभी सूखी बर्फ या LN2 के लिए एक और विकल्प प्रदान करते हैं (या कम से कम खरीद के लिए एक सिफारिश प्रदान), और यह इस के साथ सहायता के लिए स्थानीय कर्मियों से पूछने का सुझाव दिया है; 6) चित्रा 6 कुछ संग्रह अभियानों जिसमें शर्तों सीमित थे के लिए सफल ऊतक extractions रूपरेखा.

अधिक लोगों और अधिक स्थान के साथ, अधिक ऊतक अलग अलग तरीकों से एकत्र किया जा सकता है. निम्नलिखित अतिरिक्त प्रोटोकॉल कहीं और प्रकाशित कर रहे हैं कि जांचकर्ताओं पर विचार करना चाहिए अगर उचित अनुभव और सामग्री उपलब्ध हैं: 1) बल्ले metabolome, या सभी उत्सर्जित कम आणविक कोशिकाओं और ऊतकों के चयापचयों, प्रदान कर सकते हैं असाधारण बल्ले लंबी उम्र या हाइबरनेशन और चयापचय उड़ान की मांग में अंतर्दृष्टि. रक्त एक आसानी से सुलभ रक्त वाहिका से एकत्र किया जाना चाहिए, जैसे टखने की नसों के रूप में, हेपरिन48के साथ एक शीशी में , और मल के नमूने LN249में जमे हुए किया जाना चाहिए; 2) इम्यूनोमिक्स, या रोगजनकों के लिए जानवर की प्रतिक्रिया, femurs और humeri लेने के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है और उन्हें संस्कृति मैक्रोफेज बहाव50के लिए ऊतक संस्कृति समाधान में रखकर; 3) मल दो प्रकार के डाउनस्ट्रीम न्यूक्लिक-एसिड आधारित विश्लेषणों के लिए उपयोगी हो सकता है, जैसे आहार51 का निर्धारण करना और आंत माइक्रोबायोम52,53,54की जांच करना । दोनों ही मामलों में, अभिकर्मकों जैसे ऊतक स्थिर समाधान मल में मौजूद दुर्लभ वेरिएंट की गिरावट को कम करते हैं; 4) लिपिडोमिक्स, या एक ऊतक प्रकार के फॉस्फोलिपिड रिपर्टोयर्स, सफेद नाक सिंड्रोम कवक रोगज़नक़55,56को समझने में खुलासा किया गया है। ऊतक की तैयारी विच्छेदन के तुरंत बाद जमे हुए करने के लिए सुझाव दिया है।

Bat1K के लिए ऊतक अभिलेखागार
Bat1K प्रत्येक व्यक्ति बल्ले है कि जीनोम उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है की एक ऊतक बैंक बनाए रखने के लिए करना है। वर्तमान में, इन ऊतक बैंकों और प्रासंगिक phenotypic और पारिस्थितिकी डेटा प्रति व्यक्ति एकत्र Bat1K योगदान सदस्यों की प्रयोगशालाओं / संग्रहालय संग्रह में बनाए रखा जाता है. परियोजना की प्रगति के रूप में, Bat1K केंद्रीय और इस तरह के वैश्विक जीनोम जैव विविधता नेटवर्क के रूप में नेटवर्क खजाने के माध्यम से ऊतक संग्रह और प्रासंगिक डेटाबेस बनाए रखने और होगा;http://www.ggbn.org/ggbn-portal/

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम सेंट्रो डे इकोलॉजी वाई बायोडाइडिसिडैड CEBIO, एरिका पैलिज़ा, मिलुस्का सांचेज़, जॉर्ज कैरेरा, एडगर रेंगिफो वीज़, हेरोल्ड पोरोकैरेरो ज़रिया, जॉर्ज रुज़ लेवेउ, जैमे पेचेको कैस्टिलो, कार्लोस टेलो, फैनी कोर्नेजो, और फैनी फर्नान्डेज को धन्यवाद देते हैं। पेरू में संग्रह संभव. हम भी डोमिनिकन गणराज्य में ऊतक संग्रह संभव बनाने के लिए Grupo Jaragua और Yolanda Len के सभी सदस्यों को धन्यवाद, साथ ही Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, और कोस्टा रिका में ला सेल्वा जैविक अनुसंधान स्टेशन में हर कोई बनाने के लिए, नमूना संभव है. हम सेल संस्कृति पीढ़ी के लिए Phyllostomus discolor चमगादड़ से उपयोग और पंख घूंसे के नमूना संग्रह के लिए एला Lattenkamp और Lutz Wiegrebe धन्यवाद. Phyllostomus discolor चमगादड़ म्यूनिख में लुडविग-मैक्सिमिलियन्स विश्वविद्यालय के विभाग जीव विज्ञान द्वितीय में एक प्रजनन कॉलोनी से उत्पन्न. म्यूनिख जिला पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा चमगादड़ों को रखने और प्रजनन करने की स्वीकृति जारी की गई थी। LMD, SJR, KTJD, और LRY NSF-डीईबी 1442142 द्वारा वित्त पोषित किया गया. एलएमडी NSF-DEB 1838273 द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एलआरवाई को एनएसएफ-पीआरएफबी 1812035 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। SCV और पीडी एक मैक्स प्लैंक अनुसंधान समूह पुरस्कार, और एक मानव फ्रंटियर्स विज्ञान कार्यक्रम (HFSP) अनुसंधान अनुदान (RGP0058/2016) द्वारा वित्त पोषित किया गया. SJR, JHTP, और KTJD यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया (ईआरसी शुरू अनुदान 310482 [EVOGENO]) SJR को सम्मानित किया, ईसीटी यूरोपीय अनुसंधान परिषद अनुदान (ईआरसी-2012-StG311000) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

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जीव विज्ञान अंक 152 चमगादड़ जीनोमिक्स ट्रांसक्रिप्टोमिक्स ऊतक नमूना ऊतक संरक्षण विच्छेदन सेल संस्कृति
-Omics विश्लेषण और प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए चमगादड़ के ऊतक संग्रह
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Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. … More

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T. J., Potter, J. H. T., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

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