Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Культивированный первичных или установленных клеточных линий обычно используются для решения фундаментальных биологических и механистических вопросов, как первоначальный подход, прежде чем использовать модели животных. Этот протокол описывает, как подготовить целые Клеточные экстракты и субклеточные фракции к изучению цинка (Zn) и других микроэлементов с атомной спектроскопии поглощения.

Abstract

Переходные металлы являются необходимыми микроэлементами для организмов, но могут быть токсичными для клеток в высоких концентрациях, конкурируя с физиологическими металлами в белках и генерируя восстановительный стресс. Патологические состояния, которые приводят к истощению или накоплению металла, являются причинные агенты различных заболеваний человека. Некоторые примеры включают анемию, акродерматит энтеропатии, и болезни Уилсона и Менкса. Поэтому важно иметь возможность измерять уровни и транспортировать переходные металлы в биологических образцах с высокой чувствительностью и точностью, чтобы облегчить исследования, исследуя, как эти элементы способствуют нормальным физиологическим функциям и Токсичность. Цинк (Zn), например, является кофактором во многих белков млекопитающих, участвует в сигнальных событиях, и является вторичным посыльным в клетках. В избытке, Zn является токсичным и может препятствовать поглощению других металлов, в то время как в дефиците, это может привести к целому ряду потенциально смертоносных условиях.

Графит печи атомной абсорбции спектроскопии (GF-ААС) обеспечивает высокочувствительный и эффективный метод для определения Zn и других концентраций переходных металлов в различных биологических образцов. Электротермическая атомизации через GF-ААС квантифицирует металлы путем распыления небольших объемов образцов для последующего выборочного анализа поглощения с использованием длины волны возбуждения элемента интересов. В рамках линейности закона Бир-Ламберта абсорбционные света металлом прямо пропорциональны концентрации анализатора. По сравнению с другими методами определения Zn содержание, GF-ААС обнаруживает как свободные и комплексность Zn в белки и, возможно, в небольших внутриклеточных молекул с высокой чувствительностью в небольших объемах выборки. Кроме того, GF-ААС также более доступными, чем индуктивно сочетании плазменной массы спектрометрии (ПМС-MS) или синхротрон основе рентгеновской флуоресценции. В этом методе описывается систематический образец подготовки различных культивируемых клеточных линий для анализа в GF-ААС. Вариации в этом трассированном элементе сравнивались как в целых клеточных лиях, так и в субклеточных фракциях пролиферирующих и дифференцированных клеток как доказательство принципа.

Introduction

Переходные и тяжелые металлы, такие как Zn, Cu, MN и Fe, встречаются естественным образом в окружающей среде как в питательных веществах, так и в продуктах питания и загрязнителях. Все живые организмы требуют различного количества этих питательных микроэлементов; Однако воздействие высоких уровней является пагубным для организмов. Приобретение металла в основном через диету, но металлы также может быть вдыхании или всасывается через кожу1,2,3,4,5. Важно отметить, что присутствие металлов в атмосферных частицах возрастает и в значительной степени связано с риском для здоровья. В связи с антропогенной деятельностью в атмосферных твердых частиц, дождевой воде и почве6,7были обнаружены повышенный уровень тяжелых металлов, таких как АГ, как, CD, CR, гектограмм, Ni, Fe и ПБ. Эти металлы обладают потенциалом конкурировать с необходимыми физиологическими микроэлементами, в частности Zn и Fe, и они индуцируют токсические эффекты, инактивируя фундаментальные ферменты для биологических процессов.

Микроэлемент Zn является редокс нейтральным и ведет себя как кислота Льюиса в биологических реакциях, что делает его фундаментальным кофактором, необходимым для складывания белка и каталитической активностью в более чем 10% белков млекопитающих8,9, в 10 лет; Следовательно, она имеет важное значение для различных физиологических функций8,11. Однако, как и многие микроэлементы, существует хрупкое равновесие между этими металлами, облегчающ нормальную физиологическую функцию и вызывая токсичность. У млекопитающих, Zn недостатки приводят к анемии, замедление роста, гипогонадизм, кожные аномалии, диарея, алопеция, вкусовые расстройства, хроническое воспаление, и нарушениями иммунной и неврологических функций11,12, 13,14,15,16,17,18. В избытке, Zn является цитотоксическим и ухудшает поглощение других основных металлов, таких как медь19,20,21.

Кроме того, некоторые металлы, как Cu и Fe имеют потенциал для участия в вредных реакций. Производство реактивных видов кислорода (рос) через химию Фентона может помешать сборке белков железорудного кластера и изменению липидного метаболизма22,23,24. Чтобы предотвратить этот ущерб, клетки используют металлические связывания сопровождающих и транспортеров для предотвращения токсического воздействия. Несомненно, металлический гомеостаз должен быть жестко контролируется, чтобы гарантировать, что конкретные типы клеток поддерживать надлежащий уровень металлов. По этой причине существует существенная потребность в продвижении методов точного измерения микрометаллов в биологических образцах. В развивающихся и зрелых организмах существует дифференциальная биологическая потребность в микроэлементах на клеточном уровне, на различных стадиях развития, в нормальных и патологических условиях. Таким образом, точное определение тканей и системных уровней металла необходимо понять, организмы металлический гомеостаз.

