Summary
Her presenterer vi en protokoll til lokalt indusere apikale periodontitt i mus. Vi viser hvordan å bore et hull i musen tann og eksponere sin cellulose, for å forårsake lokal betennelse. Analysemetoder for å undersøke arten av denne betennelsen, slik som Micro-CT og histologi, er også demonstrert.
Abstract
Mekanismene involvert i lokale indusert betennelse kan bli studert ved hjelp av flere tilgjengelige dyr modeller. En av disse er induksjon av apikale periodontitt (AP). Apikale periodontitt er en vanlig patologi av en inflammatorisk natur i periodontal vev rundt tannen roten. For å bedre forstå naturen og mekanismen for patologi er det fordelaktig å utføre prosedyren i mus. Induksjon av denne odontogene betennelsen oppnås ved å bore inn i musen tannen til Dental massen er eksponert. Neste, tannen massen forblir eksponert for å bli forurenset av den naturlige muntlige flora over tid, forårsaker apikale periodontitt. Etter denne tidsperioden, dyret er ofret, og tannen og kjeven benet kan analyseres på ulike måter. Typiske analyser inkluderer Micro-CT Imaging (for å evaluere bein resorpsjon), histologiske farging, immunhistokjemi, og RNA uttrykk. Denne protokollen er nyttig for forskning innen oral biologi for bedre å forstå denne inflammatoriske prosessen i en in vivo eksperimentell innstilling med ensartede forhold. Prosedyren krever en forsiktig håndtering av mus og den isolerte kjeven, og en visuell demonstrasjon av teknikken er nyttig. Alle tekniske aspekter av prosedyrene som fører til indusert apikale periodontitt og dens karakterisering i en musemodell er demonstrert.
Introduction
Målet med denne metoden er å indusere apikale periodontitt i en mus ved å forurense Apex med naturlig mikroflora, og deretter studere ulike egenskaper ved denne patologiske prosessen.
Apikale periodontitt (AP) er en vanlig patologi av en inflammatorisk natur i periodontal vev rundt tannen roten. Dette Dental sykdom kan forårsake sterke smerter og må behandles av en tannlege. Behandlingsalternativene inkluderer rotfyllinger behandling (primær eller sekundær), endodontic kirurgi, tann trekking, eller oppfølging avhengig av kliniske og radiografisk funn, og den oppfatning av terapeut. Mekanismen av denne inflammatoriske prosessen, selv studert i flere ti år1,2,3, er fortsatt ikke omfattende forstått. Tatt i betraktning alvorlighetsgraden av patologi, er det dermed et klart behov for forskning adressering sin grunnleggende natur. Dermed systemer der studiet av AP er mulig er av stor vitenskapelig interesse.
Siden AP er en kompleks patologisk prosess som involverer det lokale vevet og immunsystemet, in vitro studier er utilstrekkelig for en fullstendig forståelse av prosessene. Studier av kliniske prøver av denne sykdommen er også problematisk på grunn av etiske begrensninger og signifikant variasjon mellom ulike mennesker og ulike kliniske stadier4,5, og dermed nødvendigheten av in vivo-modeller. Disse modellene er basert på konseptet med å utsette Dental massen til forurensning og observere den inflammatoriske reaksjonen av kroppen til denne stimulans i periapical vev6,7. Vanlige in vivo-modeller inkluderer gnagere eller større dyr som hunder. Til tross for den kliniske utfordringen i behandling av mus, som er svært små dyr med miniatyr tenner, er fordelene med muse modellen betydelige: praktisk talt, jobber med mus er teknisk enkel i form av fasiliteter og er mest kostnadseffektivt, og vitenskapelig, er musen en godt studert dyr modell med lett tilgjengelige genetiske og molekylære verktøy og en godt studert Genova. Faktisk brukte tidligere studier en musemodell for å studere inflammatoriske og bein resorpsjon signaler og celler involvert i apikale periodontitt8,9,10,11. Derfor er en klar protokoll om hvordan du bruker en musemodell for studiet av AP er nødvendig. Her beskriver vi en slik protokoll.
Protokollen som beskrives her, har den store fordelen av å være hensiktsmessig å studere Knock-Out (ko) mus og lære hvordan mangelen på et bestemt gen påvirker Dental betennelse7,12. Andre nyttige anvendelser av denne protokollen inkluderer studiet av effekter av medikamenter og systemiske tilstander på utviklingen av apikale periodontitt13, effekten av apikale periodontitt på utviklingen av osteonekrose i kjeven14 , 15 og stilk cellen terapi for bein gjenfødelse16.
Denne protokollen kan også generalisert som en modell for å studere lokal betennelse. For å studere den inflammatoriske prosessen, har flere musemodeller er utviklet, som inkluderer for eksempel indusert kolitt eller leddgikt17,18. Disse modellene har systemiske effekter og har ingen innebygd kontroll i samme dyr. Modeller for indusert apikale periodontitt, som inkluderer en kontralateral kontroll uten betennelse, har fordelen av å overvinne disse begrensningene14,19.
Protokollen beskrevet nedenfor er derfor nyttig for forskere som er interessert i lokale inflammatoriske prosesser. Den kontrollerte natur denne betennelsen, dens fødsel til et bestemt sted, og kontralateral kontroll tann, alle gjør denne protokollen verdifullt for å studere mekanismene som er involvert i denne prosessen. Videre er protokollen nyttig for forskere som er interessert i de kliniske aspektene ved periapical inflammasjon. Musa modellen er ideell til å studere ulike variabler av sykdommen, i tillegg til fordelen av å kunne enkelt utføre genetiske manipulasjoner i muse modellen, for å undersøke aktiviteten av spesifikke gener i periapical betennelse.
Teknisk er den kliniske prosedyren utfordrende å gjennomføre på grunn av de små dimensjonene av mus tennene. Det vil være fordelaktig å visualisere denne prosedyren for å lære om posisjonering, utstyr som trengs, og ytelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av det hebraiske universitetet (etikk nr. MD-17-15093-5).
1. Animal anestesi og posisjonering
- Klargjør sterile løsninger som beskrevet nedenfor.
- Forbered 5 mL av 7 mg/mL av ketamin og 0,09 mg/mL Medetomidine fortynnet med fosfat buffer løsning (PBS)/Saline.
- Forbered en steril løsning av Atipamezole (0,4 mg/mL) fortynnet i PBS/Saline (anbefales for å forberede et beløp på 5 mL).
- Forbered en steril løsning av Mepivacaine (7,5 mg/mL) fortynnet i PBS/Saline for lokal bedøvelse (ett med følgende hetteglass med Mepivacaine er tilstrekkelig for et lager av 7,2 mL).
- Bruk 6-8 uker gamle kvinnelige C57BL/6 mus for eksperimentet. Oppbevare dyrene inne en spesifikk patogen ledig (SPF) dyr enhet, med målestokk vann og næringen forsynt av fasiliteten og det dyr mate annonse lib.
- Veie mus og injisere intraperitonealt (IP) et volum på 10 μL for hvert gram av vekten. For eksempel, for en mus som veier 20 gram,
injisere 200 μL av ketamin/Medetomidine-løsning. Dette vil gi en endelig konsentrasjon av (70 mg/kg) ketamin og (0,9 mg/kg) Medetomidine
for hvert dyr. - For å forebygge øye sår på grunn av tørrhet under inngrepet, Påfør øye salve som inneholder Kloramfenikol (5%) på dyrenes øyne mens de er under anestesi. Hold dyrene varme med en lampe mens de er anesthetized. Sjekk dybden av anestesi ved å sjekke pedal refleks (utfører fast tå knipe).
- Etter at musen er anesthetized, plassere musen legging på høyre side (for en høyrehendt forsker) på en lukket celle ekstrudert polystyren skum overflate og feste føttene til overflaten ved hjelp av tape.
- Åpne munnen ved hjelp av små gummibånd rundt fortenner (1 for øvre fortenner, og 1 for lavere fortenner) holdt på plass av lange nåler festet inn i lukket celle ekstrudert polystyren skum overflate.
- Trekk tilbake det høyre kinnet ved å bruke tang tapet til overflaten. Bruk tang som er lukket i steady state.
- Plasser overflaten med musen i en komfortabel arbeidsstilling slik at tilgang til søvnapnéskinne jeksler, ved hjelp av riktig forstørrelse (et kikkert mikroskop eller klinisk mikroskop) og lys.
- Trekk tilbake tungen ved hjelp av Tang eller dental slikkepott og injisere lokal anestesi med en 27 gauge nål i mucobuccal fold ved siden av den første søvnapnéskinne molar. 25-50 μL er tilstrekkelig. Hevelse i vevet rundt injeksjonsstedet bør visualisere.
2. tremasse eksponering
- Bruk en 1/4 runde Dental Burr, eller en samme størrelse diamant Burr (en lang skaft anbefales) med en hastighet på 800 runder per minutt (rpm), festet til en passende Dental motor (for eksempel en automatisk dreiemoment reduksjon (ATR) motor).
- Drill på den okklusal delen av første høyre søvnapnéskinne molar til cellulose hornene er synlige gjennom dentin. Bruk korte støt av motoren for å hindre overoppheting av området.
- Bruk en K-fil eller H-fil #8 eller #10 å Pierce massen og sett filen inn i massen horn (mesial og på den andre) ved å bryte dentin dekker dem. Filene er sterilisert av autoklav.
- Fortsett å arbeide med filene inne i massen så dypt som mulig, mens utvide åpningene med filene. Vanligvis vil det være blødning synlig fra massen.
- Sørg for å runde skarpe kanter av tannen med Burr og fjerne tannen fra okklusjon, for å redusere smerte under eksperimentet. Rengjør rusk under prosedyren med en mikrobørste.
- La kontralateral tannen (venstre første søvnapnéskinne molar) som en kontroll.
3. slutt på klinisk prosedyre
- Løsne musen fra fikserings tilstanden og Injiser Atipamezole IP (10 μL for hvert gram kroppsvekt. Dette vil gi en endelig dose (4 mg/kg) Atipamezole.
- Injisere buprenorfin fortynnet i PBS/Saline (0,05 mg/kg) IP (anbefales for å forberede et beløp på 3 mL på dagen av prosedyren). Se diskusjon for forklaring på hvorfor smertelindring er nødvendig.
- Sørg for at dyrene komme seg fra anestesi før du forlater dem. Gi dem myk mat fordi de kan være ute av stand til å spise hard mat på grunn av tann smerter.
4. post prosedyre oppfølging (42 dager)
- For de første 3 dagene etter inngrepet, veie dyrene og injisere buprenorfin (0,1 mg/kg) IP en gang om dagen (anbefalt for å forberede et beløp på 6mL).
- I løpet av tiden av eksperimentet (42 dager når betennelsen bygger opp) overvåke dyrene etter vekt og generelle atferdsdata vurdering 2-3 ganger i uken.
- Lever myk mat til dyrene i løpet av oppfølgingsperioden. Fukt maten med vann og legg den i en Petri-parabolen på gulvet i buret.
5. oppsigelse og analyse av eksperimenter
- Når 42 dager11 av oppfølgingen er fullført, BEDØVE dyr IP med ketamin/xylazine ved en konsentrasjon på 106,25 mg/kg Ketamin, og 75 mg/kg Xylazine (en lagerløsning på 42,5 mg/ml Ketamin, og 1,5 mg/ml xylazine i et samlet volum på 2 ml er anbefales) og preform cervical forvridning.
Merk: det finnes ulike alternativer for mulige analyser for å evaluere betennelse20,21. Her analyse av vevet ved Micro-CT og histologiske farging vil bli beskrevet. - Etter dødshjelp, bruk kirurgisk saks og tang for å kutte ut en del av kjeven, inkludert de 3 jeksler (separat for hver side-behandlet og ikke-behandlet kontroll). Ved å bruke tang skrelle av så mye som bløtvevet som mulig, slik at det meste bein og tenner på prøven.
- Skyll vevet kort i PBS, og deretter sette den i paraformaldehyde (PFA) 4% (fortynnet i PBS) for 24-48 timer for fiksering.
FORSIKTIG: Bruk PFA i en kjemisk hette, og i henhold til retningslinjene for material sikkerhets data blad (muskel- - Etter 24-48 timer, skyll med PBS 3x for å vaske ut PFA.
- Mikro-CT
- For Micro-CT-analyse, ta høstes vev (del av kjeven inkludert 3 jeksler, i dimensjoner på ca 4 mm x 5 MMX 1 mm) til en Micro-CT scanner, plassere dem i en 12 mm diameter rør fylt med 1,5 mL PBS orientert slik at bukkal eller språklige overflater av tannen og roten legger parallelt til bunnen av røret. Skill mellom prøvene med svamp, og dekk toppen av røret med fleksibel film.
- Åpne skanne panelet og velg måle nummeret. Velg kontroll filen med følgende parametre: energi 70 kV, intensitet på 114 μA, og oppløsning på 6 μm3 Voxel størrelse.
- Klikk på speider visning, og når bildet vises, klikker du referanselinje og markerer området av prøvene for skanning. Etter hvert eksempel klikker du på Legg til skanning. Når du er ferdig med å merke prøvene, går du til oppgavelisten og velger Start samhandle oppgaver.
Merk: de samme prøvene kan senere brukes til histologi. Det er viktig at de ikke tørker ut under CT-scan.
- Bruk en passende dataprogram for Micro-CT justering og analyse.
- Åpne prøven på XY-flyet i mikro-CT-evalueringen. Velg tre punkter på hver prøve for justering:
Mesial apikale innsnevring-definerer opprinnelsen til koordinatsystemet.
Den koronale delen av mesial kanalen-definerer et punkt på Z-aksen.
Den apikale innsnevring-definerer et punkt på XZ-planet. - Bruk måleverktøyet på venstre panel, og tegn en linje når hvert punkt. Definer hvert av de tre punktene med en X-, Y & Z-verdi, slik den vises i panelet til høyre.
- Definer interesseområdet i prøven ved å velge oppgave under benvolum evaluering, og klikk på 3D-evaluering. Det vises et rektangel og et vindu med dimensjonene per akse på skjermen. Tilpass dimensjonene på rektangelet slik at det passer til det området av interesse på XY-aksen ved å klikke i hjørnene med knappen i midten av musen. Velg dimensjonene i Z-aksen ved å sette inn det første Slice-nummeret av interesse i Z-firkanten under VOI Start, og antall skiver fra den første til den siste Slice-nummeret av interesse i z-firkanten under Dim.
- Klikk på programmer under Session Manager, og velg DECterm. Vent noen sekunder på at et vindu åpnes, og skriv deretter inn de fem trinnene i det skrå skriptet som er beskrevet nedenfor, i henhold til følgende instruksjoner (mellom linjene klikker du Enter):
Ipl
isq_to_aim
aim1 - Kopier isq (fil av interesse): Velg visninger under sesjons behandling og klikk microCTdata. Finner filen tilværelse arbeider opp på, og midt falle i staver på arkiv. Så midt falle i staver rygg inne ruten av det DECterm.
- Skriv inn X, Y & Z verdier (med et mellomrom mellom dem) som ble bestemt under VOI når du velger region av interesse.
- Angi X-, Y-& Z-verdiene (med et mellomrom mellom dem) som ble bestemt under Dim når du valgte region av interesse.
- Vent til mottar en beskjed: isq å sikte fullført.
(trinn II-justering):
Juster z
aim1
aim2 - Angi X-, Y-& Z-verdiene (med et mellomrom mellom dem) som ble fastsatt for opprinnelsen til koordinatsystemet.
- Angi X-, Y-& Z-verdiene (med et mellomrom mellom dem) som ble fastsatt for punktet på Z-aksen.
- Angi X-, Y-& Z-verdiene (med et mellomrom mellom dem) som ble fastsatt for punktet på XZ-planet.
- Vent til mottar en beskjed: "align_Z fullført"
(Trinn III-header):
Topptekst
aim2
0 0 0
0 0 0 - Klikk Enter.
(trinn IV-konvertere filen tilbake fra mål til isq):
toisq
aim2 - Kopier isq (fil av interesse): Velg visninger under sesjons behandling og klikk på microCT data. Finn filen du arbeider på, og midtre Klikk på filen. Så midt falle i staver rygg inne ruten av det DECterm. Slett (med "Backspace") ". ISQ "på slutten av filen, og skrive:" _new. ISQ "for å gjenkjenne den justerte filen.
- Klikk Enter | Enter.
- Vent til mottar en beskjed: "toisq_from_aim fullført"
(trinn V-flip):
isq
A - Kopier det nye isq (fil av interesse): Velg visninger under sesjons behandling , og klikk microCT data. Finner filen tilværelse arbeider opp på, og midt falle i staver på arkiv. Så midt falle i staver rygg inne ruten av det DECterm.
- Klikk Enter | Enter. Vent med å motta en melding: "isq_to_aim fullført"
Flip
A
Aa
Zx
vente med å motta en melding: "flip_aim fullført"
Fra
Aa - Kopier det nye isq navnet: Velg visninger under sesjons behandling , og klikk på microCT data. Finner filen tilværelse arbeider opp på, og midt falle i staver på arkiv. Så midt falle i staver rygg inne ruten av det DECterm. Slett (med "Backspace") ". ISQ "på slutten av filen, og skrive:" _flip. ISQ "for å gjenkjenne den justerte filen.
- Vent til mottar en beskjed: "from_aim_to_isq fullført"
- Åpne prøven på XY-flyet i mikro-CT-evalueringen. Velg tre punkter på hver prøve for justering:
- Contouring
- Velg stykket som representerer omtrent midten av tannen, der koronale cellulose, radicular masse av begge kanalene, og begge apikale foramens presenteres.
- Manuelt markere konturen av interesse på midten skive ved å klikke på øvre venstre kontur panel-fra det flate punktet av den flate roten Apex markere apikale grensen koronalt til røntgentett apikale området, gjennom mesial grensen av mesial roten Apex følge den mesial roten og den mesial grensen til den ikke-furcation regionen (se Figur 3 II, IV).
- Kopier denne konturen (CTRL + C, CTRL + V) og justere den tilsvarende 5 skiver plassert på hver side av midten skive.
- For å beregne vevs volumet på konturen som er merket for hvert utvalg, velg aktivitet under benvolum evaluering, og klikk på 3D-evaluering. I vinduet for 3D-evaluering Klikk Velg nær aktivitet og velg et filter for å beregne vevs volumet (TV).
- Histologi
- Etter fjerning av vev fra mikro-CT scanner, avkalke av vev ved å sette hver prøve i et mikrosentrifugen rør med 1 mL ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) 0,5 M pH 8,0 i 10 dager. Endre EDTA-løsning hver 3 dager.
- Dehydrering: Put prøvene i histologiske kassetter, og i økende etanol konsentrasjoner, en time hver, som følger: 70% etanol (på dette punktet prosessen kan stoppes i flere uker, så lenge prøvene holdes i etanol), 90% etanol 2x, 100% etanol 2x, xylen 2x (forsiktig: Bruk xylen i en kjemisk hette, og i henhold til sine retningslinjer for muskel-og skjelettlidelser).
- Overfør kassetter til flytende parafin (60 ° c) og la i kjemisk hette over natten for at xylen skal fordampe.
- Blokkering: Bruk en histologiske blokkerings maskin for å bygge inn prøvene i parafin. Vær forsiktig med å legge dem i riktig posisjon (dvs. kronen og røttene bør være orientert parallelt med den nederste delen av mold, på en måte som tannen er "liggende") for å få sagittal seksjoner. Prøvene er nå klare til å kuttes med en mikrotomen.
- Skjæring delene: Start ved å kutte tykke skiver på ~ 20 μm til nå den aktuelle delen av vev. Når gjenkjenne noen del av tannen (krone eller røtter) endres til deler av 6 μm, og endre vinkelen på skjæring i henhold til forrige avsnitt.
- For eksempel, hvis den forrige delen inkluderte kronen, men ikke røttene, endre vinkelen på blokken i mikrotomen slik at røttene kommer nærmere kniven, og kronen går tilbake (de delene av tannen kan bli gjenkjent med et naken øye på blokken selv).
- Fortsett å justere vinkelen til innhenting sagittal seksjoner inkludert koronale og radicular cellulose, og apikale foramen. Skjær i denne retningen så mange skiver som mulig, til det aktuelle vevet er alt kuttet.
- For farging protokoller (f. eks Haemotoxylin og Eosin farging (H & e), brun & Brenn farging, Tartrate-resistente acid fosfatase (Trap) farging, immunhistokjemi), se20,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et flytskjema for de eksperimentelle trinnene presenteres i figur 1. Som nevnt i protokollen, musene er anesthetized, og deres første søvnapnéskinne molar på den ene siden er boret til massen eksponering, mens kontralateral tannen er igjen som en kontroll. Neste, tennene er igjen å bli forurenset av oral flora for 42 dager, der de overvåkes og motta smertestillende medikamenter. Etter 42 dager, mus er euthanized, og tennene og tilstøtende kjeven er tatt for analyse.
Figur 2 demonstrerer kliniske bilder av musen kjeven etter første høyre molar masse eksponering. I figur 2a vises hele kjeven, mens innfelt i figur 2b viser en forstørrelse av den behandlede første høyre molar. Den venstre første molar brukes som en kontroll. Eksponering av både mesial og de kan bli sett i figur 2bog inngangen til kanalene. Merk at tannen ble mekanisk senket til sub-okklusjon for å redusere smerte.
Etter Dental Pulp eksponering for oral flora, er Dental cellulose til slutt forurenset6,7 og blir nekrotisk. Ifølge litteraturen22, gram negative bakterier deretter skiller LIPOPOLYSAKKARID (LPS) til apikale regionen av tannen. Gjennom en kompleks reaksjon av immunsystemet, er et av resultatene bein resorpsjon i periapical regionen, som er kjennemerket på apikale periodontitt23. Dette benet resorpsjon kan identifiseres og kvantifisert av Micro-CT. I mikro-CT-bilder, radiolucent periapical regioner indikerer områder hvor hard bein vevet ble en myk periapical lesjon på grunn av inflammatorisk prosess. I Figur 3viser representative Micro-CT-bilder en behandlet tann sammenlignet med en kontroll. Pilen i figur 3aIII peker på mesial masse eksponering (den Fjern massen eksponeringen ikke vises på denne skive av prøven), og mesial og fjern periapical radiolucent områder av bein resorpsjon er omgitt av en stiplet linje. En boxplot grafen vist her kvantifiserer den betydelige periapical bein resorpsjon i de behandlede tennene i forhold til kontrollene.
Mens Micro-CT er en utmerket teknikk for evaluering av de 3-dimensjonale størrelsen på lesjoner, er det mangler informasjon om deres biologiske sammensetning. Histologiske farging, som presentert i Figur 4, gir denne informasjonen. H & E flekker er demonstrert i en kontroll tann i forhold til en behandlet tann. I den behandlede tannen (figur 4b, C, D), dental massen selv presenterer nekrose som kan sees tydelig i H & E flekker (figur 4c), sammenlignet med kontrollen organiserte cellulose vev (figur 4a). I tillegg, og viktigst, i periapical regionen av den behandlede tannen en periapical lesjon, sammensatt av immunceller (nesten kun makrofager og lymfocytter), er visualisere (figur 4d) (i forhold til sunn periodontal LEDDBÅND (PDL) og benvev i den periapical regionen av kontroll tannen). Dette periapical lesjon er den ønskede utfallet av indusert apikale periodontitt teknikk som presenteres her.
På den annen side, figur 5 presenterer en mislykket forurensning som kan oppstå i sjeldne tilfeller (minst 85% av dyrene viser bein resorpsjon i mikro-CT), dvs., en tann som ble utsatt for den muntlige flora for 42 dager, men ikke tilstede Pulp nekrose , og derfor ikke demonstrere bein tap og periapical lesjon i den mikro-CT (figur 5a) og histologiske (figur 5B) analyser.
Figur 1: tids akse for eksperimentell prosess. Skjematisk fremstilling av den timelige progresjon av den eksperimentelle prosedyren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kliniske bilder av musen kjeven etter høyre første molar masse eksponering. (A) mus kjeven, første høyre molar med eksponert tremasse, første venstre molar fungerer som en ubehandlet kontroll. (B) forstørrelse av høyre molar med eksponert papirmasse. Inngangen til kanalene kan du visualisere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Micro-CT analyse. (A) representant Micro-CT skanner (skiver av 6μm) av behandlet (Aiii, AIV) og kontroll (AI, Aii) tenner. Pilen peker på mesial masse eksponering (Fjern masse eksponering er ikke til stede i denne sektoren). Mesial og periapical områder av bein tap ved siden av den behandlede tannen er omringet av stiplede linjer. ALL, AIV-representative bilder av kontur merking. (B) Box-Plot kvantifisere vevet volum (målt ved kontur merket for 11 skiver av hvert utvalg) av kontrollen (oransje, n = 14 dyr) i forhold til de behandlede (blå, n = 15 dyr) prøver. Analysen ble utført ved hjelp av Scanco evalueringsprogramvare for Micro-CT. prøvene ble justert på sagittal akse orientert på en måte som koronale cellulose, rotkanaler og apikale foramen ble sett i samme SKIVE (se protokoll for detaljert informasjon om orientering). Konturene ble merket for 5 skiver på hver side av midt-tann området (alle sammen 11 skiver). Tissue volum for Konturen av hver prøve ble beregnet ved hjelp av programvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: histologiske H &Amp; E representative bilder: (A) histologiske skive av en kontroll tann. (B) histologiske skive behandlet tann, med en alvorlig periapical lesjon presentert. (C) utvidelse av nekrotisk vev. (D) utvidelse av periapical granulom vev P = Pulp, D = dentin, B = Bone, BM = benmarg, PDL = periodontal leddbånd, N = nekrotisk tremasse, G = granulom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: eksempel på mislykket forurensning: (A) Micro-CT representant bilde av en tann med masse eksponering (hvit pil), men ingen signifikant periapical bein tap, korrelert til (B) histologiske H & E representative bilde av samme tann avslørende vitale (ikke nekrotisk) cellulose, og normal apikale vev. P = tremasse, D = dentin, B = bein, BM = benmarg, PDL = periodontal leddbånd. (C) utvidelse av forkalket vev presentert i B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metode er innført her for induksjon av apikale periodontitt i mus. Målet med metoden er å utnytte apikale periodontitt tilstand for å studere mekanismer og konsekvenser av denne inflammatoriske prosessen. Apikale periodontitt ble indusert i 6-8 uke gamle mus, en alder der røttene er fullt utviklet24. For å forårsake apikale periodontitt i denne modellen, er tannen massen av mus søvnapnéskinne jeksler eksponert ved hjelp av en dental Burr. Bakterier fra Oral flora av mus (i SPF forhold) invadere cellulose og rotkanaler av tennene, forårsaker masse nekrose, og sekresjon LPS til apikale vev, som utløser apikale betennelse.
Når du utfører denne prosedyren, ta hensyn til disse følgende kritiske trinn. Riktig posisjonering av dyrene under massen eksponering er avgjørende for suksessen av prosedyren. Et kritisk trinn er riktig eksponering av massen. Utilstrekkelig kanal eksponering kan resultere i en dentin bro formasjon, som kan føre til svikt i prosedyren og manglende evne til å skape AP. Under massen eksponering, oppmerksomhet er nødvendig for å minimere bløtvev skade under cellulose eksponering for å unngå uønskede smerter og betennelser i andre regioner som kan forårsake bivirkninger. Riktig justering av prøvene i mikro-CT analyseprogramvare er avgjørende for å oppnå interpretable resultater. Når du klargjør kjeven vev for histologi, anbefales det å skrelle av bløtvevet rundt benet for å oppnå riktig orientering når du forbereder muggsopp for histologi. Prøvene må oppbevares i vått medium under hele prosessen (fra høsting scenen, gjennom Micro-CT, til histologiske blokk prosedyre). Når du skjærer vevet i en mikrotomen, bør vinkelen på prøven være fast for å oppnå sagittal skiver av tannen. Det er også viktig å ta hensyn til etiske spørsmål om velferden til dyrene. For eksempel er riktig anestesi kritisk under prosedyren (både systemisk og lokal, se25,26). Smerte medisinering er viktig, spesielt for de første dagene etter inngrepet, og overvåking vekt og atferd, samt en forsyne dyrene med myk mat bør gjennomføres. Fra tidligere erfaring, den generelle reaksjonen av mus er å tolerere godt prosedyren, og de ikke viser ekstrem nød.
En svikt i metoden er vurdert i tilfeller der en apikale betennelse ikke klarte å danne: det er ingen bevis for bein resorpsjon i periapical regionen av tannen på mikro-CT-skanning, og PDL vev av tannen er intakt i histologiske farging (som presentert i figur 5). De mulige årsakene til ikke å oppnå betennelse inkluderer Stokastisk forskjeller i oppførselen til dyrene, samt den spesifikke eksponeringen av hvert dyr til bakterier. Til tross for god resultater er utrette inne forårsaker apikale periodontitt av benytter denne metoden (det vil si 85% av dyrene viser Ben resorpsjon), følg etter protokollen undersøke saken grundig å nedskrive alle variasjon imellom prøvene. Hvis noen mus viser tegn til nød under oppfølgingsperioden, bør du vurdere å fjerne dem fra eksperimentet for å unngå lidelse. Beslutningen om å gjøre det kan bli hjulpet ved å se på tap eller gevinst på vekten av dyrene i oppfølgingsperioden. Dyr som mister mye vekt lide og bør fjernes. Vi har også observert at dyrene lider mest er de som startet eksperimentet på en lav vekt eller dårlig helsetilstand. Overall, prosedyren, hvis det utføres riktig, bør gi konsistente resultater.
Flere begrensninger av denne teknikken er å bli notert. Det er viktig å merke seg at denne modellen ble utviklet for å studere apikale periodontitt forårsaket av bakteriell forurensning og ikke etterligne flere andre mulige mekanismer som apikale periodontitt kan oppstå, slik som traumatisk skade og autoinflammatoriske sykdom. Videre finnes det betydelige forskjeller mellom denne modellen og den kliniske situasjonen hos mennesker. Hos mus har spontane periapical lesjoner ikke blitt beskrevet, og dette er helt en kunstig situasjon. Anatomien til gnager tennene skiller seg også fra menneskets; betydningen av disse forskjellene er ukjent. Likevel er musen en svært nyttig modell for å forstå grunnleggende mekanismer og fenomener. Videre har en rotfyllinger helbredende modell i en mus (ved å behandle med en rotfyllinger) ikke er rapportert så langt, men potensielt har høy betydning i dette forskningsfeltet bør det vise seg å være gjennomførbart. En metode for masse capping er rapportert for mus, som viser et stort potensial27. En rotfyllinger healing-modellen har faktisk nylig blitt utviklet i rotter, en modell dyr ofte brukt i endodontic forskning28. Metoden rapportert her kan tjene som en foreløpig prosedyre for å utvikle denne roten kanalen helbredende modell.
Bruke en in vivo-metoden er avgjørende for studiet av en slik kompleks immunreaksjon, og en musemodell, selv om klinisk utfordrende på grunn av den lille størrelsen på dyret, har mange fordeler: det er kostnadseffektivt, innebærer lett tilgjengelige anlegg, og et sett av tilgjengelige genetiske og molekylære verktøy (som tilgjengelige knock-outs, CRISPR biblioteker og en rekke genomisk data). Denne modellen egner seg best for endodontic forskning, da den induserer klinisk presentasjon av AP i sterile laboratorieforhold, med minimale variasjoner (i motsetning til kliniske studier). Videre har denne modellen også fordeler i andre forskningsfelt, for eksempel kronisk betennelse, på grunn av evnen til å forårsake en kronisk, men lokal betennelse med minimal systemisk involvering, og bruk av kontralateral IDen av samme dyret som en kontroll.
Dette arbeidet rapporterer bruk av mikro-CT og histologi for analyse av lesjon. Potensielt kan andre typer analyser brukes i denne modellen som ikke ble utført her, slik som å isolere DNA og teste DNA-metylering på forskjellige gener i inflammatoriske celler; isolere RNA og utføre RNA-SEQ for å se mønsteret av genuttrykk i forskjellige immunceller eller forskjellige typer mus; eller isolere celler og karakteriserer dem ved FACS20,21,29. Kollektivt er det et stort potensial i modellen rapportert her, som forhåpentligvis vil bli tilrettelagt av denne rapporterte protokollen og demonstrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Vi vil gjerne erkjenne Dr. Oded Heyman for hans hjelp med dyr posisjonering, Raphael Lieber for hjelp med Micro-CT analyse, og Prof Andiara de Rossi Daldegan for råd om preforming eksperimentet. Vi vil også gjerne erkjenne Dr. Sidney Cohen for kritisk lesing og redigering.
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Dr. Izador I. Cabakoff Research legat fondet til MK og IA, og en Yitzhak Navon fellesskap fra Israel Ministry of Science and Technology til EG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
References
- Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
- Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
- Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
- Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
- Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
- Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
- Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
- Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
- Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
- Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
- De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
- Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
- Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
- Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
- Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
- Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
- Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
- Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
- Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
- Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
- Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
- Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
- Metzger, Z. Macrophages in periapical lesions. Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).
- Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
- Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
- Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
- Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
- Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
- AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).
