Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקומי לגרום חניכיים פסגה בעכברים. אנו מראים כיצד לקדוח חור בשן העכבר ולחשוף את הציפה שלו, כדי לגרום לדלקת מקומית. ניתוח שיטות לחקור את טבעו של דלקת זו, כגון מיקרו-CT ו היסטולוגיה, מומחש גם.
Abstract
המנגנונים המעורבים בדלקות המושרה מקומי ניתן ללמוד באמצעות מספר מודלים בעלי חיים זמינים. אחד מאלה הוא אינדוקציה של חניכיים הרשמי (AP). חניכיים apical היא פתולוגיה נפוצה של טבע דלקתי ברקמות חניכיים המקיפים את שורש השן. כדי להבין טוב יותר את הטבע ואת המנגנון של הפתולוגיה הזו הוא יתרון לבצע את ההליך בעכברים. אינדוקציה של דלקת זו הדונטוגניים מושגת על ידי קידוח לתוך השן של העכבר עד עיסת השיניים נחשף. הבא, עיסת השן נשאר חשוף להיות מזוהם על ידי פלורה טבעי אוראלי לאורך זמן, גרימת חניכיים פסגה. לאחר זמן זה, מוקרב החיה, וניתן לנתח את השן ואת עצם הלסת בדרכים שונות. ניתוחים טיפוסיים כוללים הדמיה מיקרו-CT (כדי להעריך את ספיגת העצם), כתמים היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה, ו-RNA ביטוי. פרוטוקול זה שימושי עבור מחקר בתחום של ביולוגיה אוראלית כדי להבין טוב יותר זה תהליך דלקתי בהגדרה vivo ניסיוני עם תנאים אחיד. ההליך מחייב טיפול קפדני של העכברים והלסת המבודדת, והדגמה חזותית של הטכניקה שימושית. כל ההיבטים הטכניים של ההליכים המובילים חניכיים פסגה המושרה האפיון שלה במודל העכבר מומחש.
Introduction
המטרה של שיטה זו היא לגרום חניכיים פסגה בעכבר על ידי מזהם את הפיסגה עם microflora טבעי, ולאחר מכן ללמוד מאפיינים שונים של התהליך הזה פתולוגי.
חניכיים apical (AP) היא פתולוגיה נפוצה של טבע דלקתי ברקמות חניכיים המקיפים את שורש השן. זו מחלת שיניים יכול לגרום לכאב חמור יש לטפל על ידי רופא שיניים. אפשרויות הטיפול כוללות טיפול שורש (ראשי או משני), ניתוח אנדודונטי, מיצוי השן, או מעקב בהתאם לממצאים הקליניים והרדיוגרפיים, ולדעתו של המטפל. מנגנון התהליך הדלקתי, למרות שנחקר במשך מספר עשורים1,2,3, עדיין אינו מובן באופן מקיף. בהתחשב בחומרת הפתולוגיה הזו, יש לפיכך צורך ברור למחקר הפונה לטבעה הבסיסי. לפיכך, מערכות שבהן המחקר של AP אפשרי הן עניין מדעי רב.
מאחר שAP הוא תהליך פתולוגי מורכב הכרוך ברקמות המקומיות ובמערכת החיסונית, אין מספיק להבנת התהליכים במחקרים מחוץ לתחום. המחקר של דגימות קליניות של מחלה זו הם גם בעייתי בשל מגבלות אתיות והשתנות משמעותית בין אנשים שונים ושלבים קליניים שונים4,5, ומכאן את הצורך במודלים vivo. מודלים אלה מבוססים על הרעיון של חשיפת עיסת שיניים לזיהום והתבוננות התגובה הדלקתית של הגוף לגירוי זה ברקמות periapical6,7. נפוץ במודלים vivo כוללים מכרסמים או חיות גדולות כגון כלבים. למרות האתגר הקליני בטיפול בעכברים, שהם בעלי חיים קטנים מאוד עם שיניים זעירות, היתרונות של מודל העכבר הם משמעותיים: כמעט, עבודה עם עכברים היא פשוטה טכנית במונחים של מתקנים הוא העלות האפקטיבית ביותר, ו מדעית, העכבר הוא מודל לומד היטב עם כלים גנטיים ומולקולריים זמין בקלות וגנום למד היטב. אכן, המחקרים הקודמים השתמשו במודל העכבר לחקר אותות דלקתיות העצם ותאים מעורבים ב-פסגה חניכיים8,9,10,11. לכן, יש צורך בפרוטוקול ברור לגבי אופן השימוש במודל עכבר לחקר AP. . כאן, אנחנו מתארים נוהל כזה
הפרוטוקול המתואר כאן הוא בעל יתרון גדול של להיות מתאים ללמוד לנקוש (KO) עכברים וללמוד כיצד העדר גן ספציפי משפיע על דלקת שיניים7,12. יישומים שימושיים אחרים של פרוטוקול זה כוללים את המחקר של ההשפעות של תרופות ותנאים מערכתית על התפתחות חניכיים פסגה13, ההשפעה של חניכיים פסגה על התפתחות של מלתעות14 , 15 וטיפול בתאי גזע להתחדשות העצם16.
פרוטוקול זה יכול להיות גם כללית כמודל כדי ללמוד דלקת מקומית. כדי ללמוד את התהליך הדלקתי, כמה מודלים העכבר פותחו, אשר כוללים למשל קוליטיס המושרה או דלקת מפרקים17,18. למודלים אלה יש השפעות מערכתיות ואין להם שליטה מובנית באותה חיה. מודלים עבור חניכיים המושרה פסגה, אשר כוללים שליטה באמצעות צלעות ללא דלקת, יש את היתרון של התגברות על מגבלות אלה14,19.
הפרוטוקול המתואר להלן שימושי לפיכך לחוקרים המעוניינים בתהליכים דלקתיים מקומיים. האופי הנשלט של דלקת זו, הבידוד שלה למיקום מסוים, ואת השן בקרת הצלעות הקשורות, כל להפוך את הפרוטוקול הזה חשוב ללמוד את המנגנונים המעורבים בתהליך זה. יתר על כן, הפרוטוקול הוא שימושי עבור החוקרים המעוניינים בהיבטים הקליניים של דלקת periapical. מודל העכבר הוא אידיאלי כדי ללמוד משתנים שונים של המחלה, בנוסף ליתרון של היכולת לבצע בקלות מניפולציות גנטיות במודל העכבר, כדי לחקור את הפעילות של גנים ספציפיים בדלקת periapical.
מבחינה טכנית, ההליך הקליני הוא מאתגר לבצע בגלל הממדים הקטנים של השיניים עכברים. זה יהיה מועיל להמחיש הליך זה כדי ללמוד על מיצוב, הציוד הדרוש, וביצועים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה העברית (אתיקה לא. MD-17-15093-5).
1. הרדמה ומיצוב בעלי חיים
- הכינו פתרונות סטריליים כמתואר להלן.
- להכין 5 מ ל 7 מ"ג/mL של קטמין ו 0.09 mg/mL Medetomidine מדולל בתמיסה מאגר פוספט (PBS)/Saline.
- הכינו פתרון סטרילי של אטיפיאזול (0.4 מ"ג/mL) מדולל ב PBS/תמיסת מלח (מומלץ להכין כמות של 5 מ ל).
- הכינו פתרון סטרילי של מפיייטין (7.5 מ"ג/mL) מדולל ב-PBS/תמיסת מלח להרדמה מקומית (בקבוקון אחד שסופק על ידי מפיייטין מספיק עבור מלאי של 7.2 mL).
- השתמש 6-8 נקבה בת שבועות C57BL/6 עכברים לניסוי. לשמור על בעלי חיים ביחידת בעלי חיים מסוימים הפתוגן חינם (SPF), עם מים סטנדרטיים ומזון שסופקו על ידי המתקן ואת בעלי חיים האכלה libitum.
- שוקלים עכברים ולהזריק intraperitoneally (IP) נפח של 10 μL עבור כל גרם של המשקל. לדוגמה, עבור עכבר ששוקל 20 גרם,
להזריק 200 μL של פתרון קטמין/Medetomidine. זה ייתן ריכוז סופי של (70 מ"ג/ק"ג) קטמין ו (0.9 מ"ג/ק"ג) מדטומאינין
לכל חיה. - על מנת למנוע כיבית עין עקב יובש במהלך ההליך, להחיל משחה העין המכילה כchloramphenicol (5%) על עיני החיות כשהן תחת הרדמה. לשמור על החיות חמות עם מנורה בזמן שהם מורדם. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הדוושה (ביצוע צביטה הבוהן המשרד).
- לאחר העכבר הוא מורדם, מיקום העכבר הנחת על הצד הימני שלה (עבור חוקר יד ימין) על פני השטח פוליסטירן בגוון קלקר הבלטת המשטח ולהצמיד רגליים אל פני השטח באמצעות קלטת.
- פתח את הפה באמצעות להקות גומי קטנות סביב החותכות (1 עבור החותכות העליון, ו 1 עבור חותכות נמוך יותר) שנערך במקום על ידי מחטים ארוכות המוצמדים למשטח פוליסטירן מוקצף עם קצף הבלטת תאים.
- למשוך את הלחי הימנית באמצעות מלקחיים מודבק על פני השטח. השתמש מלקחיים כי הם סגורים במצב יציב.
- מניחים את פני השטח עם העכבר בתנוחת עבודה נוחה המאפשרת גישה טוחנות הלסת, באמצעות הגדלה נכונה (מיקרוסקופ המשקפת או מיקרוסקופ קליני) ואור.
- למשוך את הלשון באמצעות מלקחיים או שיניים מרית ולהזריק הרדמה מקומית עם 27 מד מחט לתוך קיפול mucoבוקה בסמוך טוחנת הלסת הראשונה. 25-50 μL זה מספיק. נפיחות של הרקמה סביב האתר ההזרקה צריך להיות דמיינו.
2. חשיפה זולה
- השימוש 1/4 עגול בבור שיניים, או באותו בר יהלום בגודל (שאנק ארוך מומלץ) במהירות של 800 סיבובים לדקה (rpm), מחובר לכל מנוע שיניים מתאים (למשל הפחתת מומנט האוטומטי (ATR) מנוע).
- מקדחה על החלק האחר של טוחנת הלסת הראשונה ימינה עד הקרניים הזולה הם גלויים דרך ה-דנטטין. להשתמש בצרורות קצרים של המנוע כדי למנוע השטח מתחמם.
- השתמש בקובץ K או בקובץ H-file #8 או #10 כדי לנקב את הציפה ולהכניס את הקובץ לתוך הקרניים הזולה (מכאן והמרוחק) על-ידי שבירת ה-דנטל המכסים אותם. קבצים הם מעוקר על ידי החיטוי.
- המשך לעבוד עם הקבצים שבתוך הספרות עמוק ככל האפשר, תוך הרחבת הפתחים עם הקבצים. בדרך כלל יש דימום. גלוי מהעיסה
- הקפד לעגל את הקצוות החדים של השן עם הבור ולהסיר את השן מחסימה, כדי להפחית את הכאב במהלך הניסוי. לנקות את הפסולת במהלך ההליך עם מיקרו מברשת.
- השאר את השן הצלעות (טוחנת הלסת הראשונה השמאלית) כפקד.
3. סוף הליך קליני
- לשחרר את העכבר ממצב הקיבעון ולהזריק האטיפידול IP (10 μL עבור כל גרם של משקל הגוף. זה ייתן מנה אחרונה של (4 מ"ג/ק"ג) אטיפיאזול.
- הכנס בופרנורפין מדולל ב-PBS/תמיסת מלח (0.05 מ"ג/ק"ג) IP (מומלץ להכין כמות של 3 מ ל ביום ההליך). ראה דיון להסבר מדוע ההקלה בכאב הכרחית.
- ודא שהחיות מחלימים מהרדמה לפני שהוא עוזב אותם. תן להם מזון רך כי הם אולי לא מסוגלים לאכול מזון קשה עקב כאבי השן.
4. המשך טיפול בפרוצדורה (42 ימים)
- במשך 3 הימים הראשונים לאחר ההליך, לשקול את החיות ולהזריק בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) IP פעם ביום (מומלץ להכין כמות של 6mL).
- במהלך הניסוי (42 ימים כאשר הדלקת מצטבר) לפקח על בעלי החיים על ידי משקל והערכה כללית התנהגותית 2-3 פעמים בשבוע.
- מספקים מזון רך לבעלי חיים במהלך תקופת המעקב. הרטיב את האוכל במים ושים אותו בצלוחית פטרי על רצפת הכלוב.
5. הניסוי הסיום והניתוח
- כאשר 42 ימים11 של מעקב הושלמו, מורדם בעלי חיים IP עם קטמין/xylazine בריכוז של 106.25 mg/ק"ג, ו 75 mg/Kg xylazine (פתרון מניות 42.5 של מעלות Mg/ml קטמין, ו 1.5 Mg/ML xylazine בנפח כולל של 2 מ ל הוא מומלצים) ופריקה בצוואר הרחם.
הערה: ישנן אפשרויות שונות לניתוחים אפשריים כדי להעריך דלקת20,21. כאן ניתוח של הרקמה על ידי מיקרו-CT ו כתמים היסטולוגית יהיה מתואר. - לאחר המתת חסד, השתמשו במספריים ומלקחיים כירורגיים כדי לגזור חלק מהלסת, כולל 3 טוחנות (בנפרד לכל שליטה על הצדדים ולשליטה שאינה מטופלת). על ידי שימוש מלקחיים לקלף את הרקמה הרך ככל האפשר, עוזב בעיקר עצם ושיניים על המדגם.
- לשטוף את הרקמה לזמן קצר ב-PBS, ולאחר מכן לשים אותו בתוך פאראפורמלדהיד (בלגון) 4% (מדולל ב-PBS) עבור 24-48 שעות עבור קיבעון.
התראה: השתמש בכיוון הקרח הכימי במכסה כימי, ובהתאם להנחיות של גיליון הנתונים של בטיחות החומרים (MSDS). - לאחר 24-48 שעות, לשטוף עם PBS 3x על מנת לשטוף את הלמעלה בלבד.
- מיקרו-CT
- עבור ניתוח מיקרו-CT, לקחת את הרקמות שנקטפו (חלק הלסת התחתונה כולל 3 טוחנות, בממדים של כ 4 מ"מ x 5 mmx 1 מ"מ) לסורק מיקרו-CT, למקם אותם בצינור 12 מ"מ קוטר מלא עם 1.5 mL של PBS בכיוון כך או משטחים לשוני של השן והשורש מונחים במקביל לתחתית הצינור. הפרידו בין הדגימות עם הספוג, וכיסו את החלק העליון של הצינור בסרט גמיש.
- פתחו את לוח הסריקה ובחרו במספר המדידה. בחר את קובץ הבקרה עם הפרמטרים הבאים: אנרגיה של 70 kV, העוצמה של 114 μa, והרזולוציה של 6 יקרומטר3 בגודל voxel.
- לחץ על תצוגת סייר, וכאשר התמונה מופיעה, לחץ על קו התייחסות וסמן את האזור של דגימות לסריקה. לאחר כל לדוגמה לחץ על הוספת סריקה. כשתסיים לסמן את הדגימות, עבור לרשימת המשימות ובחר באפשרות ' התחל משימות אינטראקציה'.
הערה: ניתן להשתמש באותם דגימות עבור היסטולוגיה. חשוב שהם לא להתייבש במהלך סריקת CT.
- השתמש בתוכנת מחשב מתאימה ליישור וניתוח מיקרו-CT.
- פתח את המדגם על מישור XY בהערכת מיקרו-CT. בחרו שלוש נקודות על כל אחת מהדוגמאות ליישור:
מגדיר את מקור מערכת הקואורדינטות.
החלק הקורולי של התעלה המיומנת-מגדיר נקודה על ציר Z.
הכיוון המרוחק-מגדיר נקודה במישור XZ. - השתמשו בכלי המדידה שבלוח השמאלי, וציירו קו שמגיע לכל נקודה. הגדירו כל אחת משלוש הנקודות בערך X, Y & Z, כפי שהוא מופיע בלוח הימני.
- הגדר את אזור העניין במדגם על- ידי בחירת משימה תחת הערכת μctולחץ על הערכה תלת- ממדית. מלבן וחלון עם הממדים לכל ציר יופיעו על המסך. התאם את מידות המלבן כך שיתאימו לאזור העניין בציר ה-XY על-ידי לחיצה בפינות עם הלחצן האמצעי של העכבר. בחר את הממדים בציר Z על-ידי הוספת מספר הפרוסה הראשון המעניין בריבוע Z תחת Voi Start, ומספר הפרוסות מהראשון עד למספר הפרוסה האחרון המעניין בריבוע Z תחת עמעום.
- לחץ על יישומים תחת מנהל ההפעלותובחר decterm. המתן מספר שניות לפתיחת חלון ולאחר מכן הקלד את חמשת השלבים של כתב נטוי משופע המתואר להלן בהתאם להוראות הבאות (בין השורות לחץ על enter):
ipl
isq_to_aim
aim1 - העתק את השם isq (קובץ הריבית): בחר תצוגות תחת מנהל ההפעלות ולחץ על Microctdata. מצא את הקובץ העובד על, ולחץ באמצע על הקובץ. לאחר מכן לחץ באמצע לאחור בחלון של DECterm.
- הזן את ערכי X, Y & Z (עם רווח ביניהם) אשר נקבעו תחת Voi בעת בחירת אזור מעניין.
- הזן את ערכי X, Y & Z (עם רווח ביניהם) שנקבעו תחת עמעום בעת בחירת אזור מעניין.
- המתן עד לקבלת הודעה: isq כדי לכוון הושלם.
(שלב ב'-יישור):
ליישר z
aim1
aim2 - הזן את ערכי X, Y & Z (עם רווח ביניהם) שנקבעו עבור מקור מערכת הקואורדינטות.
- הזן את ערכי X, Y & Z (עם רווח ביניהם) שנקבעו עבור הנקודה על ציר Z.
- הזן את ערכי X, Y & Z (עם רווח ביניהם) שנקבעו עבור הנקודה במישור XZ.
- המתן עד לקבלת הודעה: "align_Z הושלמה"
(שלב III-כותרת):
כותרת
aim2
0 0 0
0 0 0 - לחץ על enter.
(שלב IV-המרת הקובץ חזרה ממטרה isq):
מיכל ברקן
aim2 - העתק את השם isq (קובץ הריבית): בחר תצוגות תחת מנהל ההפעלות ולחץ על נתוני microct. מצא את הקובץ שעליו אתה עובד, ולחץ באמצע על הקובץ. לאחר מכן לחץ באמצע לאחור בחלון של DECterm. מחק (באמצעות "backspace") את ". ISQ "בסוף הקובץ, וכתוב:" _ new. ISQ "כדי לזהות את הקובץ המיושר.
- לחץ על enter | enter.
- המתן עד לקבלת הודעה: "toisq_from_aim הושלמה"
(צעד V-להעיף):
מיכל שלמה
קצת - העתק את השם isq החדש (קובץ הריבית): בחר תצוגות תחת מנהל ההפעלות ולחץ על נתוני microct. מצא את הקובץ העובד על, ולחץ באמצע על הקובץ. לאחר מכן לחץ באמצע לאחור בחלון של DECterm.
- לחץ על enter | enter. המתן לקבלת הודעה: "isq_to_aim הושלמה"
הפוך
קצת
aa
zx
המתן לקבלת הודעה: "flip_aim הושלמה"
מן
aa - העתק את שם ה-isq החדש: בחר תצוגות תחת מנהל ההפעלות ולחץ על נתוני microct. מצא את הקובץ העובד על, ולחץ באמצע על הקובץ. לאחר מכן לחץ באמצע לאחור בחלון של DECterm. מחק (באמצעות "backspace") את ". ISQ "בסוף הקובץ, וכתוב:" _ flip. ISQ "כדי לזהות את הקובץ המיושר.
- המתן עד לקבלת הודעה: "from_aim_to_isq הושלמה"
- פתח את המדגם על מישור XY בהערכת מיקרו-CT. בחרו שלוש נקודות על כל אחת מהדוגמאות ליישור:
- Contouring
- בחר את הפרוסה המייצגת בקירוב את מרכז השן, בה מוצגות הספרות הזולה והזולה של שתי התעלות, והוא מוצג בשני הצדדים.
- סימון ידני של מתאר הריבית בפרוסה האמצעית על-ידי לחיצה על חלונית המתאר השמאלית העליונה-החל מהנקודה המסנית של קודקוד השורש המרוחק מסמן את הגבול האפילי לאזור העילי, דרך הגבול ה, של קודקוד השורש בעקבות הגבול המרוחק של השורש והגבול הבין-משני של השורש המרוחק דרך אזור הפריון (ראה איור 3 ב', IV).
- העתק מתאר זה (Ctrl + C, Ctrl + V) והתאם אותו בהתאם ל-5 פרוסות הממוקמות משני צדי הפרוסה האמצעית.
- כדי לחשב את נפח הרקמה של המתאר המסומן עבור כל דוגמה לבחור משימה תחת הערכה μct, ולחץ על הערכה 3d. בחלון ההערכה התלת-ממדית לחץ על בחירה ליד פעילות ובחר מסנן כדי לחשב את נפח הרקמה (טלוויזיה).
- יסטולוגיה
- לאחר הסרת הרקמות מסורק מיקרו-CT, decalcify את הרקמות על ידי הצבת כל מדגם בצינור מיקרוצנטריפוגה עם 1 מ ל של חומצה ethylenediamאצטט (EDTA) 0.5 M pH 8.0 עבור 10 ימים. שנה את פתרון ה-EDTA כל 3 ימים.
- התייבשות: דגימות לשים בקלטות היסטולוגית, ו לתוך ריכוזי האתנול הגוברת, שעה כל אחד, כדלקמן: 70% אתנול (בשלב זה התהליך יכול להיעצר במשך מספר שבועות, כל עוד דגימות נשמרות אתנול), 90% אתנול 2x, 100% אתנול 2x, קסילן 2x (זהירות: השימוש קסילן במכסה כימי, ועל פי הנחיות msds שלה).
- העברת קלטות לפרפין נוזלי (60 ° c) והשאירו במכסה הכימי לילה כדי שהקסילן להתאדות.
- חסימת: השתמש במכונת חסימה היסטולוגית כדי להטביע את הדגימות בפרפין. היזהר להטביע אותם בתנוחה נכונה (כלומר, הכתר והשורשים צריך להיות מונחה במקביל לחלק התחתון של העובש, באופן שהשן היא "שוכב למטה") על מנת לקבל סעיפים משונן. הדגימות מוכנות כעת. לחתוך עם מיקרוטומה
- חיתוך סעיפים: להתחיל על ידי חיתוך פרוסות עבות של ~ 20 יקרומטר עד להגיע לחלק הרלוונטי של רקמות. לאחר הכרה בחלק כלשהו של השן (כתר או שורשים) לשנות סעיפים של 6 μm, ולשנות את זווית החיתוך בהתאם לסעיף הקודם.
- לדוגמה, אם הסעיף הקודם כלל את הכתר אך לא את השורשים, לשנות את זווית הבלוק במיקרוטומה כך השורשים להתקרב הסכין, ואת הכתר חוזר (חלקים של השן ניתן לזהות עם עין עירומה על הבלוק עצמו).
- המשך לכוונן את הזווית עד לקבלת סעיפים משונן, כולל ציפה מקורילית ומפרק, והקודקוד לאמן. גזור בכיוון זה כמה פרוסות ככל האפשר, עד הרקמה הרלוונטית לחתוך.
- עבור פרוטוקולים כתמים (למשל, Haemotoxylin ו אאוזין צביעת (H & e), חום & בצבע ברנאן, tartrate חומצה עמיד חומצות פוספאטאז (המלכודת) כתמים, אימונוהיסטוכימיה), ראה20,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים זרימה של הצעדים הניסיוניים מוצג באיור 1. כפי שהוזכר בפרוטוקול, העכברים מורדם, ואת טוחנת הלסת התחתונה הראשונה שלהם בצד אחד הוא קדח עד חשיפה זולה, בעוד השן הצלעות הצדדית נשאר כפקד. הבא, השיניים נותרו להיות מזוהמים על ידי פלורה אוראלי עבור 42 ימים, במהלכו הם מנוטרים ולקבל תרופות לכאב. לאחר 42 ימים, עכברים מורדמים, והשיניים והלסת הסמוכה נלקחים לניתוח.
איור 2 מדגים את התמונות הקליניות של הלסת התחתונה לאחר החשיפה הזולה הראשונה של הטוחנת. באיור 2A כל הלסת התחתונה מוצגת, בעוד הכניסה באיור 2a מראה התרחבות של הטוחנת הימנית הראשונה המטופלת. שן הטוחנת השמאלית הראשונה משמשת כפקד. באיור 2Bניתן לראות את החשיפה של קרניים משני הצדדים ואת הכניסה לתעלות. שימו לב שהשן הורדה מכנית לאוטם המשנה כדי להפחית את הכאב.
לאחר חשיפה שיניים זולה לפלורה אוראלי, עיסת שיניים הוא מזוהם בסופו של דבר6,7 ו הופך נקרוטיק. על פי הספרות22, חיידקים גראם שליליים לאחר מכן להפריש ליפופוליסכריד (lps) לאזור פסגה של השן. באמצעות תגובה מורכבת של מערכת החיסון, אחת התוצאות היא ספיגת העצם באזור periapical, אשר הוא סימן ההיכר של חניכיים פסגה23. ניתן לזהות את ספיגת העצם. ולכמת אותה ממיקרו-CT בתמונות מיקרו-CT, האזורים הפריכיים הרדיביים מצביעים על אזורים בהם רקמת העצם הקשה הפכה לנגע periapical רך בשל התהליך הדלקתי. באיור 3, הנציג מיקרו-CT תמונות להפגין שן מטופלת לעומת שליטה. החץ באיור 3AIII מצביע על החשיפה הזולה ביותר (החשיפה הזולה ביותר אינה מופיעה על פרוסה זו של המדגם), ואזורי הקרינה הרדיביים והמסחיביים של ספיגת העצם מוקפים בקו מקווקו. גרף מתווה המוצג כאן מכמת את ספיגת עצם periapical משמעותית בשיניים שטופלו בהשוואה לפקדים.
בעוד מיקרו-CT היא טכניקה מצוינת להערכת הגודל 3-מימדי של נגעים, זה חסר מידע לגבי הקומפוזיציה הביולוגית שלהם. כתמים היסטלוגיים, כפי שהוצג באיור 4, מספק מידע זה. כתמים H & E מומחש שן בקרה לעומת השן מטופלת. ב שן מטופלים (איור 4B, C, D), עיסת שיניים עצמה מציגה נמק אשר ניתן לראות בבירור ב-H & E כתמים (איור 4b), לעומת השליטה מאורגן עיסת רקמות (איור 4b). בנוסף, והכי חשוב, באזור periapical של השן המטופלת נגע periapical, מורכב של תאים חיסוניים (מקרופאגים באבירות לימפוציטים), הוא דמיינו (איור 4D) (לעומת הרצועה חניכיים בריא (PDL) ו רקמת עצם באזור periapical של השן הבקרה). זה הנגע periapical הוא התוצאה הרצויה של טכניקת חניכיים המושרה הנגרמת כאן.
מצד שני, איור 5 מציג זיהום מוצלח אשר יכול להתרחש במקרים נדירים (לפחות 85% של בעלי חיים להראות ספיגת עצם במיקרו-CT), כלומר, שן אשר נחשף פלורה אוראלי עבור 42 ימים, עדיין לא הציג נמק הזולה , ולכן לא הפגינו אובדן העצם ונגעים periapical ב-micro-CT (איור 5A) ו היסטולוגית (איור 5a) ניתוחים.
איור 1: ציר הזמן של התהליך הניסיוני. ייצוג סכימטי של ההתקדמות הטמפורלית של ההליך הניסיוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות קליניות של הלסת התחתונה של העכבר לאחר החשיפה הראשונה הזולה הטוחנת. (A) התחתונה העכבר, שן טוחנת ראשונה עם ציפה חשופה, הטוחנת השמאלית הראשונה משמש כשליטה מטופלת. (ב) הגדלת הטוחנת הימנית עם הציפה החשופה. ניתן לדמיין את הכניסה לתעלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח מיקרו-CT. (א) הנציג מיקרו CT סריקות (פרוסות של 6μm) של טיפול (aiii, aiii) ושליטה (AI, הכל) שיניים. החצים מצביעים על חשיפה זולה (החשיפה הזולה אינה קיימת בפרוסה זו). האזורים הציבוריים והמסדקים של איבוד העצמות הסמוכים להשן המטופלת מוקפים בקווים מקווקווים. הכל, AIV-תמונות מייצגות של סימון מתאר. (ב) תיבת-העלילה לכמת את נפח הרקמה (כפי שנמדד על ידי מתאר מסומן עבור 11 פרוסות של כל מדגם) של הפקד (כתום, n = 14 בעלי חיים) לעומת המטופל (כחול, n = 15 בעלי חיים) דגימות. הניתוח בוצע באמצעות תוכנת ההערכה של Scanco למיקרו-CT. הדגימות היו מיושרות על ציר המשונן מונחה באופן שבו הציפה הקורלית, תעלות השורש והפרמיות של האמן הופיעו באותה פרוסה (ראה פרוטוקול למידע מפורט אודות התמצאות). קווי המתאר סומנו ל -5 פרוסות משני צדי אזור השיניים (כולם יחד 11 פרוסות). נפח הרקמה עבור המתאר של כל דוגמה חושבה באמצעות התוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: היסטולוגית H &Amp; E תמונות הנציג: (א) פרוסה היסטולוגית של שן בקרה. (ב) פרוסה היסטולוגית של שן מטופלת, עם נגע הגיוני ביותר. (ג) הגדלה של רקמת נמק. (ד) הגדלה של רקמת גרגירומה הפריאפייומה P = זולה, D = דנטן, B = עצם, BM = מח עצם, PDL = ברצועה חניכיים, N = עיסת נמק, G = גרגירויומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דוגמה של זיהום שנכשל: (A) מיקרו-CT הדמות הנציגה של השן עם חשיפה זולה (חץ לבן), אבל לא אובדן העצם הפריסופית משמעותית, בקורלציה (ב) היסטולוגית H & E הדמות הנציגה של אותו שיניים חשיפת חיוני (לא נמק) עיסת, ורקמות פסגה נורמלי. P = זולה, D = דנטין, B = עצם, BM = מח עצם, PDL = ברצועה חניכיים. (ג) הגדלת רקמות מסויד המוצגות ב-B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה מוצגת כאן עבור אינדוקציה של חניכיים פסגה בעכברים. מטרת השיטה היא לנצל את המצב חניכיים פסגה למחקר מנגנונים ותוצאות של תהליך דלקתי זה. חניכיים apical המושרה ב 6-8 בשבוע עכברים ישנים, גיל שבו השורשים מפותחים במלואו24. כדי לגרום חניכיים פסגה במודל זה, עיסת השן של טוחנות הלסת התחתונה נחשף באמצעות בור שיניים. חיידקים מן הצומח אוראלי של העכברים (בתנאי SPF) לפלוש התעלות הזולה והשורש של השיניים, גרימת נמק הזולה, ו lps הפרשה לרקמות פסגה, אשר מפעיל דלקת פסגה.
בעת ביצוע הליך זה, שים לב לשלבים הקריטיים הבאים. המיקום הנכון של בעלי החיים במהלך חשיפה זולה הוא קריטי להצלחת ההליך. צעד קריטי הוא החשיפה הנכונה של העיסה. חשיפה מספקת לתעלה עלולה לגרום להיווצרות גשר מסוג דנטין, שעלולה להוביל לכישלון ההליך ולחוסר היכולת ליצור AP. במהלך חשיפה זולה, תשומת לב נדרשת כדי למזער את הפגיעה ברקמה רכה במהלך חשיפה זולה כדי למנוע כאב ודלקת לא רצויים באזורים אחרים אשר עלולים לגרום לתופעות לוואי. יישור נאות של דגימות בתוכנת ניתוח מיקרו-CT הוא קריטי על מנת להשיג תוצאות של שולחנות מתרגם. בעת הכנת רקמת הלסת עבור היסטולוגיה, מומלץ לקלף את הרקמה הרכה המקיפה את העצם להשגת אוריינטציה נכונה בעת הכנת תבניות עבור היסטולוגיה. את הדגימות יש לשמור במדיום רטוב במהלך כל התהליך (משלב הקציר, דרך מיקרו-CT, עד הליך בלוק היסטולוגית). כאשר חותכים את הרקמה במיקרוטומה, הזווית של המדגם צריך להיות קבוע כדי להשיג משונן פרוסות של השן. חשוב גם לקחת בחשבון בעיות אתיות בנוגע לרווחתם של בעלי החיים. לדוגמה, הרדמה נאותה היא קריטית במהלך ההליך (הן מערכתיות והן מקומיות, ראה25,26). משככי כאבים חיוניים, במיוחד בימים הראשונים שלאחר ההליך, וניטור משקל והתנהגות, כמו גם לספק את החיות עם מזון רך צריך להיות מיושם. מניסיון קודם, התגובה הכוללת של העכברים היא לסבול היטב את ההליך והם לא מפגינים מצוקה קיצונית.
כישלון של השיטה נחשב במקרים בהם דלקת פסגה נכשל בטופס: אין ראיות עבור ספיגת העצם באזור periapical של השן על סריקת מיקרו-CT, ואת רקמת PDL של השן הוא שלם בצביעת היסטולוגית (כמו וצג באיור 5). הסיבות האפשריות לא להשיג דלקת כוללות הבדלים סטוכסטיים בהתנהגות של בעלי החיים, כמו גם החשיפה הספציפית של כל חיה לחיידקים. למרות התוצאות הטובות מושגת בגרימת חניכיים פסגה באמצעות שיטה זו (לפחות 85% של בעלי חיים להראות ספיגת העצם), בצע את הפרוטוקול מקרוב כדי להפחית את כל הווריאציה בין הדגימות. אם עכברים כלשהם מראים סימנים של מצוקה במהלך תקופת המעקב, שקול להסיר אותם מהניסוי כדי למנוע סבל. ההחלטה לעשות זאת עשויה לסייע על-ידי התבוננות באובדן או בהשגת משקל של בעלי חיים בתקופת המשך הטיפול. בעלי חיים שאיבדו הרבה משקל סובלים ויש להסירו. כמו כן, הבחנו שהחיות הסובלות מרובן הן אלה שהתחילו את הניסוי במשקל נמוך או במצב בריאותי ירוד. באופן כללי, ההליך, אם יבוצע כראוי, אמור להניב תוצאות עקביות.
יש לציין מספר מגבלות של טכניקה זו. חשוב לציין כי מודל זה פותחה על מנת ללמוד חניכיים פסגה נגרמת על ידי זיהום חיידקי ואינו מחקה מספר מנגנונים אפשריים אחרים שבהם חניכיים פסגה עלול להתעורר, כגון פציעה טראומטית ו מחלה דלקתית אוטומטית. יתר על כן, הבדלים משמעותיים בין מודל זה לבין המצב הקליני בחולים אנושיים קיימים. בעכברים, נגעים periapical ספונטנית לא תוארו וזה לגמרי מצב מלאכותי. האנטומיה של שיניים מכרסמים שונה גם מזה של בני אדם; החשיבות של הבדלים אלה אינם ידועים. עם זאת, העכבר הוא מודל שימושי ביותר להבנת מנגנונים בסיסיים ותופעות. יתר על כן, שורש ריפוי מודל הטיפול בעכבר (על ידי טיפול עם תעלת שורש) לא דווחו עד כה, אבל פוטנציאל בעל חשיבות גבוהה בתחום זה של המחקר צריך להוכיח להיות ריאלי. שיטה של הסגירה הזולה דווחה עבור עכברים, אשר מציגה פוטנציאל גדול27. תעלת שורש ריפוי מודל אכן פותחה לאחרונה חולדות, חיה מודל משמש לעתים קרובות במחקר אנדודונטיק28. השיטה שדווחה כאן יכולה לשמש כהליך מקדים לפיתוח מודל ריפוי שורש זה.
שימוש בשיטה vivo הוא חיוני למחקר של תגובה חיסונית מורכבת כזאת, ומודל העכבר, למרות מאתגרת קלינית בשל גודלו הקטן של בעל החיים, יש יתרונות רבים: הוא חסכוני, כולל מתקנים נגישים בקלות, וכן קבוצה של הכלים הגנטיים והמולקולריים הזמינים (כגון מעקבים זמינים, ספריות CRISPR והמון נתונים גנומית). מודל זה מתאים ביותר עבור מחקר אנדודונטי, כפי שהוא מעורר את המצגת הקלינית של AP בתנאי מעבדה סטרילית, עם וריאציות מינימליות (בניגוד למחקרים קליניים). יתר על כן, מודל זה יש גם יתרונות בתחומים מחקר אחרים, כגון דלקת כרונית, בשל היכולת לגרום לדלקת כרונית אך מקומית עם מעורבות מערכתית מינימלית, ואת השימוש בצד הצלעות הצדדי של אותה חיה כמו שליטה.
עבודה זו מדווחת על שימוש במיקרו-CT והיסטולוגיה לניתוח הנגע. ייתכן, סוגים אחרים של ניתוחים ניתן להשתמש במודל זה שלא בוצעו כאן, כגון בידוד DNA ובדיקת מתילציה DNA על גנים שונים בתאים דלקתיים; בידוד RNA וביצוע RNA-seq כדי לראות את התבנית של ביטוי גנים בתאים חיסוניים שונים או סוגים שונים של עכברים; או בידוד תאים ואפיון של facs20,21,29. באופן קולקטיבי, יש פוטנציאל גדול במודל שדווח כאן, אשר בתקווה להיות הקלה על ידי פרוטוקול זה דיווח והדגמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף
Acknowledgments
אנו מודים לדוקטור עודד היימן על עזרתו במיצוב בעלי חיים, רפאל ליבר לקבלת עזרה בניתוח מיקרו-CT, ופרופ ' אנערה דה רוסי דאלדגאן לקבלת ייעוץ לגבי הקמת הניסוי. אנו גם רוצים להכיר בדוקטור סידני כהן על קריאה ועריכה ביקורתית.
עבודה זו נתמכת על-ידי מענק מקרן המחקר של ד ר איזאדור א. קאח'בוי לח ולחקירות פנים, ומלגת יצחק נבון ממשרד המדע והטכנולוגיה בישראל לדוגמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
References
- Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
- Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
- Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
- Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
- Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
- Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
- Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
- Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
- Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
- Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
- De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
- Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
- Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
- Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
- Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
- Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
- Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
- Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
- Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
- Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
- Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
- Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
- Metzger, Z.
- Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
- Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
- Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
- Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
- Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
- AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).
