Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Kultivert primære eller etablerte cellelinjer er ofte brukt til å ta grunnleggende biologiske og mekanistisk spørsmål som en første tilnærming før du bruker dyremodeller. Denne protokollen beskriver hvordan man skal tilberede hele celle ekstrakter og subcellulære fraksjoner for studier av sink (Zn) og andre sporstoffer med Atomic absorbansen spektroskopi.

Abstract

Overgangs metaller er essensielle mikronæringsstoffer for organismer, men kan være giftig for celler ved høye konsentrasjoner ved å konkurrere med fysiologiske metaller i proteiner og generere Redox stress. Patologiske tilstander som fører til tømming av metall eller akkumulering er årsakssammenheng mellom ulike menneskelige sykdommer. Noen eksempler er anemi, acrodermatitis enteropathica, og Wilson ' s og Menkes ' sykdommer. Det er derfor viktig å være i stand til å måle nivåene og transport av overgangs metaller i biologiske prøver med høy følsomhet og nøyaktighet for å gjøre det lettere å undersøke hvordan disse elementene bidrar til normale fysiologiske funksjoner og Toksisitet. Sink (Zn), for eksempel, er en kofaktor i mange pattedyr proteiner, deltar i signalering hendelser, og er en sekundær Messenger i cellene. I overkant, Zn er giftig og kan hemme absorpsjon av andre metaller, mens i underskudd, kan det føre til en rekke potensielt dødelige forhold.

Grafitt ovn Atomic absorpsjon spektroskopi (GF-AAS) gir en svært følsom og effektiv metode for å bestemme Zn og andre overgangen metall konsentrasjoner i ulike biologiske prøver. Elektrotermiske forstøvning via GF-AAS kvantifiserer metaller ved Forstøvende små mengder av prøver for påfølgende selektiv absorpsjon analyse ved hjelp av bølgelengde av eksitasjon av elementet av interesse. Innenfor rammene av linearitet av Beer-Lambert Law, er absorbansen av lys av metallet direkte proporsjonal med konsentrasjonen av analytt. Sammenlignet med andre metoder for å bestemme Zn innhold, oppdager GF-AAS både frie og complexed Zn i proteiner og muligens i små intracellulære molekyler med høy følsomhet i små prøve volumer. Dessuten er GF-AAS også lettere tilgjengelig enn Induktivt kombinerte plasma masse massespektrometri (ICP-MS) eller Synchrotron røntgen fluorescens. I denne metoden beskrives den systematiske prøve forberedelsen av ulike kulturperler for analyser i en GF-AAS. Variasjoner i dette sporet element ble sammenlignet i både hele cellen lysater og subcellulære fraksjoner av voksende og differensiert celler som bevis på prinsippet.

Introduction

Overgang og tungmetaller, slik som Zn, Cu, MN, og Fe, finnes naturlig i miljøet i både næringsstoffer i mat og forurensning. Alle levende organismer krever forskjellige mengder av disse mikronæringsstoffer; eksponering for høye nivåer er imidlertid skadelige for organismer. Metall oppkjøp er hovedsakelig gjennom dietten, men metaller kan også inhalert eller absorberes gjennom huden1,2,3,4,5. Det er viktig å merke seg at tilstedeværelsen av metaller i atmosfæriske partikler er økende og har vært i stor grad forbundet med helserisiko. På grunn av menneskeskapte aktiviteter har det blitt påvist økte nivåer av tungmetaller som AG, som, CD, CR, HG, ni, fe og Pb i atmosfæriske partikler, regnvann og jord6,7. Disse metaller har potensial til å konkurrere med essensielle fysiologiske sporelementer, spesielt Zn og Fe, og de induserer toksiske effekter av inaktivere grunnleggende enzymer for biologiske prosesser.

Trace element Zn er Redox nøytral og oppfører seg som en Lewis Acid i biologiske reaksjoner, noe som gjør det til en grunnleggende kofaktor nødvendig for protein folding og katalysator i over 10% av pattedyr proteiner8,9, 10andre; Følgelig er det viktig for ulike fysiologiske funksjoner8,11. Men som mange sporstoffer, det er en delikat balanse mellom disse metaller tilrettelegge normal fysiologisk funksjon og forårsaker toksisitet. I pattedyr, Zn mangler føre til anemi, vekst retardasjon, hypogonadisme, hud unormalt, diaré, alopecia, smaksforstyrrelser, kronisk betennelse, og nedsatt immun-og nevrologiske funksjoner11,12, 13,14,15,16,17,18. I overkant er Zn cytotoksisk og hemmer absorpsjon av andre essensielle metaller som kobber19,20,21.

I tillegg har noen metaller som Cu og Fe potensial til å delta i skadelige reaksjoner. Produksjon av reaktive oksygen arter (ros) via Fenton kjemi kan forstyrre monteringen av jern svovel klynge proteiner og endre lipid metabolisme22,23,24. For å hindre denne skaden, celler utnytte metall-binding chaperones og transportører for å hindre toksiske effekter. Utvilsomt, må metall homeostase være strengt kontrollert for å sikre at bestemte celletyper opprettholde riktig nivå av metaller. Av denne grunn er det et betydelig behov for å fremme teknikker for nøyaktig måling av spor metaller i biologiske prøver. I utvikling og modne organismer finnes det en differensial biologisk behov for sporstoffer på cellenivå, på ulike utviklingsmessige stadier, og i normale og patologiske tilstander. Derfor nøyaktig bestemmelse av vev og systemiske metall nivåer er nødvendig for å forstå organismal metall homeostase.

Grafitt Furnace Atomic absorpsjon massespektrometri (GF-AAS) er en svært følsom teknikk som brukes for små prøve volumer, noe som gjør det ideelt å måle overgangen og tungmetaller tilstede i biologiske og miljømessige prøver25,26 , 27 andre priser , 28. videre, på grunn av høy følsomhet av teknikken, har det vist seg å være hensiktsmessig for å studere de fine transport egenskapene til na+/K+-ATPase og mage H+/K+-ATPase ved hjelp av Xenopus oocytter som modell system29. I GF-AAS, de atomized elementene i et utvalg absorberer en bølgelengde av stråling som slippes ut av en lyskilde som inneholder metall av interesse, med absorbert stråling proporsjonal med konsentrasjonen av elementet. Elemental elektronisk eksitasjon finner sted ved absorpsjon av ultrafiolett eller synlig stråling i en kvantisert prosess som er unik for hvert grunnstoff. I en enkelt elektron prosess innebærer opptaket av et foton et elektron som beveger seg fra et lavere energi nivå til et høyere nivå i Atom-og GF-AAS bestemmer mengden av fotoner som absorberes av prøven, som er proporsjonal med antall strålings absorberende elementer atomized i grafitt røret.

Selektivitet av denne teknikken er avhengig av den elektroniske strukturen av atomer, der hvert element har en bestemt absorpsjon/utslipp Spectral linje. I tilfelle av Zn, den absorbansen bølgelengde er 213,9 NM og kan være nøyaktig skilles fra andre metaller. Overall, GF-AAS kan brukes til å kvantifisere Zn med tilstrekkelige grenser for deteksjon (LOD) og høy følsomhet og selektivitet25. Endringene i absorbert bølgelengde er integrert og presentert som topper energi absorpsjon på bestemte og isolerte bølgelengder. Konsentrasjonen av Zn i en gitt prøve beregnes vanligvis fra en standard kurve av kjente konsentrasjoner i henhold til Beer-Lambert-loven, hvor absorbansen er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av Zn i prøven. Men å anvende Beer-Lambert-ligningen på GF-AAS-analyser viser også noen komplikasjoner. Variasjoner i forstøvning og/eller ikke-homogene konsentrasjoner av prøvene kan for eksempel påvirke metall målingene.

Metall forstøvning som kreves for GF AAS sporings element analyse består av tre grunnleggende trinn. Det første trinnet er desolvation, hvor det flytende løsemiddel er fordampet; forlater tørre forbindelser etter at ovnen når en temperatur på rundt 100 ° c. Deretter blir forbindelsene fordampet ved å varme dem fra 800 til 1 400 ° c (avhengig av elementet som skal analyseres) og bli en gass. Til slutt er forbindelsene i gass-staten atomized med temperaturer som spenner fra 1 500 til 2 500 ° c. Som diskutert ovenfor, vil økende konsentrasjoner av et metall av interesse gjengi proporsjonal økning på absorpsjon oppdages av GF-AAS, men ovnen reduserer det dynamiske spekteret av analyser, som er den arbeider spekter av konsentrasjoner som kan bestemmes av instrumentet. Således krever teknikken lave konsentrasjoner og en forsiktig bestemmelse av det dynamiske spekteret av metoden ved å bestemme LOD og grensen for linearitet (LOL) av Beer-Lambert lov. Den LOD er det minste antallet som kreves for en substans som skal oppdages, definert som tre ganger standardavviket for Zn i matrisen. Den LOL er den maksimale konsentrasjon som kan oppdages ved hjelp av Beer-Lambert lov.

I dette arbeidet beskriver vi en standard metode for å analysere nivåene av Zn i hele celle ekstrakter, cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner, og i voksende og differensiere kulturperler celler (figur 1). Vi tilpasset den raske isolering av kjerner protokollen til ulike cellulære systemer for å hindre metall tap under prøveforberedelse. Den cellulære modeller som brukes var primære myoblasts avledet fra musen satellitt celler, murine neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytter, en menneskelig ikke-tumorigene bryst epitel cellelinje (MCF10A), og epitel Madin-Darby canine nyre ( MDCK)-celler. Disse cellene ble etablert fra ulike linjene og er gode modeller for å undersøke avstamning spesifikke variasjoner av metall nivåer in vitro.

Primær myoblasts avledet fra mus satellitt celler utgjør en godt egnet in vitro modell for å undersøke skjelettlidelser muskel differensiering. Spredning av disse cellene er rask når kultivert under høye serum forhold. Differensiering i muskel avstamning blir deretter indusert av lavt serum forhold30. Den murine neuroblastom (N2A) etablerte cellelinje ble avledet fra musen neural Crest. Disse cellene presentere neuronal og Amoeboid stilk cellen morfologi. Ved differensiering stimulans, de N2A cellene presentere flere egenskaper av neurons, som neurofilamenter. N2A celler brukes til å etterforske Alzheimers sykdom, neurite utvekst, og nevrotoksisitet31,32,33. Den 3T3-L1 murine pre-adipocytter etablerte cellelinjen er vanligvis brukes til å undersøke metabolske og fysiologiske endringer forbundet med adipogenesis. Disse cellene presentere en Fibroblast-lignende morfologi, men når stimulert for differensiering, presenterer de enzymatisk aktivering forbundet med lipid syntese og triglyserider akkumulering. Dette kan observeres som morfologiske endringer for å produsere cytoplasmatiske lipid dråper34,35. MCF10A er en ikke-tumor bryst epitel cellelinje avledet fra en premenopausale kvinne med bryst fibrocystic sykdom36. Det har vært mye brukt for biokjemiske, molekylær, og cellulære studier knyttet til brystkreft som spredning, celle migrasjon, og invasjon. Den Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitel cellelinjen har blitt mye brukt til å undersøke egenskaper og molekylære hendelser knyttet til etablering av epitel fenotype. Ved å nå samløpet, disse cellene blir polarisert og etablere celle-celle adhesjon, egenskaper av pattedyr epitel vev37.

For å teste AAS evne til å måle nivåene av Zn i pattedyrceller, analyserte vi hele og subcellulære fraksjoner (stoffer og nucleus) av disse fem cellelinjene. AAS-målinger viste ulike konsentrasjoner av Zn i disse celle typene. Konsentrasjonen var lavere i voksende og differensiering primære myoblasts (4 til 7 nmol/mg protein) og høyere i de fire etablerte cellelinjer (alt 20 til 40 nmol/mg protein). En liten ikke-signifikant økning i Zn nivåer ble påvist i å skille primære myoblasts og neuroblastom celler i forhold til voksende celler. Den motsatte effekten ble påvist i differensiert adipocytter. Men voksende 3T3-L1-celler viste høyere konsentrasjoner av metallet sammenlignet med differensiert celler. Viktigere, i disse tre cellelinjer, subcellulære fraksjonering viste at Zn er differensielt distribueres i stoffer og kjernen i henhold til metabolsk tilstand av disse cellene. For eksempel, i voksende myoblasts, N2A celler, og 3T3-L1 pre-adipocytter, et flertall av metallet er lokalisert til kjernen. Ved induksjon av differensiering ved hjelp av spesifikke celle behandlinger, Zn lokalisert til stoffer i disse tre celletyper. Interessant, viste både epitel cellelinjer høyere nivåer av Zn under spredning sammenlignet med når samløpet, der en karakteristisk stram monolag ble dannet. I voksende epitelceller, bryst cellelinjen MCF10A hadde en lik Zn fordeling mellom stoffer og kjernen, mens i nyre-avledet cellelinje, det meste av metallet var plassert i kjernen. I disse to celle typene, da cellene nådde samløpet, var Zn overveiende lokalisert til stoffer. Disse resultatene viser at GF-AAS er en svært følsom og nøyaktig teknikk for å utføre elementær analyse i lav kapasitets prøver. GF-AAS kombinert med subcellulære fraksjonering og kan tilpasses for å undersøke nivåene av sporstoffer metall elementer i ulike cellelinjer og vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. pattedyr cellekultur

  1. Generelle hensyn
    1. Følg aseptisk teknikk for pattedyr cellekultur som tidligere har gjennomgått38.
    2. Oppretthold alle cellelinjer i en fuktet 5% CO2 inkubator ved 37 ° c. Cellekultur forhold varierer for hver celle type. Det er viktig å opprettholde passende kultur forhold for hver cellelinje som brukes, som variasjoner av disse prosedyrene vil føre til avvikende fenotyper og svikt i celle kulturen.
    3. Sikre bekjentskap med cellelinjen av interesse, og følg protokollene som er angitt for hver celle type valgt for spesifikke eksperimenter (se noen eksempler nedenfor).
  2. Generell prosedyre for trypsinization og bestått av tilhenger celler
    1. Fjern cellekultur mediene fra kultur platen ved aspirasjon.
    2. Vask cellene forsiktig ved hjelp av PBS uten kalsium og magnesium (5 mL per 10 cm2 kultur areal). Tilsett vaskeløsningen på siden av platen for å unngå å løsne celle monolag; platen for å maksimere dekningen av løsningen. For epitelceller, er det nødvendig å ruge cellene i 10 til 15 min i inkubator ved 37 ° c i PBS å lette dissosiasjon av celler i følgende trinn.
    3. Fjern vaskeløsningen ved aspirasjon.
    4. Legg nok dissosiasjon reagens (0,25% Trypsin) til platen (ca. 0,7 mL per 10 cm2). Roter platen forsiktig for å få fullstendig dekning av celle monolag.
    5. Ruge kulturen ved romtemperatur i 2 til 5 min. Den faktiske inkubasjonstiden varierer med cellelinjen som brukes, i tilfelle av epitelceller er anbefalt å ruge i 10 til 15 min i inkubator ved 37 ° c. Observer cellene under mikroskopet for celle avløsning.
    6. Når de fleste av cellene har løsrevet, gjenopprette celle suspensjonen i 5 mL av pre-varmet plating eller vekstmedium (se nedenfor for noen eksempler). Mekanisk distansere celle klumper ved pipettering over cellen monolag flere ganger.
    7. Overfør celle suspensjonen til en 15 mL konisk rør og sentrifuger dem på 1 000 x g for 2 til 5 min. Sentrifugering hastighet og tid varierer basert på celletypen. Fjern Media ved milde aspirasjon, være forsiktig med å berøre cellen pellet. Resuspend celle pellet i 5 til 10 mL av riktig pre-varmet vekstmedium og fjerne en prøve for telling ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisk celle teller.
    8. Bruk riktig volum av celle suspensjonen for å frø den anbefalte tettheten for hver spesifikke cellelinje (se nedenfor for noen eksempler). Supplere med tilstrekkelig volum av kultur medier i henhold til størrelsen på kulturen parabolen og plassere cellene tilbake i inkubator.
  3. Primær myoblasts avledet fra muse satellitt celler
    1. Før du starter, forberede kollagen-belagt plater for primær myoblast vekst. En løsning som inneholder 0,02% kollagen, og 0,05 M eddiksyre i deionisert vann må steriliseres ved filtrering med en 0,22 μm steril Filterenhet. Ruge kultur platene med kollagen-løsningen over natten ved 37 ° c.
    2. Neste dag, aspirer kollagen, la platene lufttørke i det sterile kabinettet og oppbevares ved 4 ° c til bruk.
      Merk: minimale volumer av kollagen er: for 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Seed primære myoblasts på 1 x 104 celler/cm2 i 55 cm2 kollagen-belagt kultur plater. Spredningen Media er Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM)/ham ' s F12 næringsstoff blanding kultur medier som inneholder 20% fosterets storfe serum (FBS), 25 ng/mL av rekombinant grunnleggende fibroblastic vekstfaktor (FGF), og 100 U/mL av penicillin/Streptomycin.
      Merk: voksende og lager celler skal opprettholdes under 50% av confluency. Celle kontakt induserer engasjement av cellene for å myogenic differensiering og svekker veksten evnene til kulturen.
    4. For å skille den primære myoblasts, tillater cellene å nå 80% til 100% confluency, som vanligvis oppstår etter 48 h av plating. Deretter bytte til differensiering Media (DMEM, 2% hest serum, 1% insulin, transferrin, selen A supplement, og 100 U/mL av penicillin/Streptomycin). Oppdater mediene daglig til innhøsting.
  4. Murine neuroblastom (N2A)
    1. Plate N2A celler i en tetthet på 2 x 104 celler/cm2 i vekst medier, som inneholder en blanding av redusert serum medium/DMEM inneholdende høy glukose og L-glutamin (1:1, v:v), SUPPLERE med 10% FBS og 100 U/ml av penicillin/Streptomycin. Opprettholde aksje kulturen under 50% confluency.
    2. Indusere differensiering av N2A celler gang confluency nådd 25% til 40%. Bytt til differensiering medier som inneholder en blanding av redusert serum medium/DMEM, 1% FBS, og 20 μM retinoic syre for 7 til 10 dager. Oppdater mediet annenhver dag til celle innhøstingen.
      Merk: som N2A celler differensiere, blir noen celler runde, løsne lett, og kan gjennomgå apoptose. Vær forsiktig når du aspirating og legger til kultur mediene til platene.
  5. 3T3 L1 murine pre-adipocytter
    1. Oppretthold mus 3T3/L1-celler i DMEM med høy glukose, supplert med 10% FBS og 100 U/mL av penicillin/Streptomycin. Adipogenic prosessen er avhengig i samløpet av cellene; derfor ikke la aksje kulturen vokse over 50% confluency, som høyere samløpet vil svekke evnen til cellene å differensiere.
    2. Plate cellene på 2 x 104 celler/cm2. På denne tettheten, vil cellene nå samløpet i 3 dager.
    3. Indusere adipogenic differensiering to dager etter at cellene nå 100% confluency. Induksjon Media består av DMEM inneholdende 10% FBS μg/mL insulin, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methyxanthine, 1 μM deksametason og 10 μM troglitazone.
    4. Erstatt induksjon Media etter 48 h inkubasjons til differensiering Media (DMEM inneholder 10% FBS, og 5 μg/mL insulin). Oppdater Media annenhver dag til innhøstingen. Representative prøver av full differensiering er normalt samlet mellom 7 og 10 dager etter adipogenic induksjon.
      Merk: som adipogenesis utvikler seg, blir cellene runde og har en tendens til å løsne lett. Vær forsiktig når du aspirating og legger til kultur mediene til platene.
  6. MCF10A celler
    1. Plate MCF10A celler i DMEM/F12 (1:1, v:v), supplert med 5% FBS, 100 U/mL penicillin/Streptomycin, 0,5 μg/mL Hydrocortisone, 10 μg/mL insulin, og 20 ng/mL epidermal vekstfaktor (EGF). Anbefalt seeding tetthet er 1 x 105 celler/cm2. Under disse forholdene, cellene vil nå 100% confluency innen 4 dager. Oppdater Media hver 2 til 3 dager før innhøstingen.
      Merk: MCF10A celler er vanskelig å løsne. Det anbefales å ruge cellene i 10 til 15 min ved 37 ° c i PBS fri for kalsium med 0,5 mM EDTA før trypsinization.
  7. Madin-Darby hjørnetann nyreceller (MDCK)
    1. Plate MDCK celler i DMEM supplert med 10% FBS og 100 U/mL av penicillin/Streptomycin. Anbefalt seeding tetthet er 1 x 105 celler/cm2, der cellene vil nå 100% confluency innen 3 dager. Oppdater Media hver 2 dager til innhøsting.
      Merk: MDCK-celler er vanskelige å løsne. Det anbefales å ruge cellene i 5 til 10 min ved 37 ° c i PBS uten kalsium og magnesium før trypsinization. For å hindre at celle klumper ikke agitere platene ved å slå eller riste flasken mens du venter på at cellene skal løsne.

2. pattedyr cellekultur prøveforberedelse for AAS: hele cellen og subcellulære fraksjonering

  1. Kultur cellene av interesse i 55 cm2 plater. Bruk av mindre kultur plater kan gi prøver med nivåer av metaller under deteksjons grensene til GF-AAS.
  2. Hele celle ekstrakt
    1. Aspirer kultur mediene ved hjelp av en vakuum felle. Sørg for å fjerne alle spor av Media. Skyll cellene fra de ønskede tid punkter eller kultur forhold tre ganger med iskald PBS fri for kalsium og magnesium.
    2. Umiddelbart skrape cellene fra platen ved hjelp av en ny plast celle skraper i 1 mL PBS fri for kalsium og magnesium. Overfør prøven til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube og sentrifuger for 2 min ved 2 000 x g og aspirer supernatanten. Protokollen kan stanses midlertidig her. Oppbevar pellet prøver ved-20 ° c eller gå videre til trinn 2,4.
  3. Subcellulære fraksjonering
    1. Aspirer kultur mediene ved hjelp av en vakuum felle. Sørg for å fjerne alle spor av Media. Skyll cellene fra de ønskede tid punkter eller kultur forhold tre ganger med iskald PBS fri for kalsium og magnesium. Skrap cellene av platen med 1 mL iskald PBS fri for kalsium og magnesium.
    2. Overfør prøvene til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør og hold på isen. Sentrifuger for 10 s ved 10 000 x g. Fortsette rask isolering av kjerner hvis metall analyse av cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner er ønsket. Denne prosedyren vil minimere potensialet tap av metaller på grunn av celle utvinning39, 40.
    3. Fjern supernatanten ved aspirasjon og resuspend celle pellet i 400 μL av iskald PBS fri for kalsium og magnesium, inneholdende 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), et ikke-ioniske vaskemiddel. Overfør 100 til et nytt mikrosentrifugen rør og Vurder det som hele Celleprøven. Denne alikvot representerer 25% av prøven.
    4. Isolere kjerner ved pipettering cellen suspensjonen 5 til 10 ganger på isen med en P1000 micropipette spissen. Kjerner isolasjon av epitelceller krever en konsentrasjon av 0,5% NP-40. Oppnå celle dissosiasjon ved å passere cellen suspensjonen gjennom en 26 3/4 G nål 10 til 15 ganger, etterfulgt av 10 til 15 passasjer gjennom en 30 1/2 G nål.
      Merk: Kontroller kjernene integritet ved lys mikroskopi ved hjelp av en 40x mål.
    5. Sentrifuger den resterende celle lysat suspensjonen (300 μL) for 10 s ved 10 000 x g. Supernatanten vil inneholde cytosolic brøkdel. Overfør 300 μL til et nytt mikrosentrifugen rør.
    6. Skyll pellet med den kjernefysiske fraksjonen i 500 μL PBS fri for kalsium og magnesium, inneholdende 0,1% NP-40, deretter sentrifuge i 10 s ved 10 000 x g. Ta av supernatanten og resuspend pellet inneholdende kjerner i 100 til μL av samme løsning.
      Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Prøvene kan oppbevares ved-20 ° c.
  4. Lyse cellene med tre sonikering sykluser (30 s på/30 s av, ved 50 kHz, 200 W) i 5 min. kvantifisere totalt proteininnhold i utvalget av Bradford41.
  5. Utføre kvalitetskontroll av renheten av fraksjoner av Western Blot bruker antistoffer spesifikke for enten kjernefysiske (histoner, kromatin remodelers, kjernefysiske matrise proteiner) eller cytosolic fraksjoner (β-tubulin, β-utgangen) (figur 2).
    Merk: ikke bruk sonikatorer med metall tupp. Disse kan forurense prøven med metaller.

3. Zn innhold analyse av hele cellen og subcellulære fraksjoner av pattedyr cellekulturer av Atomic absorbansen spektroskopi

  1. Mineralize cellekultur prøvene (hel celle eller kjernefysiske fraksjoner) ved syre fordøyelsen ved hjelp av et likt volum av konsentrert HNO3 Trace metal grade (forsiktighet) for 1 h ved 80 ° c, deretter over natten ved 20 ° c.
  2. Stopp reaksjonen ved å legge 30% av reaksjons volumet av H2O2. Ta prøvevolumet til 500 μL med 18 MΩ renset vann.
    Merk: HNO3 håndtering bør gjøres med kjemiske vernebriller, et ansiktsskjerm for beskyttelse mot sprut, hansker, og en godkjent damp respirator Hvis tilstrekkelig ventilasjon (avtrekks hette) ikke er tilgjengelig. Protokollen kan stanses midlertidig her. Prøvene kan oppbevares ved romtemperatur (RT).
  3. Forbered standard løsninger og eksperimentelle prøver for Zn målinger av AAS utstyrt med en grafitt ovn.
    1. Bruk 2% (v/v) HNO3 løsning i deionisert vann, kommer fra samme batch brukes for standard kurve som blank løsning for kalibrering gjennom. Bruk analytiske kvalitetsstandarder fortynnet i 18 MΩ renset vann.
    2. Forbered en standard på 1 000 ppb av Zn fra en kommersielt tilgjengelig 1 000 ppm Zn lagerløsning med 2% (v/v) HNO3 -løsning i deionisert vann. Forbered arbeids standard løsninger fra 100-ppb standard ved å fortynne den til 5, 8, 10, 15, 20 og 25 ppb direkte med 2% (v/v) HNO3 -løsning i deionisert vann. Klargjør Zn-standardene og det tomme med en 0,1% (1 g/L) mg (nr3)2 Matrix-spesial.
      Merk: LOD av Zn er 0,01 ppb (μg/L). Ved å øke konsentrasjonen av standardene, var grensen for linearitet av Zn fast bestemt på å være 20 ppb (Figur 3).
    3. Mål standard og prøver under de samme optimaliserte betingelsene: strømningshastighet for innføring av 250 mL/min, injeksjons temperatur på 20 ° c og GF temperatur på 1 800 ° c.
      Merk: GF temperatur ble økt til 2450 ° c for cleanout trinn, før injeksjon av en ny prøve eller standard.
    4. Optimaliser lampen (C-HCL) til en strøm på 20 A, bølgelengde på 213,9 NM, og slit av 0,7 NM.
    5. Mål mineralisert prøvene ved hjelp av Zn standardkurven for å bestemme metall innhold. Når små volumer måles, kan prøvene fordampe hvis målingene tar lang tid. Derfor anbefales det å legge vann til prøvene. Fortynne prøvene med 18 MΩ renset vann behandlet med 0,01% HNO3 (analytisk grade) hvis informasjonen oppnådd er over det Lod.
      Merk: prøvene fortynnes vanligvis til et volum på 500 μL, plassert i den automatiserte autosampler av AAS som skal måles rett etter at standardkurven er etablert. Det nødvendige volumet bør bestemmes av brukeren og bør vurdere endelige beregninger av konsentrasjoner. Det anbefales å fullføre Zn bestemmelser fra AAS om et komplett eksperiment i ett forsøk. Hvis målingene stanses midlertidig, kan det føre til store eksperimentelle variasjoner og inkonsekvenser.
  4. Konverter ppb målinger til molaritet som innhentet fra Zn målt via AAS. Vurder massen av Zn (65,39 AMU). Delmengden av ppb innhentet av AAS ved 63 390 000. I celler, Zn konsentrasjoner spenner fra enheter av pmol til mikromol.
    1. Del konsentrasjonen av Zn (pmol eller mikromol) av den første massen av protein i utvalget bestemmes av Bradford (trinn 2,4). Denne beregningen vil gjengi mengden av metall (pmol eller mikromol Zn) inneholdt per mg protein av prøven.
      Merk: det er viktig å vurdere de fortynning faktorene som benyttes under metall bestemmelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi testet GF-AAS evne til å påvise minutt nivåer av Zn i pattedyrceller (figur 1). Derfor, vi kultivert primære myoblasts avledet fra musen satellitt celler, og de etablerte cellelinjer N2A (neuroblastom avledet), 3T3 L1 (adipocytter), MCF10A (bryst epitel), og MDCK celler (hund nyre epitel). Først isolerte vi hele celle, cytosolic, og kjernefysiske fraksjoner av alle disse celletyper og evaluert renheten av fraksjoner av Western Blot (figur 2). Representative immunodetection av kromatin remodeler Brg1 og tubulin som markører for henholdsvis kjernefysiske og cytosolic fraksjoner viste egnetheten til den subcellulære fraksjonering protokollen beskrevet i avsnitt 2,3 for å utføre den grunnleggende analyse (figur 2). Hele celle-og subcellulære fraksjoner ble fremstilt som beskrevet ovenfor for GF-AAS-analyser, og kalibrering av utstyret ble utført for å gi en typisk lineær standard kurve (Figur 3).

Figur 4 viser representative lys mikroskopi bilder av voksende og differensiert eller confluent monolagere av hver celle type, og tilsvarende Zn nivåer for disse. Viktigere var alle cellelinjene analysert i denne studien viste Zn konsentrasjoner i nM-serien. Imidlertid ble en differensial distribusjon av metallet oppdaget. Differensiert primære myotubes utstilt høyere nivåer av Zn enn voksende celler (figur 4a). Spesielt var mye av ion ligger til kjernefysiske brøkdel i både voksende og differensiere myoblasts. En lignende subcellulære fordeling av Zn ble oppdaget i neuroblastom avledede cellelinje N2A (figur 4b). Men målingene viste at N2A celler hadde Zn nivåer en størrelsesorden høyere enn primære myoblasts. På den andre side, det etablerte 3T3-L1 cellen line forevise høyere høyder av Zn når det pre-adipocytter var voksende enn når de var indusert å skille ut og blankett modne adipocytter det akkumulere lipider (skikkelsen 4c).

Vi målte også Zn innhold i to forskjellige etablerte epitel cellelinjer: MCF10A avledet fra menneskets melke kjertel (figur 4d) og hunden nyre-avledet MDCK (figur 4e) celler. Interessant, i begge tilfeller, høyere nivåer av Zn i voksende celler enn i confluent monolagere ble oppdaget. Imidlertid viste epitelceller avledet fra bryst kjertelen metall nivåer som var 2-fold høyere enn nyreceller. MCF10A celler viste like nivåer av Zn mellom cytosolic og kjernefysiske fraksjoner i voksende celler. Når MCF10A celler nå samløpet, en 40% nedgang i hele cellen Zn nivåer ble oppdaget, og metallet ble funnet å være mest konsentrert i cytosolic brøkdel (figur 4d). Omvendt, voksende MDCK celler utstilt høyere nivåer av Zn i den kjernefysiske fraksjonen, sammenlignet med cytosolic brøk, men når MDCK cellene nådde samløpet, en reduksjon av Zn i hele celler ble oppdaget, med flertallet av denne overgangen metall observert i cytosolic brøkdel (figur 4e).

Figure 1
Figur 1: representativ flytskjema for elementær (Zn) analyser av pattedyr kultur celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: validering av renheten av fraksjoner innhentet via rask isolering av kjerner protokollen 39 for alle , 40. representative Western Blot fra å skille primære myoblasts viser renheten av subcellulære fraksjoner. Den kromatin remodeler enzym Brg1 ble brukt til å identifisere den kjernefysiske fraksjonen, og tubulin ble brukt til å identifisere cytosolic brøkdel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kalibreringskurven til Zn-standardene. Representative standard kurve for Zn bestemt av GF-AAS. GF-AAS ble kalibrert med standard Zn-løsninger fortynnet ved følgende konsentrasjoner: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 og 30 ppb. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: sink nivåer i ulike pattedyr kulturperler celler. Representative lys micrographs og Zn innhold i hele celle ekstrakter og cytosolic og kjernefysiske fraksjoner. Data representerer gjennomsnittet av tre uavhengige biologiske replikerer ± SEM. (A) murine primær myoblasts voksende og differensiering i 2 dager. (B) MURINE neuroblastom N2A cellelinje før og etter induksjon å differensiere ved retinoic syre behandling. (C) murine 3T3-L1 pre-adipocytter og 6 dager innlegg differensiering. (D) pre-confluent og confluent monolag av den menneskelige bryst epitel cellelinje MCF10A. (E) pre-confluent og confluent monolag av nyre epitel cellelinje MDCK. Data representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SE. student t-test viser betydning, * p ≤ 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Atomic absorbansen spektroskopi er en svært følsom metode for Zn kvantifisering i små volum/masse biologiske prøver. Den beskrevne optimaliseringen av Zn måling gjør anvendelsen av denne metoden enkel og garanterer ideelle analytiske forhold. Her, ved hjelp av GF-AAS, bestemte vi konsentrasjonen av Zn i hele celler, og i cytosolic og kjernefysiske fraksjoner, fra ulike cellelinjer. Resultatene viser at denne teknikken gjengir sammenlignes med de som oppnås ved fluorescerende sonder og ICP-MS. For eksempel, flere fluorescerende sonder viste labilt mitokondrie Zn nivåer i størrelsesområdet 0,1 til 300 pM, nivåer i Golgi var under picomolar rekkevidde, og endoplasmatiske retikulum varierte fra 800 til 5 000 pM42, som er forenlig med nivåer påvist i cytosolic fraksjoner. Videre Zn-responsive fluoroforen FluoZin-3 viste akkumulering av labilt Zn i små cytosolic blemmer i MCF10A og i C2C12 celler43,44, som også er i samsvar med Zn kvantifisert i cytoplasma. Videre Zn analyser av ICP-MS utført av vår gruppe viste at hele celle nivåer Zn i å skille primære myotubes45 er lik de som er innhentet i denne rapporten av GF-Aas. Dessuten, eksempler av Zn bestemmelse inne C6 rotten glioma celler av benytter AAS og Zinquin-E46 ha likeledes gjort lignende områder å dem bemerket inne neuroblastom N2A celler anvendt her over.

Hittil har ulike teknikker er utviklet for å oppdage Zn i celler. Men GF-AAS er fortsatt en nøyaktig og svært følsom teknikk som ikke bare tillater påvisning av gratis Zn, men også måler metall complexed og bundet til proteiner og potensielt til små molekyler. Vår gruppe viste nylig at målinger utført med celle gjennomtrengelig fluorescerende sonde (som har en høy affinitet til å binde fri Zn2 +) direkte korrelert med nivåene av Zn oppdaget av GF-AAS i voksende og differensiering myoblasts 43. imidlertid kan resultatene som oppnås ved disse sonder ikke være representative for hele cellen eller protein-bundet Zn konsentrasjoner. Videre, siden Zn eksisterer som en ikke-Redox aktive arter og som divalent, under fysiologiske forhold, forble oppdagelsen i cellulære systemer en utfordring. Romanen Zn Imaging teknikker har blitt tilgjengelig, slik som State-of-the-art Synchrotron-baserte X-ray fluorescens mikroskopi, radioisotopes, og laser ablasjon Induktivt-kombinert plasma Mass massespektrometri (LA-ICP-MS). Dessverre krever noen av disse teknikkene ressurser som er utilgjengelige for det vitenskapelige samfunnet29,42,47,48,49,50.

Studier har vist at ICP-MS er en mer presis teknikk enn AAS, som relative standardavvik verdier har vist å være lavere i ICP-MS bestemmelser for metaller som Zn. Den sannsynlige forklaringen på denne effekten er at ICP-MS er egentlig i stand til å eliminere kjemiske forstyrrelser, som opererer Argon temperaturer varierer fra 5 000 til 10 000 ° c. Noen kjemiske obligasjoner kan opprettholdes ved 3 000 ° c, som er i området for AAS drift. Disse obligasjoner vil bli fullstendig forstyrret på over 6 000 ° c. Derfor, disse høye temperaturene nådd i plasma tilstand av ICP-MS kan eliminere kjemiske forstyrrelser, fører til bedre deteksjon grenser51. I tillegg krever ICP-MS større volum prøver sammenlignet med GF-AAS, som sistnevnte er i stand til å operere med volumer under 100 μL, som er betydelig mindre enn andre spektroskopiske metoder som AAS, ICP-OES, eller ICP-MS. Gitt de små volumene som er involvert i metoden, er GF-AAS den ideelle teknikken for å bestemme Zn konsentrasjon i biologiske prøver, først og fremst hvis analysen involverer subcellulære fraksjoner, metall oppdagelser i renset proteiner, eller små variasjoner i mobilnettet metall innhold på grunn av mutasjoner i transportører eller metall bindende proteiner29,52. I tillegg er følsomheten til GF-AAS-systemet for å bestemme spor og ultra-Trace konsentrasjoner (PG/mL til ng/mL) en annen fordel.

Viktige hensyn bør tas for å sikre påliteligheten av GF-AAS data. Disse inkluderer tilstrekkelig kalibrering, integritet av grafitt røret, og valg av passende matrise spesial for elektrotermiske forstøvning. Matrix bestemmelsesord er kjemiske elementer lagt til prøven, noe som påvirker de termiske prosessene som finner sted i atomizer. Disse endringselementer minimerer tap av analytt under pyrolyse og bidra til fjerning av matrise komponenter. Samlet kan bestemmelsesord endre sample Matrix å fordampe matrisen komponenter ved lavere temperaturer og kan fungere som analytt stabilisatorer. I tillegg til disse hensyn, er det viktig å utføre tilstrekkelig optimalisering av trinnene for atomizer temperatur programmet.

To viktigste hensyn bør tas, inkludert 1) etablere optimal pyrolyse temperatur, som refererer til den maksimale temperaturen på forstøvning trinn der ingen analytt tap oppstår, og som tillater en maksimal absorbansen av analytt med minimal Bakgrunn. Man bør også vurdere 2) etablere optimal forstøvning temperatur, som refererer til den laveste temperaturen der analytt er fullstendig fordampet og registrert som reproduserbar signal eller topp. En av ulempene ved GF-AAS-analyser er forstyrrelser i elementene, som en grundig optimalisering og standardisering er avgjørende for nøyaktige målinger. Men hittil, GF-AAS representerer et viktig verktøy i vitenskapelig forskning for å oppdage metall ioner i ulike biologiske prøver. Fremtidige anvendelser av Zn (og andre metaller) gjenkjenningsmetoder av GF-AAS vil omfatte måling av nivåene av metaller i organer og vev innhentet fra dyremodeller eller pasient biopsier for bedre å forstå spesifikke fysiologiske behov for sporstoffer. Som konklusjon, GF-AAS er nøyaktig, følsom, kostnadseffektiv, og tilgjengelig, og denne analytiske teknikken vil fortsette å forbedre som teknologiske fremskritt gå videre for disse deteksjon systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av fakultetet mangfold Scholars Award fra University of Massachusetts Medical School til T.P.-B. N.N.-T. støttes av SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N er støttet av National Science Foundation Grant DBI 0959476. Forfatterne er takknemlige for Dr. Daryl A. Bosco for å gi N2A cellelinjen og til Daniella Cangussu for sin tekniske støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

Biokjemi sink Atomic absorbansen spektroskopi spredning differensiering pattedyr cellekultur subcellulære fraksjonering
Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter