Summary
여기서, 우리는 마우스에서 국소치성 치주염을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 마우스의 치아에 구멍을 뚫고 국소 염증을 유발하기 위해 펄프를 노출시키는 방법을 보여줍니다. 마이크로 CT 및 조직학과 같은 이 염증의 본질을 조사하는 분석 방법도 입증됩니다.
Abstract
국소 유도 염증에 관여하는 메커니즘은 여러 가지 사용 가능한 동물 모델을 사용하여 연구 될 수있다. 이들 중 하나는 정점 치주염 (AP)의 유도입니다. 정점 치주염은 치아 뿌리를 둘러싼 치주 조직에서 염증성 성질의 일반적인 병리학입니다. 이 병리학의 특성과 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 마우스에서 절차를 수행하는 것이 유리합니다. 이 치과 펄프가 노출 될 때까지 이 치과 성 염증의 유도는 마우스 치아로 드릴링하여 달성됩니다. 다음으로, 치아 펄프는 시간이 지남에 따라 자연 구강 세균총에 의해 오염되어 정점 치주염을 유발하여 노출됩니다. 이 기간 이후에는 동물을 희생시키고 치아와 턱뼈를 다양한 방법으로 분석할 수 있습니다. 일반적인 분석은 마이크로 CT 화상 진찰 (뼈 재흡수를 평가하기 위하여), 조직학적 염색, 면역 조직 화학 및 RNA 발현을 포함합니다. 이 프로토콜은 균일 한 조건으로 생체 내 실험 환경에서이 염증 과정을 더 잘 이해하기 위해 경구 생물학 분야의 연구에 유용합니다. 절차는 마우스와 고립 된 턱의주의 깊은 취급을 필요로하며, 기술의 시각적 데모가 유용합니다. 유도 된 치주염으로 이어지는 절차의 모든 기술적 측면과 마우스 모델의 특성화가 입증됩니다.
Introduction
이 방법의 목적은 자연 미생물로 정점을 오염시킴으로써 마우스에서 정점 치주염을 유도한 다음이 병리학 적 과정의 다양한 특성을 연구하는 것입니다.
정점 치주염 (AP)은 치아 뿌리를 둘러싼 치주 조직에서 염증성 성질의 일반적인 병리학입니다. 이 치과 질환은 심한 통증을 유발할 수 있으며 치과 의사가 치료해야합니다. 치료 옵션은 근관 치료 (기본 또는 보조), endodontic 수술, 치아 추출, 또는 임상 및 방사선 연구 결과에 따라 후속, 임상의의 의견. 이 염증 과정의 메커니즘은 수십 년동안 연구되었지만 1,2,3은아직 포괄적으로 이해되지 않습니다. 이 병리학의 심각성을 고려할 때, 따라서 근본적인 본질을 다루는 연구에 대한 명확한 필요성이 있습니다. 따라서 AP 의 연구가 가능한 시스템은 과학적으로 큰 관심사입니다.
AP는 국부 조직과 면역 체계를 수반하는 복잡한 병리학 적 과정이기 때문에 시험관 내 연구는 프로세스의 완전한 이해를 위해 충분하지 않습니다. 이 질병의 임상 샘플의 연구는 또한 윤리적 한계와 다른 사람들과 다른 임상 단계사이의 상당한 가변성으로 인해 문제가 4,5,따라서 생체 내 모델의 필요성. 이들 모델은 치과 펄프를 오염에 노출시키고 신체의 염증 반응을 관찰하여 근문 조직에서 이러한 자극을 관찰하는 개념을 기반으로6,7. 일반적인 생체 내 모델은 설치류 또는 개와 같은 더 큰 동물을 포함합니다. 소형 치아를 가진 아주 작은 동물인 마우스 를 치료하는 임상 적 과제에도 불구하고 마우스 모델의 장점은 중요합니다 : 실질적으로 마우스와 함께 일하는 것은 기술적으로 간단하며 가장 비용 효율적입니다. 과학적으로, 마우스는 쉽게 사용할 수있는 유전 및 분자 도구와 잘 연구 된 게놈과 잘 연구 된 동물 모델입니다. 실제로, 이전 연구는 정점 치주염8,9,10,11에관여하는 염증성 및 뼈 흡수 신호 및 세포를 연구하기 위한 마우스 모델을 사용했다. 따라서 AP 연구에 마우스 모델을 사용하는 방법에 대한 명확한 프로토콜이 필요합니다. 여기서는 이러한 프로토콜을 설명합니다.
여기서 설명된 프로토콜은 녹아웃(KO) 마우스를 연구하고 특정 유전자의 부족이 치과 염증에 어떻게영향을 미치는지 배우기에 적합하다는 큰 장점을 갖는다 7,12. 이 프로토콜의 다른 유용한 응용 프로그램은 정점 치주염의 개발에 약물 및 전신 조건의 연구의 연구를 포함13,턱의 골괴사 개발에 정점 치주염의 효과14 , 도 15 및 골재생을 위한 줄기세포 치료제16.
이 프로토콜은 또한 국소 염증을 연구하는 모델로 일반화 될 수있다. 염증 과정을 연구하기 위해, 여러 마우스 모델이 개발되었으며, 이는 예를 들어 유도된 대장염 또는 관절염17,18을포함한다. 이 모델은 전신 효과가 있으며 동일한 동물에 내장 된 제어가 없습니다. 염증없이 반대측 조절을 포함하는 유도 된 치주염에 대한 모델은 이러한 한계를 극복하는 장점이 있습니다14,19.
아래에 설명된 프로토콜은 따라서 국부적인 염증 과정에 관심이 있는 연구자를 위해 유용합니다. 이 염증의 통제 된 특성, 특정 위치에 대한 감금 및 반대쪽 제어 치아는 모두이 과정에 관련된 메커니즘을 연구하는 데 이 프로토콜을 가치있게 만듭니다. 더욱이, 프로토콜은 근문 염증의 임상적 측면에 관심이 있는 연구자들에게 유용하다. 마우스 모델은 마우스 모델에서 유전자 조작을 용이하게 수행할 수 있다는 장점 외에도, 질병의 다양한 변수를 연구하고, 근문 염증에서 특정 유전자의 활성을 조사하는 데 이상적입니다.
기술적으로, 임상 절차는 마우스 치아의 작은 크기로 인해 수행하기가 어렵습니다. 위치 지정, 필요한 장비 및 성능에 대해 알아보려면 이 절차를 시각화하는 것이 좋습니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 히브리 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (윤리 없음. MD-17-15093-5).
1. 동물 마취 및 위치
- 아래에 설명된 대로 멸균 솔루션을 준비합니다.
- 5 mL의 케타민 7 mg/mL과 인산염 완충액(PBS)/식염수로 희석된 0.09 mg/mL 의 메데토미딘을 준비합니다.
- PBS/식염수로 희석된 아티파메졸(0.4 mg/mL)의 멸균 용액을 준비하십시오(5 mL의 양을 준비하는 것이 좋습니다).
- 국소 마취를 위해 PBS/식염수로 희석된 메피바카인(7.5 mg/mL)의 멸균 용액을 준비하십시오(메피바카인 의 공급된 유리병 1개만으로도 7.2 mL의 재고에 충분합니다).
- 실험을 위해 6-8주 된 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하십시오. 시설과 동물 먹이 광고 리비텀에서 제공하는 표준 물과 음식과 함께 특정 병원균 (SPF) 동물 단위에 동물을 유지합니다.
- 마우스를 계량하고 무게의 각 그램에 대해 10 μL의 부피를 복강 내 (IP)를 주입합니다. 예를 들어, 무게가 20그램인 마우스의 경우,
케타민/메데토미딘 용액 200 μL을 주입합니다. 이것은 (70 mg/kg) 케타민과 (0.9 mg/kg) 메데토미딘의 최종 농도를 줄 것이다
각 동물에 대해. - 시술 중 건조로 인한 눈 궤양을 방지하기 위해 클로람페니콜을 함유한 눈 연고(5%)를 바르십시오. 마취 하에 있는 동안 동물의 눈에. 동물을 마취하는 동안 램프로 따뜻하게 유지하십시오. 페달 반사 (회사 발가락 핀치를 수행)를 확인하여 마취의 깊이를 확인합니다.
- 마우스가 마취된 후, 마우스를 오른쪽(오른손잡이 연구원의 경우)에 놓고 닫힌 셀 압출 폴리스티렌 폼 표면에 놓고 테이프를 사용하여 발을 표면에 부착합니다.
- 앞니 주위에 작은 고무 밴드를 사용하여 입을 엽니 다 (상부 절개 에 대한 1, 하부 절치에 대한 1) 폐쇄 셀 압출 폴리스티렌 폼 표면에 고정 긴 바늘에 의해 장소에 개최.
- 표면에 테이핑 된 집게를 사용하여 오른쪽 뺨을 철회하십시오. 정상 상태에서 닫힌 집게를 사용합니다.
- 적절한 배율 (쌍안경 현미경 또는 임상 현미경)과 빛을 사용하여 하악 대구치에 액세스 할 수 있도록 편안한 작업 위치에 마우스로 표면을 배치합니다.
- 집게 또는 치과 주걱을 사용하여 혀를 철회하고 첫 번째 하악 골치에 인접한 점막 접힌에 27 게이지 바늘로 국소 마취를 주입합니다. 25-50 μL로 충분합니다. 주사 부위 주변의 조직의 붓기가 시각화되어야합니다.
2. 펄프 노출
- 적절한 치과 모터(예: 자동 토크 감소(ATR) 모터에 부착된 분당 800라운드(rpm)의 속도로 1/4 라운드 치과 용 버 또는 동일한 크기의 다이아몬드 버(긴 생크가 권장됨)를 사용하십시오.
- 펄프 뿔이 상아질을 통해 볼 때까지 첫 번째 오른쪽 하악 대구치의 교합 부분에 드릴. 모터의 짧은 버스트를 사용하여 과열을 방지합니다.
- K-파일 또는 H 파일 #8 또는 #10 사용하여 펄프를 관통하고 그들을 덮는 상아를 파괴하여 펄프 혼 (mesial 및 distal)에 파일을 삽입합니다. 파일은 오토 클레이브에 의해 살균됩니다.
- 파일의 개구부를 넓히는 동안 펄프 내부의 파일을 가능한 한 깊게 작업하십시오. 일반적으로 펄프에서 볼 수있는 출혈이있을 것입니다.
- 실험 중 통증을 줄이기 위해 버로 치아의 날카로운 가장자리를 둥글게 하고 치아를 폐색에서 제거하십시오. 마이크로 브러시로 시술 중에 이물질을 청소하십시오.
- 대조군 치아 (왼쪽 첫 번째 하악 어금니)를 대조군으로 둡니다.
3. 임상 절차 종료
- 고정 상태에서 마우스를 방출하고 Atipamezole IP (체중의 각 그램당 10 μL)를 주입하십시오. 이것은 (4 mg / kg) 아티파메졸의 최종 복용량을 줄 것이다.
- PBS/식염수(0.05 mg/kg) IP로 희석된 부프레노르핀을 주입하십시오(시술 당일 3 mL의 양을 준비하는 것이 좋습니다). 통증 완화가 필요한 이유에 대한 설명은 토론을 참조하십시오.
- 동물들이 마취에서 회복되는지 확인한 후 떠나십시오. 그들은 치아 통증으로 인해 하드 음식을 먹을 수 없기 때문에 그들에게 부드러운 음식을 제공합니다.
4. 사후 절차 후속 조치(42일)
- 절차 후 처음 3 일 동안, 동물의 무게와 부프레 노르 핀을 주입 (0.1 mg/kg) 하루에 한 번 IP (6mL의 양을 준비하는 것이 좋습니다).
- 실험 시간 동안(염증이 쌓이는 42일) 체중및 일반 행동평가로 동물을 일주일에 2-3회 모니터링한다.
- 후속 기간 동안 동물에게 부드러운 음식을 전달하십시오. 음식을 물로 적시고 케이지 바닥에 페트리 접시에 넣습니다.
5. 실험 종료 및 분석
- 후속 조치가 42일동안 11일 완료되면 케타민/자일라진으로 동물 IP를 106.25 mg/kg의 케타민 농도로 마취하고, 75 mg/kg의 자일라진(42.5 mg/mL 케타민의 재고 용액, 총 부피 의 1.5 mg/mL 자일라진은 총 부피의 1.5 mg/mL 자일라진입니다. 자궁 경부 탈구를 프리폼합니다.
참고 : 염증20,21을평가하기 위해 가능한 분석에 대한 다양한 옵션이 있습니다. 여기서 마이크로 CT 및 조직학적 염색에 의한 조직의 분석이 설명될 것이다. - 안락사 후, 외과 용 가위와 집게를 사용하여 3 개의 대구치 (각 측면 처리 및 비 처리 된 대조군에 대해 별도로)를 포함하여 턱의 일부를 잘라냅니다. 집게를 사용하여 가능한 한 연조직을 벗겨 내고 대부분 뼈와 치아를 시료에 남깁니다.
- PBS에서 조직을 간략하게 헹구고, 포름알데히드(PFA)에 4% (PBS에서 희석) 24-48시간 동안 고정을 위해 넣습니다.
주의: 화학 적 후드에 PFA를 사용하고 재료 안전 데이터 시트 (MSDS) 지침에 따라. - 24-48시간 후에, PFA를 씻어내기 위하여 PBS 3x로 헹구는다.
- 마이크로 CT
- 마이크로 CT 분석의 경우, 수확된 조직(약 4mm x 5mmx 1mm 크기의 대구치 3개 포함 하악골의 일부)을 마이크로 CT 스캐너에 놓고 1.5 mL의 PBS 로 채워진 직경 튜브에 놓아 볼 또는 언어 표면이 되도록 합니다. 치아와 뿌리의 튜브의 바닥에 평행하게 누워있다. 스폰지로 샘플을 분리하고 유연한 필름으로 튜브의 상단을 덮습니다.
- 스캐닝 패널을 열고 측정 번호를 선택합니다. 70kV의 에너지, 114 μA의 강도 및 6 μm3 복셀 크기의 해상도와 같은 매개 변수로 제어 파일을 선택합니다.
- 스카우트 보기를클릭하고 이미지가 나타나면 참조선을 클릭하고 스캔을 위해 샘플 영역을 표시합니다. 각 샘플 후 클릭스캔을 추가합니다. 샘플 표시가 완료되면 작업 목록으로 이동하여 상호 작용 작업을선택합니다.
참고 : 동일한 샘플을 나중에 역학에 사용할 수 있습니다. CT 스캔 중에 건조하지 않는 것이 중요합니다.
- 마이크로 CT 정렬 및 분석을 위해 적절한 컴퓨터 프로그램을 사용하십시오.
- 마이크로 CT 평가에서 XY 평면에서 샘플을 엽니다. 정렬을 위해 각 샘플에서 세 점을 선택합니다.
메사얼 상체 수축 -은 좌표계의 원점을 정의합니다.
메사운하의 관상 부 - Z 축에 대한 점을 정의합니다.
단위 정점 수축 -은 XZ 평면의 점을 정의합니다. - 왼쪽 패널의 측정 도구를 사용하고 각 점에 도달하는 선을 그립니다. 오른쪽 패널에 나타나는 X, Y 및 Z 값으로 세 점 각각을 정의합니다.
- μCT평가에서 작업을 선택하여 샘플의 관심 영역을 정의하고 3D 평가를클릭합니다. 사각형과 축당 치수가 있는 창이 화면에 나타납니다. 마우스의 가운데 버튼으로 모서리를 클릭하여 XY 축의 관심 영역에 맞게 사각형의 크기를 일치시면 됩니다. VOI Start아래의 Z 사각형에 관심있는 첫 번째 슬라이스 수를 삽입하고 첫 번째 조각부터 Dim아래의 Z 사각형에 대한 마지막 슬라이스 수까지의 슬라이스 수를 삽입하여 Z 축의 치수를 선택합니다.
- 세션관리자에서 응용 프로그램을 클릭하고 DECterm을선택합니다. 창이 열릴 때까지 몇 초 간 기다린 다음 다음 지침에 따라 아래에 설명된 기울어진 스크립트의 다섯 단계를 입력합니다(줄 클릭 사이 enter):
Ipl
isq_to_aim
aim1 - isq (관심 파일) 이름을 복사 : 세션 관리자에서 보기를 선택하고 microCTdata를클릭합니다. 작업 중인 파일을 찾아 파일을 가운데로 클릭합니다. 그런 다음 DECterm의 창을 다시 가운데로 클릭합니다.
- 관심 영역을 선택할 때 VOI로 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이의 공백 포함)을 입력합니다.
- 관심 영역을 선택할 때 희미한 상태에서 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이의 공백 포함)을 입력합니다.
- 메시지가 수신될 때까지 기다립니다.
(단계 II- 정렬):
z 정렬
aim1
목표2 - 좌표계의 원점으로 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이에 공백포함)을 입력합니다.
- z축의 점에 대해 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이에 공백포함)을 입력합니다.
- XZ 평면의 점에 대해 결정된 X, Y 및 Z 값(둘 사이에 공백포함)을 입력합니다.
- 메시지가 수신될 때까지 기다립니다: "align_Z 완료됨"
(단계 III- 헤더):
헤더
목표2
0 0 0
0 0 0 - 을 클릭합니다.
(단계IV- 목표에서 isq로다시 파일을 변환):
토이스크 (토스크)
목표2 - isq (관심 파일) 이름을 복사 : 세션 관리자에서 보기를 선택하고 microCT 데이터를클릭합니다. 작업 중인 파일을 찾아 파일을 가운데로 클릭합니다. 그런 다음 DECterm의 창을 다시 가운데로 클릭합니다. 지우기 ("백스페이스"를 사용 하 여) ". 파일 끝에 ISQ"를 쓰고 쓰기:"_new. 정렬된 파일을 인식하는 ISQ"입니다.
- 입력을 클릭합니다 . 입력합니다.
- 메시지가 수신될 때까지 기다립니다.
(단계 V- 플립):
이스크 (것)
a. - 새 isq(관심 파일) 이름 복사: 세션 관리자 에서 보기를 선택하고 microCT 데이터를클릭합니다. 작업 중인 파일을 찾아 파일을 가운데로 클릭합니다. 그런 다음 DECterm의 창을 다시 가운데로 클릭합니다.
- 입력을 클릭합니다 . 입력합니다. 메시지를 받을 때까지 기다립니다: "isq_to_aim 완료"
플립
a.
Aa
Zx
"플립_aim 완료"
보낸 사람
Aa - 새 isq 이름 복사: 세션 관리자에서 보기를 선택하고 microCT 데이터를클릭합니다. 작업 중인 파일을 찾아 파일을 가운데로 클릭합니다. 그런 다음 DECterm의 창을 다시 가운데로 클릭합니다. 지우기 ("백스페이스"를 사용 하 여) ". 파일 끝에 ISQ"를 쓰고 "_flip. 정렬된 파일을 인식하는 ISQ"입니다.
- 메시지가 수신될 때까지 기다립니다.
- 마이크로 CT 평가에서 XY 평면에서 샘플을 엽니다. 정렬을 위해 각 샘플에서 세 점을 선택합니다.
- 컨투어링
- 관상 동맥 펄프, 두 운하의 방사펄프, 그리고 두 정점 포어멘이 제시되는 치아의 대략 중간을 나타내는 슬라이스를 선택하십시오.
- 수동으로 왼쪽 상단 윤곽 패널을 클릭하여 중간 슬라이스에 관심의 윤곽을 표시 - 말단 루트 정점의 말단 점에서 시작하여 정점 테두리를 관상적으로 방사성 정점 영역으로 표시, mesial 루트 정점의 mesial 테두리를 통해 모독 뿌리의 말단 테두리와 분노 영역을 통해 말단 뿌리의 mesial 테두리를 따라 (그림 3 II, IV 참조).
- 이 윤곽선(Ctrl+C, Ctrl+V)을 복사하고 중간 슬라이스의 양쪽에 배치된 5개의 슬라이스로 조정합니다.
- 각 샘플에 대해 표시된 윤곽의 조직 부피를 계산하려면 μCT평가에서 작업을 선택하고 3D 평가를클릭합니다. 3D 평가의 창에서 작업 근처를 선택하고 조직 볼륨 (TV)를 계산하는 필터를 선택클릭합니다.
- 조직학
- 마이크로 CT 스캐너에서 조직을 제거한 후, 10일 동안 1 mL의 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 0.5M pH 8.0을 가진 마이크로원심지 튜브에 각 샘플을 넣어 조직을 탈문한다. 3일마다 EDTA 솔루션을 변경합니다.
- 탈수: 조직학적 카세트에 샘플을 넣고, 다음과 같이 각각 1시간씩 에탄올 농도를 증가시다: 70% 에탄올 (이 시점에서 샘플이 에탄올에 보관되는 한 몇 주 동안 중지될 수 있음), 90% 에탄올 2x, 100% 에탄올 2x, 자일렌 2x (주의 : 화학 후드에 자일렌을 사용하고 MSDS 지침에 따라).
- 카세트를 액체 파라핀(60°C)으로 옮기고 자일렌이 증발할 수 있도록 밤새 화학 후드에 둡니다.
- 차단: 조직학적 차단 기계를 사용하여 샘플을 파라핀에 포함시킵니다. 시상 절편을 얻으려면 올바른 위치에 포함해야합니다 (즉, 크라운과 뿌리는 치아가 "누워있는"방식으로 금형의 바닥 부분에 평행하게 지향되어야합니다). 샘플은 이제 마이크로토메로 절단할 준비가 되었습니다.
- 절개: 조직의 관련 부분에 도달할 때까지 ~ 20 μm의 두꺼운 조각을 자르는 것으로 시작하십시오. 일단 치아(크라운 또는 뿌리)의 임의의 부분을 인식하면 6 μm의 단면으로 변화하고, 이전 섹션에 따라 절단 각도를 변경한다.
- 예를 들어, 이전 섹션에 크라운이 포함되지만 뿌리가 없는 경우, 뿌리가 칼에 가까워지도록 마이크로톤에서 블록의 각도를 변경하고 크라운이 돌아갑니다 (치아의 부분은 블록 자체에 육안으로 인식 할 수 있음).
- 관상 동맥 및 방사 펄프, 정점 포어맨을 포함한 시상 단면을 얻을 때까지 각도를 계속 조정합니다. 관련 조직이 모두 절단 될 때까지 가능한 한 많은 슬라이스로 이 방향으로 자른다.
- 염색 프로토콜(예를 들어, 해모톡실린 및 이오신 염색(H&E), 브라운 & 브렌 염색, 타르타르산 내성 산 인산 인산염(TRAP) 염색, 면역히스토화학,20,21을참조하십시오.
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Representative Results
실험 단계의 흐름도는 그림1에 표시됩니다. 프로토콜에서 언급 한 바와 같이, 마우스는 마취되고, 한쪽에 그들의 첫 번째 하악 대구치 펄프 노출까지 드릴, 반대 측 치아는 대조군으로 남아있는 동안. 다음으로, 치아는 42 일 동안 구강 식물에 의해 오염되어 모니터링되고 진통제를 받습니다. 42 일 후에 마우스는 안락사되고 치아와 인접한 턱은 분석을 위해 취합니다.
도 2는 첫 번째 우측 몰 펄프 노출 후 마우스 하악의 임상 이미지를 보여 준다. 도 2A에서 전체 하악골은 도시되고, 도 2B의 인셋은 처리된 제1 우측 어금니의 확대를 나타낸다. 왼쪽 첫 번째 대구치가 대조군으로 사용된다. 도 2B에서는메사얼 및 말단 펄프 혼과 운하 입구의 노출을 볼 수 있습니다. 치아는 통증을 줄이기 위해 기계적으로 하위 폐색으로 낮아졌습니다.
구강 내 세균총에 치과 펄프가 노출된 후, 치과 펄프는 결국6,7에 오염되어 괴사된다. 문헌22에따르면, 그람 음성 박테리아는 치아의 정점 부위에 리포폴리사카라이드(LPS)를 분비한다. 면역 계통의 복잡한 반응을 통해, 결과 의 한은 정점 치주염23의특징인 근문 지구에 있는 뼈 재흡수입니다. 이 뼈 재흡수는 마이크로 CT에 의해 확인되고 정량화될 수 있습니다. 마이크로 CT 이미지에서, 방사성 성 근문 영역은 단단한 뼈 조직이 염증 과정으로 인해 연약한 periapical 병변이 된 지역을 나타냅니다. 도3에서, 대표적인 마이크로-CT 이미지는 대조군과 비교하여 치료된 치아를 입증한다. 그림 3AIII의 화살표는 메사펄프 노출(원위 펄프 노출이 샘플의 이 조각에 나타나지 않음)을 가리키며, 뼈 재흡수의 부모 및 원위 적 방사능 영역은 파선으로 둘러싸여 있습니다. 여기에 표시된 박스플롯 그래프는 대조군과 비교하여 치료된 치아에서 상당한 골 리서팅을 정량화합니다.
마이크로 CT는 병변의 3 차원 크기의 평가를위한 훌륭한 기술이지만, 그들의 생물학적 조성에 관한 정보가 부족하다. 그림4에 제시된 조직학적 염색은 이 정보를 제공한다. H&E 염색은 치료된 치아에 비해 대조군 치아에서 입증된다. 치료 치아 (그림4B, C,D)에서, 치과 펄프 자체는 H & E 염색에서 명확하게 볼 수있는 괴사를 제시 (그림4C),대조군 조직 펄프 조직에 비해 (그림4A). 또한, 중요한 것은, 치료된 치아의 복막 영역에서 면역 세포(주로 대식세포 및 림프구)로 구성된 복강변은, 가시화(도4D)(건강한 치주 인대(PDL)와 비교하여 제어 치아의 골반 부위에 있는 뼈 조직). 이러한 근막 병변은 여기에 제시된 유도된 정점 치주염 기술의 바람직한 결과이다.
한편, 도 5는 드문 경우(동물의 85% 이상이 마이크로 CT에서 뼈 재흡수를 보여준다), 즉 42일 동안 경구 세균에 노출된 치아, 아직 펄프 괴사를 제시하지 않은 실패한 오염을 나타낸다. , 따라서 마이크로 CT(도5A)및 조직학(도 5B)에서 골 손실및 골후 병변을 나타내지 않았다.
그림 1: 실험 공정의 시간 축. 실험 절차의 시간적 진행의 개략적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 의 임상 이미지는 오른쪽 첫 번째 어금니 펄프 노출 후 하악. (A) 마우스 하악, 노출 된 펄프와 첫 번째 오른쪽 대구치, 첫 번째 왼쪽 어금니 처리되지 않은 대조군 역할을한다. (B) 노출된 펄프로 오른쪽 어금니의 확대. 운하 입구를 시각화 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마이크로 CT 분석. (A) 대표적인 마이크로 CT 스캔 (6μm의 슬라이스) 처리 (AIII, AIV) 및 제어 (AI, AII) 치아. 화살표는 mesial 펄프 노출을 가리킵니다 (원위 펄프 노출은이 조각에 존재하지 않습니다). 처리된 이에 인접한 뼈 손실의 Mesial 및 Distal 경계 지역은 파선으로 포위됩니다. AII, AIV- 윤곽 표시의 대표적인 이미지. (b) 박스-플롯(각 샘플의 11개의 슬라이스에 대해 표시된 윤곽에 의해 측정된 바와 같이)을 처리된 샘플(청색, n=15 동물)과 비교하여 대조군(주황색, n=14동물)을 정량화하였다. 분석은 마이크로 CT를 위한 Scanco 평가 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 샘플은 관상 동맥 펄프, 근관 및 정점 포라멘을 동일한 조각으로 시각화하는 방식으로 방향의 시상 축에 정렬되었습니다(자세한 내용은 프로토콜 참조) 방향에 대해). 윤곽은 중간 치아 영역의 양쪽에 5 개의 슬라이스로 표시되었습니다 (모두 함께 11 개의 슬라이스). 각 샘플의 윤곽에 대한 조직 부피는 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 조직학적 H&E 대표 이미지: (A) 대조군 치아의 조직학적 조각. (B) 치료 된 치아의 조직 학적 슬라이스, 심한 회액 병변이 제시된. (C) 괴사 조직의 확대. (D) 근막 육아종 조직 P = 펄프의 확대, D = 상아질, B = 뼈, BM = 골수, PDL = 치주 인대, N = 괴사 펄프, G = 육아종. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 실패한 오염의 예: (A) 펄프 노출이 있는 치아의 마이크로 CT 대표 이미지(흰색 화살표), 유의한 골 손실,(B) 조직학적 H&E 대표 이미지와 상관없음 치아는 중요한 (괴사가 아닌) 펄프 및 정상적인 정점 조직을 드러냅니다. P = 펄프, D = 상아질, B = 뼈, BM = 골수, PDL = 치주 인대. (C) B에 제시 된 석회화 된 조직의 확대는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
방법은 마우스에 있는 정점 치주염의 유도를 위해 여기에서 소개됩니다. 이 방법의 목표는이 염증 과정의 메커니즘과 결과를 연구하기위한 정점 치주염 상태를 이용하는 것입니다. 정점 치주염은 뿌리가 완전히 발달되는 나이인 6-8주령생에서24세로유도되었다. 이 모델에서 치주염을 일으키기 위해 마우스 하악골의 치아 펄프는 치과 용 버를 사용하여 노출됩니다. 쥐의 경구 식물군 (SPF 조건에서)의 박테리아가 치아의 펄프와 근관을 침범하여 펄프 괴사를 일으키고 정점 조직에 LPS를 분비하여 정점 염증을 유발합니다.
이 절차를 수행할 때는 다음 중요한 단계에 주의하십시오. 펄프 노출 시 동물의 정확한 위치는 절차의 성공에 매우 중요합니다. 중요한 단계는 펄프의 적절한 노출입니다. 운하 노출이 부족하면 치과 교량 형성이 발생할 수 있으며, 이로 인해 시술의 실패와 AP를 생성할 수 없게 될 수 있습니다. 펄프 노출 하는 동안, 부작용을 일으킬 수 있는 다른 지역에서 원치 않는 통증과 염증을 피하기 위해 펄프 노출 하는 동안 연조직 손상을 최소화 하기 위해 주의 필요. 마이크로 CT 분석 소프트웨어에서 시료의 적절한 정렬은 해석 가능한 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 조직학을 위해 턱 조직을 준비할 때, 조직학을 위한 금형을 준비할 때 정확한 방향을 달성하기 위하여 뼈를 둘러싼 연약한 조직을 벗기는 것이 좋습니다. 샘플은 전체 공정 동안 젖은 매체에 보관해야합니다 (수확 단계에서, 마이크로 CT를 통해, 조직 학적 블록 절차까지). 마이크로토메에서 조직을 절단 할 때 치아의 시상 조각을 달성하기 위해 샘플의 각도를 고정해야합니다. 또한 동물의 복지에 관한 윤리적 문제를 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 적절한 마취는 절차 중에 중요합니다 (전신 및 국부 모두,25,26참조). 진통제는 필수적입니다, 특히 절차 다음 처음 며칠 동안, 체중과 행동을 모니터링뿐만 아니라 부드러운 음식과 동물을 공급구현되어야한다. 이전 경험에서, 마우스의 전반적인 반응은 잘 절차를 용납하는 것입니다 그리고 그들은 극단적 인 고통을 전시하지 않습니다.
이 방법의 실패는 정점 염증이 형성되지 않은 경우 고려됩니다 : 마이크로 CT 스캔에서 치아의 주후 부위에서 뼈 재흡수에 대한 증거가 없으며 치아의 PDL 조직이 조직 학적 염색에 그대로 손상되지 않았습니다 (다음과 같이) 그림 5에제시되어 있습니다. 염증을 달성하지 못하는 가능한 이유는 동물의 행동에 대한 과상적 차이뿐만 아니라 박테리아에 대한 각 동물의 특정 노출을 포함한다. 이 방법을 사용하여 정점 치주염을 일으키는 데 좋은 결과가 달성되지만 (동물의 85 % 이상이 뼈 재흡수를 보여줍니다), 프로토콜을 따라 밀접하게 프로토콜을 따라 샘플 간의 변형을 줄입니다. 어떤 마우스 후속 기간 동안 고민의 흔적을 보여 경우, 고통을 방지 하기 위해 실험에서 그들을 제거 하는 것이 좋습니다. 이렇게 하는 결정은 후속 기간 도중 동물의 손실 또는 체중의 이득을 보고 서 원조될 수 있습니다. 체중을 많이 잃는 동물은 고통을 겪고 제거해야합니다. 우리는 또한 가장 고통받는 동물이 낮은 무게 또는 가난한 건강 상태에서 실험을 시작한 동물임을 관찰했습니다. 전반적으로 프로시저가 올바르게 수행되면 일관된 결과를 얻을 수 있습니다.
이 기술의 몇 가지 제한 사항에 유의해야 합니다. 이 모형은 세균성 오염에 기인한 정점 치주염을 공부하기 위하여 개발되었다는 것을 주의하는 것이 중요합니다 및 외상성 상해와 같은 정점 치주염이 발생할 수 있는 몇몇 그밖 가능한 기계장치를 모방하지 않습니다 자동 염증성 질환. 더욱이, 인간 환자에 있는 이 모형 그리고 임상 상황 사이 중요한 다름은 존재합니다. 마우스에서, 자발적인 periapical 병변은 기술되지 않았고 이것은 전적으로 인공적인 상황입니다. 설치류 치아의 해부학은 또한 인간의 해부학과 다릅니다. 이러한 차이점의 중요성은 알 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 마우스는 기본 메커니즘과 현상을 이해하는 데 매우 유용한 모델입니다. 더욱이, 마우스에 있는 근관 치유 모형 (근관으로 취급해서) 지금까지 보고되지 않았습니다, 그러나 잠재적으로 그것이 가능하다는 것을 증명해야 하는 연구의 이 필드에 있는 높은 중요성이 있습니다. 펄프 캡핑의 방법은 큰 잠재력을 보여주는 마우스에 대해 보고되었습니다27. 근관 치유 모델은 실제로 최근에 쥐에서 개발되었으며, 종종 근관 성 연구에서 사용되는 모델 동물28. 여기에보고 된 방법은이 루트 운하 치유 모델을 개발하기위한 예비 절차역할을 할 수 있습니다.
생체 내 방법을 사용하는 것은 동물의 작은 크기로 인해 임상적으로 도전적이지만, 마우스 모델과 같은 복잡한 면역 반응의 연구에 매우 중요합니다: 비용 효율적이고, 쉽게 접근할 수 있는 시설 및 세트를 수반합니다. 사용 가능한 유전 및 분자 도구(예: 사용 가능한 녹아웃, CRISPR 라이브러리 및 다양한 게놈 데이터). 이 모델은 최소한의 변이 (임상 연구와 는 반대로)와 함께 멸균 실험실 조건에서 AP의 임상 프리젠 테이션을 유도하기 때문에 근인청 연구에 가장 적합합니다. 더욱이, 이 모델은 또한 만성 염증과 같은 다른 연구 분야에서도 이점이 있으며, 이는 최소한의 전신 침범으로 만성적이지만 국소 염증을 유발할 수 있는 능력, 및 대조군과 같은 동물의 반대측의 사용으로 인한 것이다.
이 일은 병변의 분석을 위한 마이크로 CT 그리고 조직학의 사용을 보고합니다. 잠재적으로, 분석의 그밖 모형은 선동적인 세포에 있는 다른 유전자에 DNA를 격리하고 DNA 메틸화를 시험하는 것과 같은 여기에서 수행되지 않은 이 모형에서 이용될 수 있습니다; RNA를 분리하고 RNA-seq를 수행하여 상이한 면역 세포 또는 다른 유형의 마우스에서 유전자 발현 패턴을 볼 수 있는 단계; 또는 세포를 격리하고 FACS20,21,29로특성화. 전체적으로, 여기에보고 된 모델에 큰 잠재력이 있다, 잘하면이 보고 된 프로토콜 및 데모에 의해 촉진 될 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
우리는 동물 포지셔닝에 대한 그의 도움에 대한 박사 오드 헤이먼, 마이크로 CT 분석에 대한 도움을 라파엘 리버, 그리고 교수 안디아라 드 로시 달데건 은 실험을 미리 형성에 대한 조언을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 비판적 독서와 편집에 대한 박사 시드니 코헨을 인정하고 싶습니다.
이 작품은 이자도르 I. 카바코프 연구 기금에서 MK와 IA에 대한 보조금과 이스라엘 과학기술부의 이츠학 나본 펠로우십을 통해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
References
- Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
- Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
- Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
- Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
- Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
- Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
- Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
- Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
- Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
- Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
- De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
- Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
- Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
- Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
- Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
- Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
- Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
- Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
- Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
- Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
- Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
- Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
- Metzger, Z. Macrophages in periapical lesions. Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).
- Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
- Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
- Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
- Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
- Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
- AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).
