Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Индуцирование априкового пародонтита у мышей

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59521
Automatic Translation
1,2, 1, *2, *1
1Institute of Dental Sciences, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Endodontics, Hadassah Ein Kerem Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем протокол локально индуцировать актикпаронтит у мышей. Мы показываем, как просверлить отверстие в зубе мыши и разоблачить его пульпу, чтобы вызвать местное воспаление. Также демонстрируются методы анализа для исследования характера этого воспаления, такие как микроКТ и гистология.

Abstract

Механизмы, участвующие в локальном индуцированном воспалении, могут быть изучены с помощью нескольких доступных моделей животных. Одним из них является индукция априкового пародонтита (AP). Апригальный пародонтит является распространенной патологией воспалительного характера в пародонтальных тканях, окружающих корень зуба. Для того, чтобы лучше понять природу и механизм этой патологии, выгодно проводить процедуру у мышей. Индукция этого одонтогенного воспаления достигается путем бурения в зуб мыши, пока зубной пульпы подвергается. Далее, пульпа зуба остается загрязненной естественной флоры полости рта с течением времени, вызывая акический пародонтит. По истечении этого периода животное приносится в жертву, а зуб и челюстную кость можно анализировать различными способами. Типичные анализы включают микро-КТ изображения (для оценки костной резорбции), гистологическое окрашивание, иммуногистохимия, и экспрессия РНК. Этот протокол полезен для исследований в области устной биологии, чтобы лучше понять этот воспалительный процесс в экспериментальной обстановке in vivo с однородными условиями. Процедура требует тщательного обращения с мышами и изолированной челюстью, а визуальная демонстрация техники полезна. Продемонстрированы все технические аспекты процедур, приводящих к индуцированному акциклонантиту и его характеристике в модели мыши.

Introduction

Цель этого метода состоит в том, чтобы вызвать актикальный пародонтит у мыши, загрязняя вершину с естественной микрофлорой, а затем изучить различные характеристики этого патологического процесса.

Апригальный пародонтит (АП) является распространенной патологией воспалительного характера в пародонтальных тканях, окружающих корень зуба. Это стоматологическое заболевание может вызвать сильную боль и должны рассматриваться стоматологом. Варианты лечения включают лечение корневого канала (первичное или вторичное), эндодонтическую хирургию, удаление зуба или последующее наблюдение в зависимости от клинических и радиографических результатов, а также мнение врача. Механизм этого воспалительного процесса, хотя и изучался в течение нескольких десятилетий1,2,3, до сих пор не всесторонне понял. Учитывая тяжесть этой патологии, таким образом, существует явная необходимость в исследованиях, посвященных ее фундаментальному характеру. Таким образом, системы, в которых возможно изучение АП, представляют большой научный интерес.

Поскольку AP является сложным патологическим процессом с участием местных тканей и иммунной системы, исследования in vitro недостаточны для полного понимания процессов. Изучение клинических образцов этого заболевания также проблематично из-за этических ограниченийи значительной изменчивости между разными людьми и различных клинических стадий 4,5, и, следовательно, необходимость in vivo моделей. Эти модели основаны на концепции подвергая зубной пульпы загрязнения и наблюдения воспалительной реакции организма на этот стимул в периапических тканях6,7. Общие модели vivo включают грызунов или крупных животных, таких как собаки. Несмотря на клиническую задачу в лечении мышей, которые являются очень маленькими животными с миниатюрными зубами, преимущества мышиной модели значительны: практически, работа с мышами технически проста с точки зрения удобств и наиболее рентабельна, и Научно, мышь является хорошо изученной моделью животных с легкодоступными генетическими и молекулярными инструментами и хорошо изученным геномом. Действительно, предыдущие исследования использовали модель мыши для изучения воспалительных и костной резорбции сигналов и клеток, участвующих в априковой пародонтит8,9,10,11. Поэтому необходим четкий протокол о том, как использовать модель мыши для изучения AP. Здесь мы описываем такой протокол.

Протокол, описанный здесь имеет большое преимущество в целесообразности изучения нокаута (KO) мышей и узнать, как отсутствие конкретного гена влияет на воспаление зубов7,12. Другие полезные применения этого протокола включают изучение влияния лекарств и системных условий на развитие апфического пародонтита13, влияние апфического пародонтита на развитие остеонекроза челюстей14 , 15 и терапия стволовыми клетками для регенерации костей16.

Этот протокол также может быть обобщен в качестве модели для изучения местного воспаления. Для изучения воспалительного процесса, несколько моделей мыши были разработаны, которые включают, например, индуцированный колит или артрит17,18. Эти модели имеют системный эффект и не имеют встроенного контроля в одном животном. Модели индуцированного актонетита, которые включают контралатеральный контроль без воспаления, имеют преимущество преодоления этих ограничений14,19.

Таким образом, описанный ниже протокол полезен для исследователей, интересующихся локальными воспалительными процессами. Контролируемый характер этого воспаления, его заточение в определенном месте, и контралатеральный контроль зуба, все это ценнодля для изучения механизмов, участвующих в этом процессе. Кроме того, протокол полезен для исследователей, интересующихся клиническими аспектами периапического воспаления. Модель мыши идеально подходит для изучения различных переменных заболевания, в дополнение к преимуществу возможности легко выполнять генетические манипуляции в модели мыши, чтобы исследовать активность конкретных генов в периапическом воспалении.

Технически, клиническая процедура является сложной для выполнения из-за небольших размеров зубов мышей. Это будет полезно визуализировать эту процедуру для того, чтобы узнать о позиционировании, оборудование необходимо, и производительность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Еврейского университета (Этика нет. MD-17-15093-5).

1. Анестезия и позиционирование животных

  1. Подготовьте стерильные растворы, описанные ниже.
    1. Приготовьте 5 мл 7 мг/мл кетамина и 0,09 мг/мл медетомидина, разбавленного в фосфатном буферном растворе (PBS)/Saline.
    2. Приготовьте стерильный раствор атипамезола (0,4 мг/мл), разбавленного PBS/Saline (рекомендуется для приготовления количества 5 мл).
    3. Приготовьте стерильный раствор мепивакаин (7,5 мг/мл), разбавленный PBS/Saline для местной анестезии (одного поставляемого флакона Мепивакаина достаточно для запаса 7,2 мл).
  2. Используйте для эксперимента 6-8 недель ные самки C57BL/6 мышей. Держите животных в определенном патогене свободном (SPF) животном устройстве, со стандартной водой и пищей, предоставляемой на объекте и кормлением животных ad libitum.
  3. Взвешивать мышей и вводить интраперитонеально (IP) объем 10 зл на каждый грамм веса. Например, для мыши, которая весит 20 граммов,
    вводят 200 л кетаминового/медетомидинового раствора. Это даст окончательную концентрацию (70 мг/кг) кетамина и (0,9 мг/кг) медетомидина
    для каждого животного.
  4. Для предотвращения язвы глаз из-за сухости во время процедуры, нанесите глазную мазь, содержащую хлорамфеникол (5%) на глазах животных, пока они находятся под наркозом. Держите животных в тепле с лампой, пока они под анестетом. Проверьте глубину анестезии, проверяя педали рефлекс (выполнение фирмы ног щепотку).
  5. После того, как мышь обезболлена, положение мыши, лежащей на правой стороне (для правого исследователя) на закрытой клетке экструдированной поверхности пены полистирола и прикрепите ноги к поверхности с помощью ленты.
  6. Откройте рот с помощью небольших резинок вокруг резцов (1 для верхних резцов, и 1 для нижних резцов), удерживаемых на месте длинными иглами, закрепленными в закрытой клетке экструдированной поверхности пены полистирола.
  7. Урежесли правую щеку с помощью щипкеток приклеены к поверхности. Используйте щипки, которые закрыты в стабильном состоянии.
  8. Поместите поверхность с помощью мыши в удобное рабочее положение, обеспечивающее доступ к мандибулярным молярам, используя надлежащее увеличение (бинокулярный микроскоп или клинический микроскоп) и свет.
  9. Уречку языка с помощью щипцы или зубной шпатель и ввести местную анестезию с 27 Гоуго иглы в слизистую складку, прилегающую к первому мандибулярному моляру. 25-50 зЛ достаточно. Отек ткани вокруг места инъекции должен быть визуализирован.

2. Воздействие целлюлозы

  1. Используйте 1/4 круглых зубных заусенцев, или того же размера алмазза (рекомендуется длинный хвостовик) со скоростью 800 выстрелов в минуту (об / мин), прилагается к любому подходящему зубному двигателю (например, автоматическому снижению крутящего момента (ATR) двигателя).
  2. Просверлите на окклюзионной части первого правого мандибулярного моляра до тех пор, пока рога целлюлозы не будут видны через дентин. использовать короткие очередей двигателя для предотвращения области перегрева.
  3. Используйте K-файл или H-файл #8 или #10, чтобы проколоть целлюлозу и вставить файл в целлюлозно рога (мезиальный и дистальный), нарушая дентин, покрывающий их. Файлы стерилизованы автоклавом.
  4. Продолжайте работать с файлами внутри пульпы как можно глубже, расширяя отверстия с файлами. Обычно будет кровотечение видно из мякоти.
  5. Убедитесь в том, чтобы круглые острые края зуба с заусенцев и удалить зуб из окклюзии, с тем чтобы уменьшить боль во время эксперимента. Очистите мусор во время процедуры микрощеткой.
  6. Оставьте контралатеральный зуб (левый первый мандибулярный моляр) в качестве контроля.

3. Окончание клинической процедуры

  1. Выпустить мышь из состояния фиксации и ввести Atipamezole IP (10 зл. на каждый грамм массы тела. Это даст окончательную дозу (4 мг/кг) Атипамезола.
  2. Вводят бупренорфин, разбавленный пБС/солью (0,05 мг/кг) ИС (рекомендуется готовить количество 3 мл в день процедуры). Смотрите Обсуждение для объяснения, почему боли необходимо.
  3. Убедитесь, что животные оправиться от анестезии, прежде чем оставить их. Дайте им мягкую пищу, потому что они могут быть невеспособны есть твердую пищу из-за зубной боли.

4. После процедуры наблюдения (42 дней)

  1. В течение первых 3 дней после процедуры взвесьте взвесите животных и введите Бупренорфин (0,1 мг/кг) IP один раз в день (рекомендуется готовить количество 6 мл).
  2. Во время эксперимента (42 дня, когда накапывается воспаление) следят за животными по весу и общей поведенческой оценке 2-3 раза в неделю.
  3. Доставить мягкую пищу животным в течение периода наблюдения. Смочите еду водой и положите ее в чашку петри на пол клетки.

5. Прекращение эксперимента и анализ

  1. Когда 42 дней11 наблюдения были завершены, анестезирует животных IP с кетамин / ксилазин в концентрации 106,25 мг/кг кетамин, и 75 мг/кг ксилазин (запас раствор 42,5 мг/мл кетамин, и 1,5 мг/мЛ ксазилин в общей сложности 2 м рекомендуется) и преформирования шейки матки дислокации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные варианты для возможных анализов для того, чтобы оценить воспаление20,21. Здесь будет описан анализ тканей с помощью микро-КТ и гистологического окрашивания.
  2. После эвтаназии используйте хирургические ножницы и щипцы, чтобы вырезать часть челюсти, включая 3 моляра (отдельно для каждой стороны, обработанной и необработанной контроля). С помощью щипцы снимают сне столько, сколько мягких тканей, как это возможно, оставляя в основном кости и зубы на образец.
  3. Промыть ткани кратко в PBS, а затем положить его в параформальдегид (PFA) 4% (разбавленный в PBS) в течение 24-48 часов для фиксации.
    ВНИМАНИЕ: Используйте PFA в химическом капюшоне, и в соответствии с его данными о материальной безопасности (MSDS) руководящих принципов.
  4. После 24-48 часов, промыть PBS 3x для того, чтобы вымыть PFA.
  5. Микро-КТ
    1. Для микро-Ct анализа, возьмите собранные ткани (часть челюсти, включая 3 моляра, в размерах примерно 4 мм х 5 мм х 1 мм) на микро-КТ сканер, поместите их в 12 мм диаметр трубки заполнены 1,5 мл PBS ориентированы так, что buccal или лингвистической поверхности зуба и корня прокладываются параллельно нижней части трубки. Отдельно между образцами губкой, и покрыть верхнюю часть трубки с гибкой пленкой.
    2. Откройте панель сканирования и выберите номер измерения. Выберите файл управления со следующими параметрами: энергия 70 кВ, интенсивность 114 КВ и разрешение 6 мкм3 вокселя размера.
    3. Нажмите на видразведчика, а также при появляются изображения, нажмите ссылку и пометьте область образцов для сканирования. После каждого примера нажмите добавить сканирование. При выполнении маркировки образцов перейдите в список задач и выберите задачи началавзаимодействия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Те же образцы впоследствии могут быть использованы для гистологии. Важно, чтобы они не высохли во время КТ-сканирования.
  6. Используйте соответствующую компьютерную программу для выравнивания и анализа микро-КТ.
    1. Откройте образец на плоскости XY в оценке микро-КТ. Выберите три точки на каждом примере для выравнивания:
      Mesial apical сужение - определяет происхождение системы координат.
      Корональная часть мезиального канала - определяет точку на оси.
      Дистальный атикальный сужение - определяет точку на плоскости X.
    2. Используйте инструмент измерения на левой панели и нарисуйте линию, достигаюваюую каждой точки. Определите каждую из трех точек по значению X, Y и q, как это отображается в правой панели.
    3. Определите область интереса к выборке, выбрав задачу в соответствии с оценкой ЗКТ,и нажмите на 3D-оценку. На экране появятся прямоугольник и окно с размерами на ось. Соподогвайте размеры прямоугольника, чтобы соответствовать интересующей области на оси XY, нажав по углам средней кнопкой мыши. Выберите размеры в оси, вставив первое количество срезов интереса в квадрате под VOIStart, и количество ломтиков от первого до последнего количества срезов интереса в квадрате под Dim.
    4. Нажмите на приложения под менеджеромсеанса и выберите DECterm. Подождите несколько секунд для окна, чтобы открыть, а затем введите пять шагов наклонный сценарий, описанный ниже в соответствии со следующими инструкциями (между линиями нажмите введите):
      Ipl
      isq'to-aim
      цель1
    5. Копирование isq (файл интересов) имя: выбрать представления под менеджером сессии и нажмите microCTdata. Найдите работающий файл и нажмите на середину файла. Затем нажмите кнопку назад в окне DECterm.
    6. Введите значения X, Y и q (с пространством между ними), которые были определены в соответствии с VOI при выборе региона интереса.
    7. Введите значения X, Y и q (с пространством между ними), которые были определены при тусклом регионе, представляющем интерес.
    8. Подождите, пока не получите сообщение: isq цель завершена.
      (шаг II-выравнивание):
      выровнять z
      цель1
      цель2
    9. Введите значения X, Y и q (с пространством между ними), которые были определены для происхождения системы координат.
    10. Введите значения X, Y и q (с пространством между ними), которые были определены для точки на оси z.
    11. Введите значения X, Y и q (с пространством между ними), которые были определены для точки на плоскости X.
    12. Подождите, пока не получите сообщение: "выравнивание" завершено
      (шаг III- заголовок):
      Заголовка
      цель2
      0 0 0
      0 0 0
    13. Нажмите введите.
      (шагIV- преобразование файла обратно от цели к isq):
      toisq
      цель2
    14. Копирование isq (файл интересов) имя: выбрать представления под менеджером сессии и нажмите microCT данных. Найдите файл, над которым работаете, и нажмите на файл. Затем нажмите кнопку назад в окне DECterm. Стереть (с помощью "обратного пространства") ". ИСЗ" в конце файла, и напишите: " ИСЗ" для распознавания выровненных файлов.
    15. Нажмите на ввод введите.
    16. Подождите, пока не получите сообщение: "toisq'from'aim завершена"
      (шаг V- флип):
      isq
      a
    17. Копирование нового isq (файл интересов) имя: выбрать представления под менеджером сессии и нажмите microCT данных. Найдите работающий файл и нажмите на середину файла. Затем нажмите кнопку назад в окне DECterm.
    18. Нажмите на ввод введите. Подождите, чтобы получить сообщение: "isq'to'aim завершена"
      Флип
      a
      Аа
      Zx
      ждать, чтобы получить сообщение: "флип-цель завершена"
      От
      Аа
    19. Копирование нового имени isq: выбирайте представления под руководством диспетчера сеанса и щелкните данные microCT. Найдите работающий файл и нажмите на середину файла. Затем нажмите кнопку назад в окне DECterm. Стереть (с помощью "обратного пространства") ". ИСЗ" в конце файла, и напишите: "Флип. ИСЗ" для распознавания выровненных файлов.
    20. Подождите, пока не получите сообщение: "От цели"-
  7. Контурной
    1. Выберите ломтик, который представляет собой примерно середину зуба, в котором корональная мякоть, радикулярная мякоть обоих каналов, и оба аптических foramens представлены.
    2. Ручно отмечаем контур интереса на среднем срезе, нажав на верхнюю левую контурную панель, начиная с дистальной точки дистальной вершины корня, апотическая граница коронально к атикальной области радиопака, через мизиальную границу месиальной вершины корня следуя дистальной границе мезиального корня и мезиальной границе дистального корня через область фуркации (см. Рисунок 3 II, IV).
    3. Копируйте этот контур (Ctrl-C, Ctrl-V) и отрегулируйте его соответствующим образом до 5 ломтиков, расположенных по обе стороны от среднего среза.
    4. Для расчета объема ткани контура, отмеченного для каждого образца, выберите задачу в соответствии с оценкой ККТи нажмите на 3D-оценку. В окне 3D оценки нажмите кнопку выберите рядом задачу и выберите фильтр для расчета объема ткани (ТВ).
  8. Гистологии
    1. После удаления тканей из микро-КТ сканера, декальцифифицировать ткани, поставив каждый образец в микроцентрифуге трубки с 1 мл этилэндиаминетететраацетической кислоты (ЭДТА) 0,5 М рН 8,0 в течение 10 дней. Изменяйте решение EDTA каждые 3 дня.
    2. Обезвоживание: Положите образцы в гистологические кассеты, и в увеличение концентрации этанола, по часу каждый, следующим образом: 70% этанола (на данный момент процесс может быть остановлен в течение нескольких недель, до тех пор, как образцы хранятся в этаноле), 90% этанола 2x, 100% этанол 2x, ксилен 2x (осторожно: использовать ксилен в химическом капоте, и в соответствии с его руководящими принципами MSDS).
      1. Перенесите кассеты в жидкий парафин (60 градусов по Цельсию) и оставьте в химическом капоте на ночь для того, чтобы ксилен испарился.
    3. Блокировка: Используйте гистологическую блокирующую машину для встраиваемого образца в парафин. Будьте осторожны, чтобы вставлять их в правильном положении (т.е. коронка и корни должны быть ориентированы параллельно нижней части формы, таким образом, что зуб "лежа") для того, чтобы получить сагитальные секции. Образцы теперь готовы к разрезанию с помощью микротома.
    4. Резка разделов: Начните с резки толстые ломтики юаней 20 мкм до достижения соответствующей части ткани. После признания какой-либо части зуба (корона или корни) изменить на разделы 6 мкм, и изменить угол резки в соответствии с предыдущим разделом.
      1. Например, если предыдущая секция включала коронку, но не корни, измените угол блока в микротоме так, чтобы корни приблизились к ноже, а коронка отошла назад (части зуба можно распознать невооруженным глазом на самом блоке).
      2. Продолжайте регулировать угол до получения сагитальных секций, включая корональную и радикулярную мякоть, а также атические предылза. Вырезать в этой ориентации, как много ломтиков, как это возможно, пока соответствующие ткани все вырезать.
    5. Для окрашивания протоколов (например, гемотоксилин и Эозина окрашивания (H и E), Браун и Бренокс, Тартрат-резистентная кислота фосфатазы (TRAP) окрашивания, иммуногистохимия),см.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Диаграмма потока экспериментальных шагов представлена на рисунке 1. Как указано в протоколе, мыши обезвреживаются, и их первый мандибулярный моляр с одной стороны просверливается до облучения целлюлозы, в то время как контралатеральный зуб остается в качестве контроля. Далее зубы остаются загрязненными флорой полости рта в течение 42 дней, в течение которых они контролируются и получают обезболивающее. После 42 дней, мышей усыпножают, и зубы и смежные челюсти взяты на анализ.

На рисунке 2 показаны клинические изображения челюсти мыши после первого воздействия молярной пульпы. На рисунке 2A показана вся челюсть, в то время как всет в рисунке 2B показано расширение обработанного первого правого моляра. Левый первый моляр используется в качестве элемента управления. Воздействие как мезиальных, так и дистальных валовых целлюлозно-бумажных и вход в каналы можно увидеть на рисунке 2B. Обратите внимание, что зуб был механически опущен до суб-окклюзии, чтобы уменьшить боль.

После стоматологического воздействия пульпы на пероральнуюфлору, зубная мякоть в конечном итоге загрязнены 6,7 и становится некротической. Согласно литературе22, Грамм отрицательных бактерий затем выделяют липополисахарид (LPS) в апической области зуба. Благодаря сложной реакции иммунной системы, одним из результатов является резорбция костей в периаптической области, которая является отличительной чертой апфического пародонтита23. Эта резорбция костей может быть идентифицирована и количественно определена микро-КТ. На микро-КТ-изображениях радиолуцентные периапические области указывают области, где твердая костная ткань стала мягким периапическим повреждением из-за воспалительного процесса. На рисунке 3репрезентативные микро-КТ-изображения демонстрируют обработанный зуб по сравнению с контролем. Стрелка на рисунке 3AIII указывает на мезиальную облучение целлюлозы (дистальное облучение целлюлозы не появляется на этом фрагменте образца), а мезиальные и дистальные периапектные радиолуптические участки костной резорбции окружены пунктирной линией. График boxplot показано здесь количественно значительное периапической кости резорбции в обработанных зубов по сравнению с контроля.

Хотя микро-КТ является отличным методом для оценки трехмерных размеров поражений, в нем отсутствует информация об их биологическом составе. Гистологическое окрашивание, как представлено на рисунке 4, предоставляет эту информацию. Н И E окрашивание показано в контрольный зуб по сравнению с обработанным зубом. В обработанном зубе(Рисунок 4B,C,D), зубная целлюлоза сама представляет некроз, который можно хорошо увидеть в H и E окрашивания (Рисунок 4C), по сравнению с контролем организованной целлюлозы ткани (Рисунок 4A). Кроме того, и что немаловажно, в периапической области обработанного зуба периапическое повреждение, состоящее из иммунных клеток (доминирующее макрофаги и лимфоциты), визуализировано(рисунок 4D)(по сравнению со здоровой пародонтальной связки (PDL) и костной ткани в периапической области контрольного зуба). Это периапическое поражения является желаемым результатом индуцированной техники пародонтита, представленной здесь.

С другой стороны, на рисунке 5 представлено неудачное загрязнение, которое может произойти в редких случаях (не менее 85% животных показывают резорбцию костей в микро-КТ), т.е. зуб, который подвергался воздействию пероральной флоры в течение 42 дней, но не представлял некроза целлюлозы , и поэтому не продемонстрировали потерю костной массы и периапическое поражение в микро-КТ(рисунок 5A) и гистологические (рисунок5B) анализы.

Figure 1
Рисунок 1: Оси времени экспериментального процесса. Схематическое представление временной прогрессии экспериментальной процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Клинические изображения челюсти мыши после первого первого воздействия молярной пульпы. (A) Мышь челюсть, первый правый моляр с открытой мякотью, первый левый моляр служит необработанным контролем. (B) Увеличение правого моляра с открытой мякотью. Вход в каналы может быть визуализирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Микро-КТ-анализ. (A) Репрезентативная микро-КТ (ломтики 6 мм) обработанных (AIII, AIV) и контроль (AI, AII) зубов. Стрелка указывает на mesial воздействия целлюлозы (дистальное воздействие целлюлозы не присутствует в этом ломтике). Мезиальные и дистальные периапические участки потери костной массы, прилегающие к обработанному зубу, окружены разбитыми линиями. AII, AIV- Репрезентативные изображения контурной маркировки. (B) Box-сюжет, определяющий объем ткани (измеренный контуром, отмеченным для 11 ломтиков каждого образца) контрольного (оранжевого, n'14 животных) по сравнению с обработанными (голубыми, n-15 животными) образцами. Анализ проводился с использованием программного обеспечения для оценки Scanco для микро-CT. Образцы были выровнены на сагитальной оси, ориентированной таким образом, что корональная пульпа, корневые каналы и апикальные протеже были визуализированы в одном срезе (см. протокол для подробной информации о ориентации). Контуры были отмечены по 5 ломтикам по обе стороны от середины зуба (все вместе 11 ломтиков). Объем ткани для контура каждого образца был рассчитан с помощью программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Гистологические репрезентативные изображения Н И Е: (A) Гистологический кусок контрольного зуба. (B) Гистологический кусок обработанного зуба, с тяжелым периапическим повреждением представлены. (C) увеличение некротической ткани. (D) увеличение периапической грануломы ткани P'pulp, D'dentin, B'bone, БМЗкост мозга, PDL'пародонтальной связки, Некротической пульпы, G грануломы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Пример неудачного загрязнения: (A) микро-CT репрезентативное изображение зуба с облучением пульпы (белая стрелка), но не значительная потеря периапической кости, коррелирует с(B) Гистологическим H и E репрезентативное изображение того же зуб выявления жизненно важной (некротической) мякоти, и нормальные атикальные ткани. Пюмпули, Дентин, Бюкбон, БМзкост мозга, PDL-пародонтальной связки. (C) Увеличение кальцинированной ткани, представленной в B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь вводится метод индукции априкового пародонтита у мышей. Целью метода является использование акическом пародонтита для изучения механизмов и последствий этого воспалительного процесса. Апригальный пародонтит был индуцирован у 6-8 недельных мышей, возраст, в котором корни полностью развиты24. Для того, чтобы вызвать акический пародонтит в этой модели, зубная мякоть мыши mandibular моляров подвергается с помощью зуба заусенцы. Бактерии из пероральной флоры мышей (в условиях SPF) вторгаются в целлюлозу и корневые каналы зубов, вызывая некроз пульпы, и выделяя LPS в атикальные ткани, что вызывает апекальное воспаление.

При проведении этой процедуры, обратите внимание на эти следующие критические шаги. Правильное позиционирование животных во время облучения целлюлозы имеет решающее значение для успеха процедуры. Важным шагом является надлежащее воздействие целлюлозы. Недостаточное воздействие канала может привести к образованию моста Дентина, что может привести к сбою процедуры и невозможности создания АП. Во время воздействия целлюлозы, внимание необходимо свести к минимуму повреждения мягких тканей во время воздействия пульпы, чтобы избежать нежелательной боли и воспаления в других регионах, которые могут вызвать побочные эффекты. Правильное выравнивание образцов в программном обеспечении для анализа микро-КТ имеет решающее значение для получения интерпретационных результатов. При подготовке ткани челюсти к гистологии рекомендуется снять мягкие ткани, окружающие кость, для достижения правильной ориентации при подготовке форм для гистологии. Образцы должны храниться во влажной среде в течение всего процесса (от стадии сбора урожая, через микро-КТ, до процедуры гистологического блока). При разрезании ткани в микротоме, угол образца должны быть зафиксированы для того, чтобы достичь sagittal ломтиками зуба. Важно также принимать во внимание этические вопросы, касающиеся благополучия животных. Например, надлежащая анестезия имеет решающее значение во время процедуры (как системной, так и локальной, см.25,26). Боль лекарства имеет важное значение, особенно в течение первых нескольких дней после процедуры, и мониторинг веса и поведения, а также поставки животных с мягкой пищи должны быть реализованы. Из предыдущего опыта, общая реакция мышей, чтобы хорошо переносить процедуру, и они не проявляют крайнего бедствия.

Сбой метода рассматривается в тех случаях, когда акическое воспаление не сформировалось: нет никаких доказательств резорбции костей в периапической области зуба на микро-КТ, а ткань PDL зуба не повреждена в гистологическом окрашивании (как представлено на рисунке 5). Возможные причины не достижения воспаления включают стохастические различия в поведении животных, а также специфическое воздействие каждого животного на бактерии. Хотя хорошие результаты достигаются в вызывая акическом пародонтите с помощью этого метода (по крайней мере 85% животных показывают резорбцию костей), следуйте протоколу внимательно, чтобы уменьшить любые различия между образцами. Если какие-либо мыши проявляют признаки бедствия в течение периода наблюдения, рассмотреть вопрос об удалении их из эксперимента, чтобы предотвратить страдания. Решению об этом может способствовать снижение или увеличение веса животных в течение периода наблюдения. Страдают животные, которые теряют много веса и должны быть удалены. Мы также отметили, что больше всего страдают животные, которые начали эксперимент с низким весом или плохим состоянием здоровья. В целом, процедура, если она выполнена правильно, должна дать последовательные результаты.

Следует отметить ряд ограничений этой техники. Важно отметить, что эта модель была разработана для изучения акриационного пародонтита, вызванного бактериальным загрязнением, и не имитирует ряд других возможных механизмов, с помощью которых может возникнуть апиканальный пародонтит, такие как травматическая травма т.д. аутовоспалительные заболевания. Кроме того, существуют значительные различия между этой моделью и клинической ситуацией у пациентов. У мышей, спонтанные периапические поражения не были описаны, и это полностью искусственная ситуация. Анатомия зубов грызунов также отличается от анатомии человека; важность этих различий неизвестно. Тем не менее, мышь является чрезвычайно полезной моделью для понимания основных механизмов и явлений. Кроме того, модель исцеления корневого канала в мыши (путем лечения корневого канала) не сообщалось до сих пор, но потенциально имеет большое значение в этой области исследований, если она окажется осуществимой. Метод укупорки целлюлозы был сообщен для мышей, который показывает большой потенциал27. Модель исцеления корневого канала действительно была недавно разработана у крыс, модель животного, часто используемого в эндодонтических исследованиях28. Метод сообщил здесь может служить в качестве предварительной процедуры для разработки этой модели исцеления корневого канала.

Использование метода in vivo имеет решающее значение для изучения такой сложной иммунной реакции, и модель мыши, хотя клинически сложной из-за небольшого размера животного, имеет много преимуществ: это экономически эффективным, включает в себя легко доступные средства, и набор доступные генетические и молекулярные инструменты (такие как доступные выбивания, библиотеки CRISPR и множество геномных данных). Эта модель наиболее подходит для эндодонтических исследований, так как она вызывает клиническое представление AP в стерильных лабораторных условиях, с минимальными вариациями (в отличие от клинических исследований). Кроме того, эта модель также имеет преимущества в других областях исследований, таких как хроническое воспаление, из-за способности вызывать хроническое, но локальное воспаление с минимальным системным участием, и использование контралатеральной стороны того же животного, как контроль.

Эта работа сообщает об использовании микро-КТ и гистологии для анализа поражения. Потенциально, другие типы анализов могут быть использованы в этой модели, которые не были выполнены здесь, такие как изоляция ДНК и тестирование метилирования ДНК на различных генах в воспалительных клетках; изолировать РНК и выполнять РНК-сек, чтобы увидеть картину экспрессии генов в различных иммунных клетках или различных типах мышей; или изоляции клеток и характеристики их FACS20,21,29. В совокупности в модели, о которой сообщается, есть большой потенциал, которому, как мы надеемся, будет способствовать этот протокол и демонстрация.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Одеда Хеймана за его помощь в позиционировании животных, Рафаэля Либера за помощь в анализе микро-КТ и профессора Андиару Де Росси Далдегана за совет ы по подготовке эксперимента. Мы также хотели бы отметить д-ра Сидни Коэна за критическое чтение и редактирование.

Эта работа была поддержана грантом научно-исследовательского фонда д-ра Изадора И. Кабакова Для МК и ИА, а также стипендией Ицхака Навона от Министерства науки и технологий Израиля в EG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Eurovet Animal Health CAS 104075-48-1
ATR dentsply tecnika
blocking machine Leica EG1150H
buprenorphine vetmarket 163451
clinical microscope/binocular Olympus Sz61
dental bur Komet dental ZR8801L 315 008
dental spatula Premier 1003737
EDTA J.T Baker 8993
entelan mercury 1.07961
Eosin Y solution, alcoholic SIGMA HT110116
hematoxylin solution, Mayer's SIGMA MHS 16
Ketamine hydrochloride Vetoquinol CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor) CP-pharma GmbH CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3% Teva CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators PARKELL S379
micro-ct scanner scanco uCT 40
parafin Leica 39602004
PBS SIGMA D8537
PFA EMS 15710
Chloramphenicol eye ointment (5%) Rekah pharmaceutical CAS 56-75-7
tweezers WAM Ref-CT
xylazine Eurovet Animal Health CAS 7361-61-7
xylene Gadot CAS 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
  2. Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
  3. Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
  4. Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
  5. Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
  6. Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
  7. Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
  8. Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
  9. Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
  10. Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
  11. De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
  12. Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
  13. Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
  14. Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
  15. Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
  16. Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
  17. Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
  18. Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
  19. Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
  20. Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
  21. Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
  22. Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
  23. Metzger, Z. Macrophages in periapical lesions. Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).
  24. Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
  25. Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
  26. Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
  27. Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
  28. Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
  29. AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).

Tags

Биология Выпуск 150 Априкпаронтит мыши эндодонтика зубы стоматологическое загрязнение микро-КТ
Индуцирование априкового пародонтита у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldman, E., Reich, E., Abramovitz,… More

Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M. Inducing Apical Periodontitis in Mice. J. Vis. Exp. (150), e59521, doi:10.3791/59521 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter