Summary
这些方案的开发是为了分析皮质晶状体形态, 结构完整性的斑马鱼晶状体缝合在固定和活的镜头, 并测量斑马鱼晶状体核沿前后轴的位置。
Abstract
斑马鱼特别适合于基因操作和体内成像, 使其成为逆向基因研究和体内成像转基因生成的日益流行的模型。这些独特的功能使斑马鱼成为研究眼睛发育和生理的理想平台。我们最近的发现是, Aquaporin-0, Aqp0a, 是需要的前晶状体缝合线的稳定性, 以及随着年龄的年龄将镜头核转移到镜头中心, 这导致我们开发了专门用于分析斑马鱼镜片性能的工具。在这里, 我们概述了详细的方法, 晶状体解剖, 可适用于幼虫和成人镜片, 为他们的组织学分析, 免疫组织化学和成像做准备。我们重点分析了晶状体缝合线的完整性和皮质细胞形态, 并将解剖镜片产生的数据与一种新的转基因斑马鱼系在基因上所能实现的晶状体形态体内成像数据进行了比较编码的荧光标记。通过分析垂直于其光轴的解剖镜片, 可以量化镜片核沿前后轴的相对位置。在成人斑马鱼的正常透镜光学中, 需要将晶状体核从最初的前位置移动到中心。因此, 镜头核位置的定量测量与其光学特性直接相关。
Introduction
斑马鱼是研究晶状体发育和生理的一个很好的模型, 因为它与哺乳动物的镜片有解剖上的相似性, 遗传和药理操作相对容易, 胚胎眼睛发育的速度快, 体积小, 透明度高在早期阶段允许体内成像。本文提出了分析斑马鱼晶状体在胚胎和成虫阶段形态的方法, 重点是结构完整性、体外和体内皮质膜形态以及晶状体核位置沿胚胎和成人阶段的位置。前、后轴. 这些方法作为研究晶状体发育和生理功能的起点, 以及斑马鱼晶状体表型的反向基因屏幕。
斑马鱼晶状体形态的影像学
Aquaporin 0 (AQP0) 是最丰富的晶状体膜蛋白, 由于哺乳动物的多种基本功能, 对晶状体的发育和清晰度都至关重要。斑马鱼有两个 A斯洛0 (Aqp0a 和 Aqp0a), 我们已经开发出方法来分析他们的功能在胚胎和成人镜片中的丧失。我们的研究表明, 由于前缝合不稳定, a qp0a/突变体出现前极性不透明度,而 aqp0a/双突变体发展为核不透明度1。Aqp0 已被证明在水运2、粘附3、4、细胞骨架锚固5和折射率梯度 6的生成中发挥着重要作用, 但这些研究主要是在体外。斑马鱼提供了一个独特的机会, 研究如何失去功能, 或不安的功能, Aqp0a 或 Aqp0b 将如何影响形态和功能在一个活的镜头。为了评估晶状体细胞的形态和发育过程中的完整性, 我们对现有的体外免疫组化方法7进行了改进, 用于胚胎和成人晶状体, 并生成了转基因技术来监测这一过程在体内的情况.
对整个固定胚胎和成人镜片进行了质膜结构和结构完整性的免疫组化分析。与哺乳动物相比, 斑马鱼镜片非常小 (胚胎镜片直径约为 100μm, 成人镜片直径高达1毫米), 并有点缝合 8, 这在冷冻中很少被捕获。因此, 整个镜头对于分析结构完整性是必不可少的。对于前缝合形成的体内分析, 以及精确晶状体细胞结构的成像, 我们生成了表达苹果特异性标记晶状体膜的转基因。
晶状体膜转基因实时成像的优点包括: 1) 避免固定伪影, 2) 研究延时电影的动态形态变化, 3) 使早期事件与后期事件相关的纵向研究表。虹膜的色素沉着通常会阻止晶状体外围的清晰成像。在原始数-5 (prim-5) 阶段9之前添加1苯基 2-硫脲 (PTU) 可防止黑色素生成和眼睛色素沉着, 时间约为受精 (dpf)。然而, 4 dpf 后, 晶状体周围在体内被遮挡, 特别是在较老的阶段。此外, 镜头本身的密度掩盖了它的后极的成像。因此, 要研究晶状体周围或后部缝合的形态, 需要切除和固定 4 dpf 后的晶状体。
转基因斑马鱼系已被用于体内胚胎晶状体膜结构的分析10.Q01转基因表达了在ef1 α启动子和 df4 pax6 增强剂元素的 Hexamer 驱动下, 融合到膜靶向序列 gap 的青色荧光蛋白, 在晶状体纤维细胞 11中普遍存在。Q01确实有超镜表达, 包括视网膜中的阿玛可拉细胞, 如果主要兴趣是晶状体, 这将增加背景信号。我们开发了一种新的转基因线, 它在镜头中特别表达膜系带的 mApple, 目的是避免任何超透镜信号。
镜头核定位
我们发现, 晶状体核从幼虫斑马鱼的初始前部位置移动到成人晶状体前后轴的中心位置。高折射率透镜核位置的这种变化被认为是斑马鱼透镜光学1正常发展的要求.我们的方法允许量化镜头核集中相对于镜头半径。利用该方法, 我们证明了 Aqp0a 是透镜核集中1所必需的, 该方法可应用于其他研究的发展和生理学的镜头及其光学性质的斑马鱼模型。
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Protocol
本研究中使用的动物规程符合 ARVO 关于在眼科和视力研究中使用动物的声明, 并已获得加州大学欧文分校动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。
1. 斑马鱼畜牧业和安乐死
- 在标准实验室条件下饲养和维护斑马鱼 (AB 菌株)12。在胚胎培养基 (EM) 中培养胚胎 (EM)12。在受精后 20-24小时 (原发5期之前) 向 EM 添加0.003% 的 PTU, 以防止胚胎12中用于胚胎阶段9成像的色素形成。在活轮虫的饮食中饲养6-30 的幼虫, 直到 14 dpf, 并在 14 dpf 12 后饲养活的青蒿素.
注意事项:PTU 是非常有毒的 -
麻醉鱼使用毛滴虫, 直到无反应接触。
- 在100毫升的 ddh2o 中, 将400毫克的 3-氨基苯并虫类动物与 2.1 mL 的 1 Mtis (pH 9) 结合, 制备旋毛虫,调整为 ph 7.0, 并储存在-20°c。
注意事项:崔卡因是有毒的 - 在100毫升的水箱水中稀释4.2 毫升的毛滴虫, 麻醉幼虫或 em 麻醉胚胎 (最终浓度为 0.0165% wv)。
- 在100毫升的 ddh2o 中, 将400毫克的 3-氨基苯并虫类动物与 2.1 mL 的 1 Mtis (pH 9) 结合, 制备旋毛虫,调整为 ph 7.0, 并储存在-20°c。
2. 胚胎和幼虫的固定
请注意:免疫组织化学规程是根据以前出版的材料7改编的。
- 在摇椅上的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中, 将经过分离的胚胎或幼虫在受精后2周内, 在额定盐 (PBS) 中隔夜固定。
注意事项:PFA 是可燃的, 具有致癌性。 - 在 PBS 中清洗胚胎三次 10分钟, 并在4°C 下使用10% 的 Triton 和 1% DMSO (PBS-T) 在 PBS 中渗透。
注意事项:DMSO 有毒, 因摄入或皮肤吸收而有害, 通过皮肤携带有害物质, 可燃。Triton 具有毒性、腐蚀性, 对水生环境有害。
3. 幼虫和成年斑马鱼镜片的解剖
- 将鱼类从 6 dpf 幼虫到成年, 直到对接触没有反应, 但仍表现出强烈的心跳。测量鱼的标准长度, 根据先令 (2002年) 的分期13。
-
立即使用微解剖剪刀切除眼睛, 并放置在 PBS 中的解剖盘 (图 2显示的成人眼睛)。
- 制作一个定制的35毫米的盘充满硅胶的镜头解剖。一旦硅胶设置, 切除约2-3 毫米直径和0.5 毫米深的 ditod 固定成人眼镜片在解剖过程中。
-
成年斑马鱼镜片的解剖
- 把一个成人的眼睛到盘子 divot 后侧充满了 PBS。通过视盘以 lt;45 角度插入钳子固定眼睛。注意不要划伤或压缩镜头。用解剖剪刀从视盘到睫毛区, 通过视网膜和微囊进行两到三个径向切口。
- 剥去视网膜和阴囊像花瓣一样, 倒过来的眼睛, 角膜侧向上。通过用剪刀的扁平侧间接地固定镜片和角膜, 同时用钳子拉走视网膜和连接的组织。小心地修剪晶状体中多余的组织。
请注意:仔细解剖是至关重要的, 以获得一贯健康的镜片。
-
幼虫斑马鱼镜片的解剖
- 将幼虫的眼睛后侧向上放置在充满 PBS 的硅胶盘的平坦部分上 , 并使用锐化的钨针在视网膜和进行径向切割 , 同时用另一个钨针或钳子固定眼睛。
请注意:注意不要损坏镜头。- 通过将导线尖端悬挂成 10% (w/v) NaOH 并应用低压交流电流 14, 电解地锐尖为 0.1 mm 钨丝2厘米长的尖端.使用本森燃烧器将玻璃端熔化, 将针头固定在巴斯德移液器中。
请注意:还可以使用其他精细解剖工具。
注意事项:NaOH 具有腐蚀性。
- 通过将导线尖端悬挂成 10% (w/v) NaOH 并应用低压交流电流 14, 电解地锐尖为 0.1 mm 钨丝2厘米长的尖端.使用本森燃烧器将玻璃端熔化, 将针头固定在巴斯德移液器中。
- 用针头的钝侧轻轻挖出离解的眼睛的镜片, 并小心地拔掉附着的组织。
- 将幼虫的眼睛后侧向上放置在充满 PBS 的硅胶盘的平坦部分上 , 并使用锐化的钨针在视网膜和进行径向切割 , 同时用另一个钨针或钳子固定眼睛。
4. 解剖镜片的固定
- 立即将在 PBS 中的 1.5% (v/v) 中解剖的镜片固定在室温下24小时。在 PBS 中清洗镜片三次, 每次10分钟。
- 用于整个安装分析的渗透镜片或用于冷冻培养的低温保护 (见第8节)。
- 在4°c 下, 在 PBS-T 中对镜片进行夜间渗透。
5. 镜片免疫组织化学
- 在4°C 过夜的 PBS-T 隔夜培养固定胚胎幼虫或成人镜片, 在 phaliidin-alesa flor 546 ( 1: 200) 和细胞核中贴上固定胚胎幼虫或成人镜片的标签 (dapi 中的 1:100000来)。
注意事项:DAPI 是一种皮肤和眼睛刺激物。 - 用 PBS-T 清洗三次, 每次10分钟。在 PBS-T (v2) 中, 通过孵育30%、50% 和70% 的甘油清除组织, 每次至少 1小时, 或在4°c 下过夜。
- 将70% 的鱼装在 PBS-T (v2) 中的玻璃底部35毫米微井盘上, 眼睛尽可能平、直地防止盖板。对于较年轻的鱼, 轻微的前侧倾斜可能有助于定向镜片缝合线平行于覆盖。
6. 利用体内转基因线分析斑马鱼前透镜缝合线
- 使用 Tol2套件15生成 Tg (βb1we:mapplecaax)线。Tol2 转位可控元件系统15可稳定地集成结构, 其中 mapple由人类βb1晶体启动子16的 300 BP 驱动, 由 caax 序列连接到膜上, 从而产生表达特别是在透镜光纤细胞膜。
请注意:此构造 (ID:122451) 可供购买。- 在注射的早晨, 准备注射混合物, 并保持在冰上。要达到含有无 rnase 和 dnase 的 h2o 的最终体积为10μl, 添加: 1.5 μl的 Hu Βb1哭: mapplcaax dna 构建在 50ngμμl-[0.375-0.375 pg! 最终注射], 1.5Μl 的 Tol2 转座酶 mrna 在 300Ngμμμl (tol2 kit)15 [15-30 pg/final最后注射], 和1μl 的苯酚红指示剂在 1% w/v [1x10-5% (w/v)/最终注射].
- 将50-100 毫升的注射混合物注入1细胞阶段胚胎12。
- 用 mApple 阳性镜片测量 3 dpf 胚胎的频率, 测量 F0 注射胚胎的转化效率。
请注意:使用该方法有望 gt;80% 的转化效率。F0 马赛克可以详细分析单个细胞的膜形态。不同水平的马赛克允许一个人成像单个或小的细胞群的形态, 而更多的全局透镜表达允许分析多细胞结构, 如镜头缝合在体内。 - 通过 f0 马赛克鱼产生稳定的线, 标记所有的纤维细胞膜。F0 创始人将转基因整合到胚系中, 产生具有稳定整合的后代, 这些后代可以作为转基因系加以维持。
7. 利用体内转基因线分析斑马鱼前透镜缝合线
- 麻醉 3 dpf 或成人马赛克或稳定的转基因鱼, 并安装在1% 低熔体琼脂 (LMA) 与滴虫与眼睛平对玻璃底部微井菜的盖滑。
- 在100毫升的 EM (不含亚甲蓝) 中溶解1克 LMA, 使 1% LMA。长期存放在4°C 的15毫升库存。微波溶解库存, 储存在 42°c, 直到使用每个管。
- 当 LMA 设置时, 用 EM 覆盖 6 dpf 与替拉明, 或与坦克水与毛滴安为成人。
- 如果成像 PTU 处理过的鱼类, 将5毫升的 EM 与250Μl 的三胺和7μl 的 PTU 混合, 不含亚甲蓝或水箱水。
8. 镜头冷冻和免疫组织化学
- 冷冻保护固定胚胎或成人镜片, 在 PBS (w/v) 中放入10% 的蔗糖, 在 RT (或4°c 过夜) 中放置20% 的蔗糖, 在4°C 时放置30% 的蔗糖, 隔夜为1小时。
- 将组织嵌入 OCT 基模中, 然后用 OCT 冷冻夹头, 在12-14μm 的情况下冷冻夹头, 收集到超级镜下的显微镜下的滑块上。在预热至 ~ 35°c 的滑梯上, 将温暖的部分放在滑梯上10分钟。
- 用 PBS 清洗一段三次, 每次10分钟。标签部分与 Phaloidin-alxa 面粉 546 (1:200) 与 DAPI (1:1000) 或 Wga-alqa 面粉 546 (1:200), 其次是三个 PBS 洗涤。安装防褪色安装介质, 用指甲油密封盖板。
9. 成像
- 使用共聚焦显微镜获取图像。在从前晶状体杆的特定区域, 使用 60x nc1 1.2 水浸目标或类似的目标获取 z 堆栈或光学切片。使用以下采集设置: 1.2 通风光盘使用 561 nm 激光, 德州红色滤光片用于 Phloidin-alsesacol 面粉561或 mApple, 或405激光与 UV 滤光片的 dapi。
- 校正 z 强度激光功率, 以深度抵消镜头中的信号丢失。这允许在固定和活 3 dpf 胚胎的后极有一个强信号, 在成熟的鱼镜片中的赤道光学切片中允许有强烈的信号。
- 使用图像处理软件编译和查看图像。
10. 前后轴镜头核定位的测量
- 在 PBS 中, 用一个35毫米的盘子, 用一个覆盖玻璃底部, 用与焦点平面平行的电线杆和缝合线, 将新鲜的切割镜片轴向定向。寻找折射率的差异, 这通常发生在晶状体皮层和晶状体核的界面, 以识别晶状体核。
请注意:健康的野生成人镜片是极其透明的, 因此很难看到镜片缝合线和细胞核, 也很难确定镜片的方向。在这种情况下, 一个轻微的凹痕与钳子到镜头胶囊会造成轻微的损害, 这使得缝合线和晶状体核在大约10分钟内显现出来, 帮助定位这个测量的镜头。但是, 由于镜头现在已损坏, 因此无法用于下游应用。 - 使用带有相机的解剖显微镜, 在明亮的现场照明下拍摄镜头核在明亮的现场照明下聚焦的镜头图像, 无论是否有 DIC 光学。在相同的放大倍率下成像千分尺进行校准。
- 点击实时视图按钮, 调整曝光设置以可视化镜头核和镜头外围, 并通过单击捕捉按钮拍摄图像。另存为 tif 文件。
- 使用图像处理软件校准采集到的镜头图像。选择直线工具, 并在千分尺图像上绘制一条已知长度的线, 单击 "分析"设置比例。输入已知距离、单位并选择 "全局" 校准, 然后单击 "确定"。
- 测量透镜核中心与前极 (a-r) 的距离。
- 在图像处理软件中使用直线工具, 以轴向的方式绘制一条穿过镜头核成像中心的线。以这条线的中心为镜头核的中心。
- 从这一点到镜头的前极绘制另一条线, 并在 "分析" 菜单中选择 "测量" 来测量距离 (a-r), 其中a是镜头的半径, r 是从镜头中心到中心的距离。核。
- 从前极绘制另一条线, 并测量此距离为镜头直径 (2a)。从 "结果" 窗口复制这些长度, 并传输到电子表格或统计程序。
请注意:从原子核的中心到前极的测量比从透镜核的中心测量到透镜的中心更容易。这种测量是通过步进10.3.5 的公式转换的, 以报告镜头核中心与透镜中心的距离。始终使用成体细胞核进行测量, 即使胚胎核是明显的。 - 将直径除以 2, 以计算透镜半径, a。
- 计算r/a
, 如, 这是镜头核相对于镜头半径的归一化定位。
注: 对于放置在靠近前极的原子核, r/a将是 & gt;0.0, 而中央局部核的r/a将为0.0。
- 将归一化轴核测量测井作为标准长度的函数, 确定斑马鱼发育过程中晶状体核定位的变化。
, 如, 这是镜头核相对于镜头半径的归一化定位。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
成年斑马鱼眼的解剖结构与哺乳动物的解剖结构非常相似 (图 1a)。尽管斑马鱼和哺乳动物的眼睛之间有一些差异, 如有一个睫毛区而不是一个睫毛体17, 光学特性的差异 18, 和形态发生的差异, 在胚胎发育 19,斑马鱼眼是研究眼睛发育和了解眼科疾病20,21,22的一个很好的模型。一个简单的上皮线的前极的镜头, 这在赤道经历了一个终身的过程增殖, 伸长, 并分化为纤维细胞, 构成了镜头的大部分。成熟的纤维细胞 (图 1b, 浅蓝色) 首先在胚胎中分化, 缺乏细胞器, 永远不会被替换。分化的纤维细胞尖端在极点相遇, 形成前、后缝合线。这些细胞然后由新分化的纤维细胞内化。像所有脊椎动物镜片, 斑马鱼晶状体因此有一个发展的梯度与最古老的细胞位于晶状体核的中心。斑马鱼晶状体胎盘在受精后16小时形成, 在 18 hpf 伸长形成原生透镜纤维, 次生纤维在 28-36 hpf 形成过渡区。后缝合线在 48 hpf 可见, 这是在前缝合变得可见10之前。
常规镜头结构的精确开发和维护对其光学特性至关重要。在这里, 我们描述了分析斑马鱼晶状体细胞形态的方法在体外和体内, 包括优点和局限性, 我们开发来分析表型的损失, 由于失去功能突变的两个斑马鱼 aap0,Akp0a 和 Akp0b1。为了评估成人晶状体的体外形态, 对晶状体进行了解剖 (图 2), 并立即进行了修复。胚胎评估在整个固定胚胎中进行 (图 3), 并与活转基因胚胎 (图 4) 进行比较。将解剖和固定成人镜片 (图 5) 与转基因成人镜片进行了比较 (图 6)。总结了使用这些方法检测和可视化镜头特定部分的差异 (表 1)。
与小麦胚芽凝集素 (WGA) 相比, 在斑马鱼的晶状体纤维细胞膜贴标方面, 丁叶素具有优越的优势。WGA 是一种与 n-乙酰-d-葡萄糖胺和唾液酸结合的凝集素, 与氟蛋白结合的 WGA 通常用于标记人23、牛24、卵巢25、小鼠26、大鼠27和斑马鱼28,29。在这里, 我们在整个斑马鱼镜片上使用 phalloidin (图 3,图 5)。
胚胎和幼虫斑马鱼幼虫高达 7 dpf 是小的, 具有足够的渗透性, 足以允许脂肪素渗透到晶状体外皮层。由 3 dpf 透镜核是紧凑的, 没有细胞器, 前极点的前缝合线形成 (图 3a,b), 和 phalloidin 被排除在透镜核在赤道光学平面 (图 3A,d)。由于纤维细胞膜的高压实度, 可能会将纤成核排除在外, 这与以前的研究一致 28。然而, 外皮是非常详细地可视化与此染色 (图 3c-f)。在横截面上, 纤维细胞呈扁平的六角形, 具有较宽的侧面和较短的窄边。Phalloidin 强烈标记狭窄和宽纤维细胞膜 (图 3-f), 突出了广泛两侧皮质纤维细胞的压实。该组织在aqp0a b 双突变体中基本不受影响 (图 3b、 d、 f和h)。
转基因的马赛克表达 (mApple 由 CAAX 主题由人类βB1 晶体启动子的 300 bp 启动子区域驱动的 caax 主题连接在一起) 强烈表达在从 2 dpf 开始的镜片中。转基因被随机整合到基因组中, 导致苹果的异质表达。我们展示了一个 3 dpf 透镜的例子, 它在皮层中有很强的表达 (图 4), 在细胞核的某些部分有很强的表达 (图 4d)。膜标记不受像方定一样的渗透性的限制, 因此它给晶状体核贴上标签。仅在一小部分细胞中表达的 DNA 注射所产生的马赛克 (图 4) 对于分析单个细胞形态与稳定的细胞相比是有用的, 稳定的线条标记着表达βB1 结晶的每个细胞 (图 6)。在Tg (βb1mole:mapplecaax)马赛克中, 在前极拍摄的 z 投影中可以看到前缝合线的形态 (图 4a,b)。请注意, 细胞膜的形态不同于贴有 phalloidin 标记的固定镜片 (图 3a,b), 以及在广泛细胞膜中存在子域 (图 4a' 白色箭头) (图 4a ' 白色箭头), 这些子透镜以前是在其他镜片中识别的。30种是可见的。然而, 狭窄纤维细胞膜的标记较弱, 导致无法看到在贴有 phalloidin 标签的固定镜片中看到的前缝合处的细胞惊人的收敛性 (图 4a, b 箭头) (图 3 a,b箭头)。
有趣的是, 在镜头赤道采集的光学切片也显示出不同的标记模式, 与 WT 相比, aqp0a/b 双突变体中的细胞体积明显中断 (图 4c-f).这很可能是因为转基因标签广泛的纤维细胞膜比 phalloidin 更有效。我们能够通过后极获得 z 投影, 通过 z 校正来分析后缝合线的完整性, 从而增加激光的力量和深度进入组织。对完整鱼类的后缝合线 (图 4G,h) 进行清晰分析, 仅限于前 5 dpf, 之后晶状体密度过高, 导致晶状体后部信号丢失。
修正了贴有 phalloidin 标签的解剖成人镜片, 在纤维细胞行的高度有序结构中揭示了惊人的细节, 这些结构收敛形成了前缝线 (图 5a, 箭头) 和皮层形态 (图 5c-h),由于非常强的标记狭窄的纤维细胞膜由 phalloidin。前极的最大 z 投影显示, 与 WT (图 5B, 箭头) 相比, aqp0a· b 双突变镜片中的前缝合紧密的前缝合失去了损失 (图 5B, 箭头), wt 在光学中表现为膜和细胞核的质量从前极30微米的切片 (图 5D)。在较深的光学切片中, 从较深的晶状体皮层和细胞核中排除了帕洛伊丁标记 (图 5e,f)。在aqp0a/b 双突变镜片中缺乏紧密的前缝合, 使镜片无法完全垂直于成像平面, 这在一定程度上影响了外皮层纤维细胞行的整体组织 (图 5f)) 与 WT 镜头相比 (图 5e)。然而, 在赤道平面上拍摄的光纤细胞行的高功率图像显示, 在外皮层的细胞仍然形成有序的行, 可见的是强窄的纤维细胞标记 (图 5G,h)。由于单个纤维细胞膜的紧密压实和微弱信号的组合, 无法识别出它们的宽膜。由于这些镜片被解剖, 他们可以安装后侧面对目标, 允许 z 预测的后缝合线, 这表明没有显示出基因型之间的差异, 因为后纤维细胞提示形成紧密缝合 (图5I,j箭头)。
活麻醉成人稳定Tg (Βb1lew:maappcaax) 鱼镜片的 z-投影揭示了前皮层的皮质膜形态 (图 6a,a '), 以及前极的细胞收敛程度 (图 6B)。与固定解剖镜片相比, 用垂直于成像平面的镜片缝合线安装鱼更为困难。携带转基因的稳定线在晶状体核中表达了 mApple (图 6C,d)。赤道处的光学切片显示出强烈的信号, 表明当成像时, 细胞核会广泛压实, 与前皮层的激光功率相同 (图 6C)。有趣的是, 与胚胎不同, 成人不明显的外皮层细胞分辨率。这可能是由于虹膜阻塞了来自镜头外围的清晰信号。在成像之前, 通过瞳孔的扩张, 可能会获得更强的透镜皮质信号。在激光功率降低的情况下, 可以区分晶状体核中的某些细胞层 (图 6D)。成虫斑马鱼晶状体密度很高, 不可能在体内从后极获得信号。
我们已经证明, 斑马鱼晶状体核在光轴上的运动从幼虫晶状体的初始前位置到成人1的中心位置。这些运动在轴向透镜部分突出显示, 因为 phalloidin 和 WGA 被排除在晶状体核之外 (图 7a-c)。我们已经证明, Aqp0a 是这个集中化过程1所必需的, 但这种机制很可能会受到其他蛋白质的影响。通过在 DIC 照明下将解剖的整个透镜置于轴向方向和成像, 测量了透镜核中心相对于其前后轴位置的位置的定位, 从而突出了在折射率 (图 7e)。缝合线通常与周围的皮层有不同的折射率, 因此可以作为定向的指南。幼小幼虫镜片有更明显的缝合线 (在非常年轻的镜片后缝合线), 和晶状体核, 有不同的折射率, 明显不对称, 使其更容易定位在这些阶段的镜片。镜头核中心与透镜 (r) 中心的相对距离归一化为透镜半径 (a)。然后绘制与斑马鱼发育有关的图表, 对斑马鱼的发展使用标准长度测量 13。在 WT 中, 晶状体核开始时更接近前晶状体杆
, 然后在成年后
集中 (图 7f)。
图 1: 斑马鱼成眼和镜片图.前部被认为是光线进入眼睛的地方, 在斑马鱼中实际上是侧向的。(A) 斑马鱼晶状体与角膜聚焦光一起照射到视网膜上。在水生动物中, 角膜在光折射中作用不大, 但相反, 晶状体的折射率较高。晶状体分离的前房充满了水幽默和后房充满了玻璃体幽默。(B) 斑马鱼镜片比哺乳动物镜片更有球形。纤维细胞尖在点或脐带线8在前极和后极。晶状体皮层中分化的纤维细胞具有细胞核和细胞器, 而晶状体核 (浅蓝色) 中成熟的纤维细胞则没有细胞器和细胞核。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 斑马鱼镜片解剖.(A) 眼睛从麻醉鱼解剖, 后侧向上放置 (b)。(C) 眼睛通过视盘 (od) 被双人固定, 从视盘到区域的视网膜和小环中进行两到三个径向切口。(D) 将挡板折叠出来, 露出镜头。(E) 将眼睛旋转至面角膜, 通过角膜间接固定镜片, 并拉出硬皮视网膜。(F) 从晶状体中修剪剩余的视网膜和睫毛区。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 胚胎晶状体形态的体外.用法洛伊丁 (红色) 标记的固定和渗透胚胎和带有 DAPI (蓝色) 的细胞核显示了两极的膜形态和缝合完整性。Z-投影显示, WT 和aqp0b 双突变镜片表现出非常规则的纤维细胞排列, 在 3 dpf (a, b)处非常紧密的前缝合 (箭头) 相遇。在赤道采集的光学切片显示, 在两个基因型 (c-f) 的外皮层中, 有一排排的六角形纤维细胞。纤维细胞膜的窄边和宽边都贴有如 (E) 所示的标签。在两个基因型 (g, h) 中, 后缝合 (箭头) 都形成和紧密。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 胚胎晶状体形态在体内.麻醉后的 3 dpf 马赛克 F0 注射Tg (Βb1le:ma第12·)镜片的实时成像显示了 z 投影 (a, b)中的前缝合线 (箭头)。(a ')膜子域在宽纤维细胞膜中明显为点状 (白色箭头)。狭窄的纤维细胞膜也是显而易见的 (黑色箭头)。WT 镜片显示紧密包装的晶状体皮质纤维细胞 (c, e), 与破坏的皮层的 aqp0ab 双突变体-与明显肿胀的细胞 (d, f)。聚焦于后 (g, h) 缝合线 (箭头) 显示基因型 (g, h) 之间没有区别。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 成人晶状体形态的体外.从超过23毫米标准长度的鱼的切除、固定和渗透镜片中, 用 phalloidin (红色) 和 DAPI (蓝色) 标记。前极的 150μm z 投影显示出严格的纤维细胞尖端排列, 在 WT (a) 中紧密缝合 (箭头) 处收敛, 但不是具有大量膜和原子核 (b)的双突变体 (箭头)。从前极提取的42μm 的光学片显示, 在 WT (C) 的中心有秩序的细胞聚集, 但在突变镜片 (d) 中缝合的细胞核质量。光学切片穿过镜头的赤道, 在130微米的前极揭示紧密包装的成排纤维细胞在 WT (e,g) 和突变体 (f, h)。后缝合 (箭头) 在两个基因型中都形成和紧密 (i, j)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6成人晶状体形态在体内.麻醉成人稳定Tg (βb1le:mapplecaax) wt 镜片的实时成像。前皮层的 z-投影揭示皮质形态 (a, a ')和前缝合 (箭头), 细胞收敛到单个光学片 (b,箭头) 中的一个点。与形成透镜核 (d) 的更强信号相比, 皮层可以通过赤道 (c) 在光学切片中以更高的激光功率进行可视化。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7:斑马鱼晶状体核集中化.固定和低温保护的胚胎 (a) 和镜片 (b, c)被轴向冷冻切片, 并贴上 phaliidi-546 ( a、b中的红色)、dapi (a 中的蓝色、b) 或 wga-594 (c 中的红色)。晶状体核没有细胞核, 与集中放置在成人镜片 (c) 中相比, 更接近前 (a) 3 dpf (a) 和1个月大的晶状体 (b).从一个1.1 毫米标准长度的1个月大斑马鱼的解剖镜片分别定向 (d) 或轴向 (e)。利用以下策略计算了透镜核在轴上的相对位置: (e) 将透镜核 (白色虚线) 的中心 (*) 距离测量到前极, 因为这比测量到镜头中心的距离 (r) (加)。这被归一化为透镜半径 (a), 它被初步测量为轴向 (安. pos.) 透镜直径。以标准长度 (F) 测量了归一化轴核定位的测井, 将其作为斑马鱼发育的函数。请点击这里查看此图的较大版本.
| 特征 | IHC 胚胎 | Tg胚胎 | 整体 IHC 成人镜头 | Tg成人 |
| 住 | N | Y | N | Y |
| 前缝合 | Y | 有点 | Y | 有点 |
| 后缝合 | Y | Y | Y | N |
| 皮质细胞细节 | 有点 | Y | Y | 前部有些 |
| 镜头核细节 | N | Y (稳定) | N | Y (稳定) |
| 二级标签 | Y-抗体 | 仅与 Tg 一起生活 | Y-抗体 | 仅与 Tg 一起生活 |
| 宽带: 窄纤维标签 | 两者都有 | 广泛 | 大部分是窄的 | 广泛 |
表 1: 斑马鱼晶状体形态分析的体内与体外比较综述.Y = 是, N = 否
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Discussion
斑马鱼晶状体形态分析是了解突变体表型或旨在研究晶状体生物学的药理干预作用的第一步。我们概述了分析晶状体缝合线, 皮质纤维细胞形态和镜头核的各个方面的方法。这些方法是体外和体内的结合 (与表1 相比)。体外方法允许更详细的外皮质细胞形态, 以及进入成人镜片的后缝合线。
使用转基因标记可以进行体内分析。我们在这里介绍的转基因是晶状体膜特异性, 与现有的 Q01斑马鱼系相比, 该线在标记晶状体膜的同时也标记了眼睛中的其他细胞类型, 包括 amacrine 细胞, 使解释复杂化11.体内信号受胚胎发生第二天形成的眼睛色素上皮的限制, 因此胚胎需要在这一阶段和随后的阶段进行 ptu 治疗进行分析。在成人中, 虹膜掩盖了对晶状体皮层的清晰分析, 但允许对前晶状体皮层进行体内分析。鱼类镜片的实时成像允许对同一动物的晶状体形态进行纵向研究。这可以是一个非常有用的工具, 用于研究对动态过程的影响, 如细胞体积中断, 以响应渗透或药理干扰。一个意想不到的发现是, 我们可以清楚地想象膜亚域在广泛的纤维细胞膜在活幼虫转基因, 但不是在固定的镜头。这突出了转基因和帕洛伊丁在标签上的差异, 以及这些子域可能受到固定过程的影响这一事实。
用我们描述的方法分析透镜核集中化的分子机制, 可以揭示透镜光学特性发展的重要机制。虽然, 到目前为止, 轴向镜头核不对称只报道在斑马鱼, 通过研究这一过程, 我们有可能获得深入了解所需的机制, 在其他物种的镜头光学发展。今后, 转基因动物可以与其他应用结合使用--比如过度表达研究, 使用绿色转基因标记。这些可用于研究在晶状体中过度表达特定蛋白质的效果, 或用于挽救现有突变体中的表型。
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Disclosures
我们没有披露。
Acknowledgments
我们要感谢我们的资金来源: NIH R01 Y05661 至 j. e. h, ins Gehring 协助产生aqp0a\ b 双突变体和斑马鱼饲养, Daniel Dranow 博士进行讨论, 导致产生转基因, 布鲁斯博士布隆伯格和肯·乔博士的实验室使用他们的解剖显微镜, 梅根·史密斯博士寻求统计分析方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21 °C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont #5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION - toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
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