Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Inducerende Apical periodontitis i mus

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59521
Automatic Translation
1,2, 1, *2, *1
1Institute of Dental Sciences, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Endodontics, Hadassah Ein Kerem Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til lokalt inducere apikale parodontitis i mus. Vi viser, hvordan man bore et hul i musens tand og udsætte sin Pulp, for at forårsage lokal inflammation. Analysemetoder til at undersøge karakteren af denne inflammation, såsom mikro-CT og histologi, er også påvist.

Abstract

De mekanismer, der er involveret i lokale induceret inflammation kan undersøgt ved hjælp af flere tilgængelige dyremodeller. En af disse er induktion af apikale parodontitis (AP). Apical parodontitis er en fælles patologi af en inflammatorisk natur i Periodontal væv omkring tandroden. For bedre at forstå arten og mekanismen af denne patologi er det fordelagtigt at udføre proceduren i mus. Induktion af denne odontogenic inflammation opnås ved boring i muse tanden, indtil tandkødet er eksponeret. Dernæst forbliver tandkødet udsat for at være forurenet af den naturlige orale flora over tid, hvilket forårsager apisk periodontitis. Efter denne tidsperiode, dyret er ofret, og tanden og kæbeknoglen kan analyseres på forskellige måder. Typiske analyser omfatter mikroct-billeddannelse (til vurdering af knogleresorption), histologisk farvning, immunhistokemi og RNA-ekspression. Denne protokol er nyttig for forskning inden for mund biologi til bedre at forstå denne inflammatoriske proces i en in vivo eksperimentel indstilling med ensartede betingelser. Proceduren kræver en omhyggelig håndtering af musene og den isolerede kæbe, og en visuel demonstration af teknikken er nyttig. Alle tekniske aspekter af de procedurer, der fører til induceret apikale parodontitis og dens karakterisering i en musemodel er påvist.

Introduction

Målet med denne metode er at inducere apikale parodontitis i en mus ved at forurene spidsen med den naturlige mikroflora, og derefter studere forskellige karakteristika ved denne patologiske proces.

Apical parodontitis (AP) er en fælles patologi af en inflammatorisk natur i Periodontal væv omkring tandroden. Denne tandsygdom kan forårsage alvorlige smerter og skal behandles af en tandlæge. Behandlingsmulighederne omfatter root-kanal behandling (primær eller sekundær), Endodontisk kirurgi, tandekstraktion eller opfølgning afhængigt af de kliniske og radiografiske fund og udtalelsen fra klinikeren. Mekanismen i denne inflammatoriske proces, selv om de har studeret i flere årtier1,2,3, er stadig ikke udførligt forstået. I betragtning af sværhedsgraden af denne patologi er der således et klart behov for forskning, som tager hensyn til dens grundlæggende karakter. Således er systemer, hvor studiet af AP er muligt, af stor videnskabelig interesse.

Da AP er en kompleks patologisk proces, der involverer det lokale væv og immunsystemet, er in vitro-undersøgelser utilstrækkelige til en fuldstændig forståelse af processerne. Undersøgelse af kliniske prøver af denne sygdom er også problematisk på grund af etiske begrænsninger og betydelig variation mellem forskellige mennesker og forskellige kliniske stadier4,5, ogdermed nødvendigheden af in vivo-modeller. Disse modeller er baseret på konceptet om at udsætte tandkødet til kontaminering og observere den inflammatoriske reaktion af kroppen til denne stimulus i det periapiske væv6,7. Almindeligt forekommende in vivo-modeller omfatter gnavere eller større dyr såsom hunde. På trods af den kliniske udfordring i behandling af mus, som er meget små dyr med miniature tænder, er fordelene ved musemodellen betydelige: praktisk, arbejde med mus er teknisk enkel med hensyn til faciliteter og er mest omkostningseffektiv, og videnskabeligt er musen en velfunderet dyremodel med let tilgængelige genetiske og molekylære værktøjer og en godt studeret Genome. Faktisk brugte tidligere undersøgelser en musemodel til at studere inflammatoriske og knogleresorption signaler og celler involveret i apikale parodontitis8,9,10,11. Derfor er en klar protokol om, hvordan man bruger en musemodel til studiet af AP er nødvendig. Her beskriver vi en sådan protokol.

Den protokol, der er beskrevet her, har den store fordel at være passende at studere knock-out (ko) mus og lære, hvordan manglen på et specifikt gen påvirker dental inflammation7,12. Andre nyttige anvendelser af denne protokol omfatter studiet af virkningerne af medicin og systemiske tilstande på udviklingen af apikale parodontitis13, effekten af apikale parodontitis på udviklingen af osteonekrose af kæberne14 , 15 og stamcelleterapi til knogle regenerering16.

