Un modello di Xenotrapianto a parte del paziente di melanoma
Summary
I modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente riassumono in modo più robusto le caratteristiche molecolari e biologiche del melanoma e sono più predittivi della risposta terapeutica rispetto ai tradizionali saggi basati sulla coltura dei tessuti plastici. Qui descriviamo il nostro protocollo operativo standard per la creazione di nuovi modelli PDX e la caratterizzazione/sperimentazione di modelli PDX esistenti.
Abstract
Sempre più prove suggeriscono che le proprietà molecolari e biologiche differiscono nelle cellule del melanoma coltivate in vasi tradizionali di coltura dei tessuti bidimensionali rispetto a quelli in vivo nei pazienti umani. Ciò è dovuto alla selezione del collo di bottiglia delle popolazioni clonali di cellule melanoma che possono crescere robustamente in vitro in assenza di condizioni fisiologiche. Inoltre, le risposte alla terapia nelle colture di tessuti bidimensionali nel complesso non riflettono fedelmente le risposte alla terapia nei pazienti affetti da melanoma, con la maggior parte degli studi clinici che non riescono a dimostrare l’efficacia delle combinazioni terapeutiche dimostrata essere efficaci Vitro. Sebbene il xenotrapianto delle cellule di melanoma nei topi fornisca il contesto fisiologico in vivo assente dai test di coltura dei tessuti bidimensionali, le cellule di melanoma utilizzate per l’innesto hanno già subito la selezione del collo di bottiglia per le cellule che potrebbero crescere sotto condizioni bidimensionali quando è stata stabilita la linea cellulare. Le alterazioni irreversibili che si verificano come conseguenza del collo di bottiglia includono cambiamenti nelle proprietà di crescita e invasione, così come la perdita di specifiche sottopopolazioni. Pertanto, i modelli che ricapitolano meglio la condizione umana in vivo possono prevedere meglio strategie terapeutiche che aumentano efficacemente la sopravvivenza complessiva dei pazienti con melanoma metastatico. La tecnica dello xenotrapianto derivante dal paziente (PDX) prevede l’impianto diretto delle cellule tumorali dal paziente umano a un ricevente del topo. In questo modo, le cellule tumorali sono costantemente coltivate sotto stress fisiologici in vivo e non subiscono mai il collo di bottiglia bidimensionale, che conserva le proprietà molecolari e biologiche presenti quando il tumore era nel paziente umano. Notevoli, i modelli PDX derivati da siti di organi di metastasi (cioè cervello) mostrano una capacità metastatica simile, mentre i modelli PDX derivati da pazienti ingenui di terapia e pazienti con resistenza acquisita alla terapia (cioè la terapia inibitore BRAF/MEK) sensibilità simile alla terapia.
Introduction
I modelli preclinici sono fondamentali per tutti gli aspetti della ricerca traslazionale sul cancro, compresa la caratterizzazione delle malattie, la scoperta di vulnerabilità utilizzabili per il cancro rispetto alle cellule normali e lo sviluppo di terapie efficaci che sfruttano queste vulnerabilità per aumentare la sopravvivenza complessiva dei pazienti. Nel campo del melanoma, decine di migliaia di modelli di linee cellulari sono stati fortemente utilizzati per lo screening farmacologico, con >4,000 forniti dal nostro gruppo da solo (serie WMXXX). Questi modelli di linea cellulare sono stati derivati da pazienti affetti da melanoma con varie forme di melanoma cutaneo (ad esempio, acrale, ueal e diffusione superficiale) e da diversi genotipi (ad esempio, BRAFV600-mutant e neuroblastoma RAS virale oncogene homolog [ NRAS Q61R-mutante]), che abbracciano lo spettro della malattia presente nella clinica1,2.
Inequivocabilmente, la strategia terapeutica mirata di maggior successo nel campo del melanoma è emersa da 1) la caratterizzazione genomica dei tumori dei pazienti che identificano le mutazioni di BRAF nel 50% dei melanomi3 e da 2) indagini precliniche sfruttando i modelli della linea cellulare del melanoma4. La combinazione di inibitori BRAF/MEK è stata approvata nella Food and Drug Administration (FDA) nel 2014 per il trattamento di pazienti i cui melanomi ospitano l’attivazione di mutazioni BRAFV600E/K e vanta un tasso di risposta >75%5. Nonostante questa efficacia iniziale, la resistenza si manifesta rapidamente in quasi tutti i casi a causa di meccanismi di resistenza intrinseci e acquisiti multifariosi e eterogeneità intratumorale. Sfortunatamente, i modelli della linea cellulare non ricapitolano l’eterogeneità biologica rappresentativa se coltivati in coltura bidimensionale in vasi di plastica, il che maschera il loro potenziale clinico predittivo quando gli investigatori tentano di determinare sperimentalmente terapie che potrebbero essere efficaci nei pazienti con una forma specifica o genotipo di melanoma6. Comprendere come modellare al meglio l’eterogeneità intratuare del paziente consentirà agli sperimentatori di sviluppare meglio le modalità terapeutiche che possono uccidere le sottopopolazioni resistenti alla terapia che indirizzano il fallimento alle attuali terapie standard di cura.
La Paramount al limitato valore predittivo dei modelli a linee cellulari è il modo in cui vengono inizialmente stabiliti. Alterazioni irreversibili si verificano nel paesaggio clonale del tumore quando una sospensione unicellulare del tumore di un paziente viene coltivata su vasi bidimensionali di coltura dei tessuti plastici, compresi i cambiamenti nel potenziale proliferare e invasivo, l’eliminazione di sottopopolazioni, e l’alterazione delle informazioni genetiche7. Gli Xenograft nei topi di questi modelli di linea cellulare del melanoma rappresentano la piattaforma in vivo più utilizzata per gli studi preclinici; tuttavia, questa strategia soffre anche della scarsa ricapitolazione dell’eterogeneità tumorale complessa osservata clinicamente. Per ovviare a questa lacuna, c’è stato un crescente interesse nell’incorporare modelli preclinici più sofisticati di melanoma, incluso il modello PDX. I modelli PDX sono stati utilizzati per >30 anni, con studi seminali in pazienti affetti da cancro del polmone che dimostrano la concordanza tra la risposta dei pazienti agli agenti citotossici e la risposta del modello PDX derivato dallo stesso paziente8. Recentemente, c’è stato un impulso a utilizzare i modelli PDX come strumento di scelta per le indagini precliniche sia nel settore che nei centri accademici. I modelli PDX, a causa della loro ricapitolazione superiore dell’eterogeneità tumorale nei pazienti umani, sono clinicamente più rilevanti da utilizzare negli sforzi di ottimizzazione della terapia rispetto agli xenografi della linea cellulare9. Nel melanoma, ci sono ostacoli immensi che smussano la gestione terapeutica della malattia avanzata10. Sono stati utilizzati modelli PDX clinicamente pertinenti per modellare la resistenza clinica e identificare strategie terapeutiche con agenti clinicamente disponibili per il trattamento dei tumori resistenti alla terapia11,12. In breve, il protocollo qui presentato per generare modelli PDX richiede l’impianto sottocutaneo di tessuto fresco da melanomi primari o metastatici (raccolti mediante biopsia o chirurgia) nei topi NOD/scid/IL2-receptor null (NSG). Variazioni diverse nell’approccio metodologico sono utilizzate da gruppi diversi; tuttavia, esiste un nucleo fondamentale13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto la generazione di modelli PDX di melanoma con tessuto paziente derivato da tumori primari e metastatici, biopsie core e FNA. Quando direttamente innestati in topi NSG, tumori presentano proprietà morfologiche, genomiche e biologiche simili a quelle osservate nel paziente. Nel caso in cui solo una piccola quantità di tessuto sia disponibile per i ricercatori, come spesso accade con i FNA, la tecnica PDX consente l’espansione del tessuto tumorale per la caratterizzazione del DNA, dell’RNA e delle protei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Wistar Institute Animal Facility, la Microscopy Facility, la Histotechnology Facility e il Research Supply Center. Questo studio è stato finanziato in parte da sovvenzioni della U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), del Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation e della Melanoma Research Foundation.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
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