Графитовой печи атомной поглощения спектрометрии (GF-ААС) является весьма чувствительным методом, используемым для малых объемов выборки, что делает его идеальным для измерения переходных и тяжелых металлов, присутствующих в биологических и экологических образцов25,26 , 27 , 28. Кроме того, из-за высокой чувствительности техники, было показано, что целесообразно для изучения тонких транспортных свойств Na+/K+-Atpase и желудочный H+/K+-atpase использованием ксенопус ооцитов в качестве типовой системы29. В GF-ААС, распыленных элементов в образце поглощают длину волны излучения, излучаемого источником света, содержащего металл интересов, с поглощенной излучения пропорционально концентрации элемента. Элементарное электронное возбуждение происходит при поглощении ультрафиолетового или видимого излучения в квантизованному процессе, уникальном для каждого химического элемента. В процессе одного электрона поглощение фотона включает электрон, двигающий от более низкого уровня энергии до более высокого уровня в пределах атома, и GF-ААС определяет количество фотонов, поглощающих образец, который пропорционален количеству излучения, поглощающего элементы, распыленных в графитовой трубе.

Избирательность этого метода опирается на электронную структуру атомов, в которой каждый элемент имеет специфическую спектральную линию поглощения/излучения. В случае Zn, длина волны поглощения составляет 213,9 Нм и может быть точно отличается от других металлов. В целом, GF-ААС может использоваться для количественной оценки Zn с адекватными ограничениями обнаружения (ОД) и высокой чувствительностью и избирательностью25. Изменения в поглощенной длине волны интегрированы и представлены как пики поглощения энергии на специфических и изолированных длинами волн. Концентрация Zn в данной выборке, как правило, рассчитывается от стандартной кривой известных концентраций в соответствии с законом Бир-Ламберта, в котором абсорбционные непосредственно пропорциональны концентрации Zn в образце. Однако применение уравнения Бир-Ламберта к анализу GF-ААС также представляет некоторые осложнения. Например, различия в концентрациях в атомизации и/или неоднородности образцов могут влиять на измерение металла.

Металлические атомизации, необходимые для GF ААС трассировки элементарного анализа состоит из трех фундаментальных шагов. Первый шаг – это опустошающей, где испаряется жидкий растворитель; оставляя сухие соединения после печи достигает температуры около 100 ° c. После этого, соединения испаряются путем нагревать их от 800 до 1 400 °C (в зависимости от элемента, котор нужно проанализировать) и становят газ. Наконец, соединения в газообразном состоянии распыляется с температурами, которые варьируются от 1 500 к 2 500 ° c. Как говорилось выше, повышение концентраций металлического интереса окажет пропорциональное увеличение поглощения, обнаруженного GF-ААС, но печь уменьшает динамический диапазон анализа, который является рабочим диапазоном концентраций, которые могут быть определяется инструментом. Таким образом, методика требует низких концентраций и тщательного определения динамического диапазона метода путем определения Лода и предела линейности (LOL) Закона Бир-Ламберта. ОД является минимальным количеством, необходимым для обнаружения вещества, определяемых как три раза стандартное отклонение Zn в матрице. LOL является максимальная концентрация, которая может быть обнаружена с помощью пива-Ламберт закона.

В этой работе мы описываем стандартный метод анализа уровней Zn в цельных клеточных экстрактах, цитоплазматических и ядерных фракциях, а так же в размножающихся и дифференцирующих культивируемых клетках (рис. 1). Мы адаптировали быструю изоляцию протокола ядер к разным сотовым системам, чтобы предотвратить потерю металла во время подготовки образца. Сотовые модели, используемые были первичные миобластов, полученных из клеток мыши спутник, Мурин нейрообластомы клетки (N2A или Neuro2A), Мурина 3T3 лаунематоцитов, человека, не-опухолевых клеток груди эпителиальной линии (MCF10A), и эпителиальных Мадин-Дарби почки собак ( Клеток). Эти клетки были созданы из разных линий и являются хорошими моделями для исследования линии конкретных вариаций уровней металлов в пробирке.

Первичные миобласты, полученные из клеток-спутников мыши, представляют собой хорошо подходящую в пробирке модель для исследования дифференциации скелетных мышц. Распространение этих клеток быстро, когда культивируемых в условиях высокой сыворотки. Дифференциация в мышечной линии затем индуцированных низкой сыворотки условиях30. «Мурина нейрообластома» (N2A), созданная клеточная линия, была получена из мыши нейронной гребень. Эти клетки представляют нейронов и аамбоид стволовых клеток морфологии. После стимулирования дифференциации, клетки N2A представляют несколько свойств нейронов, таких как нейронити. N2A клетки используются для исследования болезни Альцгеймера, неврит, и нейротоксичность31,32,33. 3T3-й Мурина предадипоциты, установленные клеточной линии обычно используется для исследования метаболических и физиологических изменений, связанных с адипогенез. Эти клетки настоящее фиброскомного типа морфологии, но как только стимулируется для дифференциации, они представляют ферментативной активации, связанной с синтеза липидов и накопления триглицеридов. Это можно наблюдать как морфологические изменения для производства цитоплазматических капель липидов34,35. MCF10A это не опухоль молочной эпителиальной клеточной линии, полученной от пременопаузы женщина с молочной фиброзно-кистозной болезни36. Он широко использовался для биохимических, молекулярных и клеточных исследований, связанных с карциногенеза молочной железы, таких как распространение, клеточная миграция и вторжение. Манин-Дарби собачьей почки (МДК) эпителиальной клеточной линии широко используется для исследования свойств и молекулярных событий, связанных с созданием эпителиального фенотипа. После достижения слияния, эти клетки становятся поляризованным и установить клетки ячейки спайки, характеристики млекопитающих эпителиальных тканей37.

Чтобы проверить способность ААС измерять уровни Zn в клетках млекопитающих, мы проанализировали целые и субклеточные фракции (цитозоль и ядро) этих пяти клеточных линий. Измерения ААС показали различные концентрации Zn в этих типах клеток. Концентрация была ниже в распространении и дифференцирующих первичных миобластов (от 4 до 7 нмоль/мг белка) и выше в четырех установленных клеточных линиях (от 20 до 40 нмоль/мг белка). Небольшое несущественное увеличение уровней Zn было обнаружено при дифференциации первичных мизобластов и нейростозмы клеток по сравнению с пролиферирующих клеток. Противоположный эффект был обнаружен в дифференцированных адипоцитов. Однако, пролиферирующих клетки 3T3-1, выставлены более высокие концентрации металла по сравнению с дифференцированными клетками. Важно отметить, что в этих трех клеточных линиях субклеточная фракционирование показала, что ЗН по-разному распределяется в цитозолу и ядре в соответствии с метаболическим состоянием этих клеток. Например, в пролиферирующих миобластов, N2A клеток, и 3T3-У1 до адипоцитов, большинство из металла локализован в ядро. После индукции дифференцировки используя специфические обработки клетки, Zn локализуется к цитозолу в этих 3 типах клетки. Интересно, что оба эпителиальных линий клеток показали более высокие уровни Zn во время распространения по сравнению с при достижении слияния, в котором характерный плотный монослой был сформирован. В пролиферирующих клетках эпителия, линия молочной клетки MCF10A имела равное распределение Zn между цитозолом и ядром, в то время как в клеточной линии почки, большая часть металла находилась в ядре. В этих двух типах клеток, когда клетки достигали слияния, Zn был преимущественно расположен к цитозолу. Эти результаты показывают, что GF-ААС является высокочувствительным и точным методом для выполнения элементарного анализа в малоурожайной образцах. GF-ААС в сочетании с подклеточной фракционирования и может быть адаптирована для изучения уровней следов металлических элементов в различных клеточных линий и тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток млекопитающих

  1. Общие соображения
    1. Следуйте асебтических методов для культуры клеток млекопитающих ранее рассмотрел38.
    2. Поддержание всех клеточных линий в увлажненный 5% CO2 инкубатор при температуре 37 ° c. Условия клеточной культуры различаются для каждого типа клеток. Важно, чтобы поддерживать соответствующие условия культуры для каждой клеточной линии, используемой, как вариации этих процедур приведет к аномальным фенотипов и провал клеточной культуры.
    3. Обеспечить знакомство с клеточной линией интереса, и следовать протоколам, которые предусмотрены для каждого типа клеток, отобранных для конкретных экспериментов (см. Некоторые примеры ниже).
  2. Общая процедура для трининизации и прохождения адепт клеток
    1. Извлекайте средства культуры клетки от плиты культуры устремленностью.
    2. Промойте клетки мягко, используя PBS без кальция и магния (5 мл на 10 см2 площадь поверхности культуры). Добавьте раствор для мытья в сторону пластины, чтобы избежать соединения монослоя ячейки; вихревой пластины для максимального охвата решения. Для эпителиальных клеток, необходимо инкубировать клетки для 10 до 15 минут в инкубаторе при температуре 37 ° c в PBS для облегчения диссоциации клеток в следующих шагах.
    3. Снимите стиральную раствор с помощью аспирации.
    4. Добавить достаточно реагента диссоциации (0,25% трипсин) в тарелку (примерно 0,7 мл на 10 см2). Аккуратно закружить пластину, чтобы получить полный охват ячейки монослоя.
    5. Инкубировать культуру при комнатной температуре от 2 до 5 минут. Фактическое время инкубации варьируется в зависимости от используемой клеточной линии, в случае эпителиальных клеток рекомендуется инкубировать от 10 до 15 минут в инкубаторе при температуре 37 ° c. Соблюдайте клетки под микроскопом для клеточного отряда.
    6. Когда большинство клеток отсоединяется, восстановить клеточную суспензию в 5 мл предварительно нагретого покрытия или роста среды (см. ниже для некоторых примеров). Механически отделить ячейки сгустки по пипетки над клеткой монослоя несколько раз.
    7. Перенесите клеточную подвеску к 15 мл конической трубки и центрифугу на 1 000 x g для 2 до 5 мин. Центрифугирования скорость и время меняются в зависимости от типа ячейки. Удалите средства массовой информации мягким стремлением, будучи осторожным, чтобы не коснуться ячейки гранул. Ресуспензируем ячейки гранулы в 5 до 10 мл соответствующего предварительно нагретого носителя роста и удалить образец для подсчета с помощью хемоцитометер или автоматической клеточной счетчика.
    8. Используйте соответствующий объем клеточной суспензии для посева рекомендуемой плотности для каждой конкретной клеточной линии (см. ниже для некоторых примеров). Добавка с адекватным объемом культуры средств массовой информации в соответствии с размером блюдо культуры и поместить клетки обратно в инкубатор.
  3. Первичные миобласты, полученные из клеток-спутников мыши
    1. Перед началом Подготовьте пластины с коллагеновым покрытием для первичного миобластного роста. Раствор, содержащий 0,02% коллагена, и 0,05 M ацететической кислоты в обоженной воде должны быть стерилизованы фильтрации с 0,22 мкм стерильный фильтр устройства. Инкубировать культуры пластин с раствором коллагена ночь на 37 ° c.
    2. На следующий день, аспирин раствор для коллагена, позволяют пластины высохнуть на воздухе в стерильном шкафу и хранить при температуре 4 ° c до использования.
      Примечание: минимальные объемы коллагена: для 35 мм = 1 мл; 60 мм = 2 мл; 10 см = 5 мл.
    3. Семян первичных миобластов на 1 х 104 клетки/см2 в 55 cm2 коллагена покрытием культуры пластин. Распространенческие средства массовой информации-это модифицированный Орлиный средний (ДМЕМ)/F12 питательной смеси питательных веществ, содержащий 20% фетальной бычьей сыворотки (ФПС), 25 нг/мл рекомбинантного базового фиброзного фактора роста (FGF) и 100 U/mL пенициллин/стрептомицина.
      Примечание: пролиферирующих и фондовых клеток должны быть сохранены в 50% от беглости. Контакт клетки вызывает приверженность клеток миогенными дифференцированием и ухудшает возможности роста культуры.
    4. Для дифференциации первичных миобластов, позволяют клеткам достичь 80% до 100% беглость, которая обычно происходит после 48 h покрытия. Затем, изменения в дифференциации средств массовой информации (ДМ, 2% конной сыворотки, 1% инсулина, трансферрин, Селена а. а. 100 U/мл пенициллин/стрептомицин). Обновляем средства массовой информации ежедневно до сбора урожая.
  4. Нейрообластома Мурина (N2A)
    1. Пластины N2A клеток при плотности 2 х 104 клетки/см2 в росте средств массовой информации, содержащие смесь средней сыворотки/дм, содержащие высокую глюкозу и L-глютамина (1:1, v:v), добавка с 10% ФБС и 100 U/мл пенициллин/стрептомицин. Поддержание культуры фондовых под 50% беглость.
    2. Индуцировать дифференциацию N2A клеток после беглости достигла 25% до 40%. Изменения к дифференциации средств массовой информации, содержащие смесь из уменьшсывороточный средний/ДМЭМ, 1% ФПС, и 20 мкм ретиноевой кислоты в течение 7 до 10 дней. Обновите СМИ через день до сбора урожая.
      Примечание: как N2A клетки дифференцируются, некоторые клетки становятся круглыми, легко отделяются, и может подвергнуться апоптозу. Будьте осторожны при аспоте и добавлении культуры СМИ к пластикам.
  5. 3T3 1. Мурина до адипоцитов
    1. Поддержание клеток мыши 3T3/1 в ДДЭМ с высоким уровнем глюкозы, дополнено 10% ФПС и 100 U/мл пенициллин/стрептомицина. Адипогенный процесс зависит от слияния клеток; Таким образом, не позволяйте фондовой культуры расти более 50% беглость, как высшее слияние будет нарушать способность клеток дифференцироваться.
    2. Пластина клетки на 2 х 104 ячейки/cm2. При этой плотности, клетки достигнет слияния в течение 3 дней.
    3. Индуцировать Адипогенную дифференциацию через два дня после клетки достигают 100% беглость. Индукционные носители состоят из ДМЭМ, содержащего 10% ФПС, 10 мкг/мл инсулина, 0,5 мм 3-изобутиля-1-метилксантин, 1 мкм дексаметазона и 10 мкм троглитазон.
    4. Замените индукционные носители после инкубации 48 h на средства дифференциации (ДМ, содержащие 10% ФПС, и 5 мкг/мл инсулина). Обновите средства массовой информации через день до сбора урожая. Репрезентативные образцы полной дифференциации обычно собираются между 7 и 10 днями после адипогенной индукции.
      Примечание: когда адипогенез прогрессирует, клетки становятся круглыми и легко отделяются. Будьте осторожны при аспоте и добавлении культуры СМИ к пластикам.
  6. MCF10A ячейки
    1. Пластины MCF10A клеток в ДМЕМ/F12 (1:1, v:v), дополнено 5% ФПС, 100 U/mL пенициллин/стрептомицин, 0,5 мкг/мл гидрокортизон, 10 мкг/мл инсулина, и 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF). Рекомендуемая плотность высева составляет 1 х 105 ячеек/см2. В этих условиях, клетки достигнет 100% беглость в течение 4 дней. Обновляем носители каждые 2 – 3 дня до сбора урожая.
      Примечание: MCF10A клетки трудно отделить. Рекомендуется для инкубации клеток в течение 10 до 15 минут при температуре 37 ° c в PBS, свободной от кальция с 0,5 mM ЭДТА до триссиненизации.
  7. Манин-Дарби собачьей почки клетки (МДК)
    1. Пластины МДК клеток в ДМЕМ дополнено 10% ФПС и 100 U/мл пенициллин/стрептомицина. Рекомендуемая плотность посева 1 х 105 клеток/cm2, где клетки достигнет 100% беглость в течение 3 дней. Обновляем носители каждые 2 дня до сбора урожая.
      Примечание: клетки МДК трудно отделить. Рекомендуется инкубировать клетки от 5 до 10 минут при температуре 37 ° c в PBS, свободной от кальция и магния до триссиненизации. Для предотвращения скопления клеток не агитировать пластины, нажав или встряхивая флягу в ожидании клетки для отсоединения.

2. Подготовка образцов клеточных культур млекопитающих для ААС: вся клеточная и субклеточная фракционирование

  1. Культура клетки интереса в 55 cm2 плиты. Использование более мелких пластин культуры может принести образцы с уровнями металлов в пределах обнаружения пределов GF-ААС.
  2. Весь экстракт клеток
    1. Аспоте культуры СМИ с помощью вакуумной ловушки. Обязательно удалите все следы носителя. Промыть клетки от желаемых точек времени или культурные условия три раза с ледяной PBS без кальция и магния.
    2. Сразу же очистить клетки от пластины с помощью новой пластиковой ячейки скребок в 1 мл PBS без кальция и магния. Перенесите образец в трубку микроцентрифуги 1,5 мл и центрифугу на 2 мин при 2 000 х г и аспоте супернатант. Протокол может быть приостановлен здесь. Храните образцы гранул при температуре-20 °C или переходите к шагу 2,4.
  3. Подклеточная фракционирование
    1. Аспоте культуры СМИ с помощью вакуумной ловушки. Обязательно удалите все следы носителя. Промыть клетки от желаемых точек времени или культурные условия три раза с ледяной PBS без кальция и магния. Очистите клетки от пластины с 1 мл ледяной PBS без кальция и магния.
    2. Передача образцов на 1,5 мл трубки микроцентрифуги и держать на льду. Центрифуга для 10 s на 10 000 x g. Продолжайте быструю изоляцию ядер, если желательно металлический анализ цитоплазматических и ядерных фракций. Эта процедура позволит свести к минимуму потенциальную потерю металлов из-за извлечения ячейки39, 40.
    3. Удалить супернатант по аспирации и ресуспензируем ячейки гранул в 400 МКН ледяной PBS без кальция и магния, содержащий 0,1% nonidet P-40 (НП-40), неионного моющего средства. Перенесите 100 мкл на новую микроцентрифугу и рассмотрите ее как образец всей ячейки. Это Алиготе представляет 25% образца.
    4. Изолируйте ядра, поглаживая клеточную суспензию 5 до 10 раз на льду с P1000 наконечником. Ядра изоляция эпителиальных клеток требует концентрации 0,5% НП-40. Достижения клеточной диссоциации путем прохождения клеточной суспензии через 26 3/4 G иглы 10 до 15 раз, после 10 до 15 проходов через 30 1/2 G иглы.
      Примечание: Проверка целостности ядер с помощью световой микроскопии с использованием 40x цели.
    5. Центрифуга оставшейся ячейки lysate подвеска (300 мкл) для 10 s при 10 000 x g. Супернатант будет содержать цитозолольку фракции. Перенесите 300 мкл на новую пробирку микроцентрифуги.
    6. Промыть гранулы, содержащие ядерную фракцию в 500 мкл PBS без кальция и магния, содержащий 0,1% НП-40, затем центрифуга для 10 s при 10 000 x g. Удалите супернатант и ресуспензируем гранулы, содержащие ядра, в 100 мкл одного и того же раствора.
      Примечание: протокол может быть приостановлен здесь. Образцы могут храниться при температуре-20 °C.
  4. Lyse клетки по трем циклов ультразвуковых (30 s на/30 s выключен, на 50 кГц, 200 W) в течение 5 мин. Количественная оценка общего содержания белка в образце Брэдфорда41.
  5. Выполните контроль качества чистоты фракций Западной помаркой, используя антитела, специфичные либо для ядерного (гистоны, ремонтом хроматина, нуклеарные белки), либо для цитозолольных фракций (b-тубулин, b-Actin) (рис. 2).
    Примечание: не используйте sonicators с металлическим наконечником. Они могут загрязнять образец металлами.

3. Zn содержание анализа всей клеточной и субклеточных фракций культур клеток млекопитающих по атомной спектроскопии поглощения

  1. Минерализоваться образцы клеточной культуры (целые ячейки или ядерные фракции) путем переваривания кислоты, используя равный объем концентрированного HNO3 металлического сорта (осторожность) для 1 ч при температуре 80 ° с, затем на ночь при температуре 20 °c.
  2. Остановите реакцию, добавив 30% от объема реакции H2O2. Доведите объем выборки до 500 мкл с очищенной водой 18 млн.
    Примечание: HNO3 обработка должно быть сделано ношение очков химической безопасности, лицевой щит для защиты от брызг, перчатки, и утвержденных паров респиратор, если адекватной вентиляции (вытяжка) не имеется. Протокол может быть приостановлен здесь. Образцы могут храниться при комнатной температуре (RT).
  3. Подготовка стандартных решений и экспериментальных образцов для измерений Zn ААС, оснащенная графитовой печью.
    1. Используйте 2% (v/v) HNO3 раствор в деионизированной воде, исходя из той же партии, используемой для стандартной кривой как пустое решение для калибровки во всем. Использование стандартов аналитического класса, разбавленных очищенной водой 18 МВт.
    2. Подготовка стандарта 1 000 частей на миллиард Zn из коммерчески доступных 1 000 промилле Zn складе решение с 2% (v/v) HNO3 решение в деионизированной воде. Подготовка рабочих стандартных решений от 100 частей на миллиард стандартных путем разбавления его 5, 8, 10, 15, 20 и 25 частей на миллиард непосредственно с 2% (v/v) HNO3 решение в деионизированной воде. Подготовьте стандарты Zn и бланк с 0,1% (1 g/L) мг (NO3)2 матричных модификатора.
      Примечание: Лоде Zn составляет 0,01 частей на миллиард (мкг/л). Увеличивая концентрацию стандартов, предел линейности Zn был определен как 20 частей на миллиард (Рисунок 3).
    3. Измерение стандарта и образцов при тех же оптимизированных условиях: скорость потока введения 250 мл/мин, температура впрыска 20 °C, и температура GF 1 800 ° c.
      Примечание: температура GF была увеличена до 2450 ° c для очистки шаги, до инъекции нового образца или стандарта.
    4. Оптимизируйте лампу (C-СОВМЕСТИМОГО) до тока 20 A, длина волны 213,9 Нм и разрез 0,7 Нм.
    5. Измерение минерализованных образцов с использованием стандартной кривой Zn для определения содержания металлов. При измерении малых объемов образцы могут испаряться, если измерения занимают длительное время. Поэтому рекомендуется добавлять воду в пробы. Разбавить пробы с 18 очищенной водой с момом, обработали 0,01% HNO3 (аналитический сорт), если полученные данные находятся за пределами Лода.
      Примечание: как правило, образцы разбавляют на объем 500 мкл, помещенный в автоматизированном аутокамплер ААС для измерения сразу после того, как стандартная кривая установлена. Необходимый объем должен определяться пользователем и должен учитывать окончательные расчеты концентраций. Рекомендуется закончить определение Zn ААС полного эксперимента в одной попытке. Приостановка измерений может привести к большим экспериментальным изменениям и несогласованности.
  4. Преобразование частей на миллиард измерений моллярности как полученные от Zn измеряется через ААС. Рассмотрим массу Zn (65,39 Аму). Разделите количество частей на миллиард, полученные ААС по 63 390 000. В клетках концентрации ЗН варьируются от единиц птмоль до мкмоль.
    1. Разделите концентрацию ЗН (пфмоль или мкмоль) на начальную массу белка в образце, определяем Брэдфорд (шаг 2,4). Этот расчет будет оказывать количество металла (плмоль или мкмоль Zn) содержится в мг белка образца.
      Примечание: важно рассмотреть факторы разведения, используемые во время определения металла.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы протестировали способность GF-ААС обнаруживать мельчайшие уровни Zn в клетках млекопитающих (рис. 1). Таким образом, мы культивируемые первичных миобластов, полученных из клеток мыши спутник, и установленных клеточных линий N2A (нейрообластома производные), 3T3 Л1 (адипоцитов), MCF10A (эпителий молочной железы), и МДК клеток (эпителий почки собаки). Во-первых, мы изолировали целую клетку, цитозололику и ядерные фракции всех этих типов клеток и оценивали чистоту фракций Западной помаркой (рис. 2). Репрезентативная иммунодиагностика хроматина ремоделер Brg1 и тубулина в качестве маркеров нуклеарной и цитозолольных фракций, соответственно, продемонстрировала пригодность субклеточного протокола фракционирования, описанного в разделе 2,3 для выполнения элементарного анализ (рис. 2). Все ячейки и субклеточные фракции были подготовлены как описано выше для анализа GF-ААС, и калибровка оборудования была выполнена для получения типичной линейной стандартной кривой (рис. 3).

На рисунке 4 показаны репрезентативные изображения световой микроскопии пролиферирующих и дифференцированных или свободно монопластов каждого типа клеток и соответствующие уровни Zn для них. Важно отметить, что все клеточные линии, проанализированные в данном исследовании, показали концентрацию Zn в диапазоне Нм. Однако было обнаружено дифференциальное распределение металла. Дифференцированные первичные миотрубки выставлены более высокого уровня Zn, чем пролиферирующих клеток (рис. 4A). Примечательно, что большая часть иона была расположена к ядерной фракции в обоих пролиферирующих и дифференциации миобластов. Аналогичное субклеточное распределение Zn было обнаружено в нейрообластоме, полученной клеточной линией N2A (рис. 4B). Однако, измерения показали, что N2A клетки имели Zn уровней на один порядок выше, чем первичные миобласты. С другой стороны, установленные 3T3-1 ячейки линии выставлены более высокие уровни Zn, когда преадипоциты были пролиферирующих чем тогда, когда они были индуцированные дифференцировать и образуют Зрелые адипоциты, которые накапливают липиды (рис. 4C).

Мы также измеряется Zn содержания в двух различных установленных линий эпителиальных клеток: MCF10A, полученных от человека молочной железы (рис. 4D) и собака ПОЧКИ полученных МДК (рис 4d) клеток. Интересно, что в обоих случаях были обнаружены более высокие уровни ЗН в пролиферирующих клетках, чем у свободно моноайеров. Однако клетки эпителия, полученные из молочной железы, показали уровень металла, который был в 2 раза выше, чем у клеток почек. MCF10A клетки показали равные уровни Zn между цитозололиными и ядерными фракциями в пролиферирующих клетках. Как только MCF10A клетки достигают слияния, снижение на 40% в целом уровни клеток Zn был обнаружен, и металл был найден наиболее концентрированным в цитозололийской фракции (рис. 4D). И наоборот, пролиферирующих клеток МДК выставлены более высокие уровни Zn в ядерной фракции, по сравнению с цитозололийской фракции, но когда клетки МДК достигли слияния, снижение Zn в целых клетках было обнаружено, с большинством этого переходного металла наблюдается в цитозололийской фракции (рис. 4E).

Figure 1
Рисунок 1: репрезентативная диаграмма потока для элементарного (Zn) анализов млекопитающих культивируемых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: подтверждение чистоты фракций, полученных с помощью быстрой изоляции протокола ядер 39 , 40. Представитель Вестерн-блот от дифференциации первичных миобластов, показывающих чистоту субклеточных фракций. Фермент ремоделер хроматина Brg1 использовался для идентификации ядерной фракции, и тубулин использовался для идентификации цитозоловой фракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Кривая калибровки стандартов Zn. Репрезентативная стандартная кривая для Zn определяется GF-ААС. GF-ААС был откалиброван стандартными решениями Zn, разведенной в следующих концентрациях: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 и 30 частей на миллиард. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: уровни цинка в различных культивируемых клетках млекопитающих. Репрезентативные световые микрографы и содержание Zn в цельных клеточных экстрактах и цитозололиках и ядерных фракциях. Данные представляют собой среднее из трех независимых биологических реплицирует ± МДж. (а) Мурин первичных миобластов пролиферирующих и дифференциации в течение 2 дней. (B) murine нейрообластома N2A клеточной линии до и после индукции различать ретиноевой кислоты лечения. (C) murine 3T3-1, предварительно адипоцитов и 6 дней после дифференциации. D) предварительно и свободно владеющим монослоя клеток молочной эпителиальной клеточной линии MCF10A. E) предварительно-свободно и свободно монослой эпителиальной клеточной линии МДК. Данные представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов ± SE. t-тест студента показывает значение, * p не 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Атомная спектроскопия поглощения является высокочувствительным методом для количественной оценки Zn в малом объеме/массе биологических образцов. Описанная оптимизация измерения Zn делает применение этого метода простым и гарантирует идеальные аналитические условия. Здесь, используя GF-ААС, мы определили концентрацию Zn в целых клетках, а в цитозололиях и ядерных фракциях, с разных клеточных линий. Результаты показывают, что этот метод оказывает сопоставимо с тем, полученные флуоресцентными зондами и ПМС-MS. Например, несколько флуоресцентных зондов показал лабильных митохондриальных уровней Zn в диапазоне от 0,1 до 300 pM, уровни в Golgi были ниже пиомолярный диапазон, и эндоплазматический ретикулум колебался от 800 до 5 000 pM42, которые согласуются с уровнями обнаружены в цитозолольно-фракциях. Кроме того, ЗН-отзывчивый флюорфор fluozin-3 показал накопление лабильного ЗН в малых цитозолольных везикулы в MCF10A и в C2C12 клетках43,44, которые также соответствуют Zn, количественно в цитоплазме. Кроме того, анализ Zn по ПМС-MS в исполнении нашей группы показал, что целые уровни клеток Zn в дифференциации первичных миотрубок45 аналогичны тем, которые получены в этом отчете GF-ААС. Кроме того, примеры Zn определений в клетках С6 крысы глиомы с помощью ААС и Цинкин-е46 также оказали аналогичные диапазоны для тех, которые наблюдаются в НЕЙРООБЛАСТОМЫ N2A клеток, используемых здесь.

На сегодняшний день, различные методы были разработаны для обнаружения Zn в клетках. Тем не менее, GF-ААС остается точной и очень чувствительной техникой, которая не только позволяет обнаруживать свободные Zn, но также измеряет металл комплексован и связан с белками и потенциально для малых молекул. Наша группа недавно показала, что измерения, выполняемые с клеточной проницаемой люминесцентной зонда (которая имеет высокое сродство к связать свободный Zn2 +) напрямую коррелирует с уровнями Zn обнаружены GF-ААС в пролиферирующих и дифференцируя миобластов 43. Однако результаты, полученные этими зондами, не могут быть репрезентативными для всей клеточной или протеиновой концентрации Zn. Кроме того, поскольку Zn существует как не-редокс активных видов и как дилентной катиона, в физиологических условиях, его обнаружение в клеточных системах остается проблемой. Новые методы визуализации Zn стали доступны, такие как ультрасовременная синхротронная рентгеновская Флуоресцентная микроскопия, радиоизотопы, а также лазерная абляция индуктивно-сопряженная плазменная масса спектрометрия (LA-ПМС-MS). К сожалению, некоторые из этих методов требуют ресурсов, недоступных для научного сообщества29,42,47,48,49,50.

Исследования показали, что ПМС-MS является более точным методом, чем ААС, как относительные значения стандартного отклонения были показаны ниже в ПМС-MS определений для металлов, как Zn. Вероятным объяснением этого эффекта является то, что ПМС-MS неразрывно способна ликвидировать химические помехи, так как операционная температура аргона колеблется от 5 000 до 10 000 °C. Некоторые химические облигации могут поддерживаться на уровне 3 000 ° c, который находится в диапазоне для ААС операции. Эти облигации будут полностью нарушены при температуре выше 6 000 ° c. Таким образом, эти высокие температуры, достигнутые в состоянии плазмы с помощью ПМС-MS может устранить химические помехи, что приводит к улучшению обнаружения пределов51. Кроме того, ПМС-MS требует больших объемов выборки по сравнению с GF-ААС, так как последний способен работать с объемами до 100 мкл, что значительно меньше, чем другие спектроскопические методы, такие как ААС, ПМС-АИС, или ПМС-MS. Учитывая небольшие объемы, участвующие в методе, GF-ААС является идеальной техникой для определения концентрации Zn в биологических образцах, в первую очередь, если анализ включает субклеточные фракции, обнаружение металлов в очищенных белках, или небольшие вариации в клеточных содержание металла из-за мутаций в транспортерах или металлических связывающих белков29,52. Кроме того, еще одним преимуществом является чувствительность системы GF-ААС для определения следов и ультра-следов концентраций (ПГ/мл к нг/мл).

Необходимо учитывать важные соображения для обеспечения надежности данных ГФ-ААС. К ним относятся адекватная калибровка, целостность графитовой трубки и подбор подходящего матричного модификатора для электротермической атомизации. Модификаторами матрицы являются химические элементы, добавленные в образец, которые влияют на тепловые процессы, происходящие в атомизатор. Эти модификаторы минимизируют потерю анализатора во время пиролиза и способствуют удалению матричных компонентов. В целом, модификаторы могут изменять матрицу образца для испарения компонентов матрицы при более низких температурах и могут работать в качестве анализатора стабилизаторов. В дополнение к этим соображениям, важно, чтобы выполнить адекватную оптимизацию шагов для программы температуры атомайзер.

Следует принять два основных соображения, включая 1) установление оптимальной температуры пиролиза, которая ссылается на максимальную температуру при шаге от атомизации, при которой не происходит никаких анализатоцитов, и которая позволяет максимально впитению анализата с минимальным Фон. Следует также рассмотреть 2) установление оптимальной температуры атомизации, которая относится к минимальной температуре, при которой анализатор полностью испаряется и записывается как воспроизводимые сигнала или пика. Одним из недостатков анализа GF-ААС является вмешательство в элемент, для которого тщательная оптимизация и стандартизация имеют важное значение для точных измерений. Тем не менее, на сегодняшний день, GF-ААС является важным инструментом в научных исследованиях для обнаружения ионов металлов в различных биологических образцах. Будущие применения Zn (и других металлов) методы обнаружения GF-ААС будет включать в себя измерение уровня металлов в органах и тканях, полученных из животных моделей или биопсии пациента, чтобы лучше понять специфические физиологические потребности микроэлементов. В заключение, GF-ААС является точной, чувствительной, экономически эффективным и доступным, и этот аналитический метод будет продолжать улучшаться по мере технологического прогресса двигаться вперед для этих систем обнаружения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана факультета разнообразии ученых награду от университета Массачусетса медицинская школа Т.П.-B. Н.Н.-T. поддерживается Сен-КОНАСИТ, Грант 279879. J. G. N поддерживается Национальным фондом науки Грант DBI 0959476. Авторы благодарны доктору Дэрилу а. Боско за предоставление линии N2A и Даниэлла Кангуссу за техническую поддержку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

Биохимия выпуск 147 цинк атомная спектроскопии абсорбции пролиферация дифференцировка культура клеток млекопитающих субклеточная фракционирование
Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter