Summary
ここで、マウスにおいて局所的に頂点歯状炎を誘導するプロトコルを提示する。マウスの歯に穴を開け、パルプを露出させ、局所的な炎症を引き起こす方法を示します。また、マイクロCTや組織学など、この炎症の性質を調べるための分析方法も実証されている。
Abstract
局所誘発性炎症に関与するメカニズムは、いくつかの利用可能な動物モデルを使用して研究することができる。これらの1つは、頂点歯状炎(AP)の誘導である。頂点歯周炎は、歯根を取り囲む歯周組織における炎症性の一般的な病理である。この病理の性質およびメカニズムをよりよく理解するためには、マウスで手順を実行することが有利である。この歯髄の炎症の誘導は、歯髄が露出するまでマウス歯に穴を開けることによって達成される。次に、歯パルプは、時間の経過とともに自然な口腔細菌叢によって汚染され続け、頂点歯状炎を引き起こす。この期間の後、動物を犠牲にし、歯と顎の骨を様々な方法で分析することができます。典型的な分析には、マイクロCTイメージング(骨吸収を評価する)、組織染色、免疫組織化学、RNA発現が含まれます。このプロトコルは、均一な条件を有するインインインインインインバイオ実験環境におけるこの炎症過程をよりよく理解するために、口腔生物学の分野における研究に有用である。この手順は、マウスと単離された顎の慎重な処理を必要とし、技術の視覚的なデモンストレーションが有用である。誘導されたアピカル歯全歯炎およびマウスモデルにおけるその特徴を引き起こした手順のすべての技術的側面が実証される。
Introduction
この方法の目的は、天然微生物叢で頂点を汚染することにより、マウスの頂点歯状炎を誘導し、その後、この病理学的プロセスの様々な特性を研究することである。
頂点歯周炎(AP)は、歯根を取り囲む歯周組織における炎症性の一般的な病理である。この歯科疾患は重度の痛みを引き起こす可能性があり、歯科医によって治療されなければなりません。治療オプションには、根管治療(一次または二次)、内因性手術、歯の抽出、または臨床および放射線学的所見に応じてフォローアップ、および臨床医の意見が含まれます。この炎症過程のメカニズムは、数十年にわたって研究されたが、1、2、3は、まだ包括的に理解されていない。この病理の重症度を考慮すると、その根本的な性質に取り組む研究の必要性は明らかである。したがって、APの研究が可能なシステムは、大きな科学的関心を持っている。
APは局所組織と免疫系を含む複雑な病理学的プロセスであるため、インビトロ研究はプロセスを完全に理解するには不十分です。この疾患の臨床サンプルの研究はまた、異なる人々と異なる臨床段階4、5との間の倫理的な制限と有意な変動性のために問題であり、したがって、生体内モデルの必要性。これらのモデルは、歯髄を汚染にさらし、体の炎症反応を周期組織6,7のこの刺激に観察するという概念に基づいている。生体内モデルで一般的には、げっ歯類または犬などの大型動物が含まれる。ミニチュア歯を持つ非常に小さな動物であるマウスの治療における臨床的課題にもかかわらず、マウスモデルの利点は重要です:実際には、マウスを使用することは、施設の面で技術的に簡単であり、最も費用対効果が高く、科学的に、マウスは容易に入手可能な遺伝的および分子ツールとよく研究されたゲノムを持つよく研究された動物モデルです。実際、以前の研究では、炎症性および骨吸収シグナルおよび頂点歯状炎に関与する細胞を研究するためのマウスモデルを使用し、8、9、10、11。したがって、AP の研究にマウス モデルを使用する方法に関する明確なプロトコルが必要です。ここでは、このようなプロトコルについて説明します。
ここで説明するプロトコルは、ノックアウト(KO)マウスを研究し、特定の遺伝子の欠如が歯の炎症7、12にどのように影響するかを学ぶのに適しているという大きな利点を有する。このプロトコルの他の有用な応用は、薬物および全身性状態の研究が頂点歯止炎13の発症に及ぶ、顎の骨壊死の発症に対する頂点歯状炎の影響14を含む。,骨再生のための15および幹細胞療法16.
このプロトコルはまた、局所炎症を研究するためのモデルとして一般化することができる。炎症過程を研究するために、いくつかのマウスモデルが開発されており、例えば誘発大腸炎または関節炎17、18を含む。これらのモデルは全身効果があり、同じ動物に組み込みの制御を持っていない。炎症のない逆対性コントロールを含む誘発性頂点歯膜炎のモデルは、これらの制限14、19を克服する利点を有する。
したがって、以下に説明するプロトコルは、局所的な炎症過程に興味を持っている研究者のために有用である。この炎症の制御された性質、特定の場所へのその閉じ込め、および反対の制御歯はすべて、このプロセスに関与するメカニズムを研究するためにこのプロトコルを貴重なものにする。さらに、このプロトコルは、周期的な炎症の臨床的側面に興味を持つ研究者にとって有用である。マウスモデルは、疾患の異なる変数を研究するのに理想的であり、マウスモデルにおいて容易に遺伝子操作を行うことができるという利点に加えて、周期的な炎症における特定の遺伝子の活性を調べることができる。
技術的には、臨床手順は、マウスの歯の小さな寸法のために行うことが困難です。位置、必要な機器、およびパフォーマンスについて学ぶために、この手順を視覚化することが有益です。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、ヘブライ大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています(倫理いいえ。MD-17-15093-5)。
1. 動物麻酔と位置決め
- 以下に説明するように無菌溶液を調記する。
- リン酸バッファー溶液(PBS)/生理食液で希釈したケタミン7mg/mLおよび0.09mg/mLメデトミジンの5mLを調出す。
- PBS/生理生殖水で希釈したアティパメゾール(0.4mg/mL)の滅菌液を調作する(5mLの量を調出すことを推奨)。
- 局所麻酔のためにPBS/生理生殖不能で希釈したメピバカイン(7.5mg/mL)の滅菌液を調作する(メピバカインのバイアルを供給されたものは7.2mLのストックに対して十分である)。
- 実験には6~8週齢の雌C57BL/6マウスを用いる。動物を特定の病原体フリー(SPF)動物ユニットに保管し、施設が提供する標準的な水と食物、および動物がアドリビタムを供給します。
- マウスの重量を量り、体重のグラムごとに10 μLの体積を経口腔内(IP)に注入する。例えば、20グラムの重さのマウスの場合、
ケタミン/メデトミジン溶液を200μL注入します。これは、(70 mg/kg)ケタミンと(0.9 mg/kg)メデトミジンの最終的な濃度を与えます
各動物のために。 - 手術中の乾燥による眼潰瘍を防ぐために、クロラムフェニコールを含む眼のチント(5%)彼らは麻酔下にある間、動物の目に。彼らは麻酔されている間、ランプで動物を暖かく保ちます。ペダル反射(しっかりしたつま先のピンチを実行)をチェックすることにより、麻酔の深さを確認してください。
- マウスが麻酔された後、マウスを右側(右手の研究者用)に置き、閉じたセル押し出されたポリスチレンフォーム表面に置き、テープを使用して表面に足を取り付けます。
- 切開部の周りに小さなゴムバンド(上部切開部1、下部切開部用1)を使用して口を開き、閉じたセル押し出されたポリスチレンフォーム表面にピン留めされた長い針で固定します。
- 表面にテープで留めた鉗子を使用して右頬を引き込みます。定常状態で閉じている鉗子を使用します。
- 適切な拡大(双眼鏡または臨床顕微鏡)と光を使用して、顎臼高へのアクセスを可能にする快適な作業位置にマウスで表面を置きます。
- 鉗子または歯科へらを使用して舌を引き込み、最初の顎臼歯に隣接する粘膜の折り目に27ゲージ針で局所麻酔を注入する。25-50 μLで十分です。注射部位の周りの組織の腫脹を視覚化する必要があります。
2. パルプ露光
- 1/4ラウンドの歯科用バリ、または同じサイズのダイヤモンドバリ(長いシャンクが推奨)を毎分800ラウンド(rpm)の速度で使用し、任意の適切な歯科モーター(例えば、自動トルク低減(ATR)モーター)に取り付けます。
- パルプ角がデンチンを通して見えるまで、最初の右顎臼歯の閉塞部分をドリルします。モータの短いバーストを使用して、過熱を防ぎます。
- K-ファイルまたはHファイル#8または#10を使用してパルプを貫通し、それらを覆うデンティンを壊すことによって、パルプホーン(メシアルと遠位)にファイルを挿入します。ファイルはオートクレーブによって殺菌されます。
- ファイルで開口部を広げながら、パルプ内のファイルを可能な限り深く操作し続けます。通常、パルプから目に見える出血があります。
- 実験中の痛みを軽減するために、歯の鋭いエッジをバリで丸め、閉塞から歯を取り除くようにしてください。マイクロブラシで手順中に破片をきれいにします。
- コントロールとして反対歯(左第一顎臼歯)を残します。
3. 臨床処置の終了
- 固定状態からマウスを放出し、アティパメゾールIP(体重1グラムにつき10μL)を注入する。これは(4 mg/kg)アティパメゾールの最終的な用量を与える.
- PBS/生理食/生理食(0.05mg/kg)IPで希釈したブプレノルフィンを注入する(手順の日に3 mLの量を調作することをお勧めします)。痛みの軽減が必要な理由については、「議論」を参照してください。
- 動物が麻酔から回復することを確認してから、それらを残してください。歯の痛みのために硬い食べ物を食べることができず、柔らかい食べ物を与えます。
4. 後続手続き(42日)
- 処置後の最初の3日間は、動物を計量し、1日1回ブプレノルフィン(0.1mg/kg)IPを注入する(6mLの量を調少することをお勧めします)。
- 実験の間(炎症が蓄積する42日)は、体重と一般的な行動評価によって動物を週に2〜3回監視します。
- フォローアップ期間中に動物に柔らかい食べ物を届けます。水で食べ物を濡らし、ケージの床にペトリ皿に入れます。
5. 実験終了と分析
- フォローアップの42日11日が完了すると、106.25mg/kgケタミン、および75mg/kgキシラジン(42.5mg/mLケタミンのストック溶液、および1.5mg/mLキシラジンの総容積で1.5mg/mLキシラジンの濃度でケタミン/キシラジンで動物IPを麻酔する推奨)およびプリフォーム子宮頸部脱臼。
注:炎症20、21を評価するために可能な分析のための異なるオプションがあります。ここでは、マイクロCTと組織染色による組織の分析について説明する。 - 安楽死後、外科的はさみと鉗子を使用して、3つのモルを含む顎の一部を切り取ります(各側治療および非治療コントロールに対して別々に)。鉗子を使用することにより、可能な限り柔らかい組織を剥がし、主に骨と歯をサンプルに残します。
- 組織をPBSで短時間すすいでから、パラホルムアルデヒド(PFA)4%(PBSで希釈)して24~48時間固定します。
注意:化学フードにPFAを使用し、その材料安全データシート(MSDS)ガイドラインに従って使用してください。 - 24~48時間後、PBS 3xで洗い流してPFAを洗い流します。
- マイクロCT
- マイクロCT解析の場合、収穫した組織(3モルを含む一部、約4mm x 5 mmx 1 mm)をマイクロCTスキャナに取り込み、1.5mLのPBS指向の1.5mmLのチューブに入れ、ブッカルまたは言語表面を作ります。 歯と根のチューブの底部に平行に敷設されています。スポンジでサンプル間を分離し、柔軟なフィルムでチューブの上部をカバーします。
- スキャンパネルを開き、測定番号を選択します。70 kV のエネルギー、114 μA の強度、および 6 μm3ボクセル サイズの解像度のコントロール ファイルを選択します。
- スカウトビューをクリックし、画像が表示されたら、参照線をクリックし、スキャンのためにサンプルの領域をマークします。各サンプルの後にスキャンを追加します。サンプルのマーキングが完了したら、タスクリストに移動し、[対話タスクの開始] を選択します。
注:同じサンプルは、その後、組織学に使用することができます。CTスキャン中に乾燥しないことが重要です。
- マイクロCTの位置合わせと解析に適切なコンピュータプログラムを使用します。
- マイクロCT評価でXY平面上のサンプルを開きます。各サンプルの 3 つの点を選択して位置合わせを行います。
メシアル頂点収縮 - 座標系の原点を定義します。
メサル運河の冠状部分 - Z軸上の点を定義します。
遠位頂点収縮 - XZ平面上の点を定義します。 - 左側のパネルの測定ツールを使用し、各点に達する線を描画します。3 つのポイントをそれぞれ X、Y、Z の値で定義します。
- μCT 評価でタスクを選択してサンプルの対象領域を定義し、3D評価をクリックします。四角形と軸ごとの寸法を持つウィンドウが画面に表示されます。マウスの中央ボタンでコーナーをクリックして、XY 軸の対象領域に合わせて四角形の寸法を一致させます。VOI スタートの下の Z 正方形に関心のある最初のスライス番号を挿入し、Dim の下の Z 正方形の最後のスライス数までのスライス数を挿入して、Z 軸の寸法を選択します。
- セッションマネージャの下にあるアプリケーションをクリックし、DECterm を選択します。 ウィンドウが開くのを数秒待ってから、次の手順に従って次に説明する傾斜スクリプトの 5 つの手順を入力します (行間でenter キーをクリックします)。
Ipl
isq_to_aim
目指す1 - isq (関心のあるファイル) 名をコピーする:セッション マネージャの下でビューを選択し、microCTdata をクリックします。 作業中のファイルを見つけて、ファイルを中央でクリックします。次に、DECterm のウィンドウを中央クリックします。
- 対象地域を選択する際にVOIで決定された X、Y、Z の値 (それらの間にスペースがある) を入力します。
- 対象領域を選択する際に薄暗い下で決定された X、Y、Z の値 (それらの間にスペースがある) を入力します。
- メッセージを受信するまで待ちます: isq は完了を目指します。
(ステップII-アライメント):
z の位置合わせ
目指す1
目的2 - 座標系の原点に対して決定された X、Y、Z の値 (それらの間にスペースを含む) を入力します。
- Z 軸上の点に対して決定された X、Y、Z の値 (それらの間にスペースがある) を入力します。
- XZ 平面上のポイントに対して決定された X、Y、Z の値(それらの間にスペースがある)を入力します。
- メッセージを受信するまで待ちます: "align_Z 完了"
(ステップ III- ヘッダー):
ヘッダー
目的2
0 0 0
0 0 0 - をクリックします。
(ステップIV- 目的からisqにファイルを戻す):
トイスク
目的2 - isq (関心のあるファイル) 名をコピーする:セッション マネージャの下でビューを選択し、microCTデータをクリックします。作業中のファイルを見つけて、ファイルを中央でクリックします。次に、DECterm のウィンドウを中央クリックします。消去(「バックスペース」を使用)を「。ISQ" をファイルの末端に表示し、次のように書きます。ISQ"は、整列されたファイルを認識します。
- [入力]をクリックします |を入力します。
- メッセージを受信するまで待ちます: "toisq_from_aim 完了"
(ステップV-フリップ):
isq
A - 新しい isq (関心のあるファイル) 名をコピーする:セッションマネージャの下でビューを選択し、microCTデータをクリックします。作業中のファイルを見つけて、ファイルを中央でクリックします。次に、DECterm のウィンドウを中央クリックします。
- [入力]をクリックします |を入力します。メッセージが表示されるのを待ちます: "isq_to_aim 完了"
フリップ
A
Aa
Zx
メッセージを受信するのを待つ: "flip_aim 完了"
差出人
Aa - 新しい isq 名をコピーする:セッション マネージャの下でビューを選択し、microCTデータをクリックします。作業中のファイルを見つけて、ファイルを中央でクリックします。次に、DECterm のウィンドウを中央クリックします。消去(「バックスペース」を使用)を「。ファイルの末端に ISQ" と書き込みます。ISQ"は、整列されたファイルを認識します。
- メッセージを受信するまで待ちます: "from_aim_to_isq 完了"
- マイクロCT評価でXY平面上のサンプルを開きます。各サンプルの 3 つの点を選択して位置合わせを行います。
- 輪郭
- コロナパルプ、両運河の放射状パルプ、および両方の頂点のフォアメンが提示されている歯のほぼ中央を表すスライスを選択します。
- 左上の輪郭パネルをクリックして、左上の輪郭パネルをクリックして、中間のルート頂点の頂点を冠状に線形境界を結び、膜根頂点のメシアル境界線を通して、アピカル境界を冠状に手動でマークします。線源の遠位境界と、ファーション領域を通る遠位根の膜境界に従ってください(図 3 II,IV を参照)。
- この輪郭(Ctrl +C、Ctrl+V)をコピーし、中央のスライスの両側に配置された5つのスライスに応じて調整します。
- 各サンプルにマークされた輪郭の組織体積を計算するには、μCT評価の下でタスクを選択し、3D評価をクリックします。3D評価のウィンドウでタスクの近くを選択し、組織の体積(テレビ)を計算するフィルタを選択します。
- 組織
- マイクロCTスキャナから組織を除去した後、各サンプルを1mLのエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)0.5M pH 8.0でマイクロ遠心チューブに入れて10日間組織をデカール化します。EDTA ソリューションを 3 日ごとに変更します。
- 脱水:組織学的カセットにサンプルを入れ、エタノール濃度を1時間ずつ増やす:70%エタノール(この時点で、試料がエタノールに保持されている限り、プロセスを数週間停止することができます)、90%エタノール2x、100%エタノール2x、キシレン2x(注意:化学フードにキシレンを使用し、そのMSDSガイドラインに従って)。
- 液体パラフィン(60°C)にカセットを移し、キシレンが蒸発するために一晩化学フードに残します。
- ブロッキング: 組織学的ブロッキングマシンを使用して、サンプルをパラフィンに埋め込みます。矢状の切片を得るために、正しい位置に埋め込むように注意してください(すなわち、王冠と根は、歯が「横たわっている」方法で、金型の底部に平行に向いている必要があります)。サンプルはマイクロトームで切断する準備ができました。
- セクションを切断する:組織の関連部分に到達するまで〜20 μmの厚いスライスを切断することによって開始します。歯の任意の部分(王冠または根)を認識したら、6 μmのセクションに変更し、前のセクションに従って切断の角度を変更します。
- たとえば、前のセクションにリューズが含まれていて根が含まれていない場合は、マイクロトーム内のブロックの角度を変更して、根がナイフに近づき、クラウンが戻ります(歯の部分はブロック自体に肉眼で認識できます)。
- 冠状動脈および放射状パルプ、および頂点のフォルメンを含む矢状のセクションを得るまで角度を調整し続けます。関連する組織がすべてカットされるまで、できるだけ多くのスライスをこの向きでカットします。
- 染色プロトコル(例えば、ヘモトキシリンおよびエオシン染色(H&E)、ブラウン&ブレン染色、タルトレート耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色、免疫組織化学)については、20、21を参照してください。
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Representative Results
実験ステップのフローチャートを図1に示します。プロトコルで述べたように、マウスは麻酔され、片側の最初の顎臼歯はパルプ暴露まで掘削され、反対側の歯はコントロールとして残される。次に、歯は口腔内細菌叢によって42日間汚染されたままになり、その間にモニタリングされ、鎮痛薬を受け取る。42日後、マウスを安楽死させ、歯と隣接する顎を分析用に採取する。
図2は、最初の右臼肉パルプ暴露後のマウスの臨床画像を示す。図2Aでは、マンダブル全体が示され、図2Bのインセットは、処理された最初の右臼の拡大を示す。左の最初のモルは、コントロールとして使用されます。メシアルと遠位の両方のパルプ角と運河への入り口の露出は図2Bで見ることができます。なお、歯は痛みを軽減するために機械的にサブオクルージョンに下げられた。
口腔内細菌叢への歯科パルプ暴露後、歯科パルプは最終的に6、7に汚染され、壊死する。文献22によれば、グラム陰性菌は、次にリポ多糖(LPS)を歯の頂点領域に分泌する。免疫系の複雑な反応を通じて、結果の1つは、頂点歯膜炎23の特徴である領域内の骨吸収である。この骨吸収はマイクロCTによって同定され、定量することができる。マイクロCT画像では、放射性系の円膜領域は、炎症過程による硬骨組織が軟部膜病変となった領域を示す。図3では、代表的なマイクロCT画像は、対照と比較して処理された歯を示す。図3AIIIの矢印は、魅惑的なパルプ露出(遠位パルプ暴露はサンプルのこのスライスには現れません)を指し、骨吸収の線状の線状の線状の線で囲まれています。ここに示すボックスプロットグラフは、コントロールと比較して、治療された歯の有意な周期骨吸収を定量化します。
マイクロCTは病変の3次元サイズの評価に優れた技術であるが、その生物学的組成に関する情報が不足している。図4に示すように、組織学的染色は、この情報を提供します。H&E染色は、治療された歯と比較して対照歯で実証される。処置された歯(図4B,C,D)では、歯髄自体がH&E染色(図4C)ではっきりと見られる壊死を現し、対照組織化パルプ組織(図4A)と比較した。さらに、そして重要なことに、治療された歯の周部領域では、免疫細胞(主にマクロファージおよびリンパ球)で構成される周病変が、可視化される(図4D)(健康な歯周靭帯(PDL)と比較して)対照歯の領域における骨組織)。この周期病変は、ここに提示される誘導性アピカル歯膜炎技術の所望の結果である。
一方、図5は、まれな症例で起こりうる不成功な汚染を示す(少なくとも85%の動物はマイクロCTで骨吸収を示す)、すなわち、口腔内細菌叢に42日間曝露した歯は、まだパルプ壊死を示さなかったしたがって、マイクロCT(図5A)および組織学的(図5B)分析において骨損失および回膜病変を示さなかった。
図1:実験プロセスの時間軸。実験手順の時間的進行の概略表図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:右最初のモルパルプ露光後のマウスマンダブルの臨床画像。(A)マウスマンシブル、露出パルプを持つ最初の右臼、最初の左臼は未処理のコントロールとして機能する。(B)露出パルプを含む右臼の拡大。運河への入り口を視覚化することができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロCT解析。(A)代表的なマイクロCTスキャン(6μmのスライス)を処理(AIII、AIV)および制御(AI、AII)歯。メシアルパルプ露光の矢印点(遠位パルプ暴露はこのスライスに存在しない)。治療された歯に隣接する骨損失の線膜および遠位周辺領域は、破線で囲まれています。AII、AIV-輪郭マーキングの代表的な画像。(B)処理された(青、n=15動物)サンプルと比較して、対照(オレンジ、n=14動物)の組織体積を定量する箱プロット(各サンプルの11スライスに対してマークされた輪郭によって測定される)。分析は、マイクロCTのためのスキャンコ評価ソフトウェアを使用して行われ、サンプルは、冠状動脈パルプ、根管および頂点の前兆が同じスライスで視覚化された方法で矢状軸に位置合わせされた(詳細情報についてはプロトコルを参照)オリエンテーションについて)。輪郭は、中間歯領域の両側に5つのスライス(すべて一緒に11スライス)のためにマークされました。各サンプルの輪郭に対する組織体積は、ソフトウェアを用いて算出した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:組織学的H&E代表画像:(A)対照歯の組織学的スライス。(B)治療した歯の組織学的スライスは、重度の粘膜病変を有する。(C)壊死組織の拡大。(D) 周陰肉芽腫組織の拡大 P=パルプ,D=デンチン,B=骨,BM=骨髄,PDL=歯周靭帯,N=壊死性パルプ,G=肉芽腫この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:不合格の例:(A)パルプ露光を伴う歯のマイクロCT代表画像(白矢印)、有意な周期骨損失はないが、(B)組織学的H&E代表画像と相関する歯は重要な(壊死性ではない)パルプ、および正常な頂点組織を明らかにする。P=パルプ、D=デンチン、B=骨、BM=骨髄、PDL=歯周靭帯。(C) B. B. ※この図の大きなバージョンを見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウスにおける頂点歯状炎の誘導に関する方法をここで紹介する。この方法の目的は、この炎症過程のメカニズムおよび結果を研究するための頂点歯状炎の状態を利用することです。アピカル歯全歯炎は、6〜8週齢のマウスで誘発され、根が完全に発達した年齢24である。このモデルで頂点歯膜炎を引き起こすために、マウスの顎臼歯の歯パルプは、歯のバリを使用して露出する。マウスの口腔叢からの細菌(SPF条件下)は、歯のパルプおよび根管に侵入し、パルプ壊死を引き起こし、頂点炎症を引き起こす頂点組織にLPSを分泌する。
この手順を実行する場合は、次の重要な手順に注意してください。パルプ暴露中の動物の正しい位置決めは、手順の成功のために重要です。重要なステップは、パルプの適切な露出です。運河の露出が不十分な場合、デンティン橋の形成が発生し、手順の失敗やAPの作成が不可能になる可能性があります。パルプ暴露の間、副作用を引き起こす可能性のある他の領域の望ましくない痛みや炎症を避けるために、パルプ暴露中の軟部組織損傷を最小限に抑えるために注意が必要です。マイクロCT解析ソフトウェアのサンプルの適切な位置合わせは、解釈可能な結果を得るために重要です。組織学のために顎組織を準備するときは、組織学のための金型を準備する際に正しい向きを達成するために骨を取り囲む柔らかい組織を剥離することをお勧めします。サンプルは、プロセス全体(収穫段階からマイクロCTを通して、組織ブロック手順まで)の間に湿った媒体に保管する必要があります。マイクロトームで組織を切断する場合、歯の矢状のスライスを達成するためにサンプルの角度を固定する必要があります。また、動物の福祉に関する倫理的な問題を考慮することも重要です。例えば、適切な麻酔は、処置中に重要である(全身および局所の両方、25、26を参照)。痛み止めは、特に手順の後の最初の数日間に不可欠であり、体重と行動を監視するだけでなく、柔らかい食品を動物に供給する必要があります。以前の経験から、マウスの全体的な反応は、手順をよく許容するものであり、彼らは極端な苦痛を示さない。
この方法の失敗は、頂点炎症が形成できなかった場合に考慮される:マイクロCTスキャンで歯の領域に骨吸収の証拠はなく、歯のPDL組織は組織的染色に無傷である(図5に示します)。炎症を起こしない理由として考えられるのは、動物の行動の確率的な違いや、各動物の細菌への特定の暴露などである。この方法(少なくとも85%の動物が骨吸収を示す)を使用して頂点歯全炎を引き起こすことで良好な結果が得られますが、サンプル間の変動を減らすためにプロトコルに密接に従ってください。マウスがフォローアップ期間中に苦痛の兆候を示す場合は、苦しみを防ぐために実験からそれらを削除することを検討してください。そうする決定は、フォローアップ期間中に動物の体重の損失または増加を見ることによって助けられ得る。体重の多くを失う動物は苦しむし、除去する必要があります。我々はまた、最も苦しんでいる動物が低体重または健康状態で実験を開始した動物であることを観察しました。全体として、プロシージャが正しく実行されていれば、一貫した結果が得られます。
この手法にはいくつかの制限があります。このモデルは、細菌汚染によって引き起こされる頂点歯状炎を研究するために開発されたものであり、外傷性損傷や外傷などの頂点歯状炎が生じる可能性のある他のいくつかの可能なメカニズムを模倣しないことに注意することが重要です。自己炎症性疾患。さらに、このモデルとヒト患者の臨床状況との間に有意な差が存在する。マウスでは、自発的な体心膜病変は記載されておらず、これは完全に人工的な状況である。げっ歯類の解剖学も人間の解剖学とは異なる。これらの違いの重要性は不明である。それにもかかわらず、マウスは基本的なメカニズムと現象を理解するための非常に有用なモデルです。さらに、マウスの根管治癒モデル(根管で治療することによって)はこれまで報告されていないが、それが実現可能であると証明された場合、この研究分野において潜在的に高い重要性を有する。マウスに対してパルプキャッピングの方法が報告されており、これは大きな可能性27を示している。根管治癒モデルは確かに最近ラットで開発され、エンドドンティック研究28でしばしば使用されるモデル動物である。ここで報告された方法は、この根管治癒モデルを開発するための予備的な手順として役立つ可能性がある。
このような複雑な免疫反応の研究にはインビボ法の使用が重要であり、マウスモデルは、動物の小さなサイズのために臨床的に困難であるが、多くの利点を有する:それは費用対効果が高く、容易にアクセス可能な施設を含み、および一連の利用可能な遺伝的および分子ツール(利用可能なノックアウト、CRISPRライブラリ、多数のゲノムデータなど)。このモデルは(臨床研究とは対照的に)最小限の変化で、無菌実験室条件のAPの臨床提示を誘発するように、内因性研究に最も適している。さらに、このモデルはまた、慢性炎症などの他の研究分野においても、全身的関与を最小限に抑えて慢性的で局所的な炎症を引き起こす能力、および対照として同じ動物の反対側の使用に優れている。
この研究は、病変の分析のためのマイクロCTおよび菌学の使用を報告する。潜在的には、DNAの分離や炎症細胞の異なる遺伝子のDNAメチル化のテストなど、ここで行われなかったこのモデルでは、他のタイプの分析を使用することができます。RNAを分離し、異なる免疫細胞または異なるタイプのマウスにおける遺伝子発現のパターンを見るためにRNA-seqを実行する。または細胞を分離し、FACS20、21、29によってそれらを特徴付け。まとめると、ここで報告されたモデルには大きな可能性があり、この報告されたプロトコルとデモンストレーションによって促進されることを可能にします。
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Disclosures
著者は開示するものが何もない
Acknowledgments
オデッド・ヘイマン博士が動物の位置決めを手伝ってくれることを認め、ラファエル・リーバーがマイクロCT解析を手伝い、そして実験の前に助言を求めるアンディアラ・デ・ロッシ・ダルデガン教授に謝りたい。また、シドニー・コーエン博士の批判的な読み取りと編集についても認め申し上げ上げ、お知り申し上げ上げください。
この研究は、イザドール・I・カバコフ研究基金からMKとIAへの助成金、イスラエル科学技術省からEGへのイツァク・ナボン・フェローシップによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
References
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