Denne protokol kan også være generaliseret som en model til at studere lokale inflammation. For at studere den inflammatoriske proces, flere musemodeller er blevet udviklet, som omfatter for eksempel induceret colitis eller arthritis17,18. Disse modeller har systemiske virkninger og har ingen indbygget kontrol i det samme dyr. Modeller for induceret apikale periodontitis, som omfatter en kontralateral kontrol uden betændelse, har den fordel at overvinde disse begrænsninger14,19.

Den nedenfor beskrevne protokol er derfor nyttig for forskere, der er interesseret i lokale inflammatoriske processer. Den kontrollerede karakter af denne inflammation, dens indeslutning til et bestemt sted, og den kontralaterale kontrol tand, alle gør denne protokolværdi fuld for at studere de mekanismer, der er involveret i denne proces. Desuden er protokollen nyttig for forskere, der er interesserede i de kliniske aspekter af periapisk inflammation. Musemodellen er ideel til at studere forskellige variabler af sygdommen, ud over fordelen ved at være i stand til nemt at udføre genetiske manipulationer i musemodellen, for at undersøge aktiviteten af specifikke gener i Periapikale processer inflammation.

Teknisk set er den kliniske procedure udfordrende at udføre på grund af de små dimensioner af musene tænder. Det vil være gavnligt at visualisere denne procedure for at lære om positionering, udstyr behov, og ydeevne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af den institutionelle dyrepleje-og brugs Komité (IACUC) på det hebraiske Universitet (Ethics No. MD-17-15093-5).

1. dyrs anæstesi og positionering

  1. Forbered sterile opløsninger som beskrevet nedenfor.
    1. Forbered 5 mL af 7 mg/mL ketamin og 0,09 mg/mL Medetomidin fortyndet i fosfat buffer opløsning (PBS)/Saline.
    2. Forbered en steril opløsning af Atipamezole (0,4 mg/mL) fortyndet i PBS/saltvand (anbefales at tilberede en mængde på 5 mL).
    3. Forbered en steril opløsning af mepivacain (7,5 mg/mL) fortyndet i PBS/saltvand til lokalbedøvelse (et medfølgende hætteglas med mepivacain er tilstrækkeligt til et lager på 7,2 mL).
  2. Brug 6-8 uger gamle kvindelige C57BL/6 mus til eksperimentet. Dyrene skal holdes i en specifik patogen fri (SPF) dyreenhed med standard vand og fødevarer, der leveres af anlægget, og dyrenes fodring ad libitum.
  3. Veje mus og injicere intraperitonealt (IP) et volumen på 10 μL for hvert gram af vægten. For eksempel, for en mus, der vejer 20 gram,
    Injicer 200 μL ketamin/Medetomidin opløsning. Dette vil give en endelig koncentration af (70 mg/kg) ketamin og (0,9 mg/kg) Medetomidin
    for hvert dyr.
  4. For at forhindre sår i øjet på grund af tørhed under proceduren, anvende øjensalve indeholdende chloramphenicol (5%) på dyrenes øjne, mens de er under anæstesi. Hold dyrene varme med en lampe, mens de er bedøvet. Check dybden af anæstesi ved at kontrollere pedal refleks (udfører fast tå knivspids).
  5. Når musen er bedøvet, placere musen æglæggende på sin højre side (for en ret afleveret forsker) på en lukket-celle ekstruderet polystyren skum overflade og vedhæfte fødder til overfladen ved hjælp af tape.
  6. Åbn munden ved hjælp af små gummibånd omkring fortænderne (1 for øvre fortænder, og 1 for lavere fortænder) holdt på plads af lange nåle fastgjort i den lukkede celle ekstruderet polystyren skum overflade.
  7. Træk den højre kind tilbage ved at bruge pincet tapede til overfladen. Brug pincet, der er lukket i steady state.
  8. Placer overfladen med musen i en behagelig arbejdsposition, der giver adgang til mandibulære molarer ved hjælp af korrekt forstørrelse (et Binokulært mikroskop eller klinisk mikroskop) og lys.
  9. Træk tungen tilbage ved hjælp af pincet eller dental spatel, og Injicer den lokale anæstesi med en 27 gauge nål ind i den mucobuccal fold, der støder op til den første mandibulære Molar. 25-50 μL er tilstrækkelig. Hævelse af vævet omkring injektionsstedet skal visualiseres.

2. udsættelse for papirmasse

  1. Brug en 1/4 runde dental Burr, eller en samme størrelse diamant Burr (en lang skaft anbefales) med en hastighed på 800 runder i minuttet (rpm), fastgjort til enhver egnet dental motor (for eksempel en automatisk moment reduktion (ATR) motor).
  2. Bor på den okklusale del af den første højre mandibulære Molar, indtil papirmasse hornene er synlige gennem dentin. Brug korte byger af motoren til at forhindre areal overophedning.
  3. Brug en K-fil eller H-fil #8 eller #10 til at gennembore papirmassen og indsætte filen i Pulp horn (Mesial og distal) ved at bryde dentin dækker dem. Filer er steriliseret ved autoklave.
  4. Fortsæt med at arbejde med filerne inde i Pulp så dybt som muligt, mens udvide åbninger med filerne. Normalt vil der være blødning synlig fra pulp.
  5. Sørg for at runde skarpe kanter af tanden med Burr og fjerne tanden fra okklusion, for at reducere smerter under eksperimentet. Rengør snavs under proceduren med en mikrobørste.
  6. Efterlad den kontralaterale tand (venstre første mandibulær Molar) som kontrol.

3. afslutning af den kliniske procedure

  1. Frigør musen fra fikserings tilstanden og Injicer Atipamezole IP (10 μL for hvert gram legemsvægt. Dette vil give en endelig dosis af (4 mg/kg) Atipamezole.
  2. Injicér buprenorphin fortyndet i PBS/saltvand (0,05 mg/kg) IP (anbefales at tilberede en mængde på 3 mL på dagen for proceduren). Se diskussionen for at få forklaret, hvorfor smertelindring er nødvendig.
  3. Sørg for, at dyrene restituere sig efter anæstesi, før de forlader dem. Giv dem blød mad, fordi de kan være ude af stand til at spise hård mad på grund af tand smerter.

4. opfølgning efter procedure (42 dage)

  1. I de første 3 dage efter proceduren vejes dyrene og indsprøjtes buprenorphin (0,1 mg/kg) IP en gang om dagen (anbefales for at tilberede en mængde på 6mL).
  2. I løbet af eksperimentets tid (42 dage, når inflammation opbygges) overvåge dyrene efter vægt og generel adfærdsmæssige vurdering 2-3 gange om ugen.
  3. Levere blød mad til dyrene i løbet af opfølgningsperioden. Våd fødevarer med vand og sætte det i en Petri-skål på gulvet i buret.

5. eksperimentets afslutning og analyse

  1. Når 42 dage11 af opfølgning er afsluttet, bedøve dyr IP med ketamin/xylazine i en koncentration på 106,25 mg/kg ketamin, og 75 mg/kg xylazine (en stamopløsning af 42,5 mg/ml ketamin, og 1,5 mg/ml xylazin i et samlet volumen på 2 ml er anbefales) og præforme livmoderhals dislokation.
    Bemærk: der er forskellige muligheder for mulige analyser med henblik på at evaluere inflammation20,21. Her vil analysen af vævet ved mikro-CT og histologisk farvning blive beskrevet.
  2. Efter eutanasi, brug kirurgisk saks og pincet til at skære en del af kæben, herunder 3 molarer (separat for hver side behandlet og ikke-behandlet kontrol). Ved at bruge pincet skræl så meget som det bløde væv som muligt, efterlader for det meste knogler og tænder på prøven.
  3. Skyl vævet kortvarigt i PBS, og sæt det derefter i PARAFORMALDEHYD (PFA) 4% (fortyndet i PBS) i 24-48 timer til fiksering.
    Forsigtig: Brug PFA i en kemisk hætte, og i henhold til dets retningslinjer for materiale sikkerheds data blad (MSDS).
  4. Efter 24-48 timer skylles med PBS 3x for at skylle PFA.
  5. Micro-CT
    1. For mikro-CT-analyse, tage de høstede væv (del af kæbe, herunder 3 molars, i dimensioner på ca. 4 mm x 5 MMX 1 mm) til en Micro-CT-scanner, placere dem i en 12 mm diameter rør fyldt med 1,5 mL PBS orienteret, således at de buccale eller linguale overflader af tanden og roden er æglæggende parallelt med bunden af røret. Adskilles mellem prøverne med svamp, og dækker toppen af røret med fleksibel film.
    2. Åbn panelet scanning, og vælg måle nummeret. Vælg kontrolfilen med følgende parametre: energi på 70 kV, intensitet på 114 μA, og opløsning på 6 μm3 voxel størrelse.
    3. Klik på spejder visning, og når billedet vises, Klik referencelinje og markere området af prøverne til scanning. Klik på Tilføj scanningefter hvert eksempel. Når du er færdig med at markere prøverne, skal du gå til opgavelisten og vælge Start INTERACT-opgaver.
      Bemærk: de samme prøver kan efterfølgende anvendes til histologi. Det er vigtigt, at de ikke tørrer ud under CT-scanningen.
  6. Brug et passende edb-program til mikro-CT-justering og-analyse.
    1. Åbn prøven på XY-planet i mikroct-evalueringen. Vælg tre punkter på hver prøve for justering:
      Den mesiale apikale konstriktion-definerer oprindelsen af koordinatsystemet.
      Den koronale del af den mesiale kanal-definerer et punkt på Z-aksen.
      Den distale apikale konstriktion-definerer et punkt på XZ flyet.
    2. Brug måleværktøjet i venstre panel, og tegn en linje, der når hvert punkt. Definer hvert af de tre punkter med en X, Y & Z-værdi, som det vises i højre panel.
    3. Definer interesseområdet i eksemplet ved at vælge opgave under μct-evaluering, og klik på 3D-evaluering. Et rektangel og et vindue med dimensionerne pr. akse vises på skærmen. Matche dimensionerne af rektanglet til at passe det område af interesse på XY-aksen ved at klikke i hjørnerne med den midterste knap af musen. Vælg dimensionerne i Z-aksen ved at indsætte det første skive antal interesse i Z-pladsen under VOI start, og antallet af skiver fra den første indtil den sidste skive antal interesse i z-pladsen under Dim.
    4. Klik på ansøgninger under Session Manager, og vælg decterm. Vent et par sekunder for et vindue til at åbne, og skriv derefter de fem trin af skrå script beskrevet nedenfor i henhold til følgende instruktioner (mellem linjerne Klik Enter):
      Ipl
      isq_to_aim
      aim1
    5. Kopier navnet isq (fil af interesse): Vælg visninger under sessionsstyring , og klik på microctdata. Find den fil, der arbejder på, og midterste Klik på filen. Derefter midterste Klik tilbage i vinduet af DECterm.
    6. Indtast X-, Y & Z-værdierne (med et mellemrum mellem dem), som blev bestemt under VOI , når du vælger interesseområde.
    7. Indtast X-, Y & Z-værdierne (med et mellemrum mellem dem), som blev bestemt under Dim ved valg af interesseområde.
    8. Vent, indtil du modtager en besked: isq til AIM afsluttet.
      (trin II-justering):
      Juster z
      aim1
      aim2
    9. Angiv X-, Y & Z-værdierne (med et mellemrum mellem dem), som blev bestemt for koordinatsystemets oprindelse.
    10. Indtast X-, Y & Z-værdierne (med et mellemrum mellem dem), som blev bestemt for punktet på Z-aksen.
    11. Indtast X-, Y & Z-værdierne (med et mellemrum mellem dem), som blev bestemt for punktet på XZ-flyet.
    12. Vent, indtil du modtager en meddelelse: "align_Z completed"
      (trin III-header):
      Header
      aim2
      0 0 0
      0 0 0
    13. Klik på Enter.
      (trin IV-konvertering af filen tilbage fra AIM til isq):
      toisq
      aim2
    14. Kopier navnet isq (fil af interesse): Vælg visninger under sessionsstyring , og klik på mikroct-data. Find den fil, du arbejder på, og midterste Klik på filen. Derefter midterste Klik tilbage i vinduet af DECterm. Slette (ved hjælp af "Backspace") den ". ISQ "i slutningen af filen, og skriv:" _new. ISQ "for at genkende den justerede fil.
    15. Klik på Enter | Enter.
    16. Vent, indtil du modtager en meddelelse: "toisq_from_aim completed"
      (trin V-flip):
      isq
      A
    17. Kopiér det nye isq-navn (fil af interesse): Vælg visninger under sessions styring , og klik på mikroct-data. Find den fil, der arbejder på, og midterste Klik på filen. Derefter midterste Klik tilbage i vinduet af DECterm.
    18. Klik på Enter | Enter. Vent med at modtage en meddelelse: "isq_to_aim completed"
      Flip
      A
      Aa
      Zx
      Vent med at modtage en meddelelse: "flip_aim completed"
      Fra
      Aa
    19. Kopiér det nye isq-navn: Vælg visninger under sessionsstyring , og klik på mikroct-data. Find den fil, der arbejder på, og midterste Klik på filen. Derefter midterste Klik tilbage i vinduet af DECterm. Slette (ved hjælp af "Backspace") den ". ISQ "i slutningen af filen, og skriv:" _flip. ISQ "for at genkende den justerede fil.
    20. Vent, indtil du modtager en meddelelse: "from_aim_to_isq completed"
  7. Profilstyring
    1. Vælg den skive, der repræsenterer omtrent midten af tanden, hvor den koronalsektion Pulp, radikulær pulp af begge kanaler, og begge apikale foramens præsenteres.
    2. Manuelt markere konturen af interesse på den midterste skive ved at klikke på øverste venstre kontur panel-begyndende fra det distale punkt af den distale rod Apex markere den apikale grænse kronalt til det røntgenfaste apikale område, gennem mesiale kant af mesiale root Apex efter den distale grænse af den mesiale rod og den mesiale grænse for den distale rod gennem Furka-regionen (Se figur 3 II, IV).
    3. Kopiér denne kontur (CTRL + C, CTRL + V), og Juster den derefter til 5 udsnit, der er placeret på hver side af den midterste skive.
    4. For at beregne vævs volumenet af konturen markeret for hver prøve Vælg opgave under μct evaluering, og klik på 3D evaluering. I vinduet med 3D-evaluering skal du klikke på Vælg nær opgave og vælge et filter til at beregne vævs volumen (tv).
  8. Histologi
    1. Når vævene er fjernet fra Micro-CT-scanneren, afkaldninger vævene ved at anbringe hver prøve i et mikrocentrifuge glas med 1 mL ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) 0,5 M pH 8,0 i 10 dage. Rediger EDTA-opløsningen hver 3.
    2. Dehydrering: sæt prøver i histologiske kassetter, og i stigende ethanolkoncentrationer, en time hver, som følger: 70% ethanol (på dette tidspunkt kan processen stoppes i flere uger, så længe prøverne opbevares i ethanol), 90% ethanol 2x, 100% ethanol 2x, xylen 2x (forsigtig: Brug xylen i en kemisk hætte, og ifølge dens MSDS retningslinjer).
      1. Kassetterne overføres til flydende paraffin (60 °C) og efterlades i kemisk hætte natten over, for at xylen fordampe.
    3. Blokering: Brug en histologisk blokerende maskine til at indlejre prøverne i paraffin. Vær omhyggelig med at indlejre dem i en korrekt position (dvs. kronen og rødder bør være orienteret parallelt med den nederste del af formen, på en måde, at tanden er "liggende") for at få sagittale sektioner. Prøverne er nu klar til at blive skåret med en mikrotom.
    4. Skæring af sektioner: Begynd med at skære tykke skiver på ~ 20 μm, indtil de når den relevante del af vævet. Når genkende nogen del af tanden (krone eller rødder) skifte til sektioner af 6 μm, og ændre vinklen på skæring i henhold til den foregående sektion.
      1. For eksempel, hvis det foregående afsnit omfattede kronen, men ikke rødderne, ændre vinklen af blokken i mikrotomen, så rødderne kommer tættere på kniven, og kronen går tilbage (de dele af tanden kan genkendes med et blotte øje på blokken selv).
      2. Fortsæt med at justere vinklen indtil opnåelse af sagittale sektioner, herunder koronal og radikulær Pulp, og apikale foramen. Skær i denne retning så mange skiver som muligt, indtil det relevante væv er skåret.
    5. For farvningsprotokoller (f. eks. haemotoxylin og eosin farvning (H & e), brun & Brenn farvning, tartrat-resistent syre fosfatase (Trap) farvning, immun histokemi), se20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et flowdiagram af de eksperimentelle trin er præsenteret i figur 1. Som nævnt i protokollen, er musene bedøvet, og deres første mandibulære Molar på den ene side er boret indtil Pulp eksponering, mens den kontralaterale tand er tilbage som en kontrol. Dernæst tænder er overladt til at være forurenet af den orale flora for 42 dage, hvor de overvåges og modtage smertestillende medicin. Efter 42 dage, mus er euthanized, og tænderne og tilstødende kæbe er taget til analyse.

Figur 2 viser kliniske billeder af musen mandiblen efter første højre Molar Pulp eksponering. I figur 2a vises hele mandiblen, mens justerings i figur 2b viser en udvidelse af den behandlede første højre Molar. Den venstre første Molar bruges som kontrol. Eksponering af både mesiale og distale Pulp horn og indgangen til kanalerne kan ses i figur 2b. Bemærk, at tanden blev mekanisk sænket til sub-okklusion for at reducere smerter.

Efter dental Pulp eksponering for den orale flora, er tandkødet i sidste ende forurenet6,7 og bliver nekrotisk. Ifølge litteraturen22udskiller gram negative bakterier derefter lipopolysaccharid (LPS) til den apiske region af tanden. Gennem en kompleks reaktion af immunsystemet, et af resultaterne er knogleresorption i den Periapikale processer region, som er kendetegnende for apisk parodontitis23. Denne knogleresorption kan identificeres og kvantificeres ved mikro-CT. I mikroct-billeder angiver radioaktive periapiske regioner områder, hvor det hårde knoglevæv blev en blød periapisk læsion på grund af den inflammatoriske proces. I figur 3viser repræsentative Micro-CT-billeder en behandlet tand sammenlignet med en kontrol. Pilen i figur 3aIII-punkter ved den mesiale papirmasse eksponering (den distale Pulp eksponering vises ikke på denne skive af prøven), og de mesiale og distale periapiske radiolucente områder af knogleresorption er omgivet af en stiplet linje. En kurve plot graf, der er vist her, kvantificerer den signifikante periapiske knogleresorption i de behandlede tænder sammenlignet med kontrollerne.

Mens mikro-CT er en fremragende teknik til evaluering af den 3-dimensionelle størrelse af læsioner, det mangler oplysninger om deres biologiske sammensætning. Histologisk farvning, som vist i figur 4, indeholder disse oplysninger. H & E-farvning påvises i en kontrol tand sammenlignet med en behandlet tand. I den behandlede tand (figur 4b, C, D) præsenterer selve tandkødet nekrose, som kan ses tydeligt i H & E-farvning (figur 4c), sammenlignet med kontrolorgan papir vævet (figur 4a). Derudover, og vigtigere, i den periapiske region af den behandlede tand en periapisk læsion, sammensat af immunceller (overvejende makrofager og lymfocytter), er visualiseret (figur 4d) (sammenlignet med den sunde Periodontal ligament (PDL) og knoglevævet i den periapiske region af kontrol tanden). Denne Periapikale processer læsion er det ønskede resultat af den inducerede apikale parodontitis teknik præsenteret her.

På den anden side viser figur 5 en mislykket kontaminering, som i sjældne tilfælde kan forekomme (mindst 85% af dyrene udviser knogleresorption i mikro-CT), dvs., en tand, der blev eksponeret for den orale flora i 42 dage, men som ikke fremviste Pulp nekrose , og udviste derfor ikke knogletab og periapisk læsion i mikro-CT (figur 5a) og histologiske (figur 5b) analyser.

Figure 1
Figur 1: tidsakse for eksperimentel proces. Skematisk gengivelse af den tidsmæssige progression af forsøgs proceduren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: kliniske billeder af mus mandiblen efter højre første molær Pulp eksponering. (A) mus Mandible, første højre Molar med eksponeret Pulp, første venstre Molar fungerer som en ubehandlet kontrol. B) udvidelse af den rette Molar med den udsatte pulp. Indgangen til kanalerne kan visualiseres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: MIKROCT-analyse. (A) repræsentative mikro-CT-scanninger (skiver af 6μm) af behandlede (AIII, AIV) og kontrol (AI, AII) tænder. Pile punkter ved mesiale Pulp eksponering (distal Pulp eksponering er ikke til stede i denne skive). Mesiale og distale periapiske områder af knogletab støder op til den behandlede tand er omgivet af stiplede linjer. Alle, AIV-repræsentative billeder af kontur mærkning. B) felt plot, som kvantificerer vævs volumenet (målt ved konturen markeret for 11 skiver af hver prøve) af kontrolelementet (orange, n = 14 dyr) sammenlignet med de behandlede (blå, n = 15 dyr) prøver. Analysen blev udført ved hjælp af scanco Evaluation software for Micro-CT. prøverne blev justeret på den sagittale akse orienteret på en måde, at den koronale Pulp, rodkanaler og apikale foramen blev visualiseret i samme Skive (se protokollen for detaljerede oplysninger om orientering). Konturer blev markeret for 5 skiver på begge sider af Mid-Tooth-området (alle sammen 11 skiver). Vævs volumen for konturen af hver prøve blev beregnet ved hjælp af softwaren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: histologisk H &Amp; E repræsentative billeder: (a) et histologisk udsnit af en kontrol tand. B) histologisk skive af en behandlet tand med en svær periapisk læsion præsenteret. C) udvidelse af nekrotisk væv. D) udvidelse af periapisk granulom tissue P = Pulp, D = dentin, B = knogle, BM = knoglemarv, PDL = Periodontal ligament, N = nekrotisk Pulp, G = granulom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: eksempel på mislykket kontaminering: (a) mikro-CT-repræsentativ billede af en tand med papirmasse eksponering (hvid pil), men intet signifikant periapisk knogletab, korreleret tilB) histologisk H & E repræsentativt billede af samme tand afslørende vital (ikke nekrotisk) Pulp, og normal apikale væv. P = Pulp, D = dentin, B = knogle, BM = knoglemarv, PDL = Periodontal ligament. C) udvidelse af kalcificeret væv i B. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her introduceres en metode til induktion af apikale parodontitis i mus. Målet med metoden er at udnytte den apikale parodontitis tilstand for at studere mekanismer og konsekvenser af denne inflammatoriske proces. Apical parodontitis blev induceret i 6-8 uge gamle mus, en alder, hvor rødderne er fuldt udviklet24. For at forårsage apikale parodontitis i denne model, er tand massen af mus mandibulære molarer eksponeret ved hjælp af en dental Burr. Bakterier fra den orale flora af musene (i SPF betingelser) invadere pulp og rodkanaler af tænderne, forårsager Pulp nekrose, og udskilte LPS til det apikale væv, som udløser apikale inflammation.

Når du udfører denne procedure, være opmærksom på disse følgende kritiske trin. Korrekt placering af dyrene under papirmasse eksponering er afgørende for procedurens succes. Et kritisk skridt er den korrekte eksponering af pulp. Utilstrækkelig kanal eksponering kan resultere i en dentin brodannelse, som kan føre til svigt af proceduren og manglende evne til at skabe AP. Under papirmasse eksponering kræves der opmærksomhed for at minimere bløddels skade under papirmasse eksponering for at undgå uønskede smerter og betændelse i andre regioner, som kan give bivirkninger. Korrekt tilpasning af prøverne i Micro-CT analyse software er afgørende for at opnå kan fortolkes resultater. Ved klargøring af kæbe vævet til histologi anbefales det at skrælle det bløde væv omkring knoglen for at opnå korrekt orientering, når du forbereder forme til histologi. Prøverne skal opbevares i vådt medium under hele processen (fra høst stadiet gennem mikro-CT, indtil den histologiske blok procedure). Ved skæring af vævet i en mikrotomer bør vinklen af prøven fastsættes for at opnå sagittale skiver af tanden. Det er også vigtigt at tage hensyn til etiske spørgsmål vedrørende dyrenes velfærd. For eksempel, ordentlig anæstesi er kritisk under proceduren (både systemisk og lokal, se25,26). Smertestillende medicin er afgørende, især for de første par dage efter proceduren, og overvågning vægt og adfærd samt en levering af dyrene med bløde fødevarer bør gennemføres. Fra tidligere erfaringer, den samlede reaktion af musene er at tolerere godt proceduren, og de udviser ikke ekstrem angst.

En fejl i metoden overvejes i tilfælde, hvor en apisk inflammation ikke dannes: der er ingen evidens for knogleresorption i den periapiske region af tanden på mikro-CT-scanningen, og PDL-vævet af tanden er intakt i histologisk farvning (som præsenteret i figur 5). De mulige årsager til ikke at opnå betændelse omfatter stokastiske forskelle i opførsel af dyrene samt den specifikke eksponering af hvert dyr til bakterier. Selv om gode resultater opnås ved at forårsage apikale parodontitis ved hjælp af denne metode (mindst 85% af dyrene viser knogleresorption), skal du følge protokollen nøje for at reducere eventuelle variationer mellem prøverne. Hvis nogen mus udviser tegn på angst i opfølgningsperioden, bør du overveje at fjerne dem fra eksperimentet for at forhindre lidelse. Beslutningen om at gøre dette kan hjælpes ved at se på tabet eller gevinsten af dyrenes vægt i opfølgningsperioden. Dyr, der mister en masse vægt lider og bør fjernes. Vi har også observeret, at dyrene lider mest, er dem, der startede forsøget med en lav vægt eller dårlig helbredstilstand. Samlet set bør proceduren, hvis den udføres korrekt, give ensartede resultater.

Flere begrænsninger af denne teknik skal bemærkes. Det er vigtigt at bemærke, at denne model er udviklet med henblik på at studere apisk parodontitis forårsaget af bakteriel kontaminering og ikke efterligner flere andre mulige mekanismer, hvorved apisk parodontitis kan opstå, såsom traumatisk skade og autoinflammatorisk sygdom. Desuden findes der betydelige forskelle mellem denne model og den kliniske situation hos mennesker. I mus er spontane periapiske læsioner ikke blevet beskrevet, og dette er helt en kunstig situation. Anatomi af gnaver tænder også adskiller sig fra den for mennesker; betydningen af disse forskelle er ukendt. Ikke desto mindre, musen er en yderst nyttig model for forståelsen af grundlæggende mekanismer og fænomener. Desuden er en Root Canal healing model i en mus (ved at behandle med en rodkanal) ikke er blevet rapporteret indtil videre, men potentielt har stor betydning på dette område af forskning, hvis det viser sig at være muligt. En metode til Pulp capping er blevet rapporteret for mus, som viser store potentielle27. En Root Canal healing model er faktisk blevet for nylig udviklet i rotter, en model dyr ofte anvendes i endodontik forskning28. Den metode, der rapporteres her, kan tjene som en foreløbig procedure for udvikling af denne rodkanal helbredende model.

Brug af en in vivo metode er afgørende for studiet af en sådan kompleks immunreaktion, og en musemodel, selv om klinisk udfordrende på grund af den lille størrelse af dyret, har mange fordele: det er omkostningseffektivt, involverer let tilgængelige faciliteter, og et sæt af tilgængelige genetiske og molekylære værktøjer (såsom tilgængelige Knock-outs, CRISPR biblioteker og en lang række genomiske data). Denne model er mest egnet til Endodontisk forskning, da det inducerer den kliniske præsentation af AP i sterile Lab betingelser, med minimal variationer (i modsætning til kliniske undersøgelser). Desuden har denne model også fordele i andre forskningsområder, såsom kronisk inflammation, på grund af evnen til at forårsage en kronisk, men lokal inflammation med minimal systemisk involvering, og brugen af den kontralaterale side af samme dyr som en kontrol.

Dette arbejde rapporterer brugen af mikro-CT og histologi til analyse af læsionen. Potentielt kan andre typer analyser anvendes i denne model, som ikke blev udført her, såsom isolerende DNA og afprøvning af DNA-methylering på forskellige gener i de inflammatoriske celler; isolerende RNA og udfører RNA-SEQ for at se mønstret for genekspression i forskellige immunceller eller forskellige typer mus; eller isolerende celler og kendetegner dem ved FACS20,21,29. Kollektivt, der er et stort potentiale i den model, rapporteret her, som forhåbentlig vil blive fremmet af denne rapporterede protokol og demonstration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende Dr. Oded Heyman for hans hjælp med dyrs positionering, Raphael Lieber for hjælp med Micro-CT analyse, og Prof. Andiara de Rossi Daldegan for rådgivning om præforme eksperimentet. Vi vil også gerne anerkende Dr. Sidney Cohen for kritisk læsning og redigering.

Dette arbejde blev støttet af et stipendium fra Dr. Izador I. Cabakoff Research begavelse fond til MK og IA, og en Yitzhak Navon fællesskab fra Israels ministerium for videnskab og teknologi til f. eks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole hydrochloride Eurovet Animal Health CAS 104075-48-1
ATR dentsply tecnika
blocking machine Leica EG1150H
buprenorphine vetmarket 163451
clinical microscope/binocular Olympus Sz61
dental bur Komet dental ZR8801L 315 008
dental spatula Premier 1003737
EDTA J.T Baker 8993
entelan mercury 1.07961
Eosin Y solution, alcoholic SIGMA HT110116
hematoxylin solution, Mayer's SIGMA MHS 16
Ketamine hydrochloride Vetoquinol CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor) CP-pharma GmbH CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3% Teva CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators PARKELL S379
micro-ct scanner scanco uCT 40
parafin Leica 39602004
PBS SIGMA D8537
PFA EMS 15710
Chloramphenicol eye ointment (5%) Rekah pharmaceutical CAS 56-75-7
tweezers WAM Ref-CT
xylazine Eurovet Animal Health CAS 7361-61-7
xylene Gadot CAS 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
  2. Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
  3. Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
  4. Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
  5. Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
  6. Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
  7. Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
  8. Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
  9. Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
  10. Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
  11. De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
  12. Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
  13. Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
  14. Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
  15. Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
  16. Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
  17. Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
  18. Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
  19. Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
  20. Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
  21. Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
  22. Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
  23. Metzger, Z. Macrophages in periapical lesions. Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).
  24. Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
  25. Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
  26. Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
  27. Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
  28. Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
  29. AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).

Tags

Biologi Apical periodontitis mus endodontics tænder dental kontaminering mikro-CT
Inducerende Apical periodontitis i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goldman, E., Reich, E., Abramovitz,… More

Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M. Inducing Apical Periodontitis in Mice. J. Vis. Exp. (150), e59521, doi:10.3791/59521 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter