Een melanoom patiënt-afgeleide xenograft model
Summary
Patiënten-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen meer robuust even melanoom moleculaire en biologische kenmerken en zijn meer voorspellend van therapie respons in vergelijking met traditionele kunststof weefselcultuur gebaseerde assays. Hier beschrijven we ons standaard Besturingsprotocol voor de oprichting van nieuwe PDX-modellen en de karakterisatie/experimenten van bestaande PDX-modellen.
Abstract
Accumulatie van bewijs suggereert dat moleculaire en biologische eigenschappen verschillen in melanoom cellen gekweekt in traditionele tweedimensionale weefselkweek vaten versus in vivo bij menselijke patiënten. Dit komt door de knelpunt selectie van klonale populaties melanoom cellen die in vitro in de afwezigheid van fysiologische omstandigheden krachtig kunnen groeien. Verder reflecteren de reacties op therapie in tweedimensionale weefselculturen over het algemeen niet getrouw de reacties op therapie bij melanoom patiënten, waarbij de meerderheid van de klinische proeven niet de werkzaamheid van therapeutische combinaties laat zien die effectief blijken te zijn in Vitro. Hoewel het xenotransplanteren van melanoom cellen in muizen de fysiologische in vivo context bevat die afwezig is in de tweedimensionale weefsel cultuurassays, hebben de melanoom-cellen die worden gebruikt voor engraftment al een knelpunt selectie ondergaan voor cellen die kunnen groeien onder twee-dimensionale voorwaarden wanneer de cellijn werd vastgesteld. De onomkeerbare veranderingen die zich voordoen als gevolg van het knelpunt zijn veranderingen in de groei en invasie eigenschappen, evenals het verlies van specifieke subpopulaties. Daarom kunnen modellen die de menselijke toestand in vivo beter recapituleren, beter therapeutische strategieën voorspellen die de totale overleving van patiënten met gemetastaseerd melanoom effectief verhogen. De patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) techniek omvat de directe implantatie van tumorcellen van de menselijke patiënt aan een muis ontvanger. Op deze manier, tumorcellen worden consequent geteeld onder fysiologische spanningen in vivo en nooit ondergaan de tweedimensionale knelpunt, die behoudt de moleculaire en biologische eigenschappen aanwezig wanneer de tumor in de menselijke patiënt was. Opmerkelijke, PDX-modellen afgeleid van orgaan sites van metastasen (d.w.z. hersenen) vertonen vergelijkbare metastatische capaciteit, terwijl PDX-modellen afgeleid van therapie-naïeve patiënten en patiënten met verworven resistentie tegen therapie (d.w.z. BRAF/MEK-remmer therapie) weergeven vergelijkbare gevoeligheid voor therapie.
Introduction
Preklinische modellen zijn van cruciaal belang voor alle aspecten van translationeel kankeronderzoek, waaronder ziekte karakterisering, ontdekking van bruikbare kwetsbaarheden die uniek zijn voor kanker versus normale cellen, en de ontwikkeling van werkzame therapieën die misbruik maken van Deze kwetsbaarheden om de algehele overleving van patiënten te verhogen. In het melanoom-veld zijn tienduizenden cellijn modellen intensief gebruikt voor het screenen van drugs, met > 4000 bijgedragen door onze groep alleen (WMXXX-serie). Deze cellijn modellen werden afgeleid van melanoom patiënten met verschillende vormen van cutane melanoom (d.w.z. acral, ukalfs en oppervlakkige verspreiding) en diverse genotypen (d.w.z. brafV600-Mutant en neuroblastoom RAS virale oncogen homo [ Nri’s Q61R-Mutant]), die het spectrum van de ziekte aanwezig in de kliniek1,2omvatten.
Ondubbelzinnig, de meest succesvolle, gerichte therapie strategie in het melanoom veld is voortgekomen uit 1) de genomische karakterisering van patiënten ‘ tumoren identificeren van braf mutaties in ~ 50% van melanomen3 en van 2) preklinisch onderzoek gebruik maken van melanoom Cell line modellen4. De combinatie van braf/MEK-remmer was Food and Drug Administration (FDA)-goedgekeurd in 2014 voor de behandeling van patiënten bij wie de melanomen Harbor brafV600E/K -mutaties activeert en een > 75% responsratio5heeft. Ondanks deze initiële werkzaamheid, ontstaat er snel resistentie in bijna elk geval als gevolg van multifarische intrinsieke en verworven resistentiemechanismen en intratumoreel heterogeniteit. Helaas, cellijn modellen niet recapituleren representatieve biologische heterogeniteit wanneer geteeld in de tweedimensionale cultuur in kunststof vaten, die maskeert hun klinisch voorspellend potentieel wanneer onderzoekers proberen om experimenteel te bepalen therapieën die effectief kunnen zijn bij patiënten met een specifieke vorm of genotype van melanoom6. Begrijpen hoe het beste model patiënt intratumoral heterogeniteit zal onderzoekers in staat stellen om beter te ontwikkelen therapeutische modaliteiten die kunnen doden therapie-resistente subpopulaties die het falen van de huidige standaard-van-zorg therapieën rijden.
Essentieel voor de beperkte voorspellende waarde van cellijn modellen is hoe ze in eerste instantie worden vastgesteld. Onomkeerbare veranderingen optreden in het tumor klonale landschap wanneer een eencellige suspensie van de tumor van een patiënt wordt geteeld op tweedimensionale, kunststof weefselkweek vaten, inclusief veranderingen in proliferatief en invasief potentieel, de eliminatie van specifieke subpopulaties en de wijziging van genetische informatie7. Xenografts in muizen van deze melanoom cellijn modellen vertegenwoordigen de meest gebruikte in vivo platform voor preklinische studies; echter, deze strategie lijdt ook aan de slechte recapitulatie van complexe tumor heterogeniteit waargenomen klinisch. Om deze tekortkoming te overwinnen, is er een groeiende belangstelling voor het opnemen van geavanceerdere preklinische modellen van melanoom, waaronder het PDX-model. PDX-modellen zijn gebruikt voor > 30 jaar, met zaad studies bij longkanker patiënten die overeenstemming aantonen tussen de respons van de patiënten op cytotoxische middelen en de respons van het PDX-model dat is afgeleid van dezelfde patiënt8. Onlangs is er een drive geweest om PDX-modellen te gebruiken als het instrument van keuze voor preklinisch onderzoek, zowel in de industrie als in academische centra. PDX-modellen zijn, vanwege hun superieure recapitulatie van tumor heterogeniteit bij humane patiënten, meer klinisch relevant voor gebruik in therapie optimaliserings inspanningen dan cellijn xenotransplantaten9. Bij melanoom zijn er immense hindernissen die het therapeutische beheer van gevorderde ziekte10botte. Klinisch relevante PDX-modellen zijn gebruikt om klinische resistentie te modelleren en therapeutische strategieën te identificeren met klinisch beschikbare agenten voor de behandeling van therapieresistente tumoren11,12. In het kort, het protocol hier gepresenteerd voor het genereren van PDX modellen vereist de subcutane implantatie van vers weefsel van primaire of gemetastaseerde melanomen (verzameld door biopsie of chirurgie) in NOD/scid/IL2-receptor Null (NSG) muizen. Verschillende variaties in methodologische benadering worden door verschillende groepen gebruikt; Er bestaat echter een fundamentele kern van13.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben hierin beschreven het genereren van PDX-modellen van melanoom met patiënt weefsel afgeleid van primaire en gemetastaseerde tumoren, kern biopsieën en Fna’s. Wanneer rechtstreeks in NSG-muizen worden geënt, presenteren tumoren vergelijkbare morfologische, genomische en biologische eigenschappen aan die waargenomen bij de patiënt. In het geval dat slechts een kleine hoeveelheid weefsel beschikbaar is voor onderzoekers, zoals vaak voorkomt bij Fna’s, zorgt de PDX-techniek voor de uitbreiding van het tumorweefs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het Wistar Institute dieren faciliteit, microscopie faciliteit, Histotechnologie faciliteit, en Research Supply Center. Deze studie werd deels gefinancierd door subsidies van de U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), de Dr. Miriam en Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, en de melanoma Research Foundation.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
