نموذج Xenograft مشتق من سرطان الجلد
Summary
نماذج xenograft المستمدة من المريض (PDX) أكثر قوة تلخيص الميزات الجزيئية والبيولوجية الورم الميلانيني وأكثر تنبؤا من استجابة العلاج مقارنة مع الاختبارات التقليدية القائمة على ثقافة الأنسجة البلاستيكية. هنا نقوم بوصف بروتوكول التشغيل القياسي الخاص بنا لإنشاء نماذج PDX جديدة وتحديد خصائص/تجريب نماذج PDX الموجودة.
Abstract
تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الخصائص الجزيئية والبيولوجية تختلف في خلايا الورم الميلانيني التي تنمو في أوعية زراعة الأنسجة التقليدية ثنائية الأبعاد مقابل في الجسم الحي في المرضى البشر. ويرجع ذلك إلى اختيار عنق الزجاجة من السكان clonal من خلايا الورم الميلانيني التي يمكن أن تنمو بقوة في المختبر في غياب الظروف الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، فإن الاستجابات للعلاج في الثقافات الأنسجة ثنائية الأبعاد عموما لا تعكس بأمانة الاستجابات للعلاج في مرضى الورم الميلانيني، مع غالبية التجارب السريرية فشل في إظهار فعالية تركيبات العلاجية أظهرت أن تكون فعالة في المختبر. على الرغم من أن xenografting خلايا الورم الميلانيني في الفئران يوفر الفسيولوجية في سياق الجسم الحي غائبة عن اختبارات زراعة الأنسجة ثنائية الأبعاد، خلايا الورم الميلانيني المستخدمة للتطعيم قد خضعت بالفعل لاختيار عنق الزجاجة للخلايا التي يمكن أن تنمو تحت ثنائي الأبعاد الظروف عندما تم تأسيس خط الخلية. وتشمل التعديلات التي لا رجعة فيها التي تحدث نتيجة للاختناق التغيرات في خصائص النمو والغزو، فضلا عن فقدان مجموعات فرعية محددة. ولذلك، فإن النماذج التي تُزيّن بشكل أفضل الحالة الإنسانية في الجسم الحي قد تتنبأ بشكل أفضل بالاستراتيجيات العلاجية التي تزيد بشكل فعال من البقاء الكلي للمرضى الذين يعانون من الورم الميلانيني النقيلي. تتضمن تقنية xenograft (PDX) المشتقة من المريض الزرع المباشر للخلايا السرطانية من المريض البشري إلى متلقي الماوس. وبهذه الطريقة ، تنمو الخلايا السرطانية باستمرار تحت ضغوط فسيولوجية في الجسم الحي ولا تخضع أبدا ً للاختناق الثنائي الأبعاد ، الذي يحافظ على الخصائص الجزيئية والبيولوجية الموجودة عندما كان الورم في المريض البشري. ملحوظة، نماذج PDX المستمدة من مواقع الأعضاء من الانبثاث (أي الدماغ) عرض قدرة النقيلي مماثلة، في حين نماذج PDX المستمدة من المرضى السذاجة العلاج والمرضى الذين يعانون من مقاومة المكتسبة للعلاج (أي BRAF / MEK العلاج المانع) عرض حساسية مماثلة للعلاج.
Introduction
النماذج ما قبل السريرية حاسمة لجميع جوانب أبحاث السرطان الترجمة، بما في ذلك توصيف المرض، واكتشاف نقاط الضعف القابلة للتنفيذ فريدة من نوعها للسرطان مقابل الخلايا الطبيعية، وتطوير العلاجات الفعالة التي تستغل هذه نقاط الضعف لزيادة البقاء على قيد الحياة عموما للمرضى. في مجال الورم الميلانيني، تم استخدام عشرات الآلاف من نماذج خط الخلية بشكل كبير لفحص المخدرات، مع > 4000 ساهمت بها مجموعتنا وحدها (سلسلة WMXXX). تم اشتقاق نماذج خط الخلية هذه من مرضى الورم الميلانيني الذين يعانون من أشكال مختلفة من الورم الميلانيني الجلدي (أي، الآكر، أوفيال، وانتشار السطحية) والأنماط الجينية المتنوعة (أي BRAFV600-متحولةوالورم الأرومي العصبي RAS الفيروسية الأنكيوجينية المتجانسة [ فى الانمازى Q61R-متحولة)،والتي تمتد طيف من الأمراض الموجودة في العيادة1،2.
بشكل لا لبس فيه، ظهرت استراتيجية العلاج الأكثر نجاحا والمستهدفة في مجال الورم الميلانيني من 1) التوصيف الجيني لأورام المرضى تحديد طفرات BRAF في ~ 50٪ من الأورام الميلانينية3 ومن 2) التحقيق قبل السريرية الاستفادة من نماذج خط الخلية الميلانوما4. وكان مزيج مثبطات BRAF / MEK إدارة الغذاء والدواء (FDA) المعتمدة في عام 2014 لعلاج المرضى الذين الأورام الميلانينية ميناء تفعيل الطفرات BRAFV600E / K وتفتخر > 75٪ معدل الاستجابة5. على الرغم من هذه الفعالية الأولية، والمقاومة تنشأ بسرعة في كل حالة تقريبا بسبب آليات المقاومة الجوهرية والمكتسبة متعددة والتباين داخل الورم. لسوء الحظ، نماذج خط الخلية لا تلخص التغاير البيولوجي التمثيلي عندما تزرع في ثقافة ثنائية الأبعاد في الأوعية البلاستيكية، والتي تخفي إمكاناتها التنبؤية سريريا عندما يحاول المحققون تحديد تجريبيا العلاجات التي قد تكون فعالة في المرضى الذين يعانون من شكل معين أو النمط الجيني من الورم الميلانيني6. إن فهم كيفية تحسين عدم تجانس المريض داخل الأورام سوف يسمح للمحققين بتطوير الطرائق العلاجية التي يمكن أن تقتل التجمعات السكانية الفرعية المقاومة للعلاج التي تدفع الفشل في العلاجات الحالية لمعيار الرعاية.
ومن الأهمية بمكان بالنسبة للقيمة التنبؤية المحدودة لنماذج خطوط الخلايا كيفية إنشائها في البداية. تحدث تعديلات لا رجعة فيها في المشهد الكلوني الورم عندما يتم زراعة تعليق خلية واحدة من ورم المرضى على ثنائي الأبعاد، والأوعية زراعة الأنسجة البلاستيكية، بما في ذلك التغيرات في إمكانات التكاثر والغازية، والقضاء على محددة التجمعات السكانية الفرعية، وتغيير المعلومات الوراثية7. Xenografts في الفئران من هذه النماذج خط الخلية الورم الميلانيني تمثل الأكثر استخداما في منصة الجسم الحي للدراسات ما قبل السريرية. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية تعاني أيضا من التلخيص الفقراء من عدم تجانس الورم معقدة لوحظ سريريا. وللتغلب على هذا القصور، كان هناك اهتمام متزايد بدمج نماذج أكثر تطوراً قبل السريرية للميلانوما، بما في ذلك نموذج PDX. وقد استخدمت نماذج PDX لمدة [30 عاماً)، مع دراسات أساسية في مرضى سرطان الرئة مما يدل على التوافق بين استجابةالمرضى للعوامل السامة للخلايا واستجابة نموذج PDX المستمدة من نفس المريض 8. في الآونة الأخيرة، كان هناك حملة لاستخدام نماذج PDX كأداة الاختيار للتحقيقات ما قبل السريرية سواء في هذه الصناعة وفي المراكز الأكاديمية. نماذج PDX، بسبب تلخيصها متفوقة من عدم تجانس الورم في المرضى البشر، هي أكثر ملاءمة سريريا لاستخدامها في جهود تحسين العلاج من خط الخلية xenografts9. في الورم الميلانيني ، هناك عقبات هائلة أن الحدة من الإدارة العلاجية للمرض المتقدم10. وقد استخدمت نماذج PDX ذات الصلة سريريا لنموذج المقاومة السريرية وتحديد الاستراتيجيات العلاجية مع العوامل المتاحة سريريا لعلاج الأورام المقاومة للعلاج11،12. باختصار، يتطلب البروتوكول المعروض هنا لتوليد نماذج PDX زرع تحت الجلد من الأنسجة الطازجة من الأورام الميلانينية الأولية أو النقيلية (التي تم جمعها عن طريق خزعة أو جراحة) في NOD / scid / IL2 مستقبلات فارغة (NSG) الفئران. وتستخدم مجموعات مختلفة تباينات مختلفة في النهج المنهجي؛ ومع ذلك، يوجد جوهر أساسي13.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وصفنا هنا توليد نماذج PDX من الورم الميلانيني مع أنسجة المريض المستمدة من الأورام الأولية والنقيلية، والخزعات الأساسية، وFNAs. عندما يتم تطعيمها مباشرة في الفئران NSG، والأورام تقديم خصائص مورفولوجية وجينية وبيولوجية مماثلة لتلك التي لوحظت في المريض. في حالة توافر كمية صغيرة فقط من الأنس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون مرفق معهد ويستار للحيوانية، ومرفق الفحص المجهري، ومرفق التكنولوجيا الهيستوجية، ومركز إمدادات البحوث. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من المنح المقدمة من U54 (CA224070-01)، وSPORE (CA174523)، P01 (CA114046-07)، والدكتور ميريام وشيلدون ج. أديلسون مؤسسة البحوث الطبية، ومؤسسة أبحاث الورم الميلانيني.